Introduction
Cyanobacteria पृथ्वी पर लगभग हर प्राकृतिक वातावरण में पाया जीवाणुओं की एक evolutionarily प्राचीन और विविध जाति हैं। समुद्री पारिस्थितिकी प्रणालियों में वे विशेष रूप से प्रचुर मात्रा में हैं और कार्बन निर्धारण 1 के लगभग आधे के लिए लेखांकन, महासागरों में नाइट्रोजन स्थिरीकरण 2 और हाइड्रोकार्बन उत्पादन 3 के टन के लाखों लोगों के सैकड़ों के बहुमत सालाना है, कई पोषक तत्व चक्र में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। क्लोरोप्लास्ट, organelle यूकेरियोटिक शैवाल और पौधों में प्रकाश संश्लेषण के लिए जिम्मेदार है, एक साइनोबैक्टीरीयम कि एक मेजबान जीव 4 से घिरा हुआ था से विकसित किया है की संभावना है। Cyanobacteria प्रकाश संश्लेषण, इलेक्ट्रॉन परिवहन 5 और जैव रासायनिक रास्ते, जिनमें से कई पौधों में संरक्षित कर रहे हैं के अध्ययन के लिए उपयोगी मॉडल जीवों साबित कर दिया है। इसके अलावा cyanobacteria में तेजी से उनके हाय के कारण 8, 6 जैव ईंधन, खाद्य के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है बिजली 7 और औद्योगिक यौगिकों,पानी और सीओ 2 के ghly कुशल रूपांतरण सौर ऊर्जा 9 का उपयोग बायोमास। कई प्रजातियों के कम से कम पोषक तत्वों और समुद्री जल के साथ गैर-कृषि योग्य भूमि पर खेती की जा सकती, कि cyanobacteria सुझाव संभावित बड़े पैमाने पर कृषि उत्पादन को प्रभावित किए बिना विकसित किया जा सकता है। कुछ प्रजातियां भी रोधी, जीवाणुरोधी और विरोधी कैंसर यौगिकों 10,11 सहित प्राकृतिक उत्पादों के स्रोत हैं।
म्यूटेंट उत्पन्न करने की क्षमता औद्योगिक उद्देश्यों के लिए नस्लों के विकास के लिए cyanobacterial प्रकाश संश्लेषण, जैव रसायन विज्ञान और शरीर विज्ञान, समझने की कुंजी है और आवश्यक है। प्रकाशित अध्ययन के बहुमत आनुवंशिक रूप से ब्याज की साइट में एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट की प्रविष्टि से उपभेदों संशोधित उत्पन्न। यह परिवर्तन है कि एक तनाव में पेश किया जा सकता है, के रूप में केवल कुछ एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट cyanobacteria में उपयोग के लिए उपलब्ध हैं की संख्या को सीमित करता है। जीन से युक्त खींच एंटीबायोटिक पुन प्रदानविरोध खुले तालाबों में औद्योगिक उत्पादन है, जो केवल लागत प्रभावी साधन जैव ईंधन और अन्य कम मूल्य के उत्पादों के उत्पादन के लिए 12 को होने की संभावना है के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। अगोचर म्यूटेंट की पीढ़ी के इन सीमाओं पर काबू। जब तक जानबूझकर शामिल अगोचर म्यूटेंट, कोई विदेशी डीएनए होते हैं, और कई बार चालाकी से किया जा सकता है। इसलिए यह वांछित के रूप में एक तनाव में के रूप में कई परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए संभव है। इसके अलावा, संशोधन साइट के बहाव के जीन पर ध्रुवीय प्रभाव कम किया जा सकता है, जीव 13 की अधिक सटीक संशोधन की इजाजत दी।
उत्परिवर्ती तनाव, आत्महत्या plasmids cyanobacterial गुणसूत्र में क्षेत्रों के लिए दो डीएनए टुकड़े समान युक्त जीन flanking हटाए जाने की उत्पन्न करने के लिए (करार दिया 5 'और' 3 flanking क्षेत्रों) पहली निर्माण कर रहे हैं। दो जीन तो इन flanking क्षेत्रों के बीच डाला जाता है। इनमें से एक एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रोटीन encodes; दूसरी encodes SacB, जो ठेसuces levansucrase, एक यौगिक सुक्रोज के प्रति संवेदनशीलता प्रदान। प्रक्रिया के पहले चरण में, चिह्नित म्यूटेंट, यानी कुछ विदेशी डीएनए युक्त तनाव, उत्पन्न कर रहे हैं। प्लाज्मिड निर्माण cyanobacterial कोशिकाओं के साथ मिलाया जाता है और डीएनए जीव द्वारा स्वाभाविक रूप से लिया जाता है। Transformants उचित एंटीबायोटिक और उत्परिवर्ती जीनोटाइप पीसीआर द्वारा सत्यापित युक्त अगर प्लेटों पर विकास से चुने गए हैं। आत्महत्या plasmids हित के तनाव के भीतर नकल नहीं कर सकते। इसलिए किसी भी एंटीबायोटिक प्रतिरोधी कालोनियों एक पुनर्संयोजन घटना जिससे ब्याज की जीन में गुणसूत्र में डाला से परिणाम होगा। अगोचर म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए, उल्लेखनीय उत्परिवर्ती तो सिर्फ 5 'और 3' flanking क्षेत्रों युक्त एक दूसरे आत्महत्या प्लाज्मिड के साथ मिलाया जाता है। हालांकि, अगर विदेशी डीएनए की प्रविष्टि की आवश्यकता है, 5 'और 3' एक कैसेट इन डीएनए टुकड़े के बीच डाला ब्याज की जीन से युक्त के साथ क्षेत्रों flanking से मिलकर एक प्लाज्मिड इस्तेमाल किया जा सकता है। Selection सूक्रोज युक्त अगर प्लेटों पर विकास के जरिए होता है। सुक्रोज की कोशिकाओं के लिए घातक है जब sacB जीन उत्पाद व्यक्त किया है, केवल कोशिकाओं है कि जीवित रहने के लिए उन है जिसमें एक दूसरे पुनर्संयोजन घटना हुई है, जिससे सुक्रोज संवेदनशीलता जीन, एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के अलावा, से बाहर कर दिया गया है recombined हैं गुणसूत्र और प्लाज्मिड पर। recombinational मुद्रा का एक परिणाम के रूप में, flanking क्षेत्रों और उन दोनों के बीच किसी भी डीएनए गुणसूत्र में डाला जाता है।
हम सफलतापूर्वक इन तरीकों का इस्तेमाल किया है Synechocystis सपा के ही तनाव में कई गुणसूत्र म्यूटेशन उत्पन्न करते हैं। PCC6803 (इसके बाद Synechocystis के रूप में) 13,14, ब्याज 13 की एक जीन में और जीन कैसेट की अभिव्यक्ति के लिए एकल बिंदु उत्परिवर्तन परिचय। अगोचर नॉकआउट की पीढ़ी Synechocystis 15,16, एक विस्तृत विधि में हमारे काम करने से पहले प्रदर्शन किया गया है, वहीं द्वारा सहायता प्राप्तमहत्वपूर्ण कदम के एक दृश्य प्रस्तुति, सार्वजनिक रूप से उपलब्ध नहीं है। हम भी एक और मॉडल साइनोबैक्टीरीयम, Synechococcus सपा में उल्लेखनीय नॉकआउट की पीढ़ी के लिए एक ही विधि का आवेदन किया है। PCC7002 (इसके बाद Synechococcus के रूप में)। इस प्रोटोकॉल म्यूटेंट और मान्य है और इन उपभेदों के भंडारण के लिए एक तेजी से प्रोटोकॉल पैदा करने के लिए एक स्पष्ट, सरल तरीका प्रदान करता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. संस्कृति मीडिया की तैयारी
- Castenholz, 1988 17 के अनुसार BG11 मध्यम तैयार।
- 100x BG11 का जायजा समाधान तैयार, तत्व और लोहे के शेयर (तालिका 1) का पता लगा।
- फॉस्फेट शेयर के अलग-अलग समाधान तैयार, ना 2 3 सीओ शेयर, एन - [Tris (hydroxymethyl) मिथाइल] -2-aminoethanesulfonic एसिड (टीईएस) बफर और NaHCO 3 (1 टेबल)।
- फॉस्फेट और ना 2 3 सीओ शेयरों आटोक्लेव। फिल्टर बाँझ 0.2 माइक्रोन फिल्टर के साथ टीईएस बफर और 3 NaHCO।
- 976 100x BG11 के 10 मिलीलीटर, लोहे के शेयर के तत्वों का पता लगाने के 1 मिलीलीटर और 1 मिलीलीटर पानी की मिलीलीटर, संयोजन के द्वारा BG11 को तैयार है और समाधान आटोक्लेव। इस के बाद समाधान कमरे के तापमान को ठंडा है, फॉस्फेट शेयर के 1 मिलीलीटर, ना 2 3 सीओ शेयर के 1 मिलीलीटर और 3 NaHCO के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
- BG11 ठोस माध्यम के लिए, अगर की 15 ग्राम और एक fla करने के लिए पानी की 700 मिलीलीटर जोड़नेएस। दूसरी फ्लास्क, ना 2 एस के 3 ग्राम जोड़ने के लिए 2 ओ 3, पानी की 226 मिलीलीटर, तत्वों का पता लगाने 100x BG11 के 10 मिलीलीटर, 1 मिलीग्राम और लोहे के शेयर के 1 मिलीलीटर। दोनों के समाधान आटोक्लेव। बाद इन समाधान कमरे के तापमान को ठंडा है, उन्हें गठबंधन और फॉस्फेट शेयर के 1 मिलीलीटर, ना 2 3 सीओ शेयर के 1 मिलीलीटर, टीईएस बफर के 10 मिलीलीटर, और 3 NaHCO के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
नोट: समाधान निश्चित लवण की वर्षा से बचने के लिए अलग से तैयार कर रहे हैं।
- सुक्रोज पर चयन के लिए, एक 50% (w / v) सुक्रोज समाधान तैयार है। फ़िल्टर 0.2 माइक्रोन फिल्टर के साथ समाधान बाँझ और BG11 को BG11 / 5% सूक्रोज प्लेटों का उत्पादन करने के लिए (BG11 के 900 मिलीलीटर के लिए 50% sucrose के 100 मिलीलीटर) जोड़ें।
नोट: BG11 / 5% सूक्रोज अगर प्लेट को 3 NaHCO न जोड़ें। ना 2 3 सीओ सामान्य रूप में जोड़े। - Synechococcus के संवर्धन के लिए 10 1 एम 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic एसिड, एन के मिलीलीटर जोड़ने - (2-hydroxyethyl) piperazine- एन.आर.42; - (2-ethanesulfonic एसिड) (HEPES) और BG11 माध्यम के 1 एल के लिए विटामिन बी 12 (1 टेबल) के 1 मिलीलीटर।
नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध BG11 मीडिया में सुसंस्कृत स्ट्रेन के परिवर्तन काफी कम कुशल यहाँ वर्णित BG11 मीडिया व्यंजनों में से है और इसलिए अनुशंसित नहीं है।
2. cyanobacterial उपभेदों के विकास
- संस्कृति 50 मिलीलीटर की एक अधिकतम मात्रा के साथ 100 मिलीलीटर शंक्वाकार बोतल में तनाव और 120 rpm पर हिला। प्लेट के पक्ष में Parafilm और पंचर तीन छोटे छेद के साथ BG11 प्लेटें सील गैस विनिमय की अनुमति है। 20-40 μmol फोटॉनों मीटर के बीच एक प्रकाश की तीव्रता में एक photobioreactor में फ्लोरोसेंट बल्ब के तहत 30 डिग्री सेल्सियस पर सभी उपभेदों सेते -2 सेकंड -1।
- सबसे अच्छा बाँझ तकनीकों का प्रयोग करें। एक लामिना का प्रवाह हुड में सभी cyanobacterial उपभेदों संभाल लेना।
नोट: यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जब उपभेदों मीडिया वाले सुक्रोज के साथ सुसंस्कृत हैं, जो आसानी से किया जा सकता contaminपैदा।
3. प्लाज्मिड निर्माणों के जनरेशन
- ऐसे Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), के रूप में आवश्यक प्रतिबंध एंजाइम साइटों सहित प्राइमरों, प्राइमर डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के डिजाइन सेटों के दो ~ 1 केबी क्षेत्रों 5 'और' 3 बढ़ाना ब्याज की जीन। Cyanobase के माध्यम से cyanobacterial प्रजातियों के जीनोम अनुक्रम से परामर्श (http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase)। यहां इस्तेमाल सभी प्राइमरों के लिए 2 टेबल देखें। जब डिजाइनिंग प्राइमरों निम्नलिखित कारकों पर विचार:
- सुनिश्चित करें कि परिलक्षित क्षेत्रों 5 'और 3' जीन है कि उत्परिवर्तित हो जाएगा, जैसे चित्रा 1 के क्षेत्रों में शामिल हैं।
- intergenic क्षेत्रों रूप बदलना antisense और गैर-कोडिंग RNAs के अनपेक्षित उत्परिवर्तन से बचने के लिए नहीं है। Synechocystis में म्यूटेंट की पीढ़ी के लिए, ट्रांसक्रिप्शनल प्रारंभ साइटों Mitschke एट अल में दस्तावेज की सूची के लिए आदेश antisense के उत्परिवर्तन से बचने के लिए 2011 में 18 देखें।,या गैर-कोडिंग RNAs।
- चुनने flanking क्षेत्रों कोलाई में इन जीनों की अभिव्यक्ति के रूप में आसन्न जीन की पूरी खुला पढ़ने फ्रेम क्लोनिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं शामिल नहीं करते।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ पीसीआर का उपयोग करके उत्पादों बढ़ाना।
नोट: हमारे अनुभव में इस एंजाइम कुछ त्रुटियाँ पैदा करता है।- 50 μl पीसीआर एचएफ बफर और या तो DMSO के 0, 1.5 या 3 μl युक्त प्रतिक्रियाओं सेट करें। प्रतिक्रिया प्रति जीनोमिक डीएनए के 100 एनजी का प्रयोग करें। 30 सेकंड, 10 सेकंड, 67 ° 30 सेकंड के लिए 30 सेकंड के लिए सी, 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 35 राउंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के एक प्रारंभिक विकृतीकरण कदम से मिलकर एक प्रोग्राम का उपयोग करें, 72 डिग्री के अंतिम विस्तार कदम के द्वारा पीछा 5 मिनट के लिए सी। यह आमतौर पर लगातार उत्पादों देता है।
- पीसीआर उत्पादों और नमूने जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से सही आकार के लिए endonuclease एंजाइमों के साथ पचा सत्यापित करें। 1% चलाएं (w / v) agarose जैल 0.02% से युक्त(वी / वी) ethidium 45 मिनट के लिए 100 वी पर ब्रोमाइड
चेतावनी: ethidium ब्रोमाइड एक संभावित उत्परिवर्तजन है और उचित संरक्षण के साथ संभाला जाना चाहिए। - निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक डीएनए शुद्धि किट का उपयोग पीसीआर उत्पादों शुद्ध। इसके अलावा agarose जैल से काट टुकड़े सहित प्लाज्मिड टुकड़े की शुद्धि के लिए इस किट का उपयोग करें। पानी के 14 μl में शुद्ध डीएनए Elute।
- क्लोनिंग के चरणों के लिए, प्रतिबंध endonuclease प्रतिक्रिया मिश्रण 37 डिग्री सेल्सियस पर> 1 घंटे के लिए 30 μl की कुल मात्रा में निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेते हैं।
- बंधाव चरणों के लिए, 20 μl की कुल मात्रा में> 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान, शुद्ध पचा प्लाज्मिड के 5 μl, शुद्ध पचा डालने के 12 μl, बफर के 2 μl और ligase के 1 μl युक्त पर Ligate डीएनए टुकड़े।
- निम्न विधि के अनुसार कोलाई DH5α transformant कोशिकाओं को तैयार।
- एक रात में ई बढ़ो कोलाई
- एक 1 एल शंक्वाकार रातोंरात संस्कृति के 1 मिलीलीटर के साथ 6 मिलीग्राम 1 एम 2 MgCl (तालिका 1) युक्त कुप्पी में 400 मिलीलीटर लेग टीका लगाना।
- लगभग 4 घंटे के लिए या जब तक आयुध डिपो 600nm 0.4-0.6 पहुंचता है 220 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति विकसित।
- 1 घंटे के लिए बर्फ पर कोशिकाओं रखें।
- 10 मिनट के लिए 2800 XG पर अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर गोली कोशिकाओं।
- 160 मिलीलीटर समाधान ए (तालिका 1) में सतह पर तैरनेवाला और resuspend निकालें और 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
- 10 मिनट के लिए 2800 XG पर अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर गोली कोशिकाओं।
- 4 एमएल समाधान A + ग्लिसरॉल (1 टेबल) में सतह पर तैरनेवाला और resuspend निकालें।
- 50 μl aliquots तैयार, -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल एन 2, दुकान में फ्रीज।
- सक्षम कोशिकाओं के 50 μl के साथ बंधाव मिश्रण के 5 μl मिक्स और बर्फ पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
- हीट 90 सेकंड, follo के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को झटका2 मिनट के लिए बर्फ पर ऊष्मायन से विवाह कर लिया।
- लेग मीडिया (तालिका 1) के 950 μl जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- अशेष 50 और उचित एंटीबायोटिक के साथ प्लेटों पर 200 μl, या तो एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) और / या केनामाइसिन (/ एमएल 30 माइक्रोग्राम)।
चेतावनी: दोनों केनामाइसिन और एम्पीसिलीन विषाक्त कर रहे हैं और उचित संरक्षण के साथ संभाला जाना चाहिए। - उठाओ और 2 मिलीलीटर लेग उचित एंटीबायोटिक के साथ टीका मीडिया में एकल कालोनियों सेते हैं।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक miniprep प्लाज्मिड शुद्धि किट का उपयोग सभी plasmids शुद्ध।
- Plasmids उत्पन्न, cpcC1C2 जीन बाहर दस्तक के लिए इस विशिष्ट उदाहरण में, निम्न चरणों के अनुसार।
- 1,012 बीपी 5 'flanking क्षेत्र (बाएं टुकड़ा) प्राइमरों cpcC1C2leftfor और cpcC1C2leftrev (3.2 कदम 2 टेबल देखें) का उपयोग कर बढ़ाना। पीसीआर प्रतिक्रिया की एक छोटी राशि निकालने और क्या इस बात की पुष्टिसही आकार उत्पाद जेल वैद्युतकणसंचलन (3.3 कदम) के माध्यम से परिलक्षित किया गया है। इस टुकड़ा और pUC19 Xba मैं और बेम HI (3.5 चरण) के साथ डाइजेस्ट।
- दोनों तैयारी (3.4 कदम), Ligate (कदम 3.6) को शुद्ध, (कदम 3.7) और minipreps (3.8 चरण) के माध्यम से प्लाज्मिड शुद्धि के लिए अलग कालोनियों से एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ चार 2 मिलीलीटर लेग तरल संस्कृतियों की स्थापना बदलना।
- Xba मैं / BAM HI पाचन और जेल वैद्युतकणसंचलन (3.3 कदम) के माध्यम से pUC19 में टुकड़ा की प्रविष्टि के लिए जाँच करें। 2,660 बीपी और 1,012 बीपी के बैंड प्लाज्मिड में डालने का सही परिचय संकेत मिलता है।
- 1,016 बीपी 3 'flanking क्षेत्र (सही टुकड़ा) प्राइमरों cpcC1C2rightfor और cpcC1C2rightrev (3.2 कदम 2 टेबल देखें) का उपयोग कर बढ़ाना। पीसीआर प्रतिक्रिया की एक छोटी राशि निकालें और पुष्टि करें कि क्या सही आकार उत्पाद जेल वैद्युतकणसंचलन (3.3 कदम) के माध्यम से परिलक्षित किया गया है। इस टुकड़ा और pUC19 सैक मैं और पारिस्थितिकी आरआई के साथ डाइजेस्ट (अनुसूचित जनजातिईपी 3.5)।
- दोनों तैयारी (3.4 कदम), Ligate (कदम 3.6) को शुद्ध, (कदम 3.7) और minipreps (3.8 चरण) के माध्यम से प्लाज्मिड शुद्धि के लिए अलग कालोनियों से एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ चार 2 मिलीलीटर लेग तरल संस्कृतियों की स्थापना बदलना।
- सैक मैं / पारिस्थितिकी आरआई पाचन (3.5 कदम) और जेल वैद्युतकणसंचलन (3.3 कदम) के माध्यम से pUC19 में टुकड़ा की प्रविष्टि के लिए जाँच करें। 2,660 बीपी और 1,016 बीपी के बैंड प्लाज्मिड में डालने का सही परिचय संकेत मिलता है।
नोट: Xba मैं / BAM HI pUC19 में क्षेत्र '3 की क्लोनिंग के लिए क्षेत्र और सैक मैं / पारिस्थितिकी आरआई' 5 की क्लोनिंग के लिए साइटों जहाँ भी संभव हो जाता है। संभव है, हमेशा 5 'क्षेत्र या 3 के लिए आगे प्राइमर' क्षेत्र के लिए रिवर्स प्राइमर पर एक Bam HI साइट शामिल है कि बाद में क्लोनिंग के चरणों को पूरा करने के लिए आसान कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए। - अनुक्रम दोनों सम्मिलित करता है निर्धारित करने के लिए यदि अनुक्रम प्रविष्टि साइट, जैसे एम 1 फैले प्राइमरों का उपयोग सही है3 आगे और रिवर्स M13 (तालिका 2)। अनुक्रम यह सुनिश्चित करने के लिए कोई त्रुटि flanking क्षेत्रों में पेश कर रहे हैं सही होना चाहिए।
- Xba मैं / BAM HI पाचन के माध्यम से pUC19 से बाईं टुकड़ा आबकारी। PUC19 + Xba मैं / BAM HI (3.5 कदम) के साथ सही टुकड़ा डाइजेस्ट।
- डीएनए एक छुरी ब्लेड का उपयोग कर के छांटना के माध्यम से एक agarose जेल (3.3 कदम) से 1,012 बीपी छोड़ दिया टुकड़ा और 3,676 बीपी pUC19 + सही टुकड़ा शुद्ध।
- दोनों तैयारी (3.4 कदम), Ligate (कदम 3.6) को शुद्ध, (कदम 3.7) और minipreps (3.8 चरण) के माध्यम से प्लाज्मिड शुद्धि के लिए अलग कालोनियों से एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ चार 2 मिलीलीटर लेग तरल संस्कृतियों की स्थापना बदलना।
- Xba मैं / BAM HI पाचन (3.5 कदम) और जेल वैद्युतकणसंचलन (3.3 कदम) के माध्यम से pUC19 + सही टुकड़ा टुकड़ा में की प्रविष्टि के लिए जाँच करें। 3,676 बीपी और 1,012 बीपी के बैंड प्लाज्मिड में डालने का सही प्रविष्टि (प्लाज्मिड बी के रूप में इस का उल्लेख) से संकेत मिलता है।
नोट: NPT1 / sacB कैसेट agarose जैल से शुद्ध किया जा करने के बाद से pUM24cm एक प्रोटीन chloramphenicol प्रतिरोध प्रदान कूटबद्ध नहीं है। इसलिए अगर कालोनियों लेग पर बड़े हो रहे हैं / एम्पीसिलीन / केनामाइसिन अगर प्लेटें ही संभव संयोजन है कि प्रतिरोधी कालोनियों को बढ़ावा मिलेगा प्लाज्मिड बी में NPT1 / sacB कैसेट का समावेश है - दोनों की तैयारियों को शुद्ध (3.4 कदम), Ligate (कदम 3.6), परिणत (कदम 3.7) और प्लाज्मिड शुद्धि के लिए अलग कालोनियों से एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) और केनामाइसिन (30 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ चार 2 मिलीलीटर लेग तरल संस्कृतियों की स्थापना minipreps के माध्यम से (3.8 चरण)।
- Bam HI पाचन (3.5 कदम) और जेल वैद्युतकणसंचलन (3.3 कदम) के माध्यम से प्लाज्मिड बी में NPT1 / sacB कैसेट की प्रविष्टि के लिए जाँच करें। 4688 बीपी और 3,894 बीपी के बैंड वीं की सही प्रविष्टि संकेत मिलता हैई प्लाज्मिड (प्लाज्मिड एक के रूप में इस का उल्लेख) में डालें।
- वैकल्पिक रूप से, कुंद अंत प्लाज्मिड बी में छोड़ दिया और सही टुकड़े के बीच एक अलग प्रतिबंध endonuclease साइट में NPT1 / sacB कैसेट और क्लोन NPT1 / sacB कैसेट छोड़ दिया और सही टुकड़े के बीच क्लोन किया जाना चाहिए।
नोट: एक विदेशी कैसेट की अभिव्यक्ति तो आवश्यकता है, तो यह प्लाज्मिड बी के छोड़ दिया और सही टुकड़े यह प्लाज्मिड तो अगोचर पीटकर चरणों में प्रयोग किया जाता है के बीच डाला जाना चाहिए।
4. चिह्नित Synechocystis और Synechococcus म्यूटेंट की पीढ़ी
- एक पाश BG11 माध्यम के 30-50 मिलीलीटर में कोशिकाओं का पूरा inoculating द्वारा एक ताजा संस्कृति की स्थापना की। 0.6 आयुध डिपो 750nm करने के लिए 2-3 दिनों के लिए संस्कृति विकसित = 0.2।
नोट: आमतौर पर अलग-अलग कालोनियों टीका और व्यक्ति की कोशिकाओं के प्रदर्शन के लिए उपयोग करने के लिए प्रकाश की भी निम्न स्तर photoinhibition और चयन में परिणाम होगा करने के लिए बहुत छोटे हैंप्रकाश प्रतिरोधी म्यूटेंट के लिए। - 5 मिनट के लिए 2300 XG पर संस्कृति की अपकेंद्रित्र 1-2 मिलीलीटर और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। > 2300 XG पर किसी भी cyanobacterial संस्कृतियों अपकेंद्रित्र के रूप में इस कोशिकाओं को नुकसान कर सकता है। BG11 माध्यम के साथ एक बार गोली धो लें।
नोट: इस पिली जो डीएनए तेज के लिए आवश्यक हैं के नुकसान में परिणाम हो सकता है के रूप में vortexing द्वारा कोशिकाओं resuspend मत करो। कोमल pipetting द्वारा कोशिकाओं Resuspend। - 100 μl के अंतिम मात्रा को BG11 मध्यम जोड़ें। एक 14 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण।
- प्लाज्मिड के 1 माइक्रोग्राम कोशिकाओं को जोड़ने और कोमल दोहन द्वारा मिश्रण। <प्लाज्मिड के 10 μl जोड़ें।
नोट: अधिमानतः प्लाज्मिड> 100 एनजी / μl की एकाग्रता में होना चाहिए, लेकिन सांद्रता इस से कम सफल परिवर्तन के लिए पर्याप्त हैं। - इनक्यूबेटर में लेट नलियों क्षैतिज। 4-6 घंटे के लिए संस्कृतियों सेते हैं।
नोट: प्रकोष्ठों संक्षेप में हर 1-2 घंटा दोहन से मिलाया जा सकता है, लेकिन यह आवश्यक नहीं है। नमूने एक में रखा जा सकता हैइनक्यूबेटर मिलाते हुए, हालांकि यह काफी दक्षता में सुधार नहीं होता। - एंटीबायोटिक दवाओं के बिना BG11 अगर प्लेटों पर सेल संस्कृति / डीएनए मिश्रण की aliquots बिखरा हुआ है। आम तौर पर 20 μl और 80 μl aliquots अलग प्लेटों पर फैले हुए हैं।
- अगर प्लेट के लिए: ~ 24 घंटा बाद में, (अगर की 0.12 ग्राम, 100 मिलीग्राम / एमएल केनामाइसिन के 100 μl 20 मिलीलीटर प्रति) पानी में 0.6% की 2.5-3 मिलीलीटर अगर समाधान केनामाइसिन युक्त जोड़ें। इस समाधान ~ 42 डिग्री सेल्सियस के लिए अच्छा है, और अगर थाली के किनारे करने के लिए जोड़ें। झुकाव प्लेट तो समाधान रूपों की सतह पर एक भी 'शीर्ष अगर' परत।
- समय की अवधि के लिए आगे अगर प्लेटें सेते हैं। कालोनियों लगभग 7 दिनों के बाद दिखाई जानी चाहिए।
नोट: अगर प्लेटें 3 एक मशीन में उच्च खड़ी की जा सकती है। आमतौर पर कालोनियों के सैकड़ों परिवर्तन प्रति प्राप्त कर रहे हैं। - BG11 + केनामाइसिन (30 माइक्रोग्राम / एमएल) के प्लेटों अगर पर स्ट्रीक व्यक्ति कालोनियों। 6 सेक्टरों में अगर प्लेट फूट डालो और बाहर लकीर को एक कुंद अंत दन्तखुदनी का उपयोगप्रत्येक व्यक्ति के क्षेत्र से अधिक कालोनियों। एकल कालोनियों प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, transformants की सिर्फ विकास नहीं है।
- पीसीआर द्वारा चिह्नित पीटकर निर्माता के निर्देशों के अनुसार Taq डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग कर पुष्टि करें। प्रतिक्रिया प्रति 2 MgCl (25 मिमी) के 2 μl जोड़ें।
- कोशिकाओं के एक छोटे से अनुपात निकालें और एक ट्यूब में 50 μl पानी और ~ 20 माइक्रोन 425-600 कांच के मोती युक्त में स्थानांतरित। ~ 2000 rpm पर 5 मिनट के लिए वाइब्रेटर में हिला। 5 मिनट के लिए 15,700 XG पर अपकेंद्रित्र और प्रति 50 μl पीसीआर प्रतिक्रिया सतह पर तैरनेवाला के 5 μl का उपयोग करें।
नोट: समाधान resuspend मत करो। सेल मलबे ट्यूब के नीचे रहने की जरूरत है।
- कोशिकाओं के एक छोटे से अनुपात निकालें और एक ट्यूब में 50 μl पानी और ~ 20 माइक्रोन 425-600 कांच के मोती युक्त में स्थानांतरित। ~ 2000 rpm पर 5 मिनट के लिए वाइब्रेटर में हिला। 5 मिनट के लिए 15,700 XG पर अपकेंद्रित्र और प्रति 50 μl पीसीआर प्रतिक्रिया सतह पर तैरनेवाला के 5 μl का उपयोग करें।
- म्यूटेंट मान्य
- डिजाइन प्राइमरों जो (जैसे Primer3 के रूप में) प्रथम डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पीटकर क्षेत्र अवधि। डिजाइन प्राइमरों ~ 200 बीपी या तो पीटकर क्षेत्र की ओर से शुरू।
नोट: cpcC1C2 उत्परिवर्ती पुष्टि करने के लिए प्राइमर तालिका 2 में रेखांकित कर रहे हैंऔर cpcC1C2for और cpcC1C2rev कहा जाता है। - एक के द्वारा पीछा 2 मिनट, 1 मिनट, 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, अनुक्रम का केबी प्रति 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 35 राउंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के एक प्रारंभिक विकृतीकरण कदम से मिलकर एक कार्यक्रम उत्पादों का उपयोग बढ़ाना 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के अंतिम विस्तार कदम। एक जंगली प्रकार नियंत्रण शामिल हैं। यह आमतौर पर लगातार उत्पादों देता है।
- जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से जीनोटाइप की जाँच करें। चिह्नित पीटकर transformants ~ 4 KB (दोनों बाएँ और दाएँ टुकड़े प्लस NPT1 / sacB कैसेट से 0.2 केबी) और जंगली प्रकार के बैंड की अनुपस्थिति (चित्रा 2) के एक बैंड दिखाएगा।
नोट: कुछ मामलों में एक ~ 4 केबी बैंड इस पीसीआर उत्पाद के बड़े आकार के कारण उल्लेखनीय उत्परिवर्ती में नहीं मनाया जाता है। हालांकि, अगर एक बैंड जंगली प्रकार की उम्मीद आकार के लिए इसी तो नहीं मनाया जाता है आम तौर पर इस तनाव एक उल्लेखनीय पीटकर है।
- डिजाइन प्राइमरों जो (जैसे Primer3 के रूप में) प्रथम डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पीटकर क्षेत्र अवधि। डिजाइन प्राइमरों ~ 200 बीपी या तो पीटकर क्षेत्र की ओर से शुरू।
- एक जंगली प्रकार के बैंड अभी भी मौजूद है तो फिर से लकीर एक पर तनावताजा BG11 + केनामाइसिन (30 माइक्रोग्राम / एमएल) अगर प्लेट और पीसीआर को दोहराएँ। फिर से streaking प्रक्रिया को दोहराएं जब तक उत्परिवर्ती अलग है, ताकि कोई जंगली प्रकार के बैंड पीसीआर प्रतिक्रिया में मनाया जाता है।
नोट: 50 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए केनामाइसिन की मात्रा बढ़ाने, तो 100 माइक्रोग्राम / एमएल कभी कभी पूरी तरह से एक उल्लेखनीय उत्परिवर्ती अलग करने में आवश्यक है। - तनाव पीसीआर के माध्यम से एक चिह्नित उत्परिवर्ती प्रोफ़ाइल से पता चलता है, तो एक ताजा BG11 + केनामाइसिन (30 माइक्रोग्राम / एमएल) अगर प्लेट पर फिर से लकीर। इस तनाव का प्रयोग करें अगोचर पीटकर उत्पन्न करते हैं।
नोट: प्रोटोकॉल सिर्फ एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट के साथ चिह्नित म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता छोड़ दिया और सही टुकड़े के बीच pUC18K 20 से सिर्फ NPT1 कैसेट के साथ NPT1 / sacB कैसेट की जगह से अर्थात्।।
5. अगोचर Synechocystis म्यूटेंट की पीढ़ी
- एक पाश सी का पूरा inoculating द्वारा चिह्नित पीटकर की एक ताजा संस्कृति को सेट करेंBG11 माध्यम के 30-50 मिलीलीटर में एल। 0.6 आयुध डिपो 750nm करने के लिए 2-3 दिनों के लिए संस्कृति विकसित = 0.2।
- अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागें 2300 XG पर संस्कृति के 10 मिलीलीटर। BG11 माध्यम के साथ एक बार धो लें।
नोट: इस पिली जो डीएनए तेज के लिए आवश्यक हैं के नुकसान में परिणाम हो सकता है के रूप में vortexing द्वारा कोशिकाओं resuspend मत करो। कोमल pipetting द्वारा कोशिकाओं Resuspend। - 200 μl के अंतिम मात्रा को BG11 जोड़ें। एक 14 मिलीलीटर दौर नीचे ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण।
- प्लाज्मिड बी डीएनए के 1 माइक्रोग्राम कोशिकाओं को जोड़ने और कोमल दोहन द्वारा मिश्रण।
- 4-6 घंटे के लिए नमूने सेते हैं। क्षैतिज लेट ट्यूबों।
नोट: प्रकोष्ठों संक्षेप में हर 1-2 घंटा दोहन से मिलाया जा सकता है, लेकिन यह आवश्यक नहीं है। नमूने एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है, हालांकि यह दक्षता में सुधार नहीं होता है। - झटकों के साथ 4 दिनों की कुल के लिए BG11 माध्यम की 1.8 मिलीलीटर जोड़ें और नमूने सेते हैं। यह पुनर्संयोजन कई गुणसूत्र प्रतियों में घटित करने के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त समय है।
- BG11 / 5% सूक्रोज अगर प्लेटों पर परिवर्तन मिश्रण की प्लेट aliquots। प्लेट 50 μl, 10 μl और अगर प्लेट प्रति 1 μl। एक कॉलोनी लॉन दिखाई देता है तो इन सब अगर प्लेट ताजा प्लेटों पर समाधान के लिए आगे और विभाज्य पतला पर। कालोनियों लगभग 7 दिनों के बाद दिखाई जानी चाहिए।
- 30-50 व्यक्ति BG11 / 5% सूक्रोज अगर प्लेट दूसरी प्लेटों पहले अगर BG11 + केनामाइसिन (30 माइक्रोग्राम / एमएल) पर कालोनियों और पैच, एक कुंद अंत दन्तखुदनी का उपयोग कर। किसी भी बैक्टीरिया कि BG11 / 5% सूक्रोज प्लेटों पर बढ़ने लेकिन केनामाइसिन नहीं BG11 + प्लेटों संभावित अगोचर नॉकआउट कर रहे हैं। दोनों प्लेटों पर बढ़ जीवाणु sacB जीन में उत्परिवर्तन के कारण सुक्रोज प्रतिरोधी होने की संभावना है।
- CpcC1C2 अगोचर पीटकर की पुष्टि करने के लिए एक ही प्राइमरों और विधि का उपयोग कर के रूप में चिह्नित नॉकआउट जाँच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था अगोचर नॉकआउट की जाँच करें। उदाहरण के लिए cpcC1C2for और cpcC1C2rev (तालिका 2)। एक अगोचर पीटकर एक agarose जेल इसी टी पर एक बैंड दिखाएगाओ जंगली प्रकार के आकार शून्य से नष्ट कर क्षेत्र (चित्रा 2)।
- तनाव पीसीआर के माध्यम से एक अगोचर उत्परिवर्ती प्रोफ़ाइल (कदम 4.11.2) और जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 2) से पता चलता है, तो एंटीबायोटिक दवाओं के बिना फिर से लकीर एक ताजा BG11 अगर प्लेट पर।
6. खींच की लंबी अवधि के भंडारण
- एक पाश BG11 माध्यम के 30-50 मिलीलीटर में कोशिकाओं का पूरा inoculating से तनाव का एक ताजा संस्कृति की स्थापना की। 0.7 आयुध डिपो 750nm करने के लिए 3-4 दिनों के लिए संस्कृति विकसित = 0.4।
- BG11 और BG11 की ~ 2 मिलीलीटर में resuspend के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें।
- एक ट्यूब के लिए ध्यान केंद्रित कोशिकाओं के 0.8 मिलीलीटर जोड़ें। तो 80% फिल्टर निष्फल ग्लिसरॉल के 0.2 मिलीलीटर जोड़ें।
- वैकल्पिक: एक और ट्यूब के लिए केंद्रित कोशिकाओं के 0.93 मिलीलीटर जोड़ें। इस ट्यूब को DMSO के 0.07 मिलीलीटर जोड़ें।
चेतावनी: DMSO विषैला होता है और उचित संरक्षण के साथ संभाला जाना चाहिए। - -80 डिग्री सेल्सियस पर दोनों ट्यूबों स्टोर। उपभेदों ट्यूब को हटाने और एक कुंद दांत के साथ कुछ कोशिकाओं परिमार्जन पुनर्जीवित करने के लिएएंटीबायोटिक दवाओं के बिना एक अगर प्लेट पर लेने के लिए। बाहर सामान्य रूप में एक बाँझ पाश का उपयोग लकीर।
चित्रा 1: रूप में चिह्नित और अगोचर knockouts, जैसे cpcC1 और cpcC2 Synechocystis में की पीढ़ी के लिए प्लाज्मिड निर्माण (ए) Synechocystis जीनोम जहां (बी) cpcC1 और cpcC2 और आसन्न जीन स्थित हैं क्षेत्र।। काले रंग में प्रकाश डाला जीनोम के क्षेत्र उत्परिवर्ती में नष्ट किया जा रहा है। (सी) जीनोम जो पीसीआर से परिलक्षित कर रहे हैं की साइटें। 5 'flanking क्षेत्र (नीले रंग में संकेत दिया) और 3' flanking क्षेत्र (लाल रंग में संकेत दिया) pUC19 में क्लोनिंग के लिए प्रतिबंध endonuclease साइटों के साथ परिलक्षित कर रहे हैं। 5 '(या 3') क्षेत्र flanking pUC19 से बाहर excised और pUC19 + 3 '(या 5 में डाला जाता है9;) क्षेत्र प्लाज्मिड flanking प्लाज्मिड बी (डी) pUM24 से NPT1 / sacB कैसेट क्षेत्रों flanking प्लाज्मिड ए उत्पन्न करने के लिए Bam HI पाचन के माध्यम से excised और 5 'और 3' के बीच डाला जाता है उत्पन्न करने के लिए एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का संस्करण।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
प्लाज्मिड डिजाइन दोनों चिह्नित और अगोचर म्यूटेंट के सफल उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है। चित्रा 1 प्लाज्मिड का एक उदाहरण देता और बी Synechocystis जीन cpcC1 और cpcC2 13 में एक विलोपन उत्परिवर्ती उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया। प्रत्येक मामले में 5 'और' 3 flanking क्षेत्रों लगभग 900-1,000 बीपी हैं। कम flanking क्षेत्रों हालांकि छोटी से छोटी हम सफलतापूर्वक परीक्षण किया है लगभग 500 बीपी किया गया है इस्तेमाल किया जा सकता है। प्लाज्मिड बी भी 5 'और' 3 ~ 1 केबी flanking क्षेत्रों या देशी जीन अनुक्रम का एक संशोधित संस्करण के बीच एक जीन कैसेट शामिल कर सकते हैं।
चित्रा 2: रूप में चिह्नित और अगोचर म्यूटेंट का सत्यापन, जैसे cpcC1 / cpcC2
कोशिकाओं में प्लाज्मिड के परिवर्तन करने पर, आम तौर पर कई सौ कालोनियों के बाद लगभग 7-10 दिनों एक थाली पर दिखाई देगा। कालोनियों <व्यास में 1 मिमी हैं और अगले कुछ हफ्तों के लिए आकार में वृद्धि नहीं होगी। इसलिए यह एक ताजा BG11 + केनामाइसिन अगर प्लेट पर कॉलोनी और यह लकीर को हटाने के लिए एक कुंद अंत दन्तखुदनी का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। लगभग आधे फिर से परेशान कालोनियों 4-6 दिनों के बाद विकसित होगा। जीन गैर जरूरी हैं और म्यूटेंट 20-40 μmol फोटॉनों एम -2 सेकंड -1 के निरंतर प्रकाश के तहत जंगली प्रकार के तनाव के समान विकास को प्रदर्शित करते हैं (जैसे घास-स्मिथ एट अल।, 2013 14 में टर्मिनल oxidase म्यूटेंट) (चित्रा 3), तो सभी गुणसूत्रों टी की एक प्रति शामिल करना चाहिए वह / sacB कैसेट डाला अनुक्रम, के रूप में पीसीआर के माध्यम से निर्धारित NPT1। जीन गैर जरूरी हैं और म्यूटेंट 20-40 μmol फोटॉनों मीटर की निरंतर प्रकाश के तहत एक धीमी गति से विकास phenotype -2 सेकंड -1 (जैसे phycobilisome घास-स्मिथ एट अल। में कमी म्यूटेंट, 2014 13) (चित्रा 3), तो दिखाना है तो केनामाइसिन का धीरे-धीरे वृद्धि की मात्रा के साथ BG11 अगर प्लेटों पर फिर से streaking के कई दौर के क्रम में एक अलग चिह्नित उत्परिवर्ती प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। यह एक ताजा BG11 प्लस केनामाइसिन अगर प्लेट पर फिर से परेशान किया जाना चाहिए कि यह सुनिश्चित करने अलगाव पूरा हो गया है एक बार एक अलग उत्परिवर्ती प्राप्त की है। Streaking के बार-बार चक्कर लगाने एक अलग उत्परिवर्ती चिह्नित में परिणाम नहीं है तो जीन की संभावना अस्तित्व के लिए आवश्यक है। चित्रा 4 प्रयोगात्मक अगोचर उत्परिवर्ती पीढ़ी में शामिल कदम की एक रूपरेखा देता है।
/54001/54001fig3highres.jpg "चौड़ाई =" 700 "/>
चित्रा 3:। Synechocystis म्यूटेंट के विकास म्यूटेंट के उदाहरण जो (ए) जंगली प्रकार और (बी) जंगली प्रकार की तुलना में धीमी वृद्धि के समान विकास का प्रदर्शन। ΔCOX उत्परिवर्ती जीन CtaC1D1E1 का विलोपन के कारण साइटोक्रोम oxidase का अभाव है। ΔCyd उत्परिवर्ती जीन CydAB का विलोपन के कारण quinol oxidase का अभाव है। जैतून उत्परिवर्ती जीन CpcABC1C2D का विलोपन के कारण phycobilisome के एक हिस्से का अभाव है। (बी) में नमूने विकास की सुविधा के लिए हवा के साथ bubbled थे। । Lea स्मिथ एट अल में प्रकाशित आंकड़ों से reproduced, 2013 में 14 और 2014 13 (www.plantphysiol.org; संयंत्र जीव के कॉपीराइट अमेरिकन सोसायटी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
जैसे चित्रा 2 arked। एक जीन कैसेट गुणसूत्र तो आम तौर पर केनामाइसिन की एक उच्च अनुपात प्रतिरोधी और सुक्रोज प्रतिरोधी कालोनियों मनाया जाता है में डाला जा रहा है। इन म्यूटेंट sacB जीन में उत्परिवर्तन के कारण सुक्रोज पर विकसित कर सकते हैं। कोई केनामाइसिन संवेदनशील और सुक्रोज प्रतिरोधी कालोनियों तब उत्पन्न कर रहे हैं, तो जीन कैसेट सेल के लिए हानिकारक है।
चित्रा 4: Synechocystis में चिह्नित और अगोचर म्यूटेंट की पीढ़ी योजनाबद्ध ब्यौरा (ए) पुनर्संयोजन और (बी) प्रयोगात्मक उत्परिवर्ती पीढ़ी में शामिल कदम।। प्लाज्मिड पहले कोशिकाओं के साथ मिलाया जाता है। केनामाइसिन युक्त अगर प्लेटें, कालोनियों, जिसमें एक पुनर्संयोजन घटना के बीच 5 'एक होता है पर बाद ऊष्मायनडी 3 'flanking क्षेत्रों (क्रमश: नीले और लाल रंग में संकेत दिया) और गुणसूत्र में मुताबिक़ अनुक्रम, अलग कर रहे हैं। इसके अलावा, 5 'और' 3 flanking क्षेत्रों के बीच NPT1 / sacB कैसेट गुणसूत्र में डाला जाता है। अलगाव के बाद एक उल्लेखनीय उत्परिवर्ती उत्पन्न होता है। चिह्नित उत्परिवर्ती कोशिकाओं तो प्लाज्मिड बी के साथ मिश्रित कर रहे हैं जो या तो (सी) 1 शामिल कर सकते हैं: 5 'और' 3 flanking क्षेत्रों; 2: 5 'और 3' एक अभिव्यक्ति इन दृश्यों के बीच डाला ब्याज की जीन से युक्त कैसेट के साथ क्षेत्रों flanking; 3: 5 'और 3' इन दृश्यों के बीच डाला वांछित न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन के साथ जंगली प्रकार के अनुक्रम के साथ क्षेत्रों flanking। एक दूसरा मुताबिक़ पुनर्संयोजन घटना, 5 'और' 3 flanking क्षेत्रों और गुणसूत्र में मुताबिक़ क्षेत्रों के बीच होता है NPT1 / sacB कैसेट के हटाने और या तो अगोचर पीटकर या एक प्रविष्टि के साथ एक उत्परिवर्ती या बदल जंगली typ में जिसके परिणामस्वरूपई क्षेत्र गुणसूत्र में पेश किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| स्टॉक समाधान व्यंजनों | |
| रासायनिक | राशि (छ) |
| 100x BG11 (प्रति एल) | |
| नैनो 3 | 149.6 |
| MgSO 4 .7H 2 ओ | 7.49 |
| 2 CaCl .2H 2 ओ | 3.6 |
| साइट्रिक एसिड | 0.6 |
| जोड़े 1.12 मिलीलीटर 0.25 एम ना 2 EDTA, 8.0 पीएच | |
| 0.25 एम ना 2 EDTA, पीएच 8.0 (100 मिलीलीटर प्रति) | |
| ना 2 | 9.3 |
| तत्वों का पता लगाने (100 मिलीलीटर प्रति) | |
| एच 3 बो 3 | 0.286 |
| MnCl 2 .4H 2 ओ | 0.181 |
| ZnSO 4 .7H 2 ओ | 0.022 |
| ना 2 Moo 4 .2H 2 ओ | 0.039 |
| CuSO 4 .5H 2 ओ | 0.008 |
| सह (सं 3) 2 .6H 2 ओ | 0.005 |
| आयरन शेयर (100 मिलीलीटर प्रति) | |
| फेरिक अमोनियम साइट्रेट | 1.11 |
| फॉस्फेट शेयर (100 मिलीलीटर प्रति) | |
| कश्मीर 2 4 HPO | 3.05 |
| ना 2 सीओ 3 शेयर (100 मिलीलीटर प्रति) | |
| ना 2 3 सीओ | 2 |
| टीईएस बफर, पीएच 8.2 (100 मिलीलीटर प्रति) | |
| टीईएस | 22.9 |
| 3 NaHCO शेयर (100 मिलीलीटर प्रति) | |
| 3 NaHCO | 8.4 |
| HEPES, पीएच 8.2 (500 मिलीलीटर प्रति) | |
| HEPES | 119.15 |
| विटामिन बी 12 (50 मिलीलीटर प्रति) | |
| Cyanocobalamin | 0.02 |
| Luria Bertani मीडिया (500 मिलीलीटर प्रति) | |
| Luria Bertani शोरबा | 12.5 |
| 1 एम 2 MgCl (100 मिलीलीटर प्रति) | |
| 2 MgCl .6H 2 ओ | 20.33 |
| MnCl 2 .4H 2 ओ | 0.395 |
| 2 CaCl .2H 2 ओ | 1.47 |
| 2- (एन -Morpholino) ethanesulfonic एसिड हाइड्रेट, 4-Morpholineethanesulfonic एसिड (एमईएस) | 0.4265 |
| समाधान A + ग्लिसरॉल | |
| 10 मिलीलीटर समाधान एक | |
| 1.5 मिलीलीटर ग्लिसरॉल |
तालिका 1: इस अध्ययन में इस्तेमाल समाधान।
| भजन की पुस्तक | अनुक्रम |
| cpcC1C2leftfor | GTAC TCTAGA GCGGCTAAATGCTACGAC |
| CPCC1C2leftrev | GATC GGATCC GCGGTAATTGTTCCCTTTGA |
| cpcC1C2rightfor | GATC GAGCTC TGCACTGGTCAGTCGTTC |
| cpcC1C2rightrev | GACT GAATTC ATCGTTGCTTGAACGGTCTC |
| M13 आगे | TGTAAAACGACGGCCAGT |
| M13 रिवर्स | CAGGAAACAGCTATGAC |
| cpcC1C2for | GTTTTCATTGGCATCGGTCT |
| cpcC1C2rev | ATGTCCCAGGAACGACTGAC |
| A1173for | AGCAAACCGTTTTTGTGACC |
| A1173rev | TGCAAGGTGGCGAACTGTAT |
तालिका 2:। इस अध्ययन प्रतिबंध endonuclease साइटों में इस्तेमाल किया प्राइमर रेखांकित कर रहे हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
अगोचर म्यूटेंट की पीढ़ी में सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: 1) यह सुनिश्चित करने के लिए सावधान प्लाज्मिड डिजाइन केवल लक्षित क्षेत्र बदल दिया है; 2) यह सुनिश्चित करना कि नमूने सुक्रोज पर, axenic रहने खासकर जब सुसंस्कृत; 3) चढ़ाना शुरू में BG11 अगर एंटीबायोटिक दवाओं, अगर प्लस एंटीबायोटिक दवाओं के 24 घंटा बाद में के अलावा द्वारा पीछा कमी प्लेटों पर बदल चिह्नित उत्परिवर्ती पीढ़ी के लिए कोशिकाओं; 4) संवर्धन BG11 प्लस सुक्रोज अगर प्लेटों पर चढ़ाना करने से पहले 4 दिनों के लिए पूर्ण म्यूटेंट चिह्नित: 5) सुनिश्चित करना है कि चिह्नित म्यूटेंट पूरी तरह से अलग हैं और 6) को अच्छी तरह से उत्परिवर्ती उपभेदों के जीनोटाइप की पुष्टि। इस अंतिम चरण के लिए, अतिरिक्त नष्ट कर क्षेत्र का हिस्सा बढ़ाना करने के लिए डिजाइन प्राइमरों, यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह हटा दिया गया है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दक्षिणी सोख्ता, जबकि श्रमसाध्य, का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, हमारा अनुभव है कि प्रक्रिया इस पत्र में उल्लिखित म्यूटेंट के उचित सत्यापन के लिए पर्याप्त है। यह प्रक्रिया भी Synechococ में उल्लेखनीय म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैग्राहकों elongatus PCC7942। हालांकि, इस साइनोबैक्टीरीयम के बार-बार परिवर्तन चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है।
चिह्नित म्यूटेंट तो अलग पर्यावरण की स्थिति अलग नहीं किया जा सकता है, तो उच्च सीओ 2, कम रोशनी (<20 μmol फोटॉनों एम -2 सेकंड -1) या अतिरिक्त पोषक तत्वों (यानी ग्लूकोज) का परीक्षण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ग्लूकोज के अलावा के आदेश photosystem द्वितीय म्यूटेंट 21 उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है। चिह्नित म्यूटेंट पूरी तरह से अलग तो कभी नहीं तो जीन शायद व्यवहार्यता के लिए आवश्यक है। हालांकि, वहाँ साहित्य जहां कुछ अनुसंधान समूहों को एक जीन पीटा करने में असमर्थ है से उदाहरण हैं (उदाहरण के लिए, Synechocystis में Vipp), 22, के लिए ही अन्य समूहों बाद में पता चलता है कि जीन आवश्यक 23 नहीं है। इस प्रकार के जंगली उपभेदों या गलत प्लाज्मिड डिजाइन में मतभेद के कारण हो सकता है, आसन्न, आवश्यक जीन पर ध्रुवीय प्रभाव में जिसके परिणामस्वरूप। एक उत्परिवर्ती पूरी तरह से नहीं करता हैअलग हम सुझाव है कि प्लाज्मिड छोड़ दिया और सही टुकड़े के बीच pUC18K 20 से NPT1 कैसेट युक्त परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। यह जंगली प्रकार और पीसीआर द्वारा उत्परिवर्ती करने के लिए इसी बैंड की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए आसान है, के बाद से इस टुकड़ा 3.8 केबी NPT1 / sacB कैसेट की तुलना में लगभग 1.2 केबी है। इस परिणाम के सबूत प्रदर्शन है कि जीन आवश्यक है का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है।
डाला अभिव्यक्ति कैसेट के साथ अगोचर म्यूटेंट की पीढ़ी पीटकर नस्लों के विकास की तुलना में आम तौर पर अधिक चुनौतीपूर्ण है। हम आम तौर पर मजबूत cpcBAC1C2D प्रमोटर 13 के नियंत्रण में जीन व्यक्त करते हैं। कुछ मामलों में इस जीन कैसेट के सफल प्रविष्टि की संभावना कम हो सकती है, अधिक अभिव्यक्ति एक प्रोटीन की अगर सेल के लिए हानिकारक है। कमजोर प्रमोटरों तो परीक्षण किया जाना चाहिए। सामान्य में हमने देखा है कि बड़े जीन कैसेट है, और अधिक मुश्किल यह करने के लिए हैजीनोम में यह Sert। हम जीन कैसेट 5 KB से बड़े डालने में सक्षम नहीं किया गया है। देखभाल भी जीनोम में अभिव्यक्ति कैसेट डालने के लिए साइटों के चयन में लिया जाना चाहिए। तटस्थ साइटों है कि सेल व्यवहार्यता या विकास को प्रभावित नहीं करते इस्तेमाल किया जाना चाहिए। Synechocystis में उदाहरण phaAB और phaCE, जो प्रोटीन polyhydroxybutyrate biosynthetic मार्ग 24,25 एन्कोडिंग सांकेतिक शब्दों में बदलना शामिल हैं। अभी हाल ही में Synechocystis में तटस्थ साइटों की एक व्यापक सूची 26 की पहचान की जा चुकी है।
cyanobacteria में अगोचर म्यूटेंट की पीढ़ी एक धीमी प्रक्रिया है, लगभग 5-7 सप्ताह लेने अगर सब ठीक से कदम का आयोजन कर रहे है। इस cyanobacteria की जांच कर अनुसंधान समूहों के बहुमत द्वारा उपयोग उल्लेखनीय नॉकआउट पैदा करने का मानक पद्धति की तुलना में धीमी है। हालांकि, आंशिक रूप से अगोचर म्यूटेंट में आगे म्यूटेशन को पेश करने में सक्षम होने के लचीलेपन इस क्षतिपूर्ति के लिए, अतिरिक्त प्लास्मिड के बाद शेष भागप्रदान विभिन्न एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोध कैसेट की एक सीमा aining, निर्माण किया जा करने के लिए नहीं है। अनुसंधान प्रयोजनों के लिए कई जीन रूप बदलना करने की क्षमता पूरी तरह से प्रोटीन के कार्यात्मक भूमिका को चिह्नित करने में कभी कभी आवश्यक है। उदाहरण के लिए, हम केवल thylakoid झिल्ली के लिए स्थानीय दो टर्मिनल oxidase इलेक्ट्रॉन डूब का विलोपन पर एक हानिकारक phenotype की पहचान के बाद से इन परिसरों का केवल एक की हानि अन्य 14 की गतिविधि के लिए मुआवजा किया जा सकता है। औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए एक तनाव का विकास भी न सिर्फ विदेशी जीन की शुरूआत के लिए, लेकिन यह भी वांछित सब्सट्रेट के लिए संश्लेषक दक्षता, प्रकाश कटाई अनुकूलन और प्रतिस्पर्धा रास्ते का विलोपन बढ़ाने के लिए, एक तनाव के लिए कई संशोधनों की आवश्यकता होगी।
प्रमुख कारक अगोचर उत्परिवर्ती पीढ़ी की गति को सीमित रोशनी की स्थिति पर निर्भर करता है 8-20 मानव संसाधन के बीच, मॉडल cyanobacterial प्रजातियों की धीमी गति से विभाजन का समय है। संयुक्त राष्ट्रउच्च प्रकाश तीव्रता और सीओ 2 सांद्रता der, विकास तेजी से होता है। हालांकि, वहाँ एक जोखिम है कि उत्परिवर्ती उपभेदों जो बर्दाश्त नहीं कर सकते हैं या तो उच्च प्रकाश या सीओ 2 के खिलाफ चयन किया जाएगा, या कि उत्परिवर्ती उपभेदों प्ररूपी लक्षण वर्णन करने से पहले अवांछनीय परिवर्तन से गुजरना होगा। इसलिए इस सिफारिश नहीं है। हालांकि, यह अत्यधिक लाभप्रद हो सकता है अगर अगोचर म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए एक और अधिक तेजी प्रोटोकॉल विकसित किया गया था होगा। कुल मिलाकर, यह दोनों बुनियादी अनुसंधान और लागू अनुप्रयोगों के लिए नस्लों के विकास की सुविधा होगी। इस तरह उपभेदों जैव ईंधन, बायोमास या रासायनिक उत्पादन के लिए या cyanobacterial जैव रसायन, आनुवंशिकी और शरीर विज्ञान के कई पहलुओं को समझने में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
हम पर्यावरण सेवा संघ एजुकेशन ट्रस्ट, कैम्ब्रिज SynBio फंड में सिंथेटिक जीव विज्ञान और सामाजिक न्याय और अधिकारिता मंत्रालय, भारत सरकार के मंत्रालय, वित्तीय समर्थन के लिए आभारी हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaNO3 | Sigma | S5506 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | 230391 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| citric acid | Sigma | C0759 | |
| Na2EDTA | Fisher | EDT002 | |
| H3BO3 | Sigma | 339067 | |
| MnCl2.4H2O | Sigma | M3634 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma | Z4750 | |
| Na2MoO4.2H2O | Sigma | 331058 | |
| CuSO4.5H2O | Sigma | 209198 | |
| Co(NO3)2.6H2O | Sigma | 239267 | |
| Ferric ammonium citrate | Sigma | F5879 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| Na2CO3 | Fisher | SODC001 | |
| TES | Sigma | T1375 | |
| NaHCO3 | Fisher | SODH001 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| cyanocobalamin | Sigma | 47869 | |
| Na2S2O3 | Sigma | 72049 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Sucrose | Fisher | SUC001 | |
| Petri dish 90 mm triple vented | Greiner | 633185 | |
| 0.2 µm filters | Sartorius | 16534 | |
| 100 ml conical flasks | Pyrex | CON004 | |
| Parafilm M 100 mm x 38 m | Bemis | FIL003 | |
| Phusion high fidelity DNA polymerase | Phusion | F-530 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| DNA purification kit | MoBio | 12100-300 | |
| Restriction endonucleases | NEB | ||
| T4 ligase | Thermo Scientific | EL0011 | |
| Luria Bertani broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| MES | Sigma | M8250 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma | 60615 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| GeneJET plasmid miniprep kit | Thermo Scientific | K0503 | |
| 14 ml round-bottom tube | BD falcon | 352059 | |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| 425-600 µm glass beads | Sigma | G8772 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Fluorescent bulbs | Gro-Lux | 69 | |
| HT multitron photobioreactor | Infors |
References
- Zwirglmaier, K., et al. Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes. Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).
- Galloway, J. N., et al. Nitrogen cycles: past, present, and future. Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).
- Lea-Smith, D. J., et al. Contribution of cyanobacterial alkane production to the ocean hydrocarbon cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2015).
- Howe, C. J., Barbrook, A. C., Nisbet, R. E. R., Lockhart, P. J., Larkum, A. W. D. The origin of plastids. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 2675-2685 (2008).
- Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- McCormick, A. J., et al. Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system. Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).
- Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems. Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).
- Ducat, D. C., Way, J. C., Silver, P. A. Engineering cyanobacteria to generate high-value products. Trends Biotechnol. 29, 95-103 (2011).
- Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels. Curr Opin Biotechnol. 19, 235-240 (2008).
- Tan, L. T. Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery. Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).
- Volk, R. B., Furkert, F. H. Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth. Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).
- Scott, S. A., et al. Biodiesel from algae: challenges and prospects. Curr Opin Biotechnol. 21, 277-286 (2010).
- Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity. Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).
- Lea-Smith, D. J., et al. Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities. Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).
- Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. 3rd Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).
- Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 - Consequences for pigment biosynthesis and accumulation. J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).
- Castenholz, R. W. Culturing methods for Cyanobacteria. Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).
- Mitschke, J., et al. An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).
- Ried, J. L., Collmer, A. An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis. Gene. 57, 239-246 (1987).
- Vieira, J., Messing, J. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. 19, 259-268 (1982).
- Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).
- Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis? Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).
- Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002. J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).
- Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803. Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).
- Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria. Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).
- Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium. Appl Environ Microbiol. , (2015).
