Protocol
Etik uttalande: Protokollen för djurhantering godkändes av Vanderbilt Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC, protokoll nummer M / 10/117 (svin) och M / 10/219 (möss) och genomförs i enlighet med AAALAC-internationella standarder. användning av bankas mänskliga hjärtvävnad godkändes av Vanderbilt University Medical Center IRB (protokollnummer 100.887).
1. Provtagning och förvaring
- Göra färsk 4% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert (PB) lösning.
VARNING: Glutaraldehyd är giftigt, handskar och arbeta i ett dragskåp.- Gör en 0,2 M stamlösning av PB, pH 7,4 med 21,8 g Na 2 HPO 4 och 6,4 g NaH 2 PO 4. Quantum satis (Qs) till 1000 ml dH 2 O.
- Tillsätt 400 | il 50% glutaraldehyd till 2,5 ml PB-stamlösning och 2,1 ml dH 2 O.
- Doppa en bit (inte större än 2 cm 2) av vävnad in i glutaraldehydlösningen 4%. Notera: Mindre bitar kan också användas, men bör vara av tillräcklig storlek (inte mindre än 5 mm 2) för att lätt visualiseras genom ögat för att underlätta senare steg i protokollet.
- Inkubera vid rumstemperatur under 1 timme, sedan lagra obegränsad tid vid 4 ° C.
2. decellularisering av hjärtvävnad
- Göra färsk 10% vattenhaltig NaOH-lösning med användning av 10 g NaOH-pellets / 100 ml dH 2 O.
VARNING: NaOH lösningar är frätande och kan orsaka alkali-brännskador, handskar. - Skölj vävnad i dH 2 O.
- Inkubera i 10% NaOH-lösning vid rumstemperatur under 6 - 10 dagar (tills vävnadsförändringar från rödbrun till benvitt eller vit).
- Skölj i dH 2 O tills vävnad blir genomskinlig.
- Fördjupa vävnad i en% garvsyra under 4 h vid rumstemperatur. Använd en ml 5% stamlösning per 4 ml dH 2 O.
VARNING: Garvsyraär en starkt irriterande, handskar. - Skölj i dH 2 O över natten.
3. Osmication och uttorkning av hjärtvävnad (i dragskåp för säkerhet)
- Göra en 0,2 M lagerlösning av natrium-kakodylatbuffert med användning av 21,4 g natriumkakodylat, 10,0 g kalciumklorid och 450 ml dH 2 O. Blanda, tillsätt sedan saltsyra efter behov för att justera pH till 7,4. Qs till 500 ml med dH2O
VARNING: natriumkakodylat och saltsyra är giftiga, handskar och arbeta i ett dragskåp. - Göra 2% vattenförrådslösning av osmiumtetroxid i dragskåp för säkerheten genom att lösa 1 g osmiumtetroxid kristall i 50 ml dH2O
VARNING: Osmiumtetroxid är en allvarlig fara vid inandning; ånga fixering av slemhinnor eller ögonglober är möjligt därför endast hantera i dragskåp med handskar. Stänkskydd rekommenderas. - Skölj vävnad i 0,1 M natriumkakodylatbuffert (blanda förrådslösning 1: 1 med dH
- Upprepa föregående steg två gånger, för totalt tre buffertsköljningar.
- Fördjupa vävnaden i 1% osmiumtetroxid i 0,1 M natriumkakodylatbuffert (blanda lager natriumkakodylat och stock osmiumtetroxid 1: 1) på rotator under 1 timme.
- Skölj vävnad i 0,1 M natriumkakodylatbuffert 3 gånger under 5 min vardera på rotator.
- Skölj vävnaden med användning av ökande koncentrationer av etanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95% och slutligen 100%) under 15 min vardera på rotator.
4. Tvärsnitt Ytpreparering för SEM
- Överföra vävnad i 100% etanol till en ytlig petriskål också innehållande 100% etanol.
- Hålla två mycket skarpa rakblad så att de plana ytorna på sidorna är i kontakt med varandra och skäreggarna kors för att bilda två sidor av en liksidig triangel ovanför provet. För att åstadkomma detta använder vänster hand för att placera ett blad längst till höger sida av provet ochcut åt vänster. Samtidigt använder höger för att placera det andra bladet längst till vänster av provet och skiva åt höger. Således kommer bladen att glida mot varandra från motsatta riktningar för att göra en enda smidigt skär.
- Skjut de flata bladsidorna mot varandra för att göra en mycket ren snitt av provet med minimal distorsion eller riva kraft, företrädesvis utsätta en så stor yta som möjligt utan att skada provet.
- Upprepa för varje prov för att exponera de renaste möjliga tvärsnittsytor för granskning i SEM.
5. kritisk punkt Torkning (CPD) av hjärtvävnad
- Använd en spatel eller pincett för att överföra vävnad till provhållaren av den kritiska punkten tork (CPD), vilket säkerställer att vävnad förblir i 100% etanol vid alla tidpunkter. Se till att innehavaren är nedsänkt i etanol och att överföringen uppnås med vävnaden exponeras för luft under inte mer än några sekunder.
- Driva CPD per osstagarens handbok för att slutföra tre purge-and-fylla cykler för att ersätta etanol med flytande koldioxid.
- Driva CPD per användarmanualen för att uppnå en kritisk punkt torkning av proverna och returnera dem till atmosfärstryck med kontrollerad ventilering av CO2.
6. Montering av hjärta vävnadsprover för SEM
- Förbereda ett SEM prov stub för varje prov, genom att vidhäfta en flik kol vidhäftande till den övre ytan av aluminiumet stöta.
- Med hjälp av ett stereomikroskop, försiktigt följa provet till limfliken med tvärsnitt yta av intresse uppåt (bort från fliken synlig), och så nära som möjligt parallellt med planet för provet påbörjad yta. Inte sond eller röra vid ytan av intresse.
- Bryt en trä applikator pinne för att uppnå en avsmalnande borste, perfekt för färg ansökan. Applicera silver eller kol färg vid basen och sidorna av provet, för att förbättra efterlevnaden av stubben.
- Förlänga en mycket tunn linje av silver eller kol målade upp till en kant av ytan av intresse, för att tillhandahålla en laddningsbana från ytan av intresse till jord.
- Applicera 2 eller 3 små klickar av silver eller kol färg runt omkretsen av fliken kol, för att åstadkomma en ledande bana från fliken kolytan till metallstumpen och därmed till jord.
- Låt ledande färg torka två timmar.
- Driva spotta bestrykare per användarmanualen att tillämpa en relativt tung beläggning (målintervall på 30 - 40 nm) av guld-palladiumlegering eller guld. Pump provkammare till ca 0,1 mbar; ställa in Timer till 40 sek. Öppna Ställ ventilen till 8:00 läge (moderat argongas flöde). Tryck på Start för att initiera sputterbeläggning på 30 mA. Lila glimurladdning ska vara synlig i provkammare.
7. SEM Undersökning av hjärtvävnad Prover
- Utför svepelektronmikroskopi vid relativt låg accelerationsspänning för att minimera avbildning problems samband med dålig laddning avledning i provet (laddning). Föreslagna inledande imaging tillstånd är: 5 kV accelererande spänning, 10 mm arbetsavstånd.
- Med hjälp av en erfaren operatör, ökad anställa arbetsavstånd för att utöka skärpedjupet i avbildnings tillstånd som kräver fokus för fibrer i flera fokalplan eller fibrer som sträcker sig för avsevärd längd i z-dimensionen.
- För mikroskop som används här (se tabell of Materials), i användargränssnittet tillgång tabbnavigeraren uppe till höger.
- Gå till fliken Koordinater från scenen meny. För att öka arbetsavstånd, ange ett större värde i millimeter för Z-koordinaten sedan klicka på Gå till fliken för att flytta provstadiet till det angivna arbetsavstånd.
- Med hjälp av en erfaren operatör, anställa prov lutning och rotation för att placera ytan av intresse vinkelrätt mot elektronstrålen. Ytterligare lutning 10-30 degrställda från denna position kan förbättra observation och dokumentation av matrisstrukturen.
- För mikroskop som används här (se tabell of Materials), i användargränssnittet, klicka och håll höger musknapp, sedan fingret åt vänster eller höger för att fokusera provet i närheten av periferin av den preparerade ytan planet intresse, notera fokuserade arbetsavståndet .
- Navigera med den manuella användargränssnitt joysticken för att flytta nära den motsatta kanten av ytan och upprepa fokus. Om arbetsavstånd inte är ungefär lika med det första läget, att luta provet uppnå ungefärlig överenskommelse på båda platserna använder fliken Koordinater för scenen meny (se 7.2) och ange ett lutningsvärde i T samordna.
- Rotera provet nittio grader (ange värdet i R-koordinatfält) och upprepa processen tills alla positioner är fokuserade på ungefär samma arbetsavståndet.
Obs: Varierande tryck SEM kan användas för att förbättra laddningsavledningom tillgänglig. Hög vakuum är standarddriftläge för svepelektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den markerade tekniken tillämpas på hjärtvävnader från en oanvänd human hjärttransplantation donator (Figur 1), explanterade vävnader från transplantationspatienter, hjärtan från vild-typ och dystrofa möss (Figur 3), och i efter hjärtinfarkt hjärtprover från ett svin modell av hjärtskada (Figur 2). Såsom visas i figur 1, är den mänskliga hjärt matrisen en intrikat väv av tvärbundna proteiner som visar en bikakestruktur liknande mönster när de ses i tvärsnitt. Varje "honeycomb" struktur är ungefär 40 um bred, normalt kringgå en enda myocyt, när man överväger den plana vyn i figur 1. Vid anslutning av inskjutna skivor, flera hjärtmuskelceller kan föreställa sig som en stång som löper på längden genom "tunneln" när metafor förlängs till tre dimensionerna. Figur 1 också höjdpunktervikten av skärförfarandet med större precision vilket ger mer avslöjande topografiska uppgifter (Figur 1, överst till vänster) än sektioner som är "krossas" under skärprocessen (Figur 1, överst till höger).
Borttagning av bosatta hjärtceller, blodkärl, och cirkulations celler före SEM behandling avslöjar ytterligare ultrastrukturella detaljer som skulle vara mindre märkbar genom SEM av hela hjärtvävnadsblock. Varje enskild kollagen "strut", till exempel (figur 1, bottenpaneler) är uppenbarligen i linje med jämna mellanrum och vinkelrät mot myofibrill sarkomerer. Detta arrangemang är lämpligt för att hjälpa upprätthålla hjärtstruktur genom motverkande deformationer som utövas under sammandragning och avslappning cykler, liknande den "varp och väft" av textilier som bidrar till att upprätthålla vävkroppen och formen mot sträckning.
fo: keep-together.within-page = "1"> 
Figur 1:. Representativa svepelektronmikro av tredimensionellt arrangemang av den extracellulära matrisen i decellulariserade vänsterkammar vävnad erhållen från en oanvänd Human donatorhjärtat De två översta panelerna visar matrisen i tvärsnitt vid låg förstoring (barer = 500 um), tillhandahålla ett flygfoto av arkitektur normal mänsklig hjärtvävnad. Vid högre förstoring, kan en bättre observera den typiska honeycomb-liknande struktur av stödjande fibrer som ger mekaniskt stöd för regelbundet åtskilda myofibers (mitten till vänster och höger panel barer = 100 um och 50 um, respektive). Vid närmare inspektion, varje "honeycomb" som består av fibrer som är organiserade parallellt med varandra under rät vinkel mot bosatta hjärtmuskelceller (längst ned till vänster och höger panel barer = 10 pm och 5 pm, respektive).TTP: //www.jove.com/files/ftp_upload/54005/54005fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Förutom att ge strukturell information kan SEM av decellulariserade vävnader tillåta meningsfull, kvalitativ bedömning av extracellulära matrix förändringar som svar på skada eller icke-skadliga former av kardiomyopati. Till exempel, var denna teknik nyligen använts för att undersöka de extracellulära matriser av post-infarkt svinhjärtvävnader 43. Under loppet av denna stora djurförsök, särskilt utformad för att utvärdera effekten av GGF2 isoformen av NRG-1β som ett potentiellt terapeutiskt för hjärtsvikt, postinfarkt svin som fick intravenös NRG-1β administration uppvisade slående förändringar i hjärt matris , jämfört med obehandlade hjärtvävnader av post-infarkt djur. Dessa resultat har därefter publicerat 43, och technique har varit ett värdefullt verktyg för att bygga på denna första, serendipitous upptäckten. Figur 2 omfattar exempel micrographs, produceras under loppet av denna studie, som belyser drastiska matris skillnader mellan obehandlad och NRG-1β-behandlade matriser.
Figur 2:. Representativa svepelektronmikro av vänster kammares extracellulär matrix i obehandlade och NRG-1 β behandlad Pigs efter NaOH Maceration Matrisen i tvärsnitt belyser regelbundet rumsliga arrangemang av fibrer i obehandlad efter hjärtinfarkt (post-MI) svin (överst till vänster), jämfört med post-MI NRG-1β-behandlade djur (överst till höger). Vid betraktande i longitud, matrisen i obehandlade svin uppvisar en tjock, matt-liknande utseende (nederst till vänster), medan matrisen av NRG-1p-behandlade svinvisar regelbunden rumsliga arrangemang av fibrer (nederst till höger). Vit bar = 40 pm (alla fyra paneler). Mer detaljerade resultat och siffror ingår i den tillhörande manuskript 43. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Utforskning av matris förändringar som inträffar i dystrofa hjärtan har också gett kvalitativa insikter i fortskridandet och utvecklingen av en djurmodell av Duchennes muskeldystrofi kardiomyopati (DMD). I MDX möss, en ofta använd musmodell av DMD, finns det betydande och åldersberoende skillnader mellan vild-typ och MDX hjärtan när ses av SEM efter fixering och NaOH behandling. Såsom visas i fig 3, matriskomponenter var relativt normala i 6 veckor gamla MDX hjärtan som saknar funktionell dystrofin i förhållande till normala möss. mer interesting, extracellulära matrisorganisation tydligt störd eller kanske nedbrutna i äldre dystrofin-brist möss jämfört med yngre MDX möss, visar den progressiva karaktären av DMD i hjärtat. Sådana stora skillnader inte var väntat, eftersom MDX möss är dåligt representativa för human DMD kardiomyopati beroende på det faktum att de uppvisar en mycket mildare kardiomyopati fenotyp och långsammare dödlighet än människor med DMD 48. Detta tyder på att även små förändringar i hjärtfunktionen kan fångas med hjälp av teknik visualisering presenteras i detta manuskript. Denna metod bör också vara lätt anpassas till de extracellulära matriser av andra organ, för vilka det finns heller ingen nu tillgängliga fibros inriktning terapier.
Figur 3: representativa svepelektronmikrofotografier av Vänster Ventricular Extracellulär Matrix i vildtyp kontra MDX möss. Den vänstra ventrikulära hjärt matris i vildtyp möss (övre panelen) är likartad den som observerats i andra arter. Matrisen i MDX möss vid 6 veckors ålder ser relativt normal, även om något "fluffigt" i utseende (mitten panel). Omvänt, hjärt matris av äldre MDX möss visas kraftigt degenererat (nedre panelen), vilket indikerar att dystrofisk processen kan kvalitativt fångas med användning av SEM i fasta, NaOH-urlakade vävnader. Vit bar = 10 mikrometer (alla tre paneler). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tvärsnitt ytbehandling är det mest kritiska steget under protokollet. Att bevara fina strukturen, måste dehydratiserade proverna kvar i 100% etanol vid alla tidpunkter tills introduceras till den kritiska punkten torkningsprocessen. Därför skivning av proverna för att uppnå ytor för EM undersökning måste göras medan prover nedsänkta i etanol i en flat tallrik. Det är också viktigt att den exponerade ytan inte vidrörs eller sond under efterföljande hantering. Inga större förändringar förutses för tillämpning av denna teknik till andra vävnadstyper för liknande matris observationer, även om SEM delen av protokollet kan kräva grundläggande elektronmikroskopi felsökning oavsett prov ursprung. Bilder som samlats in från de fibrösa prov är benägna att artefakter som införs genom dålig laddningsavledning ( "laddning"). Laddnings problem kan oftast minimeras genom att reducera accelerationsspänning, ökande skanningshastighet (även kallad vilotid) Och reducerande strålpunkt av elektronstrålen. Integration av flera skanningar samlas tillräckligt snabbt för att undvika laddnings artefakter kommer att producera en bild av jämförbar signalbruskvalitet utan laddnings artefakter som finns i en långsammare, högre kvalitet enda skanning bild.
Denna teknik är i sig kvalitativ och därmed kompletterar när de betraktas tillsammans med kvantitativa mätningar (t.ex. Masson trikrom eller picoserius rödfärgning, mätning av hydroxyprolin innehåll, masspektrometri och RNASeq) att ta reda på hur visualiseras strukturella skillnader kan vara relaterade till olika utvecklings eller sjukdomstillstånd. Trots denna begränsning, är metoden betydande än hjärtfibros särskilt eftersom den extracellulära matrisen är en viktig del av nästan alla organ i kroppen. I hjärtat tillhandahåller hjärt matrisen kritiska mekaniskt stöd för kontinuerlig pumpning kännetecknas av komplex sträckning, vridning, och defFörnyelsen, vilket ger optimal in- och utflöde av syresatt och syresatt blod 49 för> 2,5 miljarder slag som förekommer över den genomsnittliga människans livslängd. Med tanke på den extremt låga förnyelseförmåga hjärtvävnad, en dynamisk matris som kan byggas om enligt kontextuella behov gör logisk mening. Med endast en liten sträcka av fantasi, kan man dra slutsatsen att det finns terapeutiska mål för att manipulera matrix remodeling att förbättra läkningsprocessen, samtidigt begränsa negativa fibros. Tillämpning av demonstrerade tekniken minst visar den sofistikerade och vackra hjärt matrisen och därigenom ytterligare understryker dess funktionella betydelse.
Medan värdet av kvantitativa åtgärder är en grundläggande princip för utvärdering av praktiskt taget alla experimentella studier, tekniken markerad här kan användas för att avslöja kvalitativa ultra variationer som inte bara kompletterar standardmått matrismen kan föreslå alternativa utrednings vägar för att förstå de grundläggande biokemiska förändringar som understryker de kvalitativa förändringar. Förväntade framtida tillämpningar av denna teknik är dess användning i hjärtsjukdomsmodeller och mänskliga vävnader som ett kompletterande verktyg för att bedöma matrisförändringar, samt breddad användning för att studera andra organ som matrisförändringar är en del av sjukdomsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Chloride | Electron Microscopy Sciences | 12340 | 100 g |
| Carbon Adhesive | Electron Microscopy Sciences | 12664 | 30 g |
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | order to fit stubs |
| Double Edge Razor Blades Stainless Steel | Ted Pella, Inc | 121-6 | 250/pkg |
| Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15055 | 450 ml |
| Gluteraldehyde, 50% Solution | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, distillation purified |
| Hydrochloric Acid | Electron Microscopy Sciences | 16760 or 16770 | 100 ml |
| Monosodium Phosphate NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9251-250G | 250 g |
| Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | 1 g |
| Silver Conductive Adhesive | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | 15 g |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045-1KG | 1 kg |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264-500G | 500 g |
| Tannic Acid, 5% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 21702-5 | 500 ml |
| Trihydrate Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | 100 g |
| Gold-palladium Alloy or Gold | Refining Systems, Inc. | varies | specific to the sputter coater make and model |
| Critical Point Dryer | Electron Microscopy Sciences | 850 | |
| Plain Wooden Applicators | Fisher Scientific | 23-400-102 | |
| Quanta 250 Environmental SEM | FEI | Q250 SEM | |
| Sputter Coater | Cressington Scientific Instruments Ltd. | Model 108 | |
| Alluminum SEM Sample Stubs | Electron Microscopy Sciences | 75220-12 | specific to the miscroscope |
References
- Robinson, T. F., Cohen-Gould, L., Factor, S. M., Eghbali, M., Blumenfeld, O. O. Structure and function of connective tissue in cardiac muscle: collagen types I and III in endomysial struts and pericellular fibers. Scanning Microsc. 2, 1005-1015 (1988).
- Robinson, T. F., Geraci, M. A., Sonnenblick, E. H., Factor, S. M. Coiled perimysial fibers of papillary muscle in rat heart: morphology, distribution, and changes in configuration. Circ Res. 63, 577-592 (1988).
- Lunkenheimer, P. P., et al. The myocardium and its fibrous matrix working in concert as a spatially netted mesh: a critical review of the purported tertiary structure of the ventricular mass. Eur J Cardiothorac Surg. 29 Suppl 2, S41-S49 (2006).
- Wu, K. C., et al. Late gadolinium enhancement by cardiovascular magnetic resonance heralds an adverse prognosis in nonischemic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 51, 2414-2421 (2008).
- Kramer, C. M. The expanding prognostic role of late gadolinium enhanced cardiac magnetic resonance. J Am Coll Cardiol. 48, 1986-1987 (2006).
- Park, S., et al. Delayed hyperenhancement magnetic resonance imaging is useful in predicting functional recovery of nonischemic left ventricular systolic dysfunction. J Card Fail. 12, 93-99 (2006).
- Weber, K. T. Cardiac interstitium in health and disease: the fibrillar collagen network. J Am Coll Cardiol. 13, 1637-1652 (1989).
- Jalil, J. E., Janicki, J. S., Pick, R., Abrahams, C., Weber, K. T. Fibrosis-induced reduction of endomyocardium in the rat after isoproterenol treatment. Circ Res. 65, 258-264 (1989).
- Fidzianska, A., Bilinska, Z. T., Walczak, E., Witkowski, A., Chojnowska, L. Autophagy in transition from hypertrophic cardiomyopathy to heart failure. J Electron Microsc (Tokyo). 59, 181-183 (2010).
- Lopez, B., Querejeta, R., Gonzalez, A., Larman, M., Diez, J. Collagen cross-linking but not collagen amount associates with elevated filling pressures in hypertensive patients with stage C heart failure: potential role of lysyl oxidase. Hypertension. 60, 677-683 (2012).
- Gabbiani, G., Ryan, G. B., Majne, G. Presence of modified fibroblasts in granulation tissue and their possible role in wound contraction. Experientia. 27, 549-550 (1971).
- Lorell, B. H. Diastolic dysfunction in pressure-overload hypertrophy and its modification by angiotensin II: current concepts. Basic Res Cardiol. 87 Suppl 2, 163-172 (1992).
- Friedrich, S. P., et al. Intracardiac angiotensin-converting enzyme inhibition improves diastolic function in patients with left ventricular hypertrophy due to aortic stenosis. Circulation. 90, 2761-2771 (1994).
- Rosker, C., Salvarani, N., Schmutz, S., Grand, T., Rohr, S. Abolishing myofibroblast arrhythmogeneicity by pharmacological ablation of alpha-smooth muscle actin containing stress fibers. Circ Res. 109, 1120-1131 (2011).
- Yue, L., Xie, J., Nattel, S. Molecular determinants of cardiac fibroblast electrical function and therapeutic implications for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 89, 744-753 (2011).
- Rohr, S. Myofibroblasts in diseased hearts: new players in cardiac arrhythmias? Heart Rhythm. 6, 848-856 (2009).
- Coen, M., Gabbiani, G., Bochaton-Piallat, M. L. Myofibroblast-mediated adventitial remodeling: an underestimated player in arterial pathology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, 2391-2396 (2011).
- Brilla, C. G., Janicki, J. S., Weber, K. T. Cardioreparative effects of lisinopril in rats with genetic hypertension and left ventricular hypertrophy. Circulation. 83, 1771-1779 (1991).
- Youn, H. J., et al. Relation between flow reserve capacity of penetrating intramyocardial coronary arteries and myocardial fibrosis in hypertension: study using transthoracic Doppler echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 19, 373-378 (2006).
- Warnes, C. A., Maron, B. J., Roberts, W. C. Massive cardiac ventricular scarring in first-degree relatives with hypertrophic cardiomyopathy. Am J Cardiol. 54, 1377-1379 (1984).
- Maron, B. J., Wolfson, J. K., Epstein, S. E., Roberts, W. C. Intramural ('small vessel') coronary artery disease in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 8, 545-557 (1986).
- Olivotto, I., et al. Microvascular function is selectively impaired in patients with hypertrophic cardiomyopathy and sarcomere myofilament gene mutations. J Am Coll Cardiol. 58, 839-848 (2011).
- Beltrami, C. A., et al. Structural basis of end-stage failure in ischemic cardiomyopathy in humans. Circulation. 89, 151-163 (1994).
- Factor, S. M., et al. Pathologic fibrosis and matrix connective tissue in the subaortic myocardium of patients with hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 17, 1343-1351 (1991).
- Waller, T. A., Hiser, W. L., Capehart, J. E., Roberts, W. C. Comparison of clinical and morphologic cardiac findings in patients having cardiac transplantation for ischemic cardiomyopathy, idiopathic dilated cardiomyopathy, and dilated hypertrophic cardiomyopathy. Am J Cardiol. 81, 884-894 (1998).
- Schaper, J., Lorenz-Meyer, S., Suzuki, K. The role of apoptosis in dilated cardiomyopathy. Herz. 24, 219-224 (1999).
- de Leeuw, N., et al. Histopathologic findings in explanted heart tissue from patients with end-stage idiopathic dilated cardiomyopathy. Transpl Int. 14, 299-306 (2001).
- Yoshikane, H., et al. Collagen in dilated cardiomyopathy--scanning electron microscopic and immunohistochemical observations. Jpn Circ J. 56, 899-910 (1992).
- Marijianowski, M. M., Teeling, P., Mann, J., Becker, A. E. Dilated cardiomyopathy is associated with an increase in the type I/type III collagen ratio: a quantitative assessment. J Am Coll Cardiol. 25, 1263-1272 (1995).
- Pearlman, E. S., Weber, K. T., Janicki, J. S., Pietra, G. G., Fishman, A. P. Muscle fiber orientation and connective tissue content in the hypertrophied human heart. Lab Invest. 46, 158-164 (1982).
- Huysman, J. A., Vliegen, H. W., Van der Laarse, A., Eulderink, F. Changes in nonmyocyte tissue composition associated with pressure overload of hypertrophic human hearts. Pathol Res Pract. 184, 577-581 (1989).
- Rossi, M. A. Pathologic fibrosis and connective tissue matrix in left ventricular hypertrophy due to chronic arterial hypertension in humans. J Hypertens. 16, 1031-1041 (1998).
- Lopez, B., Gonzalez, A., Querejeta, R., Larman, M., Diez, J. Alterations in the pattern of collagen deposition may contribute to the deterioration of systolic function in hypertensive patients with heart failure. J Am Coll Cardiol. 48, 89-96 (2006).
- Krayenbuehl, H. P., et al. Left ventricular myocardial structure in aortic valve disease before, intermediate, and late after aortic valve replacement. Circulation. 79, 744-755 (1989).
- Schwarz, F., et al. Myocardial structure and function in patients with aortic valve disease and their relation to postoperative results. Am J Cardiol. 41, 661-669 (1978).
- Hein, S., et al. Progression from compensated hypertrophy to failure in the pressure-overloaded human heart: structural deterioration and compensatory mechanisms. Circulation. 107, 984-991 (2003).
- Brooks, W. W., Shen, S. S., Conrad, C. H., Goldstein, R. H., Bing, O. H. Transition from compensated hypertrophy to systolic heart failure in the spontaneously hypertensive rat: Structure, function, and transcript analysis. Genomics. 95, 84-92 (2010).
- O'Hanlon, R., et al. Prognostic significance of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 56, 867-874 (2010).
- Green, J. J., Berger, J. S., Kramer, C. M., Salerno, M. Prognostic value of late gadolinium enhancement in clinical outcomes for hypertrophic cardiomyopathy. JACC Cardiovasc Imaging. 5, 370-377 (2012).
- Frankel, K. A., Rosser, R. J. The pathology of the heart in progressive muscular dystrophy: epimyocardial fibrosis. Hum Pathol. 7, 375-386 (1976).
- Otto, R. K., Ferguson, M. R., Friedman, S. D. Cardiac MRI in muscular dystrophy: an overview and future directions. Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 123-132 (2012).
- Finsterer, J., Stollberger, C.
- Galindo, C. L., et al. Anti-remodeling and anti-fibrotic effects of the neuregulin-1beta glial growth factor 2 in a large animal model of heart failure. J Am Heart Assoc. 3, e000773 (2014).
- Caulfield, J. B., Borg, T. K.
- Ohtani, O. Three-dimensional organization of the connective tissue fibers of the human pancreas: a scanning electron microscopic study of NaOH treated-tissues. Arch Histol Jpn. 50, 557-566 (1987).
- Rossi, M. A., Abreu, M. A., Santoro, L. B. Images in cardiovascular medicine. Connective tissue skeleton of the human heart: a demonstration by cell-maceration scanning electron microscope method. Circulation. 97, 934-935 (1998).
- Icardo, J. M., Colvee, E. Collagenous skeleton of the human mitral papillary muscle. Anat Rec. 252, 509-518 (1998).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: from basic mechanisms to gene therapy. Dis Model Mech. 8, 195-213 (2015).
- Buckberg, G., Hoffman, J. I., Mahajan, A., Saleh, S., Coghlan, C. Cardiac mechanics revisited: the relationship of cardiac architecture to ventricular function. Circulation. 118, 2571-2587 (2008).
