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Developmental Biology

इन विट्रो कॉलोनी assays में त्रिकोणीय शक्तिशाली पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं निस्र्पक के लिए एडल्ट Murine अग्न्याशय से पृथक

Published: June 10, 2016 doi: 10.3791/54016
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1
1Diabetes and Metabolism Research Institute, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope, 3Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology
* These authors contributed equally

Summary

आत्म नवीकरण और वयस्क murine अग्न्याशय से अलग पूर्वज कोशिकाओं की भिन्नता का पता लगाने के लिए इन विट्रो कॉलोनी assays में तैयार कर रहे हैं। इन assays में, अग्नाशय के पूर्वज methylcellulose युक्त अर्द्ध ठोस माध्यम में 3-आयामी अंतरिक्ष में सेल कालोनियों को जन्म दे। एकल कक्षों और अलग-अलग कालोनियों के लक्षण वर्णन से निपटने के लिए प्रोटोकॉल वर्णित हैं।

Abstract

स्टेम और वयस्क अग्न्याशय से पूर्वज कोशिकाओं टाइप 1 मधुमेह के रोगियों के उपचार के लिए चिकित्सकीय बीटा कोशिकाओं की तरह का एक संभावित स्रोत हो सकता है। हालांकि, यह स्टेम कोशिकाओं और पूर्वज वयस्क अग्न्याशय में मौजूद है कि क्या अभी भी अज्ञात है। सीआरई-Lox वयस्क चूहों में वंश अनुरेखण का उपयोग कर अनुसंधान रणनीतियों परिणाम है कि या तो समर्थन या विचार है कि बीटा कोशिकाओं नलिकाओं, माना स्थान जहां वयस्क अग्नाशय पूर्वज निवास कर सकते हैं से उत्पन्न किया जा सकता खंडन मिले हैं। इन विवो सीआरई-Lox वंश अनुरेखण विधियों, हालांकि, आत्म नवीकरण और बहु-वंश भेदभाव-दो एक स्टेम सेल को परिभाषित करने के लिए आवश्यक मानदंडों के सवालों का जवाब नहीं कर सकते हैं। इस तकनीकी खाई को संबोधित शुरू करने के लिए, हम अग्नाशय progenitors के लिए 3-आयामी कॉलोनी assays तैयार की। जल्द ही हमारी प्रारंभिक प्रकाशन के बाद, अन्य प्रयोगशालाओं स्वतंत्र रूप से एक समान है, लेकिन समान नहीं, विधि organoid परख बुलाया विकसित की है। organoid परख की तुलना में हमारे विधि को रोजगारmethylcellulose, जो चिपचिपा समाधान है कि कम मात्रा में बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के शामिल किए जाने की अनुमति देने के रूपों। methylcellulose युक्त assays, आसान पता लगाने और एकल कोशिका के स्तर पर पूर्वज कोशिकाओं है, जो महत्वपूर्ण हैं जब पूर्वज एक छोटे उप जनसंख्या गठन के विश्लेषण की अनुमति के रूप में कई वयस्क स्टेम कोशिकाओं अंग के लिए मामला है। साथ में, कई प्रयोगशालाओं से परिणाम चूहों से अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं की तरह की इन विट्रो आत्म नवीकरण और बहु-वंश भेदभाव में प्रदर्शित करता है। मौजूदा प्रोटोकॉल दो methylcellulose आधारित कॉलोनी माउस अग्नाशय पूर्वज को चिह्नित करने assays का वर्णन; एक murine बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन की एक वाणिज्यिक तैयारी और अन्य एक कृत्रिम बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन एक laminin हाइड्रोजेल के रूप में जाना होता है। यहाँ दिखाया तकनीक 1) अग्न्याशय की हदबंदी और CD133 + Sox9 / EGFP की छँटाई वयस्क चूहों से + नलीपरक कोशिकाओं, 2) एस के एकल कक्ष में गड़बड़ी हैंorted कोशिकाओं, 3) एकल कॉलोनी माध्यमिक कॉलोनी assays में microfluidic QRT- पीसीआर और पूरे माउंट immunostaining, और 4) प्राथमिक कालोनियों के एकल कोशिका निलंबन और फिर से चढ़ाना में हदबंदी का उपयोग कर आत्म नवीकरण या भेदभाव का आकलन करने के लिए विश्लेषण करती है।

Introduction

अग्न्याशय के तीन प्रमुख सेल प्रजातियों से बना है; कोष्ठकी कोशिकाओं छिपाना पाचक एंजाइम, नलिकाएं रोगजनकों से रोकना और पेट के लिए पाचन एंजाइमों के परिवहन के लिए mucin छिपाना, और अंत: स्रावी कोशिकाओं को इंसुलिन और ग्लूकागन सहित हार्मोन है, कि ग्लूकोज homeostasis को बनाए रखने छिपाना। अग्न्याशय के भ्रूण के विकास के दौरान, जल्दी नलीपरक कोशिकाओं त्रिकोणीय शक्तिशाली पूर्वज वयस्क जानवरों 1,2 के Pancreata में तीन प्रजातियों को जन्म देने में सक्षम कोशिकाओं का स्रोत हैं। क्योंकि इस तरह अस्थि मज्जा स्टेम कोशिकाओं के रूप में वयस्क स्टेम कोशिकाओं और पूर्वज, पहले से ही सफलतापूर्वक विभिन्न रोगों 3 इलाज के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, वहाँ वयस्क अग्न्याशय में स्टेम कोशिकाओं और पूर्वज खोजने में गहन रुचि है। तो अलगाव और वयस्क स्टेम अग्नाशय और पूर्वज कोशिकाओं के हेरफेर संभव हो गया है, इन कोशिकाओं जैसे टाइप 1 मधुमेह, जिसमें इंसुलिन स्रावित कोशिकाओं औतोइम्मुिनित से नष्ट हो रहे रोगों के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

में विवो सीआरई-Lox वंश अनुरेखण तकनीक, Inada और सहकर्मियों से पता चला है कि वयस्क murine नलीपरक एक मार्कर, कार्बोनिक anhydrase द्वितीय के साथ लेबल की कोशिकाओं, सभी तीन अग्नाशय प्रजातियों 4 को जन्म दे सकता है। हालांकि, इस तरह HNF1b 5 और Sox9 2 के रूप में अन्य नलीपरक मार्कर का उपयोग करते हुए, यह निष्कर्ष निकाला गया था कि नलीपरक कोशिकाओं वयस्क चूहों में बीटा कोशिकाओं का प्रमुख स्रोत नहीं हैं।

कई साल पहले, हम प्रस्ताव किया है कि ऊपर उल्लिखित बहस का कारण कमी के कारण हो सकता है, क्षेत्र 6.7 में, उचित विश्लेषणात्मक उपकरण है कि आत्म नवीकरण और बहु-वंश भेदभाव-दो मापदंड आवश्यक को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक स्टेम सेल को परिभाषित। इन विवो सीआरई-Lox वंश अनुरेखण तकनीक का उल्लेखऊपर आबादी स्तर पर पूर्वज-संतान रिश्ते के लिए सबूत प्रदान कर सकते हैं। हालांकि, इस वंश अनुरेखण तकनीक विचार करने के लिए एक पूर्वज कोशिकाओं कर सकते हैं आत्म नवीकरण और कई प्रजातियों में अंतर है कि क्या अपनी शक्ति में सीमित है। एकल कोशिका विश्लेषण महत्वपूर्ण है क्योंकि अगर कई मोनो शक्तिशाली पूर्वज, एक अलग वंश क्षमता के साथ प्रत्येक, एक साथ विश्लेषण किया गया है, वे सामूहिक रूप से बहु-वंश भेदभाव क्षमता है करने के लिए प्रकट हो सकता है। इसके अलावा, स्टेम कोशिकाओं को आम तौर पर एक वयस्क अंग की एक नाबालिग आबादी है। एक छोटी सी सेल की आबादी की गतिविधियों प्रमुख जनसंख्या से छिपा हुआ जा सकता है। इसलिए, एक जनसंख्या अध्ययन से एक नकारात्मक परिणाम जरूरी स्टेम कोशिकाओं के अभाव का संकेत नहीं है। अंत में, सीआरई-Lox वंश अनुरेखण वर्तमान में आत्म नवीकरण की माप की अनुमति नहीं है।

अग्नाशय के पूर्वज कोशिका जीव विज्ञान, कॉलोनी के क्षेत्र में तकनीकी खाई को संबोधित शुरू करने के लिए 7-11 या 12-15 organoid (तरीकों और उपकरणों तालिका देखें) के एक व्यावसायिक तैयारी में शामिल है, और अन्य laminin हाइड्रोजेल, एक परिभाषित कृत्रिम ईसीएम प्रोटीन 7-11 होता है। पूर्वज कोशिकाओं अर्द्ध ठोस मध्यम युक्त methylcellulose में मिलाया जाता है। Methylcellulose एक जैविक निष्क्रिय और चिपचिपा लकड़ी फाइबर से तैयार सामग्री है, और नियमित रूप से hematopoietic कॉलोनी assays के 16 में इस्तेमाल किया गया है। methylcellulose युक्त अर्द्ध ठोस मध्यम एकल पूर्वज कोशिकाओं की आवाजाही प्रतिबंधित है ताकि वे फिर से समग्र नहीं कर सकते। फिर भी, मध्यम काफी नरम एक पूर्वज सेल बढ़ने और 3 डी अंतरिक्ष में कोशिकाओं की एक कॉलोनी में अंतर करने की अनुमति है। hematologists की परंपरा के बाद, एक अग्नाशय के पूर्वज सेल कि कोशिकाओं की एक कॉलोनी को जन्म देने में सक्षम था n थाएक अग्नाशय कॉलोनी के गठन इकाई amed (PCFU)। PCFUs, जब murine ईसीएम युक्त कॉलोनी परख में हो, पित्ताशय कालोनियों "अँगूठी" कालोनियों 7 नामित कर रहे हैं कि को जन्म दे। एक Wnt एगोनिस्ट के अलावा पर, आर spondin1, murine ईसीएम युक्त संस्कृति में, कुछ अंगूठी कालोनियों "घने" कालोनियों 7 में बदल जाते हैं। इस अनुच्छेद में, murine ईसीएम संस्कृति में विकसित कालोनियों के इन दो प्रकार के सामूहिक रूप से "अंगूठी / घने" कालोनियों के लिए भेजा जाता है। रिंग / घने कालोनियों एकल कक्ष निलंबन में अलग कर रहे हैं और संस्कृतियों है कि laminin हाइड्रोजेल रोकने में फिर से चढ़ाया है, "Endocrine / कोष्ठकी" कालोनियों 7 बनते हैं।

एकल कॉलोनी विश्लेषण का उपयोग कर, यह पाया गया कि अंगूठी / घने और Endocrine / कोष्ठकी कालोनियों का बहुमत है, या तो वयस्क से (2-4 महीने की उम्र में) 7,11 या युवा (1 सप्ताह पुराने) 9 murine अग्न्याशय, सभी तीन का इजहार वंश मार्करों। यह पता चलता है कि होने वाले PCFUs के सबसे त्रिकोणीय शक्तिशाली हैं। Murine ईसीएम युक्त कॉलोनी परख में, वयस्क murine PCFUs मजबूती के साथ आत्म नवीकरण और संस्कृति 7 में 11 सप्ताह से अधिक लगभग 500,000 बार विस्तार। Murine ईसीएम रियायत के तौर पर, अंत: स्रावी और कोष्ठकी प्रजातियों के ऊपर नलीपरक कोशिकाओं के भेदभाव का समर्थन करता है, जबकि laminin हाइड्रोजेल की उपस्थिति में, murine PCFUs और अंत: स्रावी और कोष्ठकी कोशिकाओं में रियायत के अंतर करने के लिए प्रोत्साहित किया नलीपरक वंश 7,9,11 के लिए इतना कम कर रहे हैं। महत्वपूर्ण बात है, इंसुलिन + ग्लूकागन - मोनो हार्मोनल कोशिकाओं laminin हाइड्रोजेल संस्कृति में उत्पन्न होता है और जवाब में इंसुलिन स्रावित विट्रो 7.9 में उत्तेजना ग्लूकोज, कार्यात्मक परिपक्वता सुझाव दे रहे हैं। त्रि-वंश भेदभाव संभावित 7.9 और व्यक्तिगत PCFUs की आत्म नवीकरण 11, एकल कोशिका micromanipulation, यानी द्वारा की पुष्टि की कॉलोनी गठन के लिए अच्छी तरह से प्रति एक कोशिका संवर्धन कर रहे हैं। साथ में, इन परिणामों स्वयं renewing, सप्ताह में तीन पोतेन देखते हैं कि सबूत प्रदानटी, प्रसव के बाद murine अग्न्याशय में पूर्वज कोशिकाओं की तरह चलता है कि 3 डी संस्कृति में गतिविधियों।

इस आलेख में वर्णित murine PCFU assays murine भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (mESCs) 17 से भेदभाव पूर्वज कोशिकाओं के लिए बनाया गया एक पूर्व कॉलोनी परख से निकाली गई है। यही कारण है कि प्रोटोकॉल एक और जौव प्रकाशन 18 में विस्तार से प्रलेखित है। संस्कृति के घटकों और वयस्क PCFUs के लिए murine ईसीएम युक्त कॉलोनी परख करने के लिए आवश्यक तकनीक mESC व्युत्पन्न progenitors 17,18 के लिए के रूप में ही हैं। इसलिए, परख के इन पहलुओं यहाँ दोहराया नहीं किया जाएगा; बजाय निम्नलिखित प्रक्रियाओं को संबोधित किया जाएगा: 1) वयस्क अग्न्याशय की हदबंदी और CD133 + Sox9 / EGFP + नलीपरक कोशिकाओं है, जो वयस्क चूहों 7, 2) हल कोशिकाओं की एकल कोशिका में गड़बड़ी, 3) एकल कॉलोनी से PCFUs को समृद्ध छँटाई microfluidic QRT- पीसीआर और पूरे माउंट immunostaining, और 4) Colonie की हदबंदी का उपयोग कर विश्लेषण करती हैएकल कक्ष निलंबन और एस में murine ईसीएम या laminin हाइड्रोजेल कॉलोनी assays में फिर से चढ़ाना।

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Protocol

नैतिक कथन: हम गुणवत्ता और परिणामों की अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए अनुसंधान के संचालन में व्यापक रूप से स्वीकार नैतिक मानकों का पालन करें। पशु प्रयोग आशा के शहर में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाता है।

1. वयस्क Murine Pancreata से एकल सेल निलंबन तैयार

नोट: प्रायर प्रकाशनों 7,11 में, CD-1 या बी -6 पृष्ठभूमि चूहों का इस्तेमाल किया गया था; दोनों पृष्ठभूमि में इसी तरह के परिणाम सामने आए। एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन (नामित Sox9 / EGFP) बढ़ाया हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ Sox9 लोकी 19,20 द्वारा संचालित, सीडी -1 पृष्ठभूमि में बनाया गया था।

  1. गैस सीओ 2 का उपयोग 1-2 मिनट के लिए या सांस बंद हो जाता है जब तक 3 से 5 वयस्क चूहों euthanize। अगला, प्रत्येक माउस पर ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करते हैं।
  2. काटना और Pancreata तैयार करें।
    नोट: इच्छामृत्यु के बाद जितनी जल्दी हो सके चूहों काटना। इस कारण अग्न्याशय के ऑटो पाचन से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैपोस्टमार्टम परिवर्तन करने के लिए।
    1. माउस कैंची का उपयोग कर के पेट की दीवार के midline पर एक ऊर्ध्वाधर चीरा और उदर गुहा खुला। तिल्ली का पता लगाएं और संदंश का उपयोग धीरे इसे उठा। प्लीहा और कैंची से अग्न्याशय के प्लीहा पालि के बीच संयोजी ऊतक में कटौती।
      1. अग्न्याशय के ग्रहणी और गैस्ट्रिक पालियों के लिए इस अभ्यास को दोहराएँ। (; पूर्ण समाधान पीबीएस / बीएसए के रूप में नामित पी / एस) ठंड Dulbecco संशोधित फॉस्फेट बफर समाधान (DPBS), 0.1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), और पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त बर्फ पर एक पेट्री डिश में अग्नाशय के ऊतकों रखें।
    2. एक विदारक माइक्रोस्कोप ठीक टिप संदंश का उपयोग तहत अग्न्याशय से वसा ऊतकों को हटाने।
      नोट: यह निम्न चरणों में अलग अग्नाशय कोशिकाओं के स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण है।
      1. (वैकल्पिक) 488-509 एनएम उत्तेजना का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत हरी प्रतिदीप्ति के लिए Pancreata चेकEGFP अभिव्यक्ति।
    3. एक टिशू कल्चर हुड में, ऊतक तीन 100 मिमी पेट्री डिश में तीन बार क्रमिक रूप से ठंड पीबीएस / बीएसए के 10 मिलीग्राम से युक्त कुल्ला।
  3. ऊतकों के छोटे टुकड़े उत्पन्न करता है।
    1. जितना संभव हो उतना पीबीएस / बीएसए को हटाने के लिए एक सूखी बाँझ पेट्री डिश के लिए विच्छेदित Pancreata स्थानांतरण, और बर्फ पर एक और सूखी पेट्री डिश के लिए उन्हें स्थानांतरित।
    2. 2 μl DNase मैं शेयर समाधान (1 मिलियन यूनिट [एमयू] / एमएल) 1 मिलीलीटर पीबीएस / बीएसए प्रति जोड़कर पीबीएस / बीएसए DNase मैं युक्त तैयार करें।
      नोट: यह समाधान नामित किया गया है पीबीएस / बीएसए / DNase मैं एक बार में इस समाधान के ~ 200 मिलीलीटर, जो एक छँटाई प्रयोग को कवर किया जाएगा।
    3. 2-3 मिनट के लिए या जब तक ऊतक ठीक टुकड़े में है वसंत कैंची का उपयोग Pancreata कीमा। ठंड पीबीएस / बीएसए / DNase मैं के 2-3 मिलीलीटर उन्हें निलंबित करने के लिए पेट्री डिश में ऊतक टुकड़े करने के लिए जोड़ें।
    4. एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब ऊतक टुकड़े स्थानांतरण। पीबीएस / बी एस के साथ 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा लाओजितना संभव हो उतना ऊतक उबरने के बाद ए / DNase एल।
  4. ज्यादातर एकल कक्षों में अग्नाशय के मोहरे डाइजेस्ट।
    1. ऊतक टुकड़े करने के लिए 10 मिलीलीटर 350-450 μl पर कोलैजिनेज़ बी (100 मिलीग्राम / एमएल शेयर) जोड़ें / और 8 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक सेते हैं, हर 3-4 मिनट घूमता। आकर्षित किया और बाद में स्प्रे आरटी पर 50 मिलीलीटर ट्यूब की दीवार के नीचे ऊतक समाधान करने के लिए एक 16 आधा जी सुई के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग करें। इस सात बार दोहराएँ।
      नोट: सेल समूहों को तोड़ने लेकिन बुलबुले कि कोशिकाओं को मार सकता पैदा करने से बचने के लिए पर्याप्त बल का प्रयोग करें।
    2. 37 पर पानी से स्नान ट्यूब वापसी 8 मिनट के लिए ° सी और हर 3-4 मिनट घूमता द्वारा मिश्रण। ऊतक और सात बार नीचे सिरिंज, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, और एक सूखी पेट्री डिश पर ऊतक समाधान का एक नमूना (10 μl) जगह है। एक 10x उद्देश्य लेंस के साथ एक औंधा, चरण विपरीत तहत ऊतक समाधान, प्रकाश माइक्रोस्कोप का निरीक्षण करें। एकल कक्षों और कुछ छोटे आकार के सी अपेक्षापक्ष समूहों उपस्थित होने के लिए।
    3. धीमी गति से या कोलैजिनेज़ की गतिविधि को रोकने के लिए इस बात से बर्फ पर कोशिकाओं संभाल लेना। ठंड पीबीएस / बीएसए / DNase के 5 मिलीलीटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं का उपयोग ठंड पीबीएस / बीएसए / DNase मैं अपकेंद्रित्र 50 मिलीलीटर मात्रा, और resuspend समायोजित मैं एक P1000 pipettor का उपयोग।
  5. एकल कक्ष निलंबन और धो उपज के लिए फ़िल्टर।
    1. उसके बाद एक 40 माइक्रोन नायलॉन जाल फिल्टर कप के माध्यम से एक 70 माइक्रोन नायलॉन जाल फिल्टर कप के माध्यम से और कोशिकाओं फ़िल्टर।
    2. 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend ठंड पीबीएस / बीएसए / DNase मैं और कोशिकाओं की गिनती।
      नोट: 2-4 महीने की उम्र में बी -6 या सीडी 1 चूहों के लिए, प्रत्येक अग्न्याशय ~ 5 या 10 लाख की कोशिकाओं, क्रमशः उपज हो सकती है। इन नंबरों को अलग experimentalists के बीच भिन्न हो सकते हैं। अत्यधिक सेल मलबे गिनती में पाया जाता है, मात्रा ठंड पीबीएस / बीएसए / DNase मैं के साथ 50 मिलीलीटर और सेंट्रीफ्यूज की कोशिकाओं के लिए 400 XG पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर लाने के लिए।
    3. 2 एक्स 10 की एकाग्रता के लिए सेल निलंबन की मात्रा समायोजित करें7 कोशिकाओं / ठंड पीबीएस / बीएसए / DNase मैं का उपयोग कर मिलीलीटर

2. अग्नाशय कॉलोनी के गठन प्रोजेनिटर्स को समृद्ध करने के लिए कोशिकाओं

नोट: बी -6 चूहों, CD133 + नहीं बल्कि CD133 से - कोशिकाओं PCFUs 7,9,11 के लिए समृद्ध कर रहे हैं। CD133 + कोशिकाओं कुल की ~ 13% अग्नाशय कोशिकाओं को अलग करने के बाद सभी gating मानकों को लागू कर रहे हैं 11 प्रतिनिधित्व करते हैं। सीडी 1 चूहों से, CD133 + Sox9-EGFP + कोशिकाओं को आमतौर पर कुल अग्नाशय कोशिकाओं की ~ 4% का प्रतिनिधित्व करते हैं, और इस सेल की आबादी PCFUs 7 के लिए समृद्ध है। CD133 + Sox9 / EGFP + कोशिकाओं की छंटनी यहाँ वर्णित है।

  1. Dissociated अग्नाशय कोशिकाओं दाग।
    1. पूरे अग्नाशय एकल कोशिका निलंबन ब्लॉक को कम करने के लिए बर्फ पर 5 मिनट के लिए 10 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता में विरोधी माउस CD16 / 32 के साथ एकल कक्ष निलंबन incubating द्वारा गैर विशिष्ट बंधन।
    2. 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के एक विभाज्य निकालें (50 &# 181; ठ) बर्फ पर, 5 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता में निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी, बायोटिन संयुग्मित चूहे IgG1 के साथ दाग 20 मिनट के लिए, हर 5-7 मिनट घूमता।
    3. 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं (50 μl) के एक विभाज्य निकालें और एक अस्थिर नियंत्रण के रूप में बर्फ पर रहते हैं।
    4. बर्फ पर एक बायोटिन संयुग्मित विरोधी माउस CD133 प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं के शेष के दाग, 5 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता में, 20 मिनट के लिए, हर 5-7 मिनट घूमता।
  2. धुलाई प्रकोष्ठों।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर पीबीएस / बीएसए / DNase मैं के साथ 1 मिलीलीटर मात्रा और सेंट्रीफ्यूज लाकर निर्धारण नियंत्रण और प्राथमिक एंटीबॉडी से सना हुआ नमूने धो लें। इस धोने कदम दोहराएँ।
    2. निर्धारण नियंत्रण और पीबीएस / बीएसए / DNase मैं में प्राथमिक एंटीबॉडी से सना हुआ नमूने Resuspend, तो अंतिम एकाग्रता 2 एक्स 10 7 कोशिकाओं / एमएल है।
  3. 2 & # पर निर्धारण नियंत्रण और streptavidin के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी से सना हुआ नमूने (एसटीवी) -labeled allophycocyanin (एपीसी) दाग181 छ / एमएल अंतिम एकाग्रता। बर्फ पर 15 मिनट के लिए सेते हैं, हर 5-7 मिनट घूमता।
  4. वॉशिंग कोशिकाओं और 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) धुंधला हो जाना।
    1. निर्धारण नियंत्रण और प्राथमिक एंटीबॉडी से सना हुआ नमूने पीबीएस / बीएसए / DNase मैं के साथ दो बार धोएं, 2.2 कदम के रूप में। DAPI (0.2 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) के साथ पीबीएस / बीएसए / DNase मैं में कोशिकाओं Resuspend। निर्धारण नियंत्रण नमूने की अंतिम मात्रा 0.5 मिलीग्राम होना चाहिए।
      नोट: सुनिश्चित करें कि प्राथमिक एंटीबॉडी से सना हुआ नमूने की अंतिम घनत्व उचित है के लिए सॉर्टर इस्तेमाल किया जाएगा। 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं के एक एकाग्रता / मिलीलीटर नियमित रूप से छंटाई के लिए प्रयोग किया जाता है।
    2. पीबीएस / बीएसए / पीएस / DNase मैं के साथ 0.5 मिलीलीटर बेदाग कोशिकाओं की मात्रा समायोजित सॉर्ट करने से पहले एक 20 माइक्रोन जाल के माध्यम से सभी कोशिकाओं को फ़िल्टर और अंधेरे में बर्फ पर कोशिकाओं रहते हैं।
  5. प्रकोष्ठों की छंटनी।
    1. छंटाई के लिए एक 80 माइक्रोन या बड़ा नोक का प्रयोग करें।
      ध्यान दें: Murine अग्नाशय कोशिकाओं अंत: स्रावी शारीरिक तनाव से ग्रस्त हैं। होwever, murine PCFUs एक सॉर्टर 7 के माध्यम से गुजर रहा है की वजह से तनाव से प्रभावित होने की नहीं दिखाई देते।
    2. सेल की घटनाओं और विश्लेषण के मापदंडों सॉर्टर पर मोल। गेट आगे और पक्ष बिखराव क्षेत्रों के लिए कोशिकाओं सेल मलबे 7 बाहर करने के लिए। आगे और पक्ष बिखराव की चौड़ाई के लिए गेट सेल दोहरी बाहर करने के लिए। गेट DAPI + मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए 7। EGFP और CD133 एपीसी संकेतों निर्धारण नियंत्रण कोशिकाओं से मूल्यों पर आधारित (चित्रा 1) के लिए मानकों gating चुनें।
    3. 5 मिलीलीटर polystyrene DMEM / F12 माध्यम की 1.5 मिलीलीटर 5% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) के साथ पूरक युक्त ट्यूबों में हल कोशिकाओं लीजिए। अपकेंद्रित्र या तो DMEM / F12 या पीबीएस / बीएसए / DNase के 5 मिनट और resuspend एक छोटी मात्रा में (~ 200 μl) के लिए 400 XG पर हल आबादी मैं 5% एफसीएस के साथ पूरक। उपयोग करें जब तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें।
  6. सॉर्टर से प्राप्त CD133 + Sox9-EGFP + कोशिकाओं की संख्या की गणना। एक लो10 μl सेल नमूना और सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए एक hemacytometer के साथ कोशिकाओं की गिनती।
    नोट: hemacytometer उपयोग की सिफारिश की है क्योंकि सॉर्टर से मशीन में गिना जाता है अक्सर अविश्वसनीय हैं।

3. प्लेट कॉलोनी परख में हल कोशिकाओं से युक्त Murine ईसीएम प्रोटीन

नोट: कृपया अन्य जौव प्रकाशन 18 में कोशिकाओं के चढ़ाना murine ईसीएम युक्त कॉलोनी परख में लिए विस्तृत प्रोटोकॉल को देखें।

  1. संस्कृति मीडिया तैयार करें।
    1. DMEM / F12 मध्यम, 1% (भार / वी) methylcellulose, 5% (वी / वी) murine ईसीएम प्रोटीन, 50% से युक्त एक संस्कृति के माध्यम से तैयार (वी / वी) mESC व्युत्पन्न अग्नाशय कोशिकाओं की तरह से वातानुकूलित मध्यम, 5% (वी / वी) एफसीएस, 10 mmol / एल निकोटिनामाइड, 10 एनजी / एमएल पुनः संयोजक मानव activin बी, 0.1 nmol / एल exendin -4, और 1 एनजी / एमएल संवहनी endothelial वृद्धि कारक-ए। वातानुकूलित माध्यम पैदा करने के लिए तरीके कहीं और 18 विस्तृत रहे हैं।
    2. मध्यम करने के लिए RSPO -1 के 750 एनजी / मिलीलीटर जोड़ेंयदि घने कॉलोनी गठन वांछित है।
    3. 3 सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर murine ईसीएम प्रोटीन संस्कृति सेते हैं और 5% सीओ 2।

4. संस्कृति 1 सेल प्रति ठीक है कम से हल कोशिकाओं

नोट: निम्न प्रक्रियाओं हाथ और मुँह pipettes का उपयोग एकल कक्षों में हेर-फेर करने के लिए लागू होते हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एक micromanipulator खरीद रहा है। एक ठेठ micromanipulator एक जॉयस्टिक संचालित, मोटर चालित मंच के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप भी शामिल है।

  1. ग्लास पाश्चर pipettes तैयार करें।
    1. एक लेम्प बर्नर का उपयोग करना, ठीक एक बिंदु (उद्घाटन के अवसर पर ~ 30 माइक्रोन) के लिए एक गिलास पाश्चर विंदुक की नोक बाहर खींचना। कांच पाश्चर pipettes ऑपरेटर से हवा का प्रवाह के लिए एक बाधा पैदा करने के लिए एक कपास डाट होनी चाहिए।
    2. नसबंदी के लिए 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर flamed कांच पाश्चर pipettes आटोक्लेव।
  2. संस्कृति के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करें।
    1. ठंड अर्द्ध ठोस संस्कृति के माध्यम से समझौते को तैयारपहले से वर्णित प्रोटोकॉल से 18 हैैं।
    2. / अच्छी तरह से एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर 100 μl में एक कम बाध्यकारी फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली के भीतरी कुओं में मध्यम बांटना। बाँझ पानी के साथ बाहरी कुओं भरें नमी बनाए रखने के लिए।
    3. बर्फ पर संस्कृति पकवान उपयोग करें जब तक रखें।
  3. हल कोशिकाओं से तैयार करें।
    1. जोड़े ~ 6000 कोशिकाओं को एक सॉर्टर से की DMEM / F12 / पी एस युक्त 10% एफसीएस और 1% methylcellulose एक 5 एमएल polystyrene ट्यूब में 2.5 मिलीलीटर अंतिम मात्रा करने के लिए एकत्र। सख्ती से हिला घटकों का मिश्रण करने के लिए। 5 मिनट के लिए या जब तक बुलबुले ट्यूब के शीर्ष करने के लिए नाव की प्रतीक्षा करें। यह कदम बर्फ पर प्रदर्शन करने की आवश्यकता नहीं है।
    2. एक 18 आधा जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर 1 मिलीग्राम / डिश में दो 35 मिमी बर्तन करने के लिए सेल समाधान बांटना।
    3. धीरे हाथ से पकवान कमाल से डिश में सेल समाधान बिखरा हुआ है। अर्द्ध ठोस मध्यम अच्छी तरह से Cann के मार्जिन में 35 मिमी पकवान के मार्जिन तक पहुंचने के लिए एकल कक्षों के रूप में अनुमति न देंओटी स्पष्ट रूप से एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग मनाया जा।
  4. एक माइक्रोस्कोप के आसपास काम कर क्षेत्र तैयार।
    1. ( 'कोई-सेल' मध्यम) एक समाधान किसी भी कोशिकाओं के बिना DMEM / F-12 मध्यम और 1% methylcellulose युक्त बनाने के लिए, और (पकवान प्रति 1 मिलीलीटर) (4.3.2 में वर्णित) दो 35 मिमी पेट्री डिश में समाधान बांटना ।
    2. स्वच्छ और एक 70% शराब के समाधान के साथ एक औंधा चरण विपरीत माइक्रोस्कोप चारों ओर कार्य क्षेत्र पोंछे।
  5. टुकड़ा मुंह के साथ पिपेट इकट्ठा करो।
    1. एक बाँझ गिलास पाश्चर विंदुक कि 4.1 चरण में तैयार किया गया था उठाओ। कांच पाश्चर विंदुक के शीर्ष करने के लिए एक 1 मिलीलीटर की प्लास्टिक विंदुक टिप के बड़े अंत संलग्न। एक पतली दीवारों रबर ट्यूब के एक छोर, और ट्यूब के दूसरे छोर से मुखपत्र के लिए 1 मिलीलीटर की प्लास्टिक विंदुक टिप के छोटे अंत संलग्न। एक ही समूह के कई कोशिकाओं को चुनने के लिए एक ही गिलास पिपेट का प्रयोग करें।
    2. ड्रा, मुंह सक्शन, एक छोटी मात्रा (~ 10 से 50 μl करने के लिए) के द्वारा"नहीं-सेल" अर्द्ध ठोस समाधान कांच पाश्चर विंदुक के साथ कदम 4.4.1 में बनाया है।
      नोट: कांच पाश्चर विंदुक की संकीर्ण उद्घाटन के अवसर पर अर्द्ध ठोस समाधान प्रवाह प्रतिरोध पैदा करता है और कोशिकाओं के संक्रमण को रोकने के लिए उठाया जा करने के लिए एक बाधा प्रदान करता है।
  6. एक एकल कोशिका उठाओ।
    1. 35 मिमी खुर्दबीन मंच पर हल कोशिकाओं से युक्त पकवान प्लेस और ढक्कन को हटा दें।
    2. उठाया जा के लिए एक उपयुक्त सेल पर एक 10x उद्देश्य लेंस और ध्यान का उपयोग कोशिकाओं का पता लगाएं।
    3. पता है और ब्याज की सेल करने के लिए अगले विंदुक टिप के उद्घाटन जगह है। मुंह के माध्यम से सक्शन लागू करें।
      नोट: सेल की गति काफी धीमी गति से होना चाहिए, ताकि इस प्रक्रिया के दौरान बाद में सेल को खोने का कोई खतरा नहीं है। सेल पिपेट के उद्घाटन में प्रवेश करने की गति दिखाई जानी चाहिए। प्रवाह भी तेजी से चलता है, तो एक संकरा खोलने के साथ एक विंदुक के लिए बदल जाते हैं।
  7. एक संस्कृति में अच्छी तरह से सिंगल सेल जमा।
    1. एक बार सेल पिपेट में है, टुकड़ा मुंह के उद्घाटन अवरुद्ध करके प्रवाह को रोकने के लिए जीभ का उपयोग करें। अर्द्ध ठोस माध्यम से टिप वापस लेने के लिए सुनिश्चित करें कि अर्द्ध ठोस मध्यम बहने से पहले बंद कर दिया है संक्षेप रोकें।
    2. 96 अच्छी तरह से थाली 4.2 कदम में तैयार में एक कुएं में पिपेट की नोक रखें। सेल बाहर धीरे धीरे टुकड़ा मुंह में उड़ाने से पुश। मार्क अच्छी तरह से करने के बाद सेल जमा किया जाता है, एक कुएं में दो चढ़ाना कोशिकाओं से बचने के लिए।
  8. सुनिश्चित करें कि एक एकल कोशिका एक संस्कृति खैर में रखा गया है।
    1. 'नहीं-सेल' मध्यम कदम 4.4.1 में तैयार में पिपेट टिप जगह है। खुर्दबीन के नीचे टिप के उद्घाटन का अवलोकन करते हुए, शेष अर्द्ध ठोस समाधान बाहर धक्का। पिपेट की नोक बाहर प्रवाह करने के लिए कोई सेल की अपेक्षा करें।
    2. दोहरी जांच करने के लिए, संस्कृति में अच्छी तरह से जहां एकल कक्ष प्रत्यारोपित किया गया था में स्थान पाते हैं।
  9. संस्कृति 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर एकल कक्षों के लिए सीओ 23 सप्ताह के लिए।

5. Microfluidic QRT- पीसीआर विश्लेषण के लिए अर्द्ध ठोस संस्कृति से अलग-अलग कालोनियों उठाओ

नोट: तीन सप्ताह के बाद चढ़ाना murine ईसीएम युक्त कॉलोनी परख में CD133 + Sox9 / EGFP + कोशिकाओं को हल, अंगूठी या घने कालोनियों 7 (चित्रा 2) का गठन कर रहे हैं। रिंग / घने कालोनियों एकल कक्ष निलंबन में अलग कर रहे हैं और laminin हाइड्रोजेल संस्कृति में पुन चढ़ाया है, Endocrine / कोष्ठकी कालोनियों के बाद लगभग एक सप्ताह 7 (चित्रा 2) उत्पन्न कर रहे हैं। प्रत्येक कॉलोनी के वंश संरचना का निर्धारण करने के लिए, microfluidic QRT- पीसीआर विश्लेषण वंश मार्कर 7 की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। पूर्व प्रवर्धन के लिए, एक कॉलोनी में एक TaqMan जांच मिश्रण, प्रतिक्रिया बफर, और सुपरस्क्रिप्ट III 21 से युक्त एक मास्टर मिश्रण में मिलाया जाता है। 48.48 सरणी चिप बाद में microfluidic पीसीआर प्रतिक्रियाओं 21 के लिए प्रयोग किया जाता है।

  1. पूर्व प्रवर्धन पीसीआर तैयार48 जांच युक्त मिश्रण।
    1. पिपेट एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक TaqMan जांच (20x शेयर) के 1.5 μl। ते बफर के 78 μl 150 μl के लिए मात्रा समायोजित करने के लिए जोड़ें।
  2. निर्माता 21 से प्रोटोकॉल का पालन करते हुए मास्टर मिश्रण तैयार करें।
  3. प्रत्येक 0.2 मिलीग्राम पीसीआर के लिए पतली दीवारों प्रतिक्रिया ट्यूब उपयुक्त में मास्टर मिश्रण के 9 μl प्लेस, और अप करने के लिए 48 ट्यूबों के लिए इस चरण को दोहराएँ।
  4. अर्द्ध ठोस संस्कृति से एकल कालोनियों उठाओ।
    नोट: अंगूठी / घने कालोनियों, Endocrine / कोष्ठकी कालोनियों से बड़े होते हैं ~ 50 से 400 माइक्रोन 9,11 को लेकर व्यास के साथ। इसलिए, एक अंगूठी / घने कालोनियों एक P10 pipettor एक 10 μl विंदुक टिप है कि एक घुमावदार आकार में तुला हुआ है के साथ outfitted का उपयोग कर उठाया जाता है। छोटे Endocrine / कोष्ठकी कालोनियों (चित्रा 2) चुनने के लिए, चरण 4 को देखें।
    1. उच्च वृद्धि (जैसे, 20X उद्देश्य लेंस) के तहत ब्याज की एक कॉलोनी जानें, बढ़ाई कम करने, और aspiratकॉलोनी ई। (वैकल्पिक) कॉलोनी के दृश्य विशेषताओं दस्तावेज़ करने के लिए इस कदम पर कॉलोनी के एक चरण विपरीत छवि ले लो।
    2. मास्टर मिश्रण के 9 μl युक्त पीसीआर ट्यूब में कॉलोनी स्थानांतरण।
    3. अगले कॉलोनी उठाओ। कुल में 45 कालोनियों नियंत्रण के लिए 3 स्थानों छोड़ने पीसीआर रन प्रति विश्लेषण किया जा सकता है।
  5. शाही सेना निष्कर्षण और पूर्व प्रवर्धन के साथ सीडीएनए संश्लेषण।
    1. सख्ती थर्मल प्रतिक्रिया के प्रदर्शन से पहले नमूने भंवर।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 21 थर्मल साइकिल प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करना। रिंग / घने कालोनियों 14 चक्रों की आवश्यकता होती है, Endocrine / कोष्ठकी कालोनियों 16-20 चक्र की आवश्यकता होती है, और एकल कक्षों 22 चक्र की आवश्यकता है।
      नोट: पूर्व प्रवर्धन cDNAs -20 डिग्री सेल्सियस microfluidic पीसीआर विश्लेषण करने से पहले पर संग्रहित किया जा सकता है।
  6. बाद में पीसीआर प्रतिक्रियाओं भागो, एक microfluidic चिप का उपयोग कर, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 21।
  1. हार्वेस्ट और कालोनियों को ठीक करें।
    1. ऊपर कदम 4 या 5.4 के रूप में, खुर्दबीन के नीचे कालोनियों उठाओ, और उन्हें एक 4% paraformaldehyde समाधान करने के लिए जोड़ें। कोमल झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन।
    2. 1X पीबीएस के साथ कालोनियों आरटी पर 10-30 मिनट के लिए दो बार धोएं। 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों आयल के साथ बंद में 4 डिग्री सेल्सियस पर तय कालोनियों स्टोर।
  2. एंटीबॉडी के साथ कालोनियों दाग।
    1. एक स्पष्ट नीचे अवरुद्ध बफर के 200 μl (5% गधा और / या बकरी सीरम, 1x पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100) युक्त के साथ एक 96 अच्छी तरह से काले रंग की थाली से एक अच्छी तरह से करने के लिए स्थानांतरण कालोनियों। कोमल झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन।
    2. (: हम्सटर के लिए 500 विरोधी mucin 1 एंटीबॉडी जैसे, 1) बफर अवरुद्ध का उपयोग करते हुए एक पूर्व निर्धारित एकाग्रता के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी पतला। अच्छी तरह से प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 μl के साथ एक साफ करने के लिए कालोनियों स्थानांतरण, और कोमल झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन। डब्ल्यूपीबीएस 0.1% बीच युक्त 20. एक नए कुएं में प्रत्येक धोने के लिए आरटी पर 10 मिनट के लिए बीच 20 1x पीबीएस के 200 μl / 0.1% के साथ स्थानांतरण कालोनियों के साथ कालोनियों ऐश 3 बार।
    3. अवरुद्ध बफर का उपयोग: एक पूर्व निर्धारित एकाग्रता (2,000 बकरी विरोधी अर्मेनियाई हम्सटर एंटीबॉडी के लिए जैसे, 1) के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी पतला। अंधेरे में समाधान रखें। कालोनियों स्थानांतरण माध्यमिक एंटीबॉडी के 200 μl युक्त कुओं को साफ, और आरटी पर 2 घंटे के लिए सेते हैं। कालोनियों में 3 बार पीबीएस के साथ / बीच 20, कदम 6.2.2 के रूप में धो 0.1%।
  3. DAPI के साथ काउंटर दाग कालोनियों और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना।
    1. पीबीएस युक्त 300 एनएम DAPI के साथ कुओं में कालोनियों स्थानांतरण और आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. दृश्य के लिए एक 35 मिमी गिलास नीचे पेट्री डिश के लिए DAPI से सना हुआ कालोनियों स्थानांतरण। कालोनियों वाष्पीकरण को रोकने के लिए की चोटी पर एक कवर पर्ची रखें।
    3. छवियों पर कब्जा करने के लिए एक confocal खुर्दबीन का प्रयोग करें। DAPI stainin कल्पना करने के लिएजी, 730-950 एनएम के दो photon उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें। 519 और 561 एनएम का उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ fluorochromes उत्तेजित करने के लिए 458 एनएम के तरंग दैर्ध्य के साथ एक आर्गन लेजर का प्रयोग करें। 665 एनएम का उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ fluorochromes उत्तेजित करने के लिए 633 एनएम के तरंग दैर्ध्य के साथ एक हीलियम नीयन लेजर का प्रयोग करें।

7. अलग कर देना और फिर से प्लेट प्राथमिक अंगूठी / घने माध्यमिक कालोनी Assays में कालोनियों

नोट: सभी प्रक्रियाओं बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए। ऐसी ठंड पीबीएस / बीएसए के साथ बर्फ या वाशिंग कोशिकाओं पर कोशिकाओं डाल के रूप में इस प्रक्रिया में कोशिकाओं को जितना संभव हो, के लिए ठंड के झटके से बचें। इस तरह के व्यवहार को पुन: चढ़ाया कोशिकाओं की व्यवहार्यता को कम।

  1. समाधान तैयार करें।
    1. पूर्व गर्म धो बफर (DMEM / F12, पी / एस; 0.1% बीएसए) एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में।
    2. पूर्व गर्म एक 96 अच्छी तरह से थाली (फ्लैट नीचे, कम से बाध्यकारी) एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में। एक दूसरे के लिए थाली में से एक अच्छी तरह से और 100 μl 0.25% trypsin EDTA समाधान के लिए 100 μl 100% एफसीएस जोड़ेकुंआ।
  2. कालोनियों लीजिए।
    1. कदम 5.4 में वर्णित के रूप में लेने के लिए और 20 या उससे अधिक रिंग / 10 μl पिपेट युक्तियों का उपयोग प्राथमिक संस्कृतियों में घने कालोनियों के एक कुल पूल,।
    2. कालोनियों 5 मिनट के लिए 400 XG पर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और स्पिन में गर्म (कम से कम आरटी) धोने बफर (~ 1000 μl) में रखें। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  3. Trypsin का उपयोग एकल कोशिका निलंबन में कालोनियों अलग कर देना।
    1. शेष मात्रा (20 μl या कम) है, जो अच्छी तरह से है कि गर्म trypsin समाधान (7.1 में तैयार) शामिल है में, कालोनियों में शामिल स्थानांतरण।
    2. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (नहीं एक पानी के स्नान) 1.5 मिनट के लिए में थाली सेते हैं। थाली निकालें और कालोनियों एक बार कुछ पिपेट। एक और 1.5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. प्लेट और पिपेट को निकालें और कुछ और समय नीचे कालोनियों को तोड़ने के लिए। माइक्रोस्कोप के नीचे की जाँच देखना है कि क्या कालोनियों एकल कक्ष निलंबन में मुख्य रूप से छितरी किया गया है।कालोनियों के ओवर-पाचन से बचें।
  4. जोड़ना एफसीएस द्वारा ट्रिप्सिन प्रतिक्रिया बंद करो।
    1. अच्छी तरह से सेल शामिल है कि में गर्म एफसीएस के 100 μl स्थानांतरण। पिपेट और एक बार कुछ नीचे। 1,000 μl युक्त गर्म धो बफर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण। आरटी पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र।
    2. गर्म बफर के साथ दो बार धोएं।
    3. कोशिकाओं बफर या संस्कृति के माध्यम से 200 में ~ μl फिर से निलंबित।
  5. एक hemacytometer का उपयोग कोशिकाओं की संख्या की गणना। आरटी पर सेल निलंबन रखें।
  6. पुन प्लेट अलग माध्यमिक कॉलोनी या तो murine ईसीएम प्रोटीन (5% वी / वी) या laminin हाइड्रोजेल (100 माइक्रोग्राम / एमएल) युक्त assays में कोशिकाओं और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं।
    नोट: murine ईसीएम प्रोटीन में फिर से चढ़ाना कोशिकाओं के लिए, 2-3 सप्ताह के लिए अच्छी तरह से और संस्कृति के प्रति 2,500-5,000 कोशिकाओं का उपयोग करें। laminin हाइड्रोजेल संस्कृति में फिर से pating के लिए, 7-12 दिनों के लिए अच्छी तरह से और संस्कृति के अनुसार 10,000-25,000 कोशिकाओं का उपयोग करें।

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Representative Results

एडल्ट अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (चित्रा 1) से समृद्ध किया जा सकता है। Sox9 / EGFP ट्रांसजेनिक माउस यहां इस्तेमाल लाइन पहले GENSAT ब्रेन एटलस प्रोजेक्ट 19 का एक परिणाम के रूप में उत्पन्न किया गया था, और EGFP रिपोर्टर एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र युक्त के नियंत्रण में है ~ Sox9 20 से 75 केबी नदी के ऊपर और नीचे की ओर ~ 150 केबी दृश्यों । इन चूहों में, EGFP अग्नाशय नलिकाएं कुशलता और विशेष रूप से 22 लेबल। अग्न्याशय की खरीद की गई थी और एक एकल कोशिका निलंबन में अलग, और बायोटिन के साथ संयुग्मित विरोधी CD133 एंटीबॉडी, एसटीवी एपीसी के साथ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला द्वारा पीछा के साथ दाग। जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं उचित gating मानकों (चित्रा 1) के साथ प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया। विभिन्न मापदंडों का उपयोग gating प्राप्त कोशिकाओं और हल के लिए methylcellulose युक्त कॉलोनी assays में चढ़ाया जा सकता हैकॉलोनी गठन। पिछले अध्ययनों में, यह पाया गया कि कॉलोनी बनाने की क्षमता केवल हल CD133 + Sox9 / EGFP + नलीपरक कोशिकाओं 7 में पाया जाता है।

के रूप में एक औंधा, चरण विपरीत, प्रकाश माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) का उपयोग कर मनाया कालोनियों methylcellulose युक्त कॉलोनी assays में गठन, उनके morphologies के अनुसार वर्गीकृत किया गया। बाद में, अलग-अलग कालोनियों जीन अभिव्यक्ति के लिए microfluidic QRT- पीसीआर विश्लेषण (चित्रा 3) के द्वारा या द्वारा हाथ उठाया और विश्लेषण किया गया प्रोटीन अभिव्यक्ति (चित्रा 4) के लिए immunostaining पूरे माउंट। प्रकाशित अध्ययन 7,9,11 में, यह पाया गया है कि कई अलग-अलग कालोनियों वाहिनी (mucin-1), कोष्ठकी (amylase) और अंत: स्रावी (इंसुलिन) कोशिकाओं के लिए वंश मार्कर व्यक्त की, यह दर्शाता है कि इन कालोनियों के लिए की शुरुआत PCFUs के बहुमत रहे हैं सप्ताह में तीन शक्तिशाली। प्रत्येक कॉलोनी में तीन सेल प्रजातियों के अनुपात में , तथापि, प्रकार और methylcellulose युक्त कॉलोनी assays 7.9 में मौजूद ईसीएम प्रोटीन की सांद्रता से प्रभावित था। Murine ईसीएम प्रोटीन प्रेरित PCFUs की आत्म नवीकरण और नलीपरक सेल भेदभाव जबकि laminin हाइड्रोजेल रियायत के अंत: स्रावी और कोष्ठकी सेल प्रजातियों 7,9,11 के भेदभाव का समर्थन किया।

आकृति 1
चित्रा 1 फ्लो दो नलीपरक सेल मार्कर, CD133 और Sox9। Sox9 / EGFP ट्रांसजेनिक चूहों कि निहित Sox9 लोकी संचालित EGFP संवाददाता इस्तेमाल किया गया के अनुसार धुंधला पैटर्न दिखा वयस्क चूहों से अलग अग्नाशय कोशिकाओं के cytometry विश्लेषण। एक प्रतिनिधि छँटाई गेट (लाल बॉक्स) अग्नाशय CD133 + Sox9 / EGFP + कोशिकाओं के लिए दिखाया गया है। CD133 + Sox9 / EGFP + कोशिकाओं PCFUs 7 के लिए समृद्ध कर रहे हैं।लेस / ftp_upload / 54016 / 54016fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 अलग morphologies के साथ कालोनियों methylcellulose युक्त कॉलोनी assays में उत्पन्न किया गया। अँगूठी के प्रतिनिधि photomicrographs, एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप दृश्य प्रकाश द्वारा प्रबुद्ध से घने और Endocrine / कोष्ठकी कालोनियों दिखाए जाते हैं। अंगूठी और घने कालोनियों उत्पन्न कर रहे हैं जब हौसले से हल किया PCFUs 3 सप्ताह 7 के लिए murine ईसीएम प्रोटीन और सुसंस्कृत युक्त मध्यम संस्कृति में चढ़ाया जाता है। अंत: स्रावी / कोष्ठकी कालोनियों संस्कृति के माध्यम में अलग अंगूठी या घने कॉलोनी कोशिकाओं को फिर से चढ़ाना एक laminin हाइड्रोजेल युक्त और ~ 1 सप्ताह 7 के लिए सभ्य बाद बनते हैं। स्केल की अंगूठी और घने कालोनियों के लिए सलाखों = 100 माइक्रोन। इंडो / कोष्ठकी कालोनियों = 25 μ के लिए स्केल पट्टी;। एम यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. व्यक्तिगत कालोनियों व्यक्त नलीपरक, कोष्ठकी और अंत: स्रावी कोशिकाओं के लिए मार्कर murine ईसीएम प्रोटीन में वृद्धि हुई है। व्यक्तिगत अंगूठी कालोनियों के microfluidic QRT- पीसीआर विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम है। प्रत्येक स्तंभ एक भी कॉलोनी का प्रतिनिधित्व करता है। जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर उच्च अभिव्यक्ति और ठंडा रंग कम अभिव्यक्ति का संकेत का संकेत गर्म रंग के साथ, यहाँ एक गर्मी नक्शे के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। एकल कालोनियों के कई मार्करों वाहिनी, अंत: स्रावी या कोष्ठकी सेल वंश का संकेत के लिए प्रत्येक पैनल में जीन का कम से कम एक व्यक्त करते हैं। ये आंकड़े है कि अलग-अलग कालोनियों के कई त्रि-वंश मार्कर एक्सप्रेस, और सुझाव है प्रदर्शित की सबसे अधिक है किप्रारंभिक PCFUs त्रिकोणीय शक्तिशाली हैं। यह आंकड़ा एक पहले प्रकाशित आंकड़ा 7 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. दो अंगूठी कालोनियों, एक नलीपरक प्रोटीन मार्कर mucin 1. के प्रतिनिधि परिणाम पूरे माउंट अंगूठी कालोनियों के immunostaining व्यक्त एक नलीपरक मार्कर mucin 1 (हरे रंग) के प्रोटीन अभिव्यक्ति दिखा। नाभिक काउंटर से सना हुआ DAPI (नीला रंग) के साथ कर रहे हैं। ये अंगूठी कालोनियों में कई कोशिकाओं mucin 1 प्रोटीन व्यक्त करते हैं। यह दिखा रहा है कि रिंग कालोनियों murine ईसीएम प्रोटीन में उगाया mucin1 और अन्य नलीपरक सेल मार्कर के उच्च स्तर (चित्रा 3 में गर्म रंग) को व्यक्त microfluidic QRT- पीसीआर परिणामों के साथ संगत है। पैमाने पर पट्टी प्रतिनिधित्व50 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा आत्म नवीकरण और संस्कृति में अलग-अलग पूर्वज कोशिकाओं की बहु-वंश भेदभाव की माप के लिए 5. अग्नाशय कॉलोनी assays। प्रतिनिधि कार्यप्रवाह प्रस्तुत किया है। तो यह है कि संस्कृति के माध्यम से अर्द्ध ठोस हो जाता है हमारी अग्नाशय कॉलोनी assays, एक चिपचिपा पदार्थ, methylcellulose होते हैं। अर्ध ठोस मध्यम आंदोलन प्रतिबंधित करता है और एकल पूर्वज कोशिकाओं के एकत्रीकरण (लाल रंग में संकेत दिया) से बचाता है। हालांकि, मध्यम काफी नरम करने के लिए एक ही पूर्वज सेल आत्म नवीकरण और / या अंतर है, और कोशिकाओं की एक कॉलोनी (एकाधिक लाल हलकों द्वारा प्रतिनिधित्व) के रूप में विकसित की अनुमति है। इसके विपरीत, एकल कक्षों कि कॉलोनी के गठन क्षमताओं की जरूरत नहीं है, <उन्हें> यानी, गैर-पूर्वज कोशिकाओं (नीले रंग में संकेत दिया), एकल कक्षों के रूप में रहने या संस्कृति में समय के साथ मर जाते हैं। Methylcellulose भी कम मात्रा में ईसीएम प्रोटीन, इस तरह के रूप में 5% murine ईसीएम प्रोटीन या 100 माइक्रोग्राम / एमएल laminin हाइड्रोजेल के शामिल किए जाने की अनुमति देता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

अग्नाशय कॉलोनी assays और एकल कॉलोनी यहाँ वर्णित विश्लेषण methylcellulose युक्त hematopoietic कॉलोनी assays पिछले दशकों 23 हीमैटोपोयटिक पूर्वज कोशिकाओं के जीव विज्ञान का गूढ़ रहस्य में प्रमुख भूमिका निभाई है कि से प्रेरित थे। इन assays में (चित्रा 5), अलग अग्नाशय कोशिकाओं में चढ़ाया जाता है methylcellulose युक्त उचित वृद्धि कारक है और ईसीएम प्रोटीन है कि अंगूठी, घने या अंतःस्रावी / कोष्ठकी कालोनियों 7 के गठन का समर्थन के साथ अर्द्ध ठोस मीडिया। एक एकल पूर्वज सेल कि कोशिकाओं की एक कॉलोनी को जन्म देने में सक्षम है एक PCFU करार दिया है। व्यक्तिगत microfluidic QRT- पीसीआर और पूरे माउंट immunostaining का उपयोग कर कालोनियों निस्र्पक द्वारा, मूल PCFUs के वंश क्षमता deduced किया जा सकता है। यह पाया गया कि वयस्क murine PCFUs के बहुमत त्रिकोणीय शक्तिशाली, इन विट्रो 7.9 में नलीपरक, कोष्ठकी, और अंत: स्रावी वंश कोशिकाओं को जन्म देने में सक्षम हैं। जबकि हत्याine ईसीएम प्रोटीन वाहिनी वंश के प्रति सप्ताह में तीन शक्तिशाली PCFU के भेदभाव को प्रोत्साहित करते हैं, laminin हाइड्रोजेल मजबूत अंत: स्रावी और कोष्ठकी सेल वंश भेदभाव 7.9 अनुमति देता है। एक माध्यमिक murine ईसीएम कॉलोनी परख 7 में चढ़ाया पुन PCFUs, अंगूठी या घने कालोनियों एक प्राथमिक murine ईसीएम कॉलोनी परख में उगाया की इन विट्रो आत्म नवीकरण क्षमता एकल कोशिका निलंबन और में अलग किया जा सकता आकलन करने के लिए। यह पाया गया कि PCFUs 11 सप्ताह 7 में विस्तार ~ murine ईसीएम प्रोटीन में 500,000 बार। महत्वपूर्ण कदम पर पाचन कोलैजिनेज़ द्वारा अग्नाशय कोशिकाओं के बचने, और इससे पहले कि फिर से चढ़ाना अलग अंगूठी / घने कॉलोनी कोशिकाओं को ठंड के झटके को कम करने, विच्छेदित Pancreata से वसा ऊतकों को हटाने के शामिल हैं। माहिर एकल कक्षों के micromanipulation कुछ समय लग सकता है; धैर्य और अभ्यास की आवश्यकता है।

अन्य अग्नाशय के पूर्वज सेल assays की तुलना में, 2 डी संस्कृति 24, एस सहितuspension "pancreasphere" 25 और organoid assays 12-15, methylcellulose युक्त कॉलोनी यहाँ वर्णित assays के प्रमुख लाभ इस प्रकार हैं। सबसे पहले, इसके अलावा और ईसीएम प्रोटीन की ट्यूनिंग सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। इसका कारण यह है methylcellulose पदार्थ है कि अर्द्ध ठोस माध्यम से 3 डी प्रकृति प्रदान है। इसके विपरीत, organoid संस्कृति तरीकों murine ईसीएम प्रोटीन है, जो 33% वी / वी या उच्चतर में मौजूद हैं के solidification पर निर्भर करते हैं। यहां यह उल्लेखनीय है के रूप में छोटे रूप में 1% murine ईसीएम प्रोटीन अंत: स्रावी 9 कोशिकाओं के भेदभाव को बाधित कर सकते हैं कि, पूर्वज सेल परख में ईसीएम प्रोटीन एकाग्रता के महत्व को रेखांकित। दूसरा, कालोनियों में समान रूप से अच्छी तरह से संस्कृति भर में वितरित कर रहे हैं और सही ढंग से गिना जा सकता है। तीसरा, एकल कालोनियों आसानी से बाद के विश्लेषण के लिए चुना जा सकता है। चौथा, methylcellulose युक्त अर्द्ध ठोस मध्यम बनाए रखने के लिए आसान है, और कोई मध्यमपरिवर्तन संस्कृति के दौरान आवश्यक है। अंत में, कोशिकाओं की बड़ी संख्या (प्रति 24 अच्छी तरह से थाली 25,000 कोशिकाओं तक) चढ़ाया और इन कॉलोनी assays में जांच की, उन्हें पूर्वज सेल की गतिविधियों का पता लगाने के लिए कुशल भले ही वे चढ़ाया कोशिकाओं के बीच एक छोटी सी आबादी हैं बना रही हो सकता है।

अग्नाशय के पूर्वज सेल यहाँ वर्णित assays कार्यात्मक के आधार पर कर रहे हैं, लेकिन नहीं मार्कर आधारित, अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं का विश्लेषण करती है। इसका मतलब यह है कि अग्नाशय कोशिकाओं पूर्वज जानते हुए भी कि वे क्या मार्करों व्यक्त बिना अध्ययन किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि वयस्क अग्नाशय कोशिकाओं पूर्वज क्या विशिष्ट मार्करों व्यक्त कर सकते हैं के बारे में थोड़ा ज्ञान है नहीं है। इसके अलावा, भ्रूण अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं के लिए मार्कर वयस्क progenitors के अध्ययन के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता। कार्यात्मक विश्लेषण का उपयोग करके, एक पहली बार इस तरह CD133 के रूप में, उप जनसंख्या PCFU गतिविधि है कि निर्धारित करने से विशिष्ट पूर्वज सेल मार्कर की पहचान करने के लिए शुरू कर सकते हैं + </ sup> Sox9 / EGFP + कोशिकाओं यहाँ सचित्र। यह जीन है कि विभिन्न PCFU युक्त आबादी द्वारा व्यक्त कर रहे हैं की पहचान के द्वारा पीछा किया जा सकता है, शाही सेना seq का उपयोग कर। उम्मीदवार मार्कर तो परीक्षण किया है और इस तरह इन विट्रो में और vivo वंश अनुरेखण तकनीक है कि पूर्वज कोशिकाओं के भेदभाव क्षमताओं ट्रैक में संसाधनों द्वारा सत्यापित किया जा सकता है।

इन विट्रो methylcellulose युक्त कॉलोनी assays की सीमाओं को तीन गुना कर रहे हैं। सबसे पहले, हालांकि assays संस्कृति में 3 डी अंतरिक्ष में अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं को ईसीएम प्रोटीन और वृद्धि कारकों प्रदान करके अग्न्याशय के vivo microenvironment नकल, स्थिति नहीं समान हैं। इसके अलावा, विवो में उपकला कोशिकाओं के ढांचे एकल कक्षों, जो महत्वपूर्ण परिणाम हो सकते में हदबंदी द्वारा बाधित कर रहे हैं। इसलिए, यह विवो में उपयोग करते हुए अनुवर्ती अध्ययन में पूर्वज कोशिकाओं को सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण होगा 18 अपरिभाषित अभिकर्मकों, होते हैं। ये अपरिभाषित घटकों परोक्ष रूप से पूर्वज कोशिकाओं पर विशिष्ट वृद्धि कारकों के कार्य को प्रभावित कर सकते हैं और अधिक कार्य संस्कृति की स्थिति की एक पूरी तरह से परिभाषित सेट बनाने के लिए की जरूरत है। अंत में, वंश अनुरेखण प्रयोगों कोष्ठकी करने वाली बीटा कोशिकाओं 26,27 या अल्फा कोशिकाओं करने वाली बीटा कोशिकाओं 28 रूपांतरण वयस्क चूहों में vivo में प्रदर्शन किया। methylcellulose संस्कृति यहाँ वर्णित शर्तों वाहिनी करने वाली बीटा सेल रूपांतरण के लिए ही विशिष्ट हो सकता है। गैर-वाहिनी कोशिकाओं संस्कृति में बीटा कोशिकाओं में बदलने के लिए के लिए अन्य अज्ञात संस्कृति की स्थिति की जरूरत हो सकती है।

ऐसे कई उदाहरण हैं जहां समस्या निवारण आवश्यक हो सकता है कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, यदि अलग कोशिकाओं साथ clumped कर रहे हैं, समाधान में DNase मैं की अधिक मात्रा का उपयोग करें। DNase मैं अलग अग्नाशय डीएनए मो की वजह से कोशिकाओं के tangling को रोकने के लिए महत्वपूर्ण हैमृत कोशिकाओं द्वारा जारी lecules (कदम 1.3.2 देखें)।

वैकल्पिक रूप से, अगर कीमा ऊतकों 10 मिलीलीटर पिपेट में चिपके रहते हैं, छोटे टुकड़ों में ऊतक कीमा। 10 मिलीलीटर पिपेट के उद्घाटन के अवसर काफी व्यापक ऊतक टुकड़े collagenase पाचन के बाद के माध्यम से पारित करने के लिए होना चाहिए। टुकड़े 10 मिलीलीटर पिपेट की नोक पर अटक जाते हैं, तो यह इंगित करता है कि वसंत कैंची से ऊतक के नख़रेबाज़ पर्याप्त नहीं है (कदम 1.3.4 देखें)।

एक अन्य समस्या उत्पन्न हो सकती है कि अलग अग्नाशय कोशिकाओं (यानी, अवर्गीकृत कोशिकाओं) से murine ईसीएम प्रोटीन में कोई कॉलोनी वृद्धि है। यदि ऐसा होता है, अग्न्याशय हदबंदी चरण के दौरान एकल कक्षों में समूहों के सभी तोड़ने के लिए, के रूप में इस overdigestion और कोशिका मृत्यु में हो सकता है प्रयास नहीं करते। बड़े टुकड़े कर रहे हैं, तो 7 बार या उससे कम में कुछ (4) मिनट और सिरिंज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए ट्यूब वापसी। खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं पुनः जाँच। कोलैजिनेज़ बी के इलाज के लिए अधिकतम समय 30 मिनट है। डीइस्तेमाल किया कोलैजिनेज़ पर epending, पाचन के लिए इष्टतम समय अलग (कदम 1.4.2 देखें) हो सकती है।

इसके अलावा, संस्कृति कुओं में murine बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के झुरमुटों ऊष्मायन के बाद देखा जा सकता है। इससे बचने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि संस्कृति घटक है कि murine बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ संपर्क में आने के सभी 37 डिग्री सेल्सियस (3 कदम देखें) में ऊष्मायन से पहले समय से पहले solidification से बचने के लिए बर्फ पर ठंडा रखा जाता है।

इसके अलावा, यह एक गिलास पाश्चर विंदुक में एक समय में एक सेल उठा में मुश्किल हो सकती है। इस का हल अर्द्ध ठोस माध्यम में चढ़ाया यकीन है कि एक सेल अन्य कोशिकाओं से पर्याप्त दूरी है कि बनाने के लिए हौसले से हल कोशिकाओं के घनत्व को कम करने के लिए है। यह एक ही समय में कई कोशिकाओं उठा से बचना होगा। इसके अलावा, यह बेहतर है, अर्द्ध ठोस माध्यम के तल के पास माइक्रोस्कोप का ध्यान केंद्रित करने के लिए जगह के रूप में यह आसान है कि विमान के पास हाथ से एकल कक्षों को लेने के लिए एक माइक्रो के बिना हैजोड़तोड़ (कदम 4.6.2 देखें)।

इसके अलावा, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या एकल कक्ष में गड़बड़ी सफल हो सकता है। एक समाधान वास्तविक प्रयोग से पहले एकल कक्ष micromanipulation अभ्यास है। सेल कांच पाश्चर विंदुक में उठाया है एक बार, ( 'कोई-सेल' मध्यम कदम 4.4.1 में तैयार) कोशिकाओं के बिना 1% methylcellulose समाधान के 1 मिलीलीटर युक्त एक 35 मिमी पेट्री डिश के लिए सेल हस्तांतरण। कल्पना और माइक्रोस्कोप के नीचे ध्यान में पाश्चर विंदुक टिप के उद्घाटन जगह है, और धीरे-धीरे सेल बाहर धक्का। एकल कक्ष धीरे धीरे पिपेट की नोक चारों ओर दिखाई देते हैं और फिर 'कोई-सेल' मध्यम (कदम 4.8.2 देखें) में स्थानांतरित करने की उम्मीद है।

अंत में, कोई कॉलोनी विकास अलग प्राथमिक अंगूठी / घने कालोनियों से माध्यमिक संस्कृतियों में हो सकता है। समस्या निवारण के लिए, यह सुनिश्चित करें कि अलग प्राथमिक कालोनियों से कोशिकाओं माध्यमिक संस्कृतियों में चढ़ाना पहले आरटी में रखा जाता है। murine ईसीएम प्रोटीन में संवर्धन के लिए, जोड़नेकोशिकाओं 18 मिश्रण है, जिससे ठंड तापमान के लिए कोशिकाओं है, जो प्राथमिक कालोनियों से प्राप्त अलग कोशिकाओं को मार सकता है के जोखिम को कम करने से पहले ठंड संस्कृति के माध्यम से युक्त ट्यूब के लिए पिछले। हालांकि, laminin हाइड्रोजेल में कोशिकाओं की फिर से चढ़ाना पहले 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन (चरण 7 देखें) बर्फ पर प्रदर्शन करने की आवश्यकता नहीं है।

सारांश में, दो methylcellulose युक्त कॉलोनी assays के रूप में अच्छी तरह के रूप में युवा चूहों 10 के यकृत से, वयस्क 7,11 और प्रसव के बाद युवा चूहों 9,10 के Pancreata से पूर्वज कोशिकाओं की तरह चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। भविष्य अनुप्रयोगों की पहचान और शव का अग्नाशय अंगों से मानव कॉलोनी के गठन पूर्वज कोशिकाओं के लक्षण वर्णन में निर्देशित किया जाएगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम लूसी ब्राउन और अलेक्जेंडर spalla छँटाई में सहायता के लिए आशा की सिटी में विश्लेषणात्मक Cytometry कोर से धन्यवाद देता हूं। इस काम के स्वास्थ्य (एनआईएच) के राष्ट्रीय संस्थानों डैट समर्थन करने के लिए पुनर्योजी चिकित्सा अनुदान RB5-07398 के लिए R01DK081587 और R01DK099734 HTK करने के लिए, और एडीआर के लिए U01DK089533, और अनुदान राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान NSF-DMR-1206121 और कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट द्वारा द्वारा समर्थित है यूसुफ जे याकूब आण्विक इंजीनियरिंग के लिए चिकित्सा के लिए कैलटेक में डैट के लिए HTK करने के लिए संस्थान, और Oxnard फाउंडेशन और एला फाउंडेशन की ओर से उन लोगों से भी कर रहे हैं आभार स्वीकार किया।

अनुदान: इस काम के स्वास्थ्य (एनआईएच) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित है HTK को R01DK081587 और R01DK099734 अनुदान, और एडीआर के लिए U01DK089533, और पुनर्योजी चिकित्सा अनुदान RB5-07398 के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान NSF-DMR-1206121 और कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट द्वारा डैट यूसुफ जे याकूब से समर्थन करता हैसंस्थान डैट को कैलटेक में चिकित्सा के लिए आण्विक इंजीनियरिंग के लिए, और Oxnard फाउंडेशन और HTK को एला फाउंडेशन की ओर से उन लोगों को भी आभार स्वीकार कर रहे हैं। अनुसंधान इस प्रकाशन में सूचना विश्लेषणात्मक Cytometry कोर और प्रकाश माइक्रोस्कोपी डिजिटल इमेजिंग कोर के तहत पुरस्कार नंबर P30CA33572 राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित में निष्पादित कार्य शामिल थे।

अध्ययन का प्रायोजक: प्रायोजक अध्ययन डिजाइन, संग्रह, विश्लेषण, या डेटा की व्याख्या में भाग नहीं लिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Murine ECM proteins (Matrigel) Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) 354230 Stock kept at -20 °C
Laminin Hydrogel Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) Stock kept at -20 °C
Methylcellulose Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) 1,500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15 g/cm/sec) (high viscosity)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Mediatech (Manassas, VA, USA) 21-031-CV
Phosphate Buffered Saline Gibco (Grand Island, NY, USA) 15070-063
50 ml Flacon Conical vial Corning Inc. (Corning, NY, USA) 352070
100 mm x 20 mm Suspension culture dish Corning Inc. (Corning, NY, USA) 430591
Bovine Serum Albumin Sigma (St. Louis, MO, USA) A8412
Penicillin/Streptomycin Gibco (Grand Island, NY, USA) 15070-063
DNase1 Calbiochem (Darmstadt, Germany) 260913
Collagenase B Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) 11088831001 Stock kept at -20 °C
Anti-mouse CD16/32 Biolegend (San Diego, CA, USA) 101310 low endotoxin, azide free
PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control Biolegend (San Diego, CA, USA) 400522
Rat IgG1 κ Isotype Control eBioscience (San Diego, CA, USA) 13-4301-82
Anti-CD133-Biotin eBioscience (San Diego, CA, USA) 13-1331-82
Anti-CD71-PE-Cy7 Biolegend (San Diego, CA, USA) 113812
Streptavidin-Allophycocyanin Biolegend (San Diego, CA, USA) 405207
4',6-Diamidino-2-phenylindole Invitrogen (Waltham, MA,  USA) 3571 Stock kept at -20 °C
Anti-mucin 1 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) HM-1630-P1
Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) 127-495-160
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 Mediatech(Manassas, VA, USA) 10-092-CV
Fetal Bovine Serum Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) 101 Stock kept at -20 °C
Tris Ethylenediaminetetraacetic acid TEKnova (Hollister, CA, USA) T0221
Rneasy Micro Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 74004
QuantiTec Reverse Transcription Kit Qiagen (Venlo, Netherlands) 205310
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) 11753-100
Paraformaldehyde Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) SC-281692
Goat serum Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) 005-000-121 Stock kept at -20 °C
Donkey serum Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) 0017-000-121 Stock kept at -20 °C
Triton X-100 Sigma (St. Louis, MO, USA) T9284
Trypsin Sigma (St. Louis, MO, USA) T-4799
Ethylenediaminetetraacetic acid Invitrogen (Waltham, MA,  USA) 15575-020
Trypsin-EDTA Life Technologies (Waltham, MA, USA) 25200-056
Sterile Water Gibco (Grand Island, NY, USA) 15230-147 Molecular biology grade
Pasteur Pipette Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) 13-678-8B
40 μm Filter Mesh Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) 08-771-1
70 μm filter mesh Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) 08-771-2
TC Plate 96 Well Suspension Sarstedt 83.3924 (Previously 83.1835)
1 cc Syringe Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) 309659
10 cc Syringe Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) 301604
48.48 Dyanmic Array Chip Fluidigm (San Francisco, CA, USA) BMK-M-48.48
Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit Fluidigm (San Francisco, CA, USA) 85000800
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) 4304437
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate Sigma (St. Louis, MO, USA) P7949
Glass Bottom Dish MatTek (Ashland, MA, USA) P35G-1.5-14-C 35 mm Petri dish with glass bottom
Mouth Piece/Rubber Tubing Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) MP-SET
Nicotinamide Sigma (St. Louis, MO, USA) N0636 Stock kept at -20 °C
Vascular Endothelial Growth Factor R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) 293-VE Stock kept at -80 °C
Activin B R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) 659-AB Stock kept at -80 °C
Extendin 4 Sigma (St. Louis, MO, USA) E7144 Stock kept at -20 °C
Rspondin-1 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) 3474-RS Stock kept at -80 °C
Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube Corning Inc. (Corning, NY, USA) 352054
PrecisionGlide Needle 18 G x1 1/2 Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) 305196
PrecisionGlide Needle 16 G x 1 1/2 Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) 305198
Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate  Corning Inc. (Corning, NY, USA) 3473
Costar 96 Black Well Plate Corning Inc. (Corning, NY, USA) 3603 Flat, clear bottom with lid.  Black polystyrene TC-treated microplates
Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany)
Biomark HD  Fluidigm (San Francisco, CA, USA)
Aria Special Order Research Product Cell Sorter Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA)
PBS/BSA 1x PBS
0.1% (wt/vol) BSA
PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin)
PBS/BSA/Dnase1 1x PBS
0.1% (wt/vol) BSA
PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin)
Dnase 1 (2,400 Units/ml per pancreas)

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 112 अग्नाशय कॉलोनी के गठन इकाइयों पूर्वज कोशिकाओं प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) एकल कॉलोनी का विश्लेषण करती है एकल कोशिका का विश्लेषण करती है बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन laminin हाइड्रोजेल methylcellulose अर्द्ध ठोस मध्यम पूरे माउंट immunostaining microfluidic पीसीआर वयस्क चूहों
<em>इन विट्रो</em> कॉलोनी assays <em>में</em> त्रिकोणीय शक्तिशाली पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं निस्र्पक के लिए एडल्ट Murine अग्न्याशय से पृथक
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