Protocol
Ethiek Verklaring: De protocollen voor de behandeling van dieren werden goedgekeurd door de Vanderbilt Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC, protocollen nummer M / 10/117 (varkens) en M / 10/219 (muizen) en uitgevoerd volgens AAALAC-Internationale normen. het gebruik van opgespaarde menselijk hartweefsel werd goedgekeurd door de Vanderbilt University Medical Center IRB (protocol nummer 100887).
1. Monsterneming en opslag
- Voeg vers 4% glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB) oplossing.
LET OP: Glutaaraldehyde is giftig, draag handschoenen en werken in een zuurkast.- Maak een 0,2 M voorraad oplossing van PB, pH 7,4 met behulp van 21,8 g Na 2 HPO 4 en 6,4 g NaH 2 PO 4. Quantum satis (Qs) tot 1000 ml dH 2 O.
- Voeg 400 ul van 50% glutaaraldehyde tot 2,5 ml PB voorraadoplossing en 2,1 ml dH 2 O.
- Dompel een stuk (niet groter dan 2 cm 2) van weefsel in de 4% glutaaraldehyde oplossing. Opmerking: kleinere stukken kunnen ook worden gebruikt, maar van voldoende omvang (niet kleiner dan 5 mm 2) gemakkelijk worden gevisualiseerd door het oog om latere stappen van het protocol te vergemakkelijken moet worden.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, bewaar oneindig bij 4 ° C.
2. Decellularisatie van hartweefsel
- Voeg verse 10% NaOH waterige oplossing met 10 g NaOH pellets / 100 ml dH 2 O.
LET OP: NaOH oplossingen zijn bijtend en kan alkali-brandwonden veroorzaken, draag handschoenen. - Spoel weefsel in dH 2 O.
- Incubeer in 10% NaOH-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 6-10 dagen (tot weefselveranderingen van roodbruine tot gebroken wit of wit).
- Spoel in dH 2 O tot weefsel transparant wordt.
- Dompel weefsel in 1% looizuur gedurende 4 uur bij kamertemperatuur geroerd. Gebruik 1 ml 5% stamoplossing per 4 ml dH 2 O.
LET OP: Looizuuris een sterk irriterend, handschoenen dragen. - Spoel in dH 2 O 's nachts.
3. Osmication en uitdroging van hartweefsel (in de zuurkast voor de veiligheid)
- Voeg een 0,2 M voorraadoplossing van natrium cacodylaatbuffer middels 21,4 g natriumcacodylaat, 10,0 g calciumchloride en 450 ml dH 2 O. Mix, voeg zoutzuur als nodig om de pH op 7,4. Q tot 500 ml met dH 2 O.
LET OP: natriumcacodylaat en zoutzuur zijn giftig, draag handschoenen en werken in een zuurkast. - Maak 2% waterige voorraad oplossing van osmiumtetroxide in zuurkast voor de veiligheid door het oplossen van 1 g osmiumtetroxide kristallen in 50 ml dH 2 O.
LET OP: osmiumtetroxide is een ernstig gevaar bij inademing; damp fixatie van slijmvliezen of oogbollen mogelijk is, vandaar behandelen alleen in de zuurkast met handschoenen. Een spatscherm wordt aanbevolen. - Spoel weefsel in 0,1 M natriumcacodylaat buffer (mix voorraad oplossing 1: 1 met dH
- Herhaal vorige stap tweemaal voor een totaal van drie spoelingen buffer.
- Dompel weefsel in 1% osmiumtetroxide in 0,1 M natriumcacodylaat buffer (mix stock natriumcacodylaat en stock osmiumtetroxide 1: 1) op rotator gedurende 1 uur.
- Spoel weefsel in 0,1 M natriumcacodylaat buffer 3 keer per rotator op 5 min.
- Spoel weefsel met behulp van toenemende concentraties aan ethanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, en tenslotte 100%) gedurende 15 min op elke rotator.
4. Dwarsdoorsnede Oppervlaktebehandeling voor SEM
- Transfer weefsel in 100% ethanol tot een ondiepe petrischaal ook met 100% ethanol.
- Houd twee scherpe scheermesjes zodat de vlakke zijden van de zijden in contact met elkaar en de snijranden kruis twee zijden van een gelijkzijdige driehoek boven het monster te vormen. Om dit te bereiken, gebruiken de linkerhand een mes te plaatsen aan de rechterkant van het monster encut naar links. Op hetzelfde moment, met de rechterhand op het tweede mes te plaatsen op de uiterst links van het monster en slice naar rechts. Zo zal de lamellen worden geschoven tegen elkaar uit tegengestelde richting een gladde snede te maken.
- Schuif de platte zijkanten tegen elkaar om een zeer zuivere snede van het monster met minimale vervorming of scheuren kracht te maken, bij voorkeur zo groot mogelijk oppervlak bloot mogelijk zonder beschadiging van het monster.
- Herhaal dit voor elk monster aan de schoonst mogelijke dwarsdoorsnede oppervlakken bloot te leggen voor het onderzoek in de SEM.
5. Critical Point Drogen (CPD) van hartweefsel
- Gebruik een spatel of pincet om weefsel te dragen aan de monsterhouder van het kritische punt droger (CPD), zodat weefsel blijft 100% ethanol te allen tijde. Opdat de houder wordt ondergedompeld in ethanol en dat de overdracht voltooid met het weefsel blootgesteld aan lucht niet langer dan enkele seconden.
- Bedien CPD per onshandleiding er zo op 3 purge-and-fill volledige cycli om ethanol te vervangen door vloeibare kooldioxide.
- Bedien CPD per gebruikershandleiding om kritisch punt drogen van de monsters te bereiken en breng ze terug naar de atmosferische druk met gecontroleerde ontluchting van CO 2.
6. Montage van het Hart van weefselmonsters voor SEM
- Bereid een SEM monster stub voor elk monster, door het hechten van een tab koolstofkleefband op het bovenoppervlak van de aluminium strook.
- Met behulp van een stereomicroscoop, zorgvuldig houden het monster dat u de sticker met de doorsnede oppervlak van belang naar boven (weg van het tabblad, zichtbaar), en zo dicht mogelijk bij de parallel met het vlak van het monster stomp oppervlak. Niet sonde en raak het oppervlak van belang.
- Breek een houten applicator stok om een taps toelopende borstel, ideaal voor het aanbrengen van verf te bereiken. Solliciteer zilver of carbon verf op de bodem en zijkanten van het monster, om de naleving van de stomp te verbeteren.
- Breiden een zeer dunne lijn van zilver of koolstof verf tot een rand van het oppervlak plaats, een lading weg van het oppervlak van belang aarding.
- Toepassen 2 of 3 kleine dabs zilver of koolstof verf rond de omtrek van de lip koolstof, een geleidend pad van de tab kooloppervlak de metalen strook en aldus naar aarde.
- Met geleidende verf drogen gedurende twee uur.
- Bedien sputter coater per gebruikershandleiding om een relatief zware coating (doelbereik van 30 - 40 nm) van toepassing zijn van goud-palladium legering of goud. Pomp specimen kamer tot ongeveer 0,1 mbar; Timer instellen op 40 sec. Open Set klep op de 8:00 positie (matig Argon gas flow). Druk op Start om sputter coating starten bij 30 mA. Paarse gloed lozing moet zichtbaar zijn in het monster kamer zijn.
7. SEM onderzoek van Hart weefselmonsters
- Voer aftastelektronenmicroscopie bij relatief lage versnellingsspanning beeldvormende p minimaliserenroblemen geassocieerd met een slechte lading dissipatie in de steekproef (opladen). Suggereerde aanvankelijk imaging aandoening zijn: 5 kV versnellende voltage, 10 mm werkafstand.
- Met de hulp van een ervaren operator, in dienst verhoogd werkafstand om de scherptediepte te breiden in de beeldvorming als voorwaarde stellen dat de focus van de vezels in meerdere focale vliegtuigen, of vezels die zich uitstrekt voor aanzienlijke lengte in de z-dimensie.
- Voor de microscoop die hier gebruikt (zie tabel of Materials), bij de toegang gebruikersinterface de tab-navigatie rechtsboven.
- Open het tabblad Coördinaten uit het werkgebied menu. Om werkafstand te verhogen, voert u een grotere waarde in millimeters voor de Z-coördinaat dan klikt u op Ga naar het tabblad om het monster etappe naar de ingevoerde werkafstand.
- Met behulp van een ervaren operator, gebruik model draaipunt en het oppervlak van belang orthogonaal positioneren de elektronenbundel. Extra helling van 10 tot 30 grees vanuit deze positie kunnen observatie en documentatie van de matrix structuur te verbeteren.
- Voor de microscoop die hier gebruikt (zie tabel of Materials), in de gebruikersinterface, klik en houd de rechter muisknop en schuif naar links of rechts om het monster in de buurt van de periferie van het voorbereide oppervlak vlak van belang richten, wijzend op de gerichte werkafstand .
- Navigeren met de Manual User Interface joystick om te bewegen in de buurt van de tegenoverliggende rand van het oppervlak en herhaal focus. Als werkafstand is ongeveer gelijk aan de eerste positie, tilt specimen bij benadering akkoord op beide locaties via het tabblad Coördinaten van het werkgebied menu (zie 7.2) en voer een tilt waarde in de T-coördinaat te bereiken.
- Draai specimen negentig graden (in te voeren waarde in R Coördineren veld) en herhaal het proces totdat alle posities zijn gericht op ongeveer dezelfde werkafstand.
Opmerking: Variabele druk SEM kunnen worden toegepast om lading dissipatie verbeterenindien beschikbaar. Hoog vacuüm is de standaard modus voor het scannen elektronenmicroscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gemarkeerde techniek werd toegepast op hartweefsel van een ongebruikte menselijk hart transplantatie donor (figuur 1), geëxplanteerde weefsels transplantatie ontvangers, harten van wildtype en dystrofische muizen (figuur 3), en in post-myocardiaal infarct hart monsters van een varkens model van het hart schade (figuur 2). Zoals getoond in figuur 1, de menselijke cardiale matrix een ingewikkelde weefsel verknoopt eiwitten die een honingraat-achtig patroon weer gezien in dwarsdoorsnede. Elke 'honingraat-structuur is ongeveer 40 micrometer breed, normaal omzeilen één myocyten, bij het overwegen van het bovenaanzicht in figuur 1. Terwijl het toestel met geïntercaleerde schijven, meerdere hartspiercellen kunnen worden voorgesteld als een stang in de lengte loopt door de' tunnel 'als metafoor wordt uitgebreid naar driedimensionaliteit. Figuur 1 ook hoogtepuntenhet belang van de snijprocedure, nauwkeuriger waardoor meer onthullende topografische data (Figuur 1, linksboven) dan gedeelten die worden "gebroken" tijdens het snijproces (Figuur 1, rechtsboven).
Verwijdering van de ingezeten hartcellen, bloedvaten en de bloedsomloop cellen voorafgaand aan SEM verwerking onthult extra ultra-structurele details die minder merkbaar zou zijn met SEM van hele hartweefsel blokken. Elk individu collagene "strut", bijvoorbeeld (figuur 1, bodempanelen) blijkbaar uitgelijnd met regelmatige intervallen loodrecht op sarcomeren myofibril. Deze opstelling is geschikt voor het helpen handhaven van hartstructuur-teller optredende vervormingen tijdens contractie en relaxatie cycli uitgeoefend, vergelijkbaar met de schering en inslag "textiel dat helpt stof lichaam en vorm te handhaven tegen uitrekken.
fo: keep-together.within-page = "1"> 
Figuur 1:. Representatieve Rasterelektronenmicrografieën van de drie-dimensionale Regeling van de extracellulaire matrix van cellen ontdane Linksventriculaire Weefsel verkregen van een niet gebruikte Menselijk Hart Donor De bovenste twee panelen tonen de matrix in dwarsdoorsnede bij een lage vergroting (bar = 500 urn), het verstrekken van een luchtfoto van de architectuur van normaal menselijk hartweefsel. Bij hogere vergroting, kan men beter waarnemen typische honingraatvormige structuur ondersteunende vezels die mechanische ondersteuning voor regelmatige afstanden myovezels (midden links en rechts paneel bars = 100 pm en 50 pm, respectievelijk) verschaffen. Bij nader inzien, wordt elke 'honingraat' bestaat uit vezels die parallel georganiseerd met elkaar terwijl loodrecht op resident hartspiercellen (onderaan links en rechts paneel bars = 10 pm en 5 pm, respectievelijk).TTP's: //www.jove.com/files/ftp_upload/54005/54005fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Naast het verschaffen van structurele informatie kan SEM van ontcelde weefsels zinvolle, kwalitatieve beoordeling van extracellulaire matrix verandert als gevolg van letsel of schade veroorzakende vormen van cardiomyopathie mogelijk. Zo is deze techniek onlangs gebruikt om extracellulaire matrices van post-infarct varkens hartweefsels 43 onderzocht. Tijdens deze grote dierproef, speciaal ontworpen om de werkzaamheid van de GGF2 isovorm van NRG-1β evalueren als een potentieel therapeutisch voor hartfalen, post-infarct varken dat intraveneuze NRG-1β toediening ontvingen vertoonden opvallende veranderingen in de cardiale matrix , vergeleken met onbehandelde hartweefsel post-infarct dieren. Deze resultaten werden vervolgens gepubliceerd 43, en de technique is een waardevol instrument voor bouwen op deze eerste, toevallige ontdekking bleef. Figuur 2 bevat bijvoorbeeld micrografische, geproduceerd in de loop van deze studie, die drastische matrix verschillen tussen de onbehandelde en NRG-1β-behandelde matrices te markeren.
Figuur 2:. Vertegenwoordiger Rasterelektronenmicrografieën van de linker ventriculaire extracellulaire matrix in Onbehandelde en NRG-1 β-behandelde varkens, na NaOH Maceratie De matrix in dwarsdoorsnede belicht de regelmatige ruimtelijke ordening van vezels in onbehandelde post-myocardinfarct (post-MI) varkens (linksboven), in vergelijking met post-MI NRG-1β-behandelde dieren (rechtsboven). Wanneer bekeken in lengte, de matrix in onbehandelde varkens vertoont een dikke, matte-achtige verschijning (linksonder), terwijl de matrix van NRG-1β-behandelde varkensgeeft regelmatig ruimtelijke ordening van vezels (rechtsonder). Witte balk = 40 micrometer (alle vier panelen). Meer gedetailleerde resultaten en cijfers zijn opgenomen in de bijbehorende manuscript 43. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Onderzoek van matrix veranderingen die optreden in dystrofische harten ook opgeleverd kwalitatieve inzicht in de voortgang en ontwikkeling van een diermodel van Duchenne spierdystrofie cardiomyopathie (DMD). In mdx muizen een veel gebruikte muismodel van DMD, er aanzienlijke en leeftijd-afhankelijke verschillen tussen wildtype en mdx harten gezien door SEM na fixatie en behandeling NaOH. Zoals getoond in figuur 3, matrixcomponenten relatief normaal 6 weken oude mdx harten ontbreekt functioneel dystrofine opzichte van normale muizen. meer interesting, extracellulaire matrix organisatie werd duidelijk verstoord of misschien afgebroken bij oudere dystrofine-deficiënte muizen in vergelijking met jongere mdx muizen, ter illustratie van het progressieve karakter van DMD in het hart. Dergelijke grote verschillen werden niet verwacht omdat mdx muizen weinig representatief humane DMD cardiomyopathie omdat ze vertonen een veel milder cardiomyopathie fenotype en langzamer sterftecijfer dan mensen met DMD 48. Dit suggereert dat zelfs kleine veranderingen in de hartfunctie kunnen worden vastgelegd met behulp van de visualisatietechniek in dit manuscript. Deze methode zou ook gemakkelijk aan te passen aan het extracellulaire matrices van andere organen, waarvoor er geen moment eveneens beschikbaar fibrose richten therapieën.
Figuur 3: Representatieve Rasterelektronenmicrografieën van Left Ventricular extracellulaire matrix in wildtype versus mdx muizen. De linker ventriculaire cardiale matrix in wildtype muizen (bovenste paneel) is vergelijkbaar met dat waargenomen bij andere diersoorten. De matrix in mdx muizen op leeftijd van 6 weken ziet er relatief normaal, hoewel iets 'fluffy' in verschijning (middelste paneel). Omgekeerd, de cardiale matrix van oudere mdx muizen lijkt sterk gedegenereerde (onderste panel), wat aangeeft dat de werkwijze dystrofische kwalitatief kan worden vastgelegd met behulp van SEM vast NaOH-geweekt weefsels. Witte balk = 10 micrometer (alle drie panelen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dwarsdoorsnede voorbereiding van het oppervlak is de meest kritische fase in het protocol. Om fijne structuur te behouden, moeten gedroogde exemplaren in 100% ethanol blijven te allen tijde tot ingevoerd om het kritische punt droogproces. Daarom is het snijden van de monsters te bereiken oppervlakken voor EM-onderzoek moet worden gedaan, terwijl monsters worden ondergedompeld in ethanol in een ondiepe schaal. Het is ook belangrijk dat het blootgestelde oppervlak niet wordt aangeraakt of geprobed tijdens daaropvolgende behandeling. Geen grote wijzigingen verwacht voor de toepassing van deze techniek om andere weefseltypen Soortgelijke opmerkingen matrix, hoewel de SEM gebruikt een protocol basis- elektronenmicroscopie oplossen ongeacht oorsprong monster vereisen. Beelden verzameld uit de vezelige monsters zijn gevoelig voor artefacten geïntroduceerd door slechte lading dissipatie ( "laden"). Het opladen problemen kunnen meestal worden geminimaliseerd door het verminderen van het versnellen van de spanning, het verhogen van de scansnelheid (ook wel verblijftijd) En vermindering puntgrootte van de elektronenbundel. Integratie van meerdere scans verzamelde snel genoeg om de leiding artefacten te voorkomen zal een beeld van vergelijkbare signaal-ruis-kwaliteit te produceren zonder de lading artefacten aanwezig zijn in een langzamer, beeld van hogere kwaliteit enkele scan.
Deze techniek is inherent kwalitatieve en vormt dus een aanvulling zijn in combinatie met kwantitatieve metingen (bijv Masson trichroom of picoserius rode vlekken, de meting van hydroxyproline inhoud, massaspectrometrie en RNASeq) na te gaan hoe gevisualiseerd structurele verschillen kunnen worden gerelateerd aan verschillende ontwikkelings- of ziekten. Ondanks deze beperking is de werkwijze aanzienlijk boven cardiale fibrose bijzonder omdat de extracellulaire matrix is een essentieel onderdeel van bijna elk orgaan in het lichaam. In het hart, de cardiale matrix biedt kritische mechanische ondersteuning voor continu pompen gekenmerkt door complexe stretching, draaien, en deformatie, die een optimale in- en uitstroom van zuurstofrijk en zuurstofarm bloed 49 voor de> 2,5 miljard beats die zich voordoen over de gemiddelde mens levensduur verleent. Gezien de extreem lage regeneratieve capaciteit van hartweefsel, een dynamische matrix die kan worden verbouwd volgens contextuele behoeften maakt logische zin. Met een kleine rek van de verbeelding, kan men ervan uitgaan dat er therapeutische doelwitten voor het manipuleren matrix remodeling het genezingsproces te verbeteren, terwijl het beperken van ongewenste fibrose. Toepassing van de aangetoonde techniek op een minimum vitrines de verfijning en schoonheid van de cardiale matrix en zo verder onderstreept de functionele betekenis.
Terwijl de waarde van kwantitatieve maatregelen is een basisprincipe voor de evaluatie van vrijwel alle experimentele onderzoeken werd de techniek gemarkeerd hier kan worden gebruikt om kwalitatieve ultrastructurele variaties bekend dat niet alleen aanvullen standaardmatrix metingenmaar zou kunnen suggereren alternatieve onderzoeksbevoegdheden paden naar de fundamentele biochemische veranderingen die de kwalitatieve veranderingen onderstrepen begrijpen. Verwachte toekomstige toepassingen van deze techniek het gebruik bij cardiale ziektemodellen en weefsels als aanvulling voor het beoordelen van veranderingen matrix, en uitgebreid gebruik van andere organen waarvan matrix veranderingen zijn een component van de ziekte te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Chloride | Electron Microscopy Sciences | 12340 | 100 g |
| Carbon Adhesive | Electron Microscopy Sciences | 12664 | 30 g |
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | order to fit stubs |
| Double Edge Razor Blades Stainless Steel | Ted Pella, Inc | 121-6 | 250/pkg |
| Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15055 | 450 ml |
| Gluteraldehyde, 50% Solution | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, distillation purified |
| Hydrochloric Acid | Electron Microscopy Sciences | 16760 or 16770 | 100 ml |
| Monosodium Phosphate NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9251-250G | 250 g |
| Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | 1 g |
| Silver Conductive Adhesive | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | 15 g |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045-1KG | 1 kg |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264-500G | 500 g |
| Tannic Acid, 5% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 21702-5 | 500 ml |
| Trihydrate Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | 100 g |
| Gold-palladium Alloy or Gold | Refining Systems, Inc. | varies | specific to the sputter coater make and model |
| Critical Point Dryer | Electron Microscopy Sciences | 850 | |
| Plain Wooden Applicators | Fisher Scientific | 23-400-102 | |
| Quanta 250 Environmental SEM | FEI | Q250 SEM | |
| Sputter Coater | Cressington Scientific Instruments Ltd. | Model 108 | |
| Alluminum SEM Sample Stubs | Electron Microscopy Sciences | 75220-12 | specific to the miscroscope |
References
- Robinson, T. F., Cohen-Gould, L., Factor, S. M., Eghbali, M., Blumenfeld, O. O. Structure and function of connective tissue in cardiac muscle: collagen types I and III in endomysial struts and pericellular fibers. Scanning Microsc. 2, 1005-1015 (1988).
- Robinson, T. F., Geraci, M. A., Sonnenblick, E. H., Factor, S. M. Coiled perimysial fibers of papillary muscle in rat heart: morphology, distribution, and changes in configuration. Circ Res. 63, 577-592 (1988).
- Lunkenheimer, P. P., et al. The myocardium and its fibrous matrix working in concert as a spatially netted mesh: a critical review of the purported tertiary structure of the ventricular mass. Eur J Cardiothorac Surg. 29 Suppl 2, S41-S49 (2006).
- Wu, K. C., et al. Late gadolinium enhancement by cardiovascular magnetic resonance heralds an adverse prognosis in nonischemic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 51, 2414-2421 (2008).
- Kramer, C. M. The expanding prognostic role of late gadolinium enhanced cardiac magnetic resonance. J Am Coll Cardiol. 48, 1986-1987 (2006).
- Park, S., et al. Delayed hyperenhancement magnetic resonance imaging is useful in predicting functional recovery of nonischemic left ventricular systolic dysfunction. J Card Fail. 12, 93-99 (2006).
- Weber, K. T. Cardiac interstitium in health and disease: the fibrillar collagen network. J Am Coll Cardiol. 13, 1637-1652 (1989).
- Jalil, J. E., Janicki, J. S., Pick, R., Abrahams, C., Weber, K. T. Fibrosis-induced reduction of endomyocardium in the rat after isoproterenol treatment. Circ Res. 65, 258-264 (1989).
- Fidzianska, A., Bilinska, Z. T., Walczak, E., Witkowski, A., Chojnowska, L. Autophagy in transition from hypertrophic cardiomyopathy to heart failure. J Electron Microsc (Tokyo). 59, 181-183 (2010).
- Lopez, B., Querejeta, R., Gonzalez, A., Larman, M., Diez, J. Collagen cross-linking but not collagen amount associates with elevated filling pressures in hypertensive patients with stage C heart failure: potential role of lysyl oxidase. Hypertension. 60, 677-683 (2012).
- Gabbiani, G., Ryan, G. B., Majne, G. Presence of modified fibroblasts in granulation tissue and their possible role in wound contraction. Experientia. 27, 549-550 (1971).
- Lorell, B. H. Diastolic dysfunction in pressure-overload hypertrophy and its modification by angiotensin II: current concepts. Basic Res Cardiol. 87 Suppl 2, 163-172 (1992).
- Friedrich, S. P., et al. Intracardiac angiotensin-converting enzyme inhibition improves diastolic function in patients with left ventricular hypertrophy due to aortic stenosis. Circulation. 90, 2761-2771 (1994).
- Rosker, C., Salvarani, N., Schmutz, S., Grand, T., Rohr, S. Abolishing myofibroblast arrhythmogeneicity by pharmacological ablation of alpha-smooth muscle actin containing stress fibers. Circ Res. 109, 1120-1131 (2011).
- Yue, L., Xie, J., Nattel, S. Molecular determinants of cardiac fibroblast electrical function and therapeutic implications for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 89, 744-753 (2011).
- Rohr, S. Myofibroblasts in diseased hearts: new players in cardiac arrhythmias? Heart Rhythm. 6, 848-856 (2009).
- Coen, M., Gabbiani, G., Bochaton-Piallat, M. L. Myofibroblast-mediated adventitial remodeling: an underestimated player in arterial pathology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, 2391-2396 (2011).
- Brilla, C. G., Janicki, J. S., Weber, K. T. Cardioreparative effects of lisinopril in rats with genetic hypertension and left ventricular hypertrophy. Circulation. 83, 1771-1779 (1991).
- Youn, H. J., et al. Relation between flow reserve capacity of penetrating intramyocardial coronary arteries and myocardial fibrosis in hypertension: study using transthoracic Doppler echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 19, 373-378 (2006).
- Warnes, C. A., Maron, B. J., Roberts, W. C. Massive cardiac ventricular scarring in first-degree relatives with hypertrophic cardiomyopathy. Am J Cardiol. 54, 1377-1379 (1984).
- Maron, B. J., Wolfson, J. K., Epstein, S. E., Roberts, W. C. Intramural ('small vessel') coronary artery disease in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 8, 545-557 (1986).
- Olivotto, I., et al. Microvascular function is selectively impaired in patients with hypertrophic cardiomyopathy and sarcomere myofilament gene mutations. J Am Coll Cardiol. 58, 839-848 (2011).
- Beltrami, C. A., et al. Structural basis of end-stage failure in ischemic cardiomyopathy in humans. Circulation. 89, 151-163 (1994).
- Factor, S. M., et al. Pathologic fibrosis and matrix connective tissue in the subaortic myocardium of patients with hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 17, 1343-1351 (1991).
- Waller, T. A., Hiser, W. L., Capehart, J. E., Roberts, W. C. Comparison of clinical and morphologic cardiac findings in patients having cardiac transplantation for ischemic cardiomyopathy, idiopathic dilated cardiomyopathy, and dilated hypertrophic cardiomyopathy. Am J Cardiol. 81, 884-894 (1998).
- Schaper, J., Lorenz-Meyer, S., Suzuki, K. The role of apoptosis in dilated cardiomyopathy. Herz. 24, 219-224 (1999).
- de Leeuw, N., et al. Histopathologic findings in explanted heart tissue from patients with end-stage idiopathic dilated cardiomyopathy. Transpl Int. 14, 299-306 (2001).
- Yoshikane, H., et al. Collagen in dilated cardiomyopathy--scanning electron microscopic and immunohistochemical observations. Jpn Circ J. 56, 899-910 (1992).
- Marijianowski, M. M., Teeling, P., Mann, J., Becker, A. E. Dilated cardiomyopathy is associated with an increase in the type I/type III collagen ratio: a quantitative assessment. J Am Coll Cardiol. 25, 1263-1272 (1995).
- Pearlman, E. S., Weber, K. T., Janicki, J. S., Pietra, G. G., Fishman, A. P. Muscle fiber orientation and connective tissue content in the hypertrophied human heart. Lab Invest. 46, 158-164 (1982).
- Huysman, J. A., Vliegen, H. W., Van der Laarse, A., Eulderink, F. Changes in nonmyocyte tissue composition associated with pressure overload of hypertrophic human hearts. Pathol Res Pract. 184, 577-581 (1989).
- Rossi, M. A. Pathologic fibrosis and connective tissue matrix in left ventricular hypertrophy due to chronic arterial hypertension in humans. J Hypertens. 16, 1031-1041 (1998).
- Lopez, B., Gonzalez, A., Querejeta, R., Larman, M., Diez, J. Alterations in the pattern of collagen deposition may contribute to the deterioration of systolic function in hypertensive patients with heart failure. J Am Coll Cardiol. 48, 89-96 (2006).
- Krayenbuehl, H. P., et al. Left ventricular myocardial structure in aortic valve disease before, intermediate, and late after aortic valve replacement. Circulation. 79, 744-755 (1989).
- Schwarz, F., et al. Myocardial structure and function in patients with aortic valve disease and their relation to postoperative results. Am J Cardiol. 41, 661-669 (1978).
- Hein, S., et al. Progression from compensated hypertrophy to failure in the pressure-overloaded human heart: structural deterioration and compensatory mechanisms. Circulation. 107, 984-991 (2003).
- Brooks, W. W., Shen, S. S., Conrad, C. H., Goldstein, R. H., Bing, O. H. Transition from compensated hypertrophy to systolic heart failure in the spontaneously hypertensive rat: Structure, function, and transcript analysis. Genomics. 95, 84-92 (2010).
- O'Hanlon, R., et al. Prognostic significance of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 56, 867-874 (2010).
- Green, J. J., Berger, J. S., Kramer, C. M., Salerno, M. Prognostic value of late gadolinium enhancement in clinical outcomes for hypertrophic cardiomyopathy. JACC Cardiovasc Imaging. 5, 370-377 (2012).
- Frankel, K. A., Rosser, R. J. The pathology of the heart in progressive muscular dystrophy: epimyocardial fibrosis. Hum Pathol. 7, 375-386 (1976).
- Otto, R. K., Ferguson, M. R., Friedman, S. D. Cardiac MRI in muscular dystrophy: an overview and future directions. Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 123-132 (2012).
- Finsterer, J., Stollberger, C.
- Galindo, C. L., et al. Anti-remodeling and anti-fibrotic effects of the neuregulin-1beta glial growth factor 2 in a large animal model of heart failure. J Am Heart Assoc. 3, e000773 (2014).
- Caulfield, J. B., Borg, T. K.
- Ohtani, O. Three-dimensional organization of the connective tissue fibers of the human pancreas: a scanning electron microscopic study of NaOH treated-tissues. Arch Histol Jpn. 50, 557-566 (1987).
- Rossi, M. A., Abreu, M. A., Santoro, L. B. Images in cardiovascular medicine. Connective tissue skeleton of the human heart: a demonstration by cell-maceration scanning electron microscope method. Circulation. 97, 934-935 (1998).
- Icardo, J. M., Colvee, E. Collagenous skeleton of the human mitral papillary muscle. Anat Rec. 252, 509-518 (1998).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular dystrophy: from basic mechanisms to gene therapy. Dis Model Mech. 8, 195-213 (2015).
- Buckberg, G., Hoffman, J. I., Mahajan, A., Saleh, S., Coghlan, C. Cardiac mechanics revisited: the relationship of cardiac architecture to ventricular function. Circulation. 118, 2571-2587 (2008).
