Summary
מבחני מושבה במבחנה כדי לזהות עצמית והתחדשות והבחנה של ובתאים מבודדים לבלב בעכברים בוגר הם המציאו. מבחנים אלה, אבות לבלב להצמיח מושבות תאים בחלל 3 ממדים במדיום methylcellulose המכיל מוצק למחצה. פרוטוקולים לטיפול תאים בודדים ואפיון של מושבות בודדות מתוארים.
Abstract
גזע ובתאים מהלבלב המבוגר יכולים להיות מקור פוטנציאלי של תאי בטא דמוי טיפולי לטיפול בחולי סוכרת מסוג 1. עם זאת, זה עדיין לא ידוע אם תאי גזע מולידם להתקיים בלבלב המבוגר. אסטרטגיות מחקר באמצעות-לקס cre שושלת-התחקות בעכברים בוגרים הניבו תוצאות כי גם תמיכה או להפריך את הרעיון כי תאי הבטא ניתן להפיק מן הצינורות, מיקומו המשוער שבו אבות לבלב מבוגרים עשויים להימצא. Vivo ב אלה שיטות cre-לקס התחקות השושלת, לעומת זאת, לא יכול לענות על השאלות של התחדשות עצמית ושתיים בידול קריטריונים רב השושלת צורך להגדיר תא גזע. כדי להתחיל פונה פער הטכני הזה, אנחנו ממציאים מבחני מושבה 3 ממדים עבור אבות לבלב. זמן קצר לאחר הפרסום הראשוני שלנו, מעבדות אחרות שפותחו באופן עצמאי דומה, אך לא זהה, שיטה המכונית assay organoid. בהשוואה assay organoid, השיטה שלנו מעסיקהmethylcellulose, המהווה פתרונות צמיגים המאפשרים הכללת החלבונים תאים מטריקס בריכוזים נמוכים. המבחנים המכיל methylcellulose להתיר זיהוי קל וניתוחים של ובתאים ברמת התא בודד, אשר הם קריטיים כאשר אבות מהווים אוכלוסייה-משנה קטן, כמו במקרה של תאי גזע איבר רבים מבוגר. יחד, תוצאות מכמה מעבדות להפגין במבחנת התחדשות עצמית והבחנה רבה שושלת של ובתאים דמויים לבלב מעכברים. הפרוטוקולים הנוכחיים מתארים שני מבחני מושבה מבוסס methylcellulose לאפיין אבות לבלב עכבר; אחד מכיל תכשיר מסחרי של חלבונים תאי מטריקס murine והשני חלבון תאי מטריקס מלאכותי המכונה הידרוג'ל laminin. הטכניקות המוצגות כאן הן 1) דיסוציאציה של הלבלב ומיון של CD133 + Sox9 / EGFP + תאים ductal מעכברים בוגרים, 2) מניפולציה תא בודד של יםתאי orted, 3) מושבה אחת המנתח באמצעות immunostaining qRT-PCR ו כל ההר microfluidic, ו -4) דיסוציאציה של מושבות עיקריות לתוך תא בודד השעיות מחדש ציפוי לתוך מבחני מושבה משני להעריך התחדשות עצמית או בידול.
Introduction
הלבלב מורכב משלוש שושלות תאים עיקריות; תאים acinar להפריש אנזימי עיכול, צינוריות להפריש mucin להדוף פתוגנים ולהעביר אנזימי עיכול כדי במעיים, ותאי האנדוקרינית להפריש הורמונים, כולל אינסולין וגלוקגון, כי לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז. במהלך ההתפתחות העוברית של הלבלב, תאי ductal מוקדם הם המקור של ובתאים תלת-עוצמה המסוגל והוליד שלושה שושלות של pancreata של בעלי חיים בוגרים 1,2. מכיוון שתאי גזע ובתאים מבוגרים, כגון תאי גזע ממוח העצם, כבר משמשים בהצלחה לטיפול במגוון מחלות 3, יש עניין רב במציאת תאי הגזע ועל מי שהגה בלבלב המבוגר. אם בידוד מניפולציה של תאי גזע ועל מי שהגה לבלב המבוגרים היו אפשריים, תאים אלה יכולים לשמש לטיפול במחלות כגון סוכרת מסוג 1, שבה תאי מפרישי האינסולין נהרסים על ידי אוטואימוניות.
s = "jove_content"> אם ובתאים תלת-עצמה עדיין קיימים צינוריות לבלב מבוגרות לאחר השלמת התפתחות עוברית היא שאלה התווכחה בכבדות בקהילה המדעית. בדיון זה, ושימוש in vivo cre-לקס השושלת-התחקות טכניקות, Inada ועמיתים לעבודה הראו כי תאי ductal בעכברים בוגרים שסומנו בסמן, anhydrase פחמתית השנייה, יכול מעוררים שלוש כל שושלות הלבלב 4. עם זאת, באמצעות סמנים ductal אחרים, כגון HNF1b 5 ו Sox9 2, זה היה להסיק כי תאים ductal אינם המקור העיקרי של תאי בטא בעכברים בוגרים.
לפני מספר שנים, הצענו כי עילת הדיון הנ"ל יכולה להיות בגלל החוסר, בתחום 6,7, של כלי אנליטיים מתאימים שיכול לשמש למדידת התחדשות עצמית ושתיים בידול קריטריונים רב שושלת צורך להגדיר תא גזע. טכניקת in vivo cre-לקס התחקות השושלת ציינההנ"ל יכול לספק ראיות קשר הצאצאים-אב ברמת אוכלוסייה. עם זאת, טכניקת התחקות בשושלת זו מוגבלת שביכולתה כדי להבחין אם ובתאים יחידים יכולים עצמי לחדש להתמיין שושלות מרובות. ניתוח מתא בודד חשוב כי אם אבות מונו-עוצמה כמה, כל אחד עם פוטנציאל באים ממשפחות שונות, נותחו יחד, הם עשויים להופיע באופן קולקטיבי יש יכולות בידול רב השושלת. בנוסף, תאי גזע הם בדרך כלל אוכלוסיית קטין של איבר בוגר. הפעילות של אוכלוסיית תא קטין יכולה להיות רעולה פנים על ידי האוכלוסייה הגדולה. לכן, תוצאה שלילית ממחקר האוכלוסייה אינה מעידה בהכרח על העדר תאי גזע. לבסוף, מעקב שושלת-לקס cre אינו מאפשר כרגע המדידה עצמית והתחדשות.
כדי להתחיל בהתמודדות טכנית הפער בתחום ביולוגיה של התא ובתאים הלבלב, המושבה 7-11 או organoid 12-15 שיטות וציוד טבלה), והשני מכיל הידרוג'ל laminin, חלבון ECM מלאכותי מוגדר 7-11. ובתאים מעורבבים methylcellulose המכיל בינוני חצי מוצק. Methylcellulose הוא חומר אינרטי וצמיג ביולוגית מוכן סיבי עץ, ויש בו נעשה שימוש באופן שגרתי מבחני המושבה hematopoietic 16. את methylcellulose המכיל בינוני חצי מוצק מגביל את תנועתם של ובתאים יחידים, כך שהם לא יכולים מחדש המצרפי. עם זאת, המדיום הוא רך מספיק כדי לאפשר תאים ובתאים לגדול להתמיין מושבה של תאים בחלל 3D. בהמשך למסורת של המטולוגים, תא ובתאים הלבלב כי היה מסוגל והוליד מושבה של תאים היה nאמד יחידת המושבה יוצרי הלבלב (PCFU). PCFUs, כאשר גדל ב assay המושבה ECM המכיל בעכברים, להצמיח מושבות פיברוזיס ששמם "טבעת" מושבות 7. עם תוספת של אגוניסט Wnt, R-spondin1, לתוך תרבות ECM המכיל בעכברים, כמה מושבות טבעת לההפך "צפוף" מושבות 7. במאמר זה, אלה שני סוגי מושבות הגדלים בתרבית ECM בעכברים הם יכונו "טבעת / צפופות" מושבות. כאשר הטבעת / מושבות צפופות הם ניתקו לתוך השעית תא בודדת מחדש מצופות לתוך תרבויות המכילות הידרוג'ל laminin, "האנדוקרינית / acinar" מושבות נוצרות 7.
שימוש יחיד מושבה ניתוחית, נמצא כי רוב מושבות טבעת / סמיך האנדוקרינית / acinar, או ממבוגר (2-4 בן חודש) 7,11 או צעיר (1 שבועות בן) 9 לבלב בעכברים, לבטא את כל השלושה סמני שושלת. הדבר מצביע על כך שרוב PCFUs שמקורם הוא תלת-עצמה. ב assay מושבת ECM המכיל בעכברים, PCFUs בעכברים הבוגר וחסון עצמי לחדש ולהרחיב כ -500,000 פעמים מעל 11 שבועות בתרבות 7. ECM Murine מועדף תומך התמיינות של תאים ductal על שושלות האנדוקרינית acinar, ואילו בנוכחות הידרוג'ל laminin, PCFUs murine מעודדים להבדיל מועדף לתאי האנדוקרינית acinar ופחות אל שושלת ductal 7,9,11. חשוב לציין, אינסולין + גלוקגון - תאי-הורמונלית מונתה נוצר בתרבות הידרוג'ל laminin ולהפריש אינסולין בתגובה לגלוקוז גירוי במבחנה 7,9, דבר המצביע על בגרות פונקציונלית. הבידול תלת-השושלת 7,9 פוטנציאל ההתחדשות עצמית 11 של PCFUs הבודד אושר על ידי המיקרומניפולציה תא בודד, כלומר, culturing תא אחד לכל טוב עבור היווצרות מושבה. יחד, תוצאות אלו מספקים ראיות שיש עצמית חידוש,-poten תלתt, דמויי תאים ובתאים בלבלב בעכברים לאחר הלידה המציגות פעילויות בתרבות 3D.
מבחני PCFU murine המתואר במאמר זה לקוחים מתוך assay המושבה לפני המיועד ובתאים הבדיל מתאי גזע עובריים בעכברים (mESCs) 17. פרוטוקול זה מתועד בפירוט אחר פרסום יופיטר 18. הרכיבים וטכניקות התרבות נדרשו לבצע את assay מושבת ECM המכיל בעכברים עבור PCFUs המבוגר זהים עבור אבות נגזרות המסקלין 17,18. לכן, היבטים אלה של assay לא יחזור על עצמו כאן; במקום הנהלים הבאים יטופלו: 1) דיסוציאציה של הלבלב מבוגר ומיון תאים CD133 + Sox9 / EGFP + ductal, המעשירים PCFUs מעכברים בוגרים 7, 2) מניפולציה תא בודד של תאים ממוינים, 3)-מושבה אחת מנתח באמצעות qRT-PCR ו כל הר immunostaining, ו -4) דיסוציאציה של Colonie microfluidicים לתוך ההשעיה תא בודד מחדש ציפוי לתוך ECM בעכברים או מבחני המושבה הידרוג'ל laminin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרה אתית: אנו דבקי הסטנדרטים האתיים מקובל מחקר כדי להבטיח את האיכות ואת היושרה של התוצאות. ניסויים בבעלי חיים נערכים על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת השימוש ב העיר של תקווה.
1. כן השעית תא בודד מתוך למבוגרים Murine pancreata
הערה: בפרסומים לפני 7,11, CD-1 או רקע B6 עכברים שימשו; הן רקע הניב תוצאות דומות. קו עכבר מהונדס (המיועד Sox9 / EGFP) עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת מונע על ידי Sox9 לוקוסים 19,20, נוצר ברקע CD-1.
- להרדים 3 עד 5 עכברים בוגרים באמצעות גז CO 2 למשך 1-2 דקות או עד מפסיק לנשום. לאחר מכן, לבצע פריקת צוואר רחם על כל עכבר.
- לנתח ולהכין את pancreata.
הערה: לנתח העכברים בהקדם האפשרי לאחר המתת חסד. זה חשוב כדי למנוע עיכול אוטומטי של הלבלב בשללשינויים שלאחר המוות.- ביצוע חתך אנכי על קו האמצע של דופן הבטן של העכבר באמצעות מספריים ופתח את חלל הבטן. מצא את הטחול להשתמש במלקחיים כדי להרים אותו בעדינות. חותכים את רקמת החיבור בין הטחול ואת האונה הטחול של הלבלב עם מספריים.
- חזור על הנוהג הזה עבור אונות תריסריון קיבה של הלבלב. מניחים את רקמות הלבלב בצלחת פטרי על קרח המכיל פתרון חיץ פוספט שונה של קר Dulbecco (DPBS), אלבומין 0.1% שור (BSA), ו פניצילין סטרפטומיצין (P / S; פתרון מלא יועד PBS / BSA).
- הסר רקמות שומן מהלבלב תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מלקחיים בסדר-קצה.
הערה: זה קריטי עבור בריאותו של תאי לבלב ניתקו בשלבים הבאים.- (אופציונלי) סמן את pancreata פלואורסצנטי ירוק תחת סטראו הקרינה באמצעות עירור ננומטר 488-509 כדי להבטיחביטוי EGFP.
- במנדף בתרבית רקמה, יש לשטוף את הרקמה שלושה ברצף פעמים בשלוש 100 מ"מ צלחות פטרי המכיל 10 מיליליטר של קר PBS / BSA.
- ביצוע חתך אנכי על קו האמצע של דופן הבטן של העכבר באמצעות מספריים ופתח את חלל הבטן. מצא את הטחול להשתמש במלקחיים כדי להרים אותו בעדינות. חותכים את רקמת החיבור בין הטחול ואת האונה הטחול של הלבלב עם מספריים.
- צור חתיכות קטנות של רקמות.
- מעביר את pancreata גזור לצלחת יבשה סטרילית פטרי כדי להסיר כמה שיותר PBS / BSA ככל האפשר, ולהעבירם אחר צלחת פטרי יבשה על קרח.
- הכן PBS / BSA המכיל DNase אני על ידי הוספת 2 μl DNase אני פתרון מניות (1 מיליון יחידות [MU] / מ"ל) לכל 1 מ"ל PBS / BSA.
הערה: פתרון זה מיועד PBS / BSA / DNase I. הפוך ~ 200 מ"ל של פתרון זה בבת אחת, אשר יכסה אחד הניסוי מיון. - לרכך את pancreata באמצעות מספרי האביב במשך 2-3 דקות או עד הרקמה לחתיכות בסדר. להוסיף 2-3 מ"ל של קר PBS / BSA / DNase אני אל פיסות הרקמה בצלחת פטרי להשעות אותם.
- מעבירים את חתיכות רקמה על צינור חרוטי 50 מ"ל על הקרח עם טפטפת 10 מ"ל. תביאו את הנפח הכולל עד 10 מ"ל עם PBS / BSA / DNase l לאחר שהחלים רקמות ככל האפשר.
- תקציר הבתרים הלבלב לתוך תאים בודדים בעיקר.
- להוסיף B collagenase (100 מ"ג / מ"ל המניות) ב 350-450 μl / 10 מ"ל אל פיסות הרקמה דגירה הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 8 דקות, מתערבל כל 3-4 דקות. השתמש מזרק 10 מ"ל עם מחט 16 ½ G להכין ובהמשך לרסס הפתרון רקמות לאורך הקיר של הצינור 50 מ"ל ב RT. חזור שבע פעמים זה.
הערה: השתמש מספיק כוח כדי לשבור את צבירי תאים, אך להימנע בועות יצירה שעשויה להרוג את התאים. - החזר את הצינור אל באמבט מים ב 37 ° C במשך 8 דקות ומערבבים על ידי מתערבל כל דקות 3-4. מזרק הרקמה מעלה ומטה שבע פעמים, כאמור לעיל, ומניח מדגם (10 μl) של הפתרון רקם על צלחת פטרי יבשה. שים פתרון הרקמה תחת מיקרוסקופ הפוכה, שלב בניגוד, אור עם עדשה אובייקטיבית 10X. צפו תאים בודדים וכמה ג קטן בגודלאשכולות ell להיות נוכחים.
- טפלו התאים על הקרח מנקודה זו ואילך להאט או להפסיק את הפעילות של collagenase. כוון את עוצמת הקול ל -50 מ"ל באמצעות קר PBS / BSA / DNase I. צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C, ו resuspend ב 5 מ"ל של DNase קר PBS / BSA / I באמצעות pipettor P1000.
- להוסיף B collagenase (100 מ"ג / מ"ל המניות) ב 350-450 μl / 10 מ"ל אל פיסות הרקמה דגירה הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 8 דקות, מתערבל כל 3-4 דקות. השתמש מזרק 10 מ"ל עם מחט 16 ½ G להכין ובהמשך לרסס הפתרון רקמות לאורך הקיר של הצינור 50 מ"ל ב RT. חזור שבע פעמים זה.
- סנן להניב השעיות תא בודדות ולשטוף.
- סנן את התאים דרך כוס מסנן רשת ניילון 70 מיקרומטר ולאחר מכן דרך כוס מסנן רשת ניילון 40 מיקרומטר.
- Resuspend התאים 5 מ"ל קר PBS / BSA / DNase אני לספור את התאים.
הערה: במשך 2-4 חודשים בן B6 או CD-1 עכברים, כל לבלב עשוי להניב ~ 5 או 10 מיליון תאים, בהתאמה. מספרים אלה עשויים להשתנות בין experimentalists השונה. אם פסולת תאים מופרזת נמצא בספירה, ולהביא את נפח עד 50 מ"ל עם קר PBS / BSA / DNase אני צנטריפוגות התאים ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. - כוון את עוצמת הקול של השעית התא בריכוז של 2 x 107 תאים מ"ל / באמצעות I. קר PBS / BSA / DNase
2. מיין לתאים עשר לבלב מושבת יוצרי אבות
הערה: מעכברים B6, CD133 + אבל לא CD133 - תאים מועשרים עבור PCFUs 7,9,11. תאי CD133 + מייצגים ~ 13% מכלל תושבי העיר ניתקים לתאי לבלב לאחר שכל פרמטרי gating מוחלים 11. מ CD-1 עכברים, CD133 + Sox9-EGFP + תאים בדרך כלל מייצגים ~ 4% של תאי לבלב מוחלטים, אוכלוסיית תא זה היא מועשר עבור PCFUs 7. מיון של תאי CD133 + Sox9 / EGFP + מתואר כאן.
- להכתים את תאי הלבלב ניתק.
- חסום את ההשעיה תא בודד הלבלב כולו להפחית את הלא ספציפית מחייב ידי דוגרים ההשעיה תא יחיד עם CD16 אנטי עכבר / 32 בשעה 10 מיקרוגרם / מ"ל ריכוז סופי עבור 5 דקות על הקרח.
- הסרת aliquot של 1 x 10 6 תאים (50 &# 181; l) להכתים עם נוגדן אלוטיפ, IgG1 עכברוש מצומדות ביוטין ב 5 מיקרוגרם / מ"ל ריכוז סופי, במשך 20 דקות על הקרח, מתערבל כל 5-7 דקות.
- הסרת aliquot של 1 x 10 6 תאים (50 μl) ולשמור על הקרח כפקד בלא כתם.
- הכתם שארית התאים עם נוגדן ראשוני ביוטין מצומדות אנטי עכבר CD133, בשעה 5 מיקרוגרם / מ"ל ריכוז סופי, במשך 20 דקות על הקרח, מתערבל כל 5-7 דקות.
- תאי כביסה.
- שטפו את אלוטיפ דגימות מוכתם נוגדן ראשוני על ידי הבאת את עוצמת הקול עד 1 מ"ל עם PBS / BSA / DNase אני צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. חזור על שלב זה כביסה.
- Resuspend שליטה אלוטיפ דגימות מוכתם הנוגדן העיקרי PBS / BSA / DNase אני, כך הריכוז הסופי הוא 2 x 10 7 תאים / מ"ל.
- הכתם אלוטיפ דגימות מוכתם נוגדן ראשוני עם streptavidin (STV) allophycocyanin -labeled (APC) בשעה 2 & #181; g / ml ריכוז סופי. דגירה במשך 15 דקות על קרח, מתערבל כל 5-7 דקות.
- כביסה תאים ו -4 ', 6-diamidino-2-phenylindole מכתים (DAPI).
- שטפו את אלוטיפ דגימות מוכתם נוגדן ראשוני פעמיים עם אני PBS / BSA / DNase, כמו בשלב 2.2. Resuspend התאים PBS / BSA / DNase אני עם DAPI (0.2 מיקרוגרם / הריכוז הסופי מ"ל). ההיקף הסופי של מדגם שליטת אלוטיפ צריך להיות 0.5 מיליליטר.
הערה: ודא כי הצפיפות הסופית של מדגם הנוגדן מוכתם העיקרי מתאימה הסדרן לשמש. ריכוז של 5 x 10 6 תאים / מ"ל משמש באופן שגרתי למיון. - כוון את עוצמת הקול של תאים בלא כתם 0.5 מ"ל עם PBS / BSA / PS / DNase I. מסנן כל התאים דרך רשת 20 מיקרומטר לפני מיון לשמור על התאים על הקרח בחושך.
- שטפו את אלוטיפ דגימות מוכתם נוגדן ראשוני פעמיים עם אני PBS / BSA / DNase, כמו בשלב 2.2. Resuspend התאים PBS / BSA / DNase אני עם DAPI (0.2 מיקרוגרם / הריכוז הסופי מ"ל). ההיקף הסופי של מדגם שליטת אלוטיפ צריך להיות 0.5 מיליליטר.
- מיון התאים.
- השתמש זרבובית 80 מיקרומטר או גדולים למיון.
הערה: תאי האנדוקרינית לבלב Murine נוטים ללחץ פיזי. הוwever, PCFUs בעכברים אינו מופיע להיות מושפע הלחץ שנגרם על ידי עובר דרך סדרן 7. - רוכשת אירועים התא ופרמטרים ניתוח על סדרן. שער התאים עבור קדימה באזורי פיזור הצד להוציא תא פסול 7. שער עבור רוחבי קדימה פיזור בצד להוציא כפילויות התא. שער להוציא DAPI + תאים מתים 7. בחר gating פרמטרים עבור אותות EGFP ו CD133-APC המושתתים על הערכים מתא אלוטיפ (איור 1).
- אוספים את התאים מסודרים לתוך 5 מ"ל צינורות פוליסטירן המכיל 1.5 מ"ל של מדיום DMEM / F12 בתוספת 5% נסיוב עגל עוברית (FCS). צנטריפוגה האוכלוסיות מיון ב 400 XG במשך 5 דקות ו resuspend בנפח קטן (~ 200 μl) של או DMEM / F12 או PBS / BSA / DNase אני בתוספת 5% FCS. שמור את התאים על הקרח עד לשימוש.
- השתמש זרבובית 80 מיקרומטר או גדולים למיון.
- ספירת CD133 + Sox9-EGFP + תאים המתקבלים הסדרן. קח10 מדגם תא μl לספור את התאים עם hemacytometer כדי לקבוע את צפיפות התאים.
הערה: שימוש hemacytometer מומלץ כי ספירת מכונית מן הסדרן היא בדרך כלל לא אמינה.
3. פלייט תאים ממוינים לתוך Assay המושבה המכילים חלבונים Murine ECM
הערה: עיין פרוטוקולים מפורטים עבור ציפוי של תאים לתוך assay המושבה ECM המכיל murine אחר פרסום יופיטר 18.
- כן תרבות מדיה.
- כן בינוני תרבות המכיל בינוני DMEM / F12, 1% (wt / v) methylcellulose, 5% (v / v) חלבוני ECM בעכברים, 50% (v / v) בינוני מותנות מתאי לבלב דמוי המסקלין נגזר, 5% (v / v) FCS, 10 מילימול / nicotinamide L, 10 ng / B Activin רקומביננטי אנושי מ"ל, 0.1 nmol / L exendin-4, ו -1 ng / הצמיחה של אנדותל כלי הדם מ"ל גורם-A. שיטות להפקת המדיום המותנה מפורטות במקום אחר 18.
- להוסיף 750 ng / ml של RSPO-1 עד בינוניאם היווצרות מושבה צפופה היא רצויה.
- דגירת תרבות חלבון ECM בעכברים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 3 שבועות.
4. התרבות תאים ממוינים ב 1 נייד לכל טוב
הערה: ההליכים הבאים חלים על מניפולציה תאים בודדים באמצעות טפטפות היד לפה. גישה חלופית היא לרכוש micromanipulator. Micromanipulator טיפוסי כולל מיקרוסקופ הפוך עם פלטפורמת ג'ויסטיק מופעל, ממונע.
- כן פיפטות פסטר זכוכית.
- באמצעות מבער בונזן, להוציא את קצה פיפטה פסטר זכוכית לנקודת קנס (~ 30 מיקרומטר בפתיחה). את pipettes הזכוכית פסטר צריך פקק כותנה כדי ליצור מחסום לזרימת האוויר מהמפעיל.
- חיטוי טפטפות זכוכית פסטר להטה ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות עבור עיקור.
- כן 96-פלטות היטב לתרבות.
- כן הסכם בינוני תרבות חצי מוצק קרing לפרוטוקול שתואר לעיל 18.
- מחלק את המדיום לתוך הבארות הפנימיות של צלחת 96-היטב נמוכה מחייבת שטוח תחתון ב 100 μl / גם באמצעות מזרק 1 מיליליטר. מלא את הבארות החיצוניות עם מים סטריליים כדי לשמור על לחות.
- מניחים את צלחת תרבות על הקרח עד לשימוש.
- הכן את התאים הממוינים.
- הוסף ~ 6,000 תאים שנאספו סדרן 2.5 נפח סופי מ"ל של DMEM / F12 / PS FCS המכיל 10% ו methylcellulose 1% בתוך שפופרת קלקר 5 מ"ל. לנער במרץ כדי לערבב את המרכיבים. מתן 5 דקות או עד הבועות לצוף אל החלק העליון של הצינור. צעד זה אינו צריך להתבצע על קרח.
- מחלקים את פתרון התא לשני מנות 35 מ"מ ב 1 מ"ל / תבשיל באמצעות מזרק 1 מ"ל עם 18 ½ מחט G.
- מורחים את פתרון התא בצלחת ידי נדנדה המנה בעדינות ביד. אל תאפשרו בינוני חצי מוצק להגיע למרווח של המנה 35 מ"מ, כמו תאים בודדים בשוליים של cann היטבot להיות נצפה בבירור באמצעות מיקרוסקופ אור הפוכה.
- הכן את משטח העבודה בסביבות מיקרוסקופ.
- הכן תמיסה המכילה DMEM / F-12 methylcellulose בינוניים 1% ללא כל התאים (בינוני "אין תאים '), ולחלק את הפתרון (כמתואר 4.3.2) לשתי 35 מ"מ צלחות פטרי (1 מ"ל לכל צלחת) .
- נקי ולנגב את אזור העבודה סביב מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך עם פתרון אלכוהול 70%.
- הרכב את פיפטה עם חתיכת הפה.
- פיק פיפטה פסטר זכוכית סטרילית כי היה מוכן בשלב 4.1. חבר את הקצה הגדול של קצה פיפטה פלסטיק 1 מ"ל לחלק העליון של פיפטה פסטר זכוכית. חבר את הקצה הקטן של קצה פיפטה פלסטיק 1 מ"ל ל קצה אחד של צינור גומי דק דופן, ואת שופר אל הקצה השני של הצינור. השתמש באותו פיפטה זכוכית להרים מספר תאים מאותה קבוצה.
- צייר למעלה, על ידי יניקת פה, נפח קטן (~ 10 עד 50 μl) של"אין תאים" חצי מוצק פתרון עשה צעד 4.4.1 עם פיפטה פסטר זכוכית.
הערה: הפתרון חצי מוצק על הפתח הצר של פיפטה הזכוכית פסטר יוצרת התנגדות זרימה מספקת מחסום על מנת למנוע זיהום של התאים להיות ניטל.
- בחר תא יחיד.
- מניחים את צלחת 35 מ"מ המכיל את התאים מסודרים על הבמה מיקרוסקופ ולהסיר את המכסה.
- מצא את התאים באמצעות עדשה 10X אובייקטיבי התמקדות תא מתאים להיות נטל.
- מצא ומניחים פתיחת קצה פיפטה ליד התא של עניין. החל יניקה דרך הפה.
הערה: התנועה של התא צריכה להיות די איטית, כך שאין סיכון לאבד את התא במהלך התהליך מאוחר יותר. התנועה של תא הזנת פתיחת פיפטה צריכה להיות גלויה. אם הזרימה נעה מהר מדי, לשנות כדי פיפטה עם פתח צר.
- להפקיד את התא הבודד לתוך באר תרבות.
- לאחר התא נמצא פיפטה, להשתמש בלשון לעצור את הזרימה על ידי חסימת פתיחת פי החתיכה. השהה בקצרה לפני נסיגת הקצה מהמדיום חצי המוצק כדי להבטיח כי המדיום חצי מוצק הפסיק לזרום.
- הניחו את קצה פיפטה לתוך באר צלחת 96-היטב מוכן בשלב 4.2. לדחוף את התא לאט על ידי נושבת בעדינות לתוך חתיכת הפה. מארק הבאר לאחר התא מופקד, כדי למנוע ציפוי שני תאים לתוך באר.
- ודא כי תא בודד מושם ובכן תרבות.
- הניחו את קצה פיפטה ב 'לא-תא' מוכן בינוני בשלב 4.4.1. תוך שמירה על פתיחת הקצה תחת מיקרוסקופ, לדחוף את הפתרון חצי מוצק נותרים. צפו שום תא לזרום החוצה את קצה פיפטה.
- כדי לבדוק פעמים, למצוא את המיקום גם בתרבות שבה התא הבודד הושתל.
- תרבות תאים אחת ב 37 ° C ב 5% CO 2 עדעד 3 שבועות.
5. פיק מושבות הפרט מ תרבות חצי-מוצק עבור ניתוח Microfluidic qRT-PCR
הערה: שלושה שבועות לאחר הציפוי מסודר CD133 + Sox9 / EGFP + תאים לתוך assay ECM המכיל המושבה בעכברים, טבעת או מושבות צפופות נוצרות 7 (איור 2). כאשר הטבעת / מושבות צפופות הם ניתקו לתוך השעית תא בודדת מחדש מצופות לתוך תרבות הידרוג'ל laminin, מושבות האנדוקרינית / acinar נוצרות לאחר כשבוע 7 (איור 2). כדי לקבוע את הרכב שושלת היוחסין של כל מושבה, ניתוח microfluidic qRT-PCR משמש כדי לזהות את הביטוי של סמני שושלת 7. עבור הגברה מראש, מושבה ממוזגת תערובת אמן המכיל תערובת בדיקת TaqMan, מאגר תגובה, ואת עילי III 21. השבב 48.48 מערך מכן משמש תגובות microfluidic PCR 21.
- הכן את ההגברה מראש PCRלערבב המכיל 48 בדיקות.
- פיפטה 1.5 μl של כל בדיקה TaqMan (מלאי 20x) בצינור 1.5 מ"ל. להוסיף 78 μl של חיץ TE כדי לכוונן את עוצמת הקול כדי 150 μl.
- מכינים את תערובת אמן על ידי הבאים פרוטוקולים מהיצרן 21.
- מניחים 9 μl של תמהיל מאסטר לתוך צינור כל תגובה 0.2 מ"ל דק דופן מתאים PCR, וחזור על שלב זה עד 48 צינורות.
- פיק מושבות אחת מן התרבות חצי מוצק.
הערה: הטבעת / מושבות צפופות שגודלם עולים על מושבות האנדוקרינית / acinar, עם בקטרים הנעים בין 50 ~ 400 מיקרומטר 9,11. לכן, צלצול יחיד / מושבות צפופות נקטפות באמצעות pipettor P10 לבוש עם קצה פיפטה 10 μl מקופל לתוך צורה מעוגלת. עבור לקטוף את האנדוקרינית הקטנה / מושבות acinar (איור 2), מתייחס לשלב 4.- אתר מושבה של עניין בהגדלה גבוהה (למשל, עדשה אובייקטיבית 20X), להפחית את ההגדלה, ו aspiratדואר המושבה. (אופציונאלי) קח תמונת שלב ניגודיות של המושבה בשלב זה לתעד את המאפיינים הגלויים של המושבה.
- מעבירים את המושבה לתוך הצינור PCR המכיל 9 μl של תמהיל מאסטר.
- פיק למושבה הבאה. עד 45 מושבות בסך הכל ניתן לנתח לכל בטווח PCR, עוזבות 3 נקודות עבור פקדים.
- מיצוי RNA וסינתזה cDNA עם הגברה מראש.
- וורטקס הדגימות במרץ לפני ביצוע התגובה התרמית.
- בצע את תגובות רכיבת תרמית על פי הוראות היצרן 21. מושבות טבעת / צפופות דורשות 14 מחזורים, האנדוקרינית / מושבות acinar דורשות 16-20 מחזורים, תאים בודדים דורשים 22 מחזורים.
הערה: cDNAs הגברת קדם ניתן לאחסן ב -20 ° C לפני ניתוח PCR microfluidic.
- הפעל PCR תגובות עוקבות, באמצעות שבב microfluidic, על פי הוראות היצרן 21.
- קציר ולתקן מושבות.
- תרימי המושבות מתחת למיקרוסקופ, כמו בשלבים 4 או 5.4, ולהוסיף אותם פתרון paraformaldehyde 4%. דגירה O / N ב 4 ° C עם רעד עדין.
- שטוף את המושבות עם 1X PBS פעמים במשך 10-30 דקות ב RT. אחסן את המושבות הקבועות ב 4 ° C ב 1.5 מיליליטר צינורות חתומים עם פרפין.
- כתם המושבות עם נוגדנים.
- מושבות העברה אחד טובה של צלחת שחורה 96-היטב עם תחתית שקופה המכילה 200 μl של חיץ חסימה (חמורים 5% ו / או סרום עיזים, 0.1% Triton X-100 ב PBS 1x). דגירה O / N ב 4 ° C עם רעד עדין.
- לדלל את הנוגדן העיקרי לריכוז שנקבע מראש (למשל, 1: 500 עבור אוגר נגד mucin 1 נוגדן) באמצעות חסימת חיץ. מעביר את המושבות נקיות היטב עם 200 μl של נוגדן ראשוני, דגירת O / N ב 4 ° C עם רעד עדין. Wאפר המושבות 3 פעמים עם PBS המכיל 0.1% Tween 20. העברת המושבות לתוך באר חדשה עם 200 μl של 1x PBS / 0.1% Tween 20 במשך 10 דקות ב RT עבור כל שטיפה.
- לדלל את הנוגדנים משני לריכוז שנקבע מראש (למשל, 1: 2,000 נוגדן אוגר עז נגד ארמני) באמצעות חיץ חסימה. שמור את הפתרון בחושך. מעביר את המושבות לנקות בארות המכילות 200 μl של נוגדנים משני, דגירה במשך שעה 2 ב RT. שטפו את מושבות 3 פעמים עם PBS / 0.1% Tween 20, כמו בשלב 6.2.2.
- מושבות מתפרצות כתם עם DAPI ולדמיין עם מיקרוסקופיה confocal.
- מעביר את המושבות לתוך בארות עם PBS המכיל 300 ננומטר DAPI דגירה במשך 5 דקות ב RT.
- מעבירים את מושבות DAPI מוכתם לצלחת זכוכית התחתונה פטרי 35 מ"מ לשם ויזואליזציה. במקום להחליק על גבי העטיפה של מושבות על מנת למנוע אידוי.
- שימוש במיקרוסקופ confocal כדי ללכוד את התמונות. כדי להמחיש DAPI staining, השתמש גל עירור שני פוטונים של 730-950 ננומטר. השתמש לייזר ארגון עם אורך גל של 458 ננומטר לרגש fluorochromes עם אורכי גל הפליטה של ננומטר 519 ו 561. השתמש לייזר הליום-נאון עם אורך גל של 633 ננומטר לרגש fluorochromes עם אורכי גל הפליטה של 665 ננומטר.
7. לנתק ו Re-צלחת ראשית טבעת / מושבות צפופות לתוך מבחני מושבה משנית
הערה: כל הנהלים צריכים להתבצע בתנאים סטריליים. הימנע הלם קר אל התאים בהליך זה ככל האפשר, כגון הצבת תאים על תאי קרח או שטיפה עם PBS קר / BSA. שיטות אלה מצמצמות את הכדאיות של תאים מצופים מחדש.
- הכינו פתרונות.
- חיץ לשטוף טרום חמים (DMEM / F12; P / S; 0.1% BSA) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- טרום לחמם צלחת 96-היטב (תחתית שטוחה; נמוך המחייבת) בתוך 37 ° C חממה. הוספת 100 μl 100% FCS כדי גם אחד צלחת 100 μl פתרון 0.25% טריפסין- EDTA על השניטוֹב.
- אסוף המושבות.
- פיק וברכת סך של 20 או יותר טבעת / מושבות צפופות בתרבויות ראשוניות באמצעות 10 טיפי פיפטה μl, כפי שמתוארת בשלב 5.4.
- מניחים את מושבות חם (לפחות RT) חיץ לשטוף (בערך 1000 μl) בצינור 1.5 מ"ל ספין ב 400 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant.
- לנתק את המושבות לתוך תא בודד השעיות באמצעות טריפסין.
- מעביר את נפח הנותרים (20 μl או פחות), אשר מכיל את המושבות, לבאר המכיל פתרון טריפסין חם (שהוכן 7.1).
- דגירה את הצלחת באינקובטור 37 ° C (לא באמבט מים) עבור 1.5 דקות. הסר את הצלחת ו פיפטה מושב כמה פעמים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות אחרות.
- הסר את את הצלחת ו פיפטה ולמטה עוד כמה פעמים כדי לשבור את המושבות. בדוק תחת מיקרוסקופ כדי לראות אם המושבות פוזרו בעיקר לתוך השעית תא בודד.הימנע-עיכול על המושבות.
- לעצור את התגובה טריפסין ידי הוספת FCS.
- העברת 100 μl של FCS החם לתוך הבאר המכילה את התאים. עד פיפטה ולמטה כמה פעמים. העברת התאים לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל 1,000 μl חיץ לשטוף חם. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות ב RT.
- שטפו פעמיים עם חיץ חם.
- Re- להשעות את התאים ~ 200 μl של חיץ או בינוני תרבות.
- ספירת תאים באמצעות hemacytometer. שמור את ההשעיה תא ב RT.
- Re-צלחת תאים ניתק לתוך מבחני המושבה משני המכיל גם חלבונים ECM בעכברים (5% v / v) או הידרוג'ל laminin (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
הערה: לקבלה מחדש תאי ציפוי לחלבוני ECM בעכברים, השתמש 2,500-5,000 תאים לכל היטב בתרבות במשך 2-3 שבועות. לקבלת מחדש pating לתוך תרבות הידרוג'ל laminin, השתמש 10,000-25,000 תאים לכל טוב ותרבות 7-12 ימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתן להעשיר תאי בוגרים ובתאי לבלב על ידי מיון תא מופעל קרינה (איור 1). שורת העכבר המהונדס Sox9 / EGFP משמשת כאן נוצרה הראשונה כתוצאה של פרויקט אטלס מוח GENSAT 19, ואת כתב EGFP נמצא תחת השליטה של כרומוזום חיידקים מלאכותי המכיל ~ 75 kb במעלה או ~ 150 kb רצפים במורד זרם של Sox9 20 . בעכברים אלו, EGFP תוויות צינוריות הלבלב ביעילות ובאופן ספציפי 22. לבלב היה רכש ו ניתק לתוך ההשעיה תא בודד, ומוכתמת עם נוגדנים נגד CD133 מצומדות עם ביוטין, ואחריו מכתים עם נוגדנים משני מצומדות עם STV-APC. התאים וכתוצאה מכך נותחו על ידי cytometry זרימה עם פרמטרי gating מתאימים (איור 1). תאים שהושגו באמצעות פרמטרים gating שונים ניתן למיין מצופה לתוך מבחני המושבה המכילים methylcellulose עבורהיווצרות המושבה. במחקרים קודמים, צוין כי יכולת המושבה להרכיב נמצאה רק בתאי CD133 + Sox9 / EGFP המיון + ductal 7.
המושבות נוצרו מבחני המושבה המכיל methylcellulose מוינו לפי המורפולוגיות שלהם, כפי שנצפו באמצעות הפוך, שלב בניגוד, מיקרוסקופ אור (איור 2). בהמשך לכך, מושבות בודדות היו שנבחר בקפידה ונותח על ידי ניתוח microfluidic qRT-PCR עבור ביטוי גנים (איור 3) או על ידי כל הר immunostaining עבור ביטוי חלבון (איור 4). במחקרים שפורסמו 7,9,11, נמצא כי רבי מושבות בודדות הביעו סמני שושלת עבור צינור (mucin-1), acinar (עמילאז) ומערכת האנדוקרינית (אינסולין) תאים, המעיד כי הרוב המכריע של PCFUs הייזום עבור מושבות אלה תלת-עוצמה. חלקם של השלוש שושלות תאים בכל מושבה עם זאת,, הושפע סוגים והריכוזים של חלבוני ECM נוכחים 7,9 מבחני מושבה המכיל methylcellulose. חלבוני ECM Murine מגורה התחדשות עצמית של PCFUs ו התמיינות תאי ductal ואילו הידרוג'ל laminin מועדף תמכה הבידול של שושלות האנדוקרינית acinar תא 7,9,11.
איור 1. הזרימה cytometry ניתוח של תאים בלבלב ניתקו מעכברים בוגרים מראים דפוסי מכתים פי שני סמני תא ductal, CD133 ו Sox9. Sox9 / עכברים מהונדסים EGFP שהכיל Sox9 מונחה לוקוסי כתב EGFP שמש. שער מיון נציג (תיבה אדומה) עבור CD133 לבלב + Sox9 / EGFP + תאים מוצג. CD133 + Sox9 / EGFP + תאים מועשרים עבור PCFUs 7.les / ftp_upload / 54,016 / 54016fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מושבות איור 2. עם מורפולוגיות שונות נוצרו מבחני מושבה המכיל methylcellulose. Photomicrographs נציג של טבעת, צפופות האנדוקרינית / acinar מושבות מיקרוסקופ שלב בניגוד מואר על ידי אור הנראה מוצגות. טבעת ומושבות צפופות נוצרות כאשר PCFUs המסודר טרי מצופה לתוך מדיום תרבות המכיל חלבוני ECM murine ותרבותיים במשך 3 שבועות 7. מושבות האנדוקרינית / acinar נוצרות לאחר מחדש ציפוי הטבעת הניתקת או תאי מושבה צפופים לתוך מדיום תרבות המכילה הידרוג'ל laminin ותרבותי עבור ~ 1 שבוע 7. ברי סולם עבור טבעת ומושבות צפופות = 100 מיקרומטר. סרגל קנה מידה עבור אנדו / acinar מושבות = 25 μ;. מ ' אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. מושבות פרט גדלו חלבוני ECM murine הביעו סמנים עבור ductal, acinar ותאי האנדוקרינית. נציג תוצאות של ניתוח microfluidic qRT-PCR של מושבות טבעת פרט. כל טור מייצג מושבה אחת. הרמות של גני הביטוי מבוטאות כמפה חום כאן, עם צבעים חמים יותר מעידים על ביטוי גבוה וצבעים קרים מעיד ביטוי תחתון. רבות מן המושבות היחידות להביע לפחות אחד הגנים בכל פנל על הסמנים המעידים על צינור, האנדוקרינית או שושלת תא acinar. נתונים אלה מראים כי חלק ניכר מן המושבות הבודדות להביע סמנים תלת-שושלת, ולהציע שרובPCFUs שמקורם הוא תלת-עצמה. נתון זה שונה מדמות שפורסמו בעבר 7. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מושבות איור 4. שני רינג הביע סמן חלבון ductal mucin 1. תוצאות נציג של כל הר immunostaining של מושבות טבעת, מראה ביטוי החלבון של סמן ductal 1 mucin (צבע ירוק). הגרעינים הם נגד מוכתם DAPI (צבע כחול). תאים רבים במושבות טבעת אלה מבטאים חלבון mucin 1. זה עולה בקנה אחד עם תוצאות microfluidic qRT-PCR מראים כי מושבות טבעת גדלי חלבוני ECM murine מבטאות רמות גבוהות (צבעים כהים יותר באיור 3) של mucin1 וסמני תאי ductal אחרים. סרגל הסולם מייצגזה 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. מבחני מושבת לבלב למדידת התחדשות עצמית והבחנה רבה שושלת של ובתאי פרט בתרבות. עבודת נציג מוצגת. מבחני מושבת הלבלב שלנו מכילים חומר צמיג, methylcellulose, כך בינוני התרבות הופך חצי מוצק. בינוני חצי מוצק מגביל את התנועה ומונע הצטברות של ובתאים יחידים (מסומנת באדום). עם זאת, המדיום הוא רך מספיק כדי לאפשר תא אב יחיד עצמי לחדש ו / או להבדיל, ויהפוך מושבה של תאים (המיוצגים על ידי עיגולים אדומים מרובים). לעומת זאת, תאים בודדים שאין להם יכולות מושבה יוצרי, <em> כלומר, הלא-אב תאים (מסומן בכחול), יישאר כפי תאים בודדים או למות לאורך זמן בתרבות. Methylcellulose גם מאפשר הכללת חלבוני ECM בריכוזים נמוכים, כגון 5% חלבוני ECM בעכברים או 100 מיקרוגרם / הידרוג'ל laminin מיליליטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מבחני מושבת לבלב המושבה אחת ניתוחי המתואר כאן נוצרו בהשראת מבחני מושבת hematopoietic המכיל methylcellulose אשר שחקו תפקיד מכריע בפענוח הביולוגיה של תאי אבות היווצרות דם בעשורים האחרונים 23. מבחנים אלה (איור 5), תאים ניתקים לבלב הם מצופים לתוך methylcellulose המכיל תקשורת חצי מוצקה עם גורמי גדילה מתאימים וחלבוני ECM התומכים ההיווצרות של טבעת, צפופות או האנדוקרינית / acinar מושבות 7. תא אב יחיד כי הוא מסוגל והוליד מושבה של תאים שמכונה PCFU. בכך שהיא מכנה מושבות בודדים באמצעות microfluidic qRT-PCR ו כל הר immunostaining, הפוטנציאלים השושלת של PCFUs שמקורם יכול להיות מוסק. נמצא כי רוב PCFUs בעכברים בוגרים הם תלת-עוצמה, המסוגל והוליד ductal, acinar, ותאי השושלת האנדוקרינית במבחנה 7,9. בעוד murחלבוני ECM ine לעודד את הבידול של PCFU תלת-עצמה כלפי שושלת צינור, הידרוג laminin מאפשר האנדוקרינית חזק והבחנת שושלת תא acinar 7,9. כדי להעריך את יכולת התחדשות עצמית במבחנה של PCFUs, הטבעת או מושבות צפופות גדלו ב assay מושבת ECM murine עיקרי ניתן ניתקת לתוך השעית תא בודד מחדש מצופה לתוך assay מושבת ECM murine משני 7. נמצא כי PCFUs מורחבת ~ 500,000 פעמים חלבונים ECM בעכברים מעל 11 שבועות 7. השלבים הקריטיים כוללים הסרת רקמות השומן מן pancreata הגזור, הימנעות יתר העיכול של תאי לבלב ידי collagenase, ומזעור הלם קר אל תאי מושבת טבעת הניתק / הצפופים לפני מחדש ציפוי. מאסטרינג המיקרומניפולציה של תאים בודדים עשוי לקחת קצת זמן; סבלנות ותרגול נדרשים.
לעומת מבחני תא אב לבלב אחרים, כולל תרבות 2D 24, מדד Suspension "pancreasphere" 25 ואת מבחני organoid 12-15, היתרונות העיקריים של מבחני המושבה המכילים methylcellulose המתוארים כאן הם כדלקמן. ראשית, התוספת והשלמות חלבוני ECM למגוון רחב של ריכוזים יכולים להיות מושגת בקלות. הסיבה לכך היא כי methylcellulose הוא החומר המעניק את אופי 3D של המדיום חצי מוצק. לעומת זאת, שיטות תרבות organoid תלויות מיצוק של חלבוני ECM בעכברים, אשר נוכחים v / v 33% ומעלה. יצוין כי קטן כמו חלבון ECM murine 1% עשוי לעכב את ההתמיינות של תאים האנדוקרינית 9, מה שמדגיש את החשיבות של ריכוז חלבון ECM ב assay תא אב. שנית, מושבות מופצות באופן שווה על פני התרבות היטב ניתן לספור במדויק. מושבות שלישיות, אחת יכולה להיות מובחרות בקלות לניתוח שלאחר מכן. רביעית, בינוני חצי מוצק methylcellulose המכילים קל לשמור, ולא בינוניהשינוי נדרש במהלך התרבות. לבסוף, מספר גדול של תאים (עד 25,000 תאים לכל צלחת 24 גם) יכול להיות מצופה ובחן מבחני מושבה אלה, מה שהופך אותם יעילים לאיתור פעילויות תא אב גם אם הם אוכלוסיית קטין בין התאים המצופים.
מבחני תא אב הלבלב המתוארים כאן מבוססים על פונקציונלי, אבל לא MARKER מבוסס, מנתח של ובתאי לבלב. משמעות הדבר היא כי ובתאי לבלב ניתן ללמוד בלי לדעת מה סמנים שהם מבטאים. זה חשוב כי יש מעט ידע על מה סמנים ספציפיים ובתאי הלבלב המבוגרים יכולים להביע. בנוסף, סמנים עבור ובתאי לבלב עובריים לא יכולים להיות מספיק ללימוד האבות המבוגרים. באמצעות ניתוחים תפקודיים, אפשר להתחיל לזהות סמני תאים ובתאים ספציפיים על ידי קביעת הראשונה האוכלוסייה משנה שיש לו פעילות PCFU, כגון CD133 + </ sup> Sox9 / EGFP + תאים מאוירים כאן. זה יכול להיות מלווה על ידי זיהוי, באמצעות RNA-seq, גנים באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי על ידי האוכלוסייה המכיל PCFU. סמני המועמד לאחר מכן יהיו אפשר לבדוק ולאמת ידי מבחנים כגון במבחנת התחקות טכניקות שושלת vivo, העוקבות אחר יכל ההתמיינות של תאי האב.
המגבלות של מבחני מושבה במבחנה המכיל methylcellulose הן משולשות. ראשית, למרות המבחנים לחקות את המיקרו-סביבת in vivo של הלבלב על ידי מתן חלבוני ECM ו- גורמי גדילה כדי ובתאים הלבלב בחלל 3D בתרבות, התנאים אינם זהים. בנוסף, המבנים של תאי אפיתל in vivo הם שיבשו על ידי ניתוק לתוך תאים בודדים, ולכך יכולות להיות השלכות חשובות. לכן, זה יהיה חשוב לוודא ובתאים במחקרי מעקב באמצעות in vivo 18. רכיבים מוגדרים אלה עשויים להשפיע על התפקוד של גורמי גדילה ספציפיים על ובתאים בעקיפין דרושה עוד עבודה כדי ליצור קבוצה אחרת לגמרי של תנאי תרבות. לבסוף, ניסויי התחקות שושלת הפגינו תאי acinar לתאי בטא 26,27 או אלפא תאים לתאי בטא תאים 28 מרות in vivo בעכברים בוגרים. תנאי תרבות methylcellulose המתואר כאן עלולים להיות ספציפיים לגיור תא צינור לתא בטא בלבד. תנאי תרבות ידועים אחרים עשויים להידרש עבור תאים שאינם צינור להמיר לתאים בטאו בתרבות.
ישנם כמה מקרים שבם פתרון בעיות עשויות להיות נחוצות. לדוגמא, אם תאים ניתקים הם בכבדות יחד, להשתמש במינונים גבוהים של DNase אני בפתרונות. DNase אני חשוב למנוע להסתבך של תאי לבלב ניתקים הנגרמים על ידי ה- DNA מוlecules שפורסם על ידי התאים המתים (ראה שלב 1.3.2).
לחלופין, אם רקמות טחון מקל פיפטה 10 מ"ל, לקצץ את הרקמה לחתיכות קטנות. פתיחת פיפטה 10 מ"ל צריך להיות רחב מספיק עבור פיסות הרקמה לעבור לאחר עיכול collagenase. אם חתיכות להיתקע בבית קצה פיפטה 10 מ"ל, זה מצביע על כך מתייפייף של הרקמה על ידי מספריים האביב אינו מספיק (ראה שלב 1.3.4).
בעיה נוספת שעלולות להתעורר אין צמיחת מושבה בחלבוני ECM murine מתאי לבלב ניתקו (כלומר, תאים לא ממוינים). אם זה יקר, אל תנסה לשבור את כל האשכולות לתוך תאים בודדים במהלך שלב דיסוציאציה הלבלב, מכיוון שהדבר עלול לגרום overdigestion תהליכי מוות תאי. אם יש חתיכות גדולות, להחזיר את הצינור כדי 37 מעלות צלזיוס במשך כמה (4) דקות ומזרק 7 פעמים או פחות. בדוק שוב את התאים תחת המיקרוסקופ. הזמן המקסימאלי לטיפול B collagenase הוא 30 דקות. Depending על collagenase בשימוש, הזמן האופטימלי לעיכול עשוי להיות שונה (ראה שלב 1.4.2).
בנוסף, גושים של חלבוני מטריקס murine תאי בבארות תרבות ייתכן שנצפו לאחר דגירה. כדי למנוע זאת, לוודא כי כל רכיבי התרבות אשר באים במגע עם חלבונים תאים מטריקס murine נשמרים קר על קרח כדי למנוע התמצקות מוקדמת לפני הדגירה 37 ° C (ראה שלב 3).
בנוסף, זה עלול להיות קשה להרים תא אחד בכל פעם לתוך פיפטה פסטר זכוכית. פתרון זה הוא להפחית את הצפיפות של התאים הטריים המסודרים המצופים במדיום החצי מוצק לוודא כי תא יש מספיק מרחק מן התאים האחרים. זה ימנע להרים תאים מרובים בו זמנית. בנוסף, עדיף למקם את המיקוד של המיקרוסקופ קרוב לתחתית של המדיום חצי מוצק, כפי שהוא קל יותר להרים תאים בודדים ביד ליד המטוס ללא מיקרומניפולטור (ראה שלב 4.6.2).
בנוסף, הוא עשוי להיות לא ברור אם מניפולצית תא בודדת היא מוצלחת. פתרון הוא לתרגל את המיקרומניפולציה התא הבודדה לפני הניסוי בפועל. לאחר התא הרים ב פיפטה פסטר זכוכית, להעביר את התא לצלחת פטרי 35 מ"מ המכיל 1 מ"ל של 1% פתרון methylcellulose ללא תאים ( "אין תאים" בינוני מוכן בשלב 4.4.1). דמיינו ומניחים פתיחת קצה פיפטה פסטר בפוקוס מתחת למיקרוסקופ, ולדחוף את התא לאט. צפו התא הבודד להופיע לאט סביב קצה פיפטה ולאחר מכן להעביר לתוך המדיום "אין תאים '(ראה שלב 4.8.2).
לבסוף, אין צמיחת מושבה עלולה להתרחש בתרבויות משניות מן ניתק טבעת יסודית / מושבות צפופות. לפתרון בעיות, להבטיח כי תאים ממושבות עיקריות ניתקו נשמרים RT לפני הציפוי לתוך תרבויות משניות. עבור culturing בחלבונים ECM בעכברים, להוסיףהתא האחרון אל הצינור המכיל בינוני תרבות קר לפני ערבוב 18, ובכך לצמצם את החשיפה של התאים לטמפרטורה קרה, אשר עשוי להרוג את התאים הניתקים המתקבלים מושבות עיקריות. עם זאת, מחדש ציפוי של תאים לתוך הידרוג'ל laminin לא צריכה להתבצע על הקרח לפני 37 ° C הדגירה (ראה שלב 7).
לסיכום, שני מבחני המושבה methylcellulose המכילים שימשו לאפיין תאים דמויי אב מן pancreata של עכברים בוגרים צעירים 7,11 ואחרי לידה 9,10, כמו גם מן הכבדים של עכברים צעירים 10. יישומים עתידיים תופנה כלפי זיהוי ואפיון של ובתאים המושבה יוצרי האדם מאיברים הלבלב cadaveric.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לוסי בראון ואלכסנדר Spalla מהליבה Cytometry האנליטי של עיר של תקווה עבור סיוע במיון. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מעניק R01DK081587 ו R01DK099734 כדי HTK, ו U01DK089533 ל- ADR, ועל ידי מענק הקרן הלאומית למדע NSF-DMR-1,206,121 וקליפורניה המכון RB5-07398 מענק רפואה רגנרטיבית כדי DAT תומך ממכון ג'ייקובס יוסף י להנדסה מולקולרית לרפואה בקלטק כדי DAT, ואלה מן קרן אוקסנרד ואלה פיצג'רלד קרן כדי HTK גם הודתה בהכרת תודה.
מימון: עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מעניק R01DK081587 ו R01DK099734 כדי HTK, ו U01DK089533 ל- ADR, ועל ידי מענק הקרן הלאומית למדע NSF-DMR-1,206,121 וקליפורניה המכון RB5-07398 מענק רפואה רגנרטיבית כדי DAT תומך מן יוסף י ג'ייקובסמכון להנדסה מולקולרית לרפואה בקלטק כדי DAT, ואלה מן אוקסנרד קרן ואלה פיצג'רלד קרן כדי HTK גם הודו בהכרת תודה. מחקר מדווח בפרסום זה כלל את עבודות שבוצעו Core ההדמיה הדיגיטלי המיקרוסקופי Core Cytometry אנליטית האור הנתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב תחת מספר פרסי P30CA33572.
מחקר חסות: נותן החסות לא להשתתף בעיצוב המחקר, איסוף, ניתוח, או פרשנות של נתונים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20 °C |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20 °C | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1,500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15 g/cm/sec) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50 ml Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100 mm x 20 mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20 °C |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40 μm Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 μm filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20 °C |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80 °C |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80 °C |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20 °C |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80 °C |
| Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18 G x1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16 G x 1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | ||
| PBS/BSA | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) |
||
| PBS/BSA/Dnase1 | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) Dnase 1 (2,400 Units/ml per pancreas) |
References
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).
- Inada, A., et al. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Fu, X., et al. MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).
- Ghazalli, N., et al. Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jin, L., et al. Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures. Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).
- Jin, L., et al. In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. 32, 2708-2721 (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Lee, J., et al. Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells. Elife. 2, e00940 (2013).
- Dorrell, C., et al. The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar. Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).
- Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice. Blood. 87, 4544-4551 (1996).
- Ku, H. T., et al. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Winkler, M., et al. A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors. J Vis Exp. , e3148 (2011).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Formeister, E. J., et al. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).
- Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide (PN) 68000088 K1. , Available from: http://www.fluidigm.com/documents (2015).
- Seymour, P. A., et al. A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation. Dev Biol. 323, 19-30 (2008).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455, 627-632 (2008).
- Baeyens, L., et al. Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice. Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).
- Thorel, F., et al. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature. 464, 1149-1154 (2010).
