Protocol
Declaração de Ética: Os protocolos para lidar com os animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care Vanderbilt e Comitê de Uso (IACUC, protocolos número M / 10/117 (suína) e M / 10/219 (ratos) e conduzida de acordo com padrões AAALAC-internacionais. o uso de tecidos cardíacos humano de banco foi aprovado pela Vanderbilt University Medical Center IRB (protocolo número 100.887).
1. Amostra Coleta e Armazenamento
- Adicione fresco de glutaraldeido a 4% em solução tampão de fosfato 0,1 M (PB).
CUIDADO: O glutaraldeído é tóxico, usar luvas e trabalhar em um exaustor.- Adicione uma solução de estoque 0,2 M de PB, pH 7,4 utilizando 21,8 g de Na 2 HPO 4 e 6,4 g de NaH 2 PO 4. Quantum satis (Qs) a 1000 ml de dH 2 O.
- Adicionar 400 ul de 50% de glutaraldeído e 2,5 ml da solução de PB e 2,1 ml de dH 2 O.
- Mergulhe um pedaço (não maior que 2 cm 2) de tecido em solução de glutaraldeido a 4%. Nota: pedaços menores também podem ser usados mas deve ser de tamanho suficiente (não menor do que 5 mm 2) para ser facilmente visualizada por olho, a fim de facilitar as etapas posteriores do protocolo.
- Incubar à temperatura ambiente durante 1 h, em seguida, armazenar indefinidamente a 4 ° C.
2. Decelularização of Heart Tissue
- Adicione uma solução aquosa a 10% de NaOH fresco utilizando 10 g de pastilhas de NaOH / 100 ml de dH 2 O.
CUIDADO: soluções de NaOH são corrosivos e podem causar alcalinos-queimaduras, usar luvas. - Lavar o tecido em dH 2 O.
- Incubar em solução de NaOH a 10% à temperatura ambiente durante 6 - 10 dias (até que as mudanças de tecido de castanho-avermelhado para fora-branco ou branco).
- Enxágüe em dH2O até que o tecido torna-se transparente.
- Imergir tecido em ácido tânico 1% durante 4 horas à temperatura ambiente. Use solução de 1 ml de 5% por 4 ml de dH 2 O.
CUIDADO: O ácido tânicoé um irritante forte, usar luvas. - Enxágüe em dH2O durante a noite.
3. Osmication e desidratação do coração Tissue (em Fume Hood Segurança)
- Adicione uma solução de estoque 0,2 M de tampão de cacodilato de sódio utilizando 21,4 g de cacodilato de sódio, 10,0 g de cloreto de cálcio e 450 ml de dH 2 O. Mistura, em seguida, adiciona-se ácido clorídrico como necessário para ajustar o pH para 7,4. Qs para 500 mL com dH2O
CUIDADO: cacodilato de sódio e ácido clorídrico são tóxicos, usar luvas e trabalhar em um exaustor. - Adicione solução estoque aquoso a 2% de tetróxido de ósmio no exaustor de fumos para a segurança através da dissolução de 1 g de tetróxido de ósmio cristal em 50 ml dH2O
CUIDADO: tetróxido de ósmio é um perigo por inalação grave; fixação de vapor de membranas mucosas ou olhos é possível, portanto, lidar apenas no exaustor com luvas. A proteção contra respingos é recomendado. - Lavar o tecido em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M (solução estoque mistura 1: 1 com dH
- Repita o passo anterior por duas vezes, para um total de três lavagens de buffer.
- Imergir tecido em 1% de tetróxido de ósmio em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M (mistura de cacodilato de sódio e da lingua de tetróxido de ósmio 1: 1) em rotador durante 1 h.
- Lavar o tecido em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M, 3 vezes durante 5 min cada em rotador.
- Lavar o tecido utilizando concentrações crescentes de etanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, e, finalmente, 100%) durante 15 min cada em rotador.
4. Preparação de Superfície Corte Transversal para SEM
- Transferir o tecido em etanol a 100% a um prato raso de Petri contendo também 100% de etanol.
- Segurar duas lâminas muito afiadas de tal modo que os planos dos lados estão em contacto uma com a outra e as arestas de corte transversal de modo a formar dois lados de um triângulo equilátero de cima do espécime. Para conseguir isso, usar a mão esquerda para colocar um pino no lado mais à direita da amostra ecorte para a esquerda. Ao mesmo tempo, usar a mão direita para colocar a segunda lâmina na extrema esquerda da amostra e fatia direita. Assim, as pás irão deslizar uma contra a outra a partir de direcções opostas para fazer um único corte liso.
- Deslize os lados lâmina plana umas contra as outras para fazer um corte muito limpo do espécime com a mínima distorção ou rasgar força, de preferência tão grande expondo uma área de superfície possível, sem danificar a amostra.
- Repita o procedimento para cada espécime para expor as mais limpas possíveis superfícies de seção transversal para exame na SEM.
5. Pontos Críticos de secagem (CPD) do Coração Tissue
- Usar uma espátula ou uma pinça para transferir o tecido para o suporte de amostras do secador de ponto crítico (CPD), assegurando que o tecido permanece em etanol a 100% em todos os momentos. Certifique-se de que o suporte é imerso em etanol e de que a transferência é conseguido com o tecido exposto ao ar durante não mais do que alguns segundos.
- Operar CPD por nósmanual do er para completar 3 purga-e-fill ciclos para substituir o etanol com dióxido de carbono líquido.
- Operar CPD per manual do usuário para alcançar a secagem ponto crítico das amostras e devolvê-los à pressão atmosférica com ventilação controlada de CO 2.
6. Montagem de Amostras coração de tecido para SEM
- Prepara-se uma amostra de topo SEM para cada espécime, aderindo uma aba adesiva de carbono para a superfície de topo do topo de alumínio.
- Com o auxílio de um microscópio estereoscópico, o espécime cuidadosamente aderir à aba adesiva com a superfície de secção transversal de interesse virado para cima (afastado do separador, visível), e tão perto quanto possível em paralelo com o plano da superfície da amostra topo. Não sondar ou toque na superfície de interesse.
- Quebrar uma vara aplicador de madeira para alcançar uma escova cônico, ideal para aplicação da tinta. Aplicar prata ou tinta de carbono na base e os lados do espécime, para melhorar a adesão ao topo.
- Estender uma linha muito fina de prata ou de carbono pintar-se a uma aresta da superfície de interesse, para fornecer um caminho de carga a partir da superfície de interesse para o solo.
- Aplicar 2 ou 3 pequenas salpicos de tinta de prata ou de carbono em torno do perímetro da guia de carbono, para proporcionar um caminho condutor da superfície de guia de carbono para o topo de metal e, assim, para o solo.
- Permite que a tinta condutora de secar durante duas horas.
- Operar revestidor por crepitação per manual do usuário para aplicar um revestimento relativamente pesado (intervalo alvo de 30 - 40 nm) de liga de ouro-paládio ou ouro. Bombear câmara de amostra para aproximadamente 0,1 mbar; definido Temporizador de 40 segundos. Abrir Set válvula para a posição 08:00 (fluxo moderado de gás argônio). Press Start para iniciar revestimento por pulverização em 30 mA. descarga luminescente roxo deve ser visível na câmara de amostra.
7. SEM análise de amostras do tecido cardíaco
- Execute microscopia eletrônica de varredura na relativamente baixa tensão de aceleração para minimizar a imagem pROBLEMAS associados à má dissipação da carga na amostra (carga). condição de imagem inicial sugerida são: 5 kV tensão de aceleração, distância de trabalho de 10 mm.
- Com a ajuda de um operador experiente, empregam aumento da distância trabalhando para estender a profundidade de campo em condições de imagens que requerem foco de fibras em vários planos focais, ou fibras que se estendem para o comprimento considerável na dimensão z.
- Para o microscópio usado aqui (ver Tabela de Materiais), no acesso à interface de usuário na guia de navegação na parte superior direita.
- Acesse a aba coordenadas a partir do menu Stage. Para aumentar a distância de trabalho, digite um valor maior em milímetros para a coordenada Z, em seguida, clique no Go To Tab para mover o estágio da amostra à distância de trabalho entrou.
- Com a ajuda de um operador experiente, empregam espécime inclinação e rotação para posicionar a superfície de interesse ortogonal em relação ao feixe de electrões. inclinação adicional de 10 a 30 DEGRees a partir desta posição pode melhorar a observação e documentação da estrutura da matriz.
- Para o microscópio usado aqui (ver Tabela de Materiais), na interface do usuário, clique e segure o botão direito do mouse, em seguida, deslize para a esquerda ou para a direita para focar a amostra perto da periferia do avião superfície preparada de interesse, notando a distância de trabalho focado .
- Navegar com o Manual joystick User Interface para mover perto da borda oposta do foco de superfície e de repetição. Se a distância de trabalho não é aproximadamente igual à primeira posição, espécime inclinação para alcançar um acordo aproximado em ambos os locais usando a guia Coordenadas do menu Stage (ver 7.2) e digite um valor de inclinação na T coordenadas.
- Gire espécime noventa graus (inserir o valor em R campo de coordenadas) e repita o processo até que todas as posições estão focados em aproximadamente a mesma distância de trabalho.
Nota: SEM de pressão variável pode ser empregue para melhorar a dissipação de cargasse disponível. Alto vácuo é o modo de operação padrão para microscopia eletrônica de varredura.
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Representative Results
A técnica realçada foi aplicada aos tecidos cardíacos de um doador de transplante de coração humano não utilizado (Figura 1), tecidos explantados de pacientes receptores de transplante, corações de tipo selvagem e ratinhos distróficos (Figura 3), e em amostras de coração pós-enfarte do miocárdio de um suíno modelo de lesão cardíaca (Figura 2). Como mostrado na Figura 1, a matriz cardíaco humano é um complexo de proteínas de tecelagem reticulados que exibem um padrão de favo de mel, quando vistos em secção transversal. Cada estrutura "favo de mel" é de aproximadamente 40 m de largura, normalmente contornar um único miócitos, ao considerar o ponto de vista planar na Figura 1. Quando conectado por discos intercalados, vários cardiomiócitos pode ser concebido como uma haste correndo longitudinalmente através do "túnel" quando a metáfora estende-se a tridimensionalidade. a Figura 1 também destaquesa importância do processo de corte, com maior precisão dando origem a dados topográficos mais revelador (Figura 1, parte superior esquerda) de secções que são "esmagado" durante o processo de corte (Figura 1, parte superior direita).
A remoção de células residentes cardíacas, vasos sanguíneos e células circulatórias anteriores à transformação SEM revela detalhes ultra-estruturais adicionais que seriam menos sensível por SEM de blocos de tecido cardíaco inteiras. Cada "suporte" indivíduo colagenosa, por exemplo (figura 1, painéis inferiores) é aparentemente alinhados em intervalos regulares e perpendicular ao sarcómeros miofibrilar. Este arranjo é adequado para ajudar a manter a estrutura do coração por deformações contra-agir exercidas durante os ciclos de contração e relaxamento, semelhante à "urdidura e trama" de têxteis que ajuda a manter o corpo de tecido e forma contra o alongamento.
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Figura 1:. Representativos micrografias de exploração electrónica da disposição tridimensional da matriz extracelular em descelularizado Ventricular Esquerda tecido obtido a partir de um doador coração humano não utilizado Os dois painéis superiores mostram a matriz em secção transversal a baixa ampliação (barras = 500 mm), proporcionando uma vista aérea da arquitetura do tecido do coração humano normal. Na maior ampliação, pode-se observar melhor a estrutura típica de favo de mel de fibras de suporte que fornecem suporte mecânico para miofibras regularmente espaçadas (barras de painel esquerdo e direito médio = 100 uM e 50 uM, respectivamente). Após a inspecção mais próximo, cada «favo de mel» é composta por fibras que são organizados em paralelo um com o outro enquanto perpendicular ao cardiomiócitos residentes (barras a parte inferior do painel de esquerda e direita = 10 um e 5 uM, respectivamente).ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54005/54005fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Além de fornecer informações estruturais, SEM dos tecidos descelularizados pode permitir uma avaliação significativa, qualitativa das alterações da matriz extracelular em resposta a lesão ou formas não prejudiciais da cardiomiopatia. Por exemplo, esta técnica foi recentemente utilizado para examinar as matrizes extracelulares de tecidos cardíacos suína pós-infartados 43. Durante o decurso desta experiência de larga animal, especificamente concebido para avaliar a eficácia da isoforma GGF2 de NRG-1β como um agente terapêutico potencial para a insuficiência cardíaca, suína pós-enfartada que receberam a administração NRG-1β intravenosa exibiram marcante alterações na matriz cardíaca , em comparação com tecidos cardíacos não tratados de animais pós-infartados. Estes resultados foram posteriormente publicados 43, e technique manteve-se uma ferramenta valiosa para construir sobre esta descoberta inicial, serendipitous. Figura 2 inclui exemplos de micrografias, produzidos durante o curso do estudo, que destacam diferenças de matriz drásticas entre matrizes tratadas com NRG-1β não tratada e.
Figura 2:. Representativos micrografias de exploração electrónica de Ventricular Esquerda Matriz Extracelular em não tratados e NRG-1 β Pigs tenha sido tratada com, depois de NaOH maceração A matriz em secção transversal destaca o arranjo espacial regular de fibras no pós-enfarte do miocárdio sem tratamento (pós-MI) suínos (canto superior esquerdo), em comparação com animais de pós-MI tratados-NRG-1β (canto superior direito). Quando visto em longitude, a matriz em suínos não tratada apresenta um aspecto de espessura, como mate-(inferior esquerdo), enquanto que a matriz de NRG-tratadas-1p porcosexibe arranjo espacial regular de fibras (canto inferior direito). Branco bar = 40 mm (todas as quatro painéis). Resultados mais detalhados e figuras estão incluídas no manuscrito associada 43. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Exploração de mudanças da matriz que ocorrem nos corações distróficos também produziu percepções qualitativas sobre a progressão e desenvolvimento de um modelo animal de Duchenne cardiomiopatia distrofia muscular de Duchenne (DMD). Em camundongos mdx, um modelo de rato comumente usado de DMD, existem diferenças significativas e dependentes da idade entre os do tipo selvagem e corações MDX quando vistos por SEM após a fixação e tratamento NaOH. Como mostrado na Figura 3, os componentes da matriz eram relativamente normal em seis semanas de idade mdx corações que não produzem distrofina funcional em relação a ratinhos normais. mais interesting, a organização matriz extracelular foi claramente interrompida ou talvez degradada em camundongos distrofina-deficientes idosos em comparação com camundongos mdx mais jovens, ilustrando a natureza progressiva da DMD no coração. Tais diferenças profundas não eram esperados, porque os ratos mdx são mal representante de cardiomiopatia DMD humana devido ao facto de que elas exibem um fenótipo cardiomiopatia muito mais suave e taxa de mortalidade mais lenta do que os humanos com DMD 48. Isto sugere que, mesmo pequenas alterações no funcionamento do coração pode ser capturado utilizando a técnica de visualização apresentado neste trabalho. Esta metodologia também deve ser facilmente adaptável às matrizes extracelulares de outros órgãos, para a qual também não existem actualmente disponíveis terapias-alvo fibrose.
Figura 3: Representante micrografias de exploração electrónica de Esquerda VenMatriz Extracelular ventricular no tipo selvagem, face a ratinhos mdx. A matriz do ventrículo esquerdo cardíaco em ratinhos de tipo selvagem (painel superior) é semelhante à observada em outras espécies. A matriz em ratinhos mdx com 6 semanas de idade parece relativamente normal, embora ligeiramente "macio" na aparência (painel do meio). Por outro lado, a matriz cardíaca de ratinhos mdx aparece mais velhos severamente degenerado (painel inferior), indicando que o processo pode ser qualitativamente distrófica capturado utilizando SEM, em tecidos de NaOH maceradas fixos. Branco bar = 10 mm (todos os três painéis). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
preparação seção superfície Cruz é o passo mais crítico durante o protocolo. Para preservar a estrutura fina, as amostras desidratadas devem permanecer em etanol 100% em todos os momentos, até introduzido para o processo de secagem de ponto crítico. Portanto, o corte dos espécimes para alcançar superfícies para exame EM deve ser feito enquanto espécimes estão submersos em etanol em um prato raso. É também fundamental que a superfície exposta não é tocado ou sondado durante o manuseamento subsequente. Sem grandes modificações estão previstos para aplicação desta técnica a outros tipos de tecidos para observações matriz semelhante, embora a porção SEM do protocolo pode exigir solução de problemas básicos de microscopia eletrônica, independentemente da origem da amostra. Imagens recolhidas a partir das amostras fibrosos são propensos a artefatos introduzidas pela dissipação pobres carga ( "carregar"). problemas de carregamento geralmente pode ser minimizado através da redução tensão de aceleração, aumentando a velocidade de digitalização (também chamado tempo de permanência) E reduzindo o tamanho do ponto do feixe de electrões. Integração de várias varreduras recolhidos com rapidez suficiente para evitar artefatos de carga irá produzir uma imagem de sinal comparável à qualidade de ruído sem os artefatos de carga presentes em uma imagem mais lento, de maior qualidade única varredura.
Esta técnica é inerentemente qualitativa e, portanto, complementa quando consideradas juntamente com medidas quantitativas (por exemplo, Masson ou coloração vermelha picoserius, a medição do teor de hidroxiprolina, espectrometria de massa e RNA-Seq) para averiguar como diferenças estruturais visualizadas pode estar relacionado a vários estados de desenvolvimento ou de doença. No entanto, não obstante esta limitação, o método é significativo para além fibrose cardíaca especificamente, porque a matriz extracelular é um componente essencial de quase todos os órgãos no corpo. No coração, a matriz cardíaca fornece suporte mecânico crítico para o bombeamento contínuo caracterizado pelo complexo esticar, torcer e deformação, que confere entrada ideal e efluxo de sangue oxigenado e desoxigenado 49 para os> 2,5 bilhões de batidas que ocorrem ao longo da vida humana média. Dada a extremamente baixa capacidade de regeneração do tecido cardíaco, uma matriz dinâmica que pode ser remodelado de acordo com as necessidades contextuais faz sentido lógico. Com apenas um ligeiro estiramento da imaginação, pode-se inferir que existem alvos terapêuticos para a manipulação de remodelação da matriz para melhorar o processo de cicatrização, embora limitando a fibrose adverso. Aplicação da técnica demonstrada no mínimo mostra a sofisticação e beleza da matriz cardíaca e ao fazer isso reforça ainda mais a sua importância funcional.
Enquanto o valor das medidas quantitativas é um princípio fundamental para a avaliação de praticamente todos os estudos experimentais, a técnica destacada aqui pode ser usado para revelar variações ultra-estruturais qualitativos que não só complementar as medições de matriz standardmas pode sugerir caminhos de investigação alternativos para compreender as alterações bioquímicas fundamentais que reforçam as mudanças qualitativas. Antecipados futuras aplicações desta técnica são a sua utilização em modelos de doenças cardíacas e tecidos humanos como uma ferramenta complementar para avaliar as alterações da matriz, bem como o uso alargado de modo a estudar outros órgãos para os quais as alterações da matriz são um componente do processo da doença.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Chloride | Electron Microscopy Sciences | 12340 | 100 g |
| Carbon Adhesive | Electron Microscopy Sciences | 12664 | 30 g |
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | order to fit stubs |
| Double Edge Razor Blades Stainless Steel | Ted Pella, Inc | 121-6 | 250/pkg |
| Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15055 | 450 ml |
| Gluteraldehyde, 50% Solution | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, distillation purified |
| Hydrochloric Acid | Electron Microscopy Sciences | 16760 or 16770 | 100 ml |
| Monosodium Phosphate NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9251-250G | 250 g |
| Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | 1 g |
| Silver Conductive Adhesive | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | 15 g |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045-1KG | 1 kg |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264-500G | 500 g |
| Tannic Acid, 5% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 21702-5 | 500 ml |
| Trihydrate Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | 100 g |
| Gold-palladium Alloy or Gold | Refining Systems, Inc. | varies | specific to the sputter coater make and model |
| Critical Point Dryer | Electron Microscopy Sciences | 850 | |
| Plain Wooden Applicators | Fisher Scientific | 23-400-102 | |
| Quanta 250 Environmental SEM | FEI | Q250 SEM | |
| Sputter Coater | Cressington Scientific Instruments Ltd. | Model 108 | |
| Alluminum SEM Sample Stubs | Electron Microscopy Sciences | 75220-12 | specific to the miscroscope |
References
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