Summary
Em ensaios de colónias in vitro para a detecção de auto-renovação e diferenciação de células progenitoras isoladas a partir de pâncreas de murino adulto são concebidos. Nestes ensaios, progenitores pancreáticas dar origem a colónias de células no espaço 3-dimensional em meio semi-sólido contendo metilcelulose. Protocolos para a manipulação de células individuais e caracterização de colónias individuais são descritos.
Abstract
Stem e células progenitoras do pâncreas adultos poderia ser uma fonte potencial de células beta como terapêuticos para o tratamento de pacientes com diabetes do tipo 1. No entanto, ainda é desconhecido se existem células estaminais e progenitoras no pâncreas adulto. estratégias de pesquisa usando cre-lox linhagem-tracing em ratos adultos têm rendido resultados que apoiar ou refutar a ideia de que as células beta podem ser gerados a partir dos dutos, a localização presumida quando adultas progenitoras pancreáticas podem residir. Estes métodos de rastreamento de linhagem in vivo cre-lox, no entanto, não pode responder às perguntas de auto-renovação e multi-linhagem de diferenciação e dois critérios necessários para definir uma célula-tronco. Para começar a abordar esta lacuna técnica, eu inventei ensaios de colónias 3-dimensionais para progenitores pancreáticas. Logo após a publicação inicial, outros laboratórios desenvolveram independentemente um semelhante, mas não idêntico, método chamado o ensaio organ�de. Em comparação com o ensaio de organ�de, o nosso método empregametilcelulose, que forma soluções viscosas que permitem a inclusão de proteínas de matriz extracelular em baixas concentrações. Os ensaios de metilcelulose contendo permitir a detecção e análise das células progenitoras para o nível de uma única célula, que são críticos quando progenitoras constituem uma pequena sub-população mais fácil, como é o caso de muitas células estaminais adultas de órgãos. Juntos, os resultados de vários laboratórios demonstrar in vitro de auto-renovação e multi-linhagem diferenciação de células progenitoras semelhante pancreáticas de ratos. Os protocolos atuais descrevem dois ensaios de colónias à base de metilcelulose para caracterizar progenitores rato pancreáticas; um contém uma preparação comercial de proteínas da matriz extracelular de murino e o outro uma proteína da matriz extracelular artificial conhecido como um hidrogel laminina. As técnicas aqui descritas são: 1) dissociação do pâncreas e triagem de CD133 + Sox9 / eGFP + ductais de ratos adultos, 2) manipulação de uma única célula das scélulas orted, 3) analisa única colônia usando 4) dissociação de colónias primárias em uma única célula suspensões e re-plaqueamento microfluídico qRT-PCR e montagem-toda a imunocoloração, e em ensaios de colónias secundárias para avaliar a auto-renovação ou diferenciação.
Introduction
O pâncreas é composto por três grandes linhagens celulares; células acinares secretam enzimas digestivas, dutos segregam mucina para se defender de agentes patogénicos e transportar enzimas digestivas para o intestino, e células endócrinas secretam hormônios, incluindo a insulina e glucagon, que mantêm a homeostase da glicose. Durante o desenvolvimento embrionário do pâncreas, as células ductais primeiros são a fonte das células progenitoras tri-potentes, capazes de dar origem às três linhagens no pâncreas dos animais adultos 1,2. Como as células estaminais e progenitoras adultas, tais como células estaminais da medula óssea, são já utilizados com sucesso no tratamento de várias doenças 3, existe grande interesse em encontrar as células estaminais e progenitoras no pâncreas adulto. Se o isolamento e manipulação de células estaminais e progenitoras adultas pancreáticos eram possíveis, estas células podem ser usadas para o tratamento de doenças tais como diabetes do tipo 1, em que as células secretoras de insulina são destruídas por auto-imunidade.
in vivo cre-lox-linhagem rastreamento técnicas, Inada e colaboradores mostraram que as células do ducto murino adulto marcadas com um marcador, anidrase carbônica II, poderia dar origem a todos os três linhagens pancreáticas 4. No entanto, o uso de outros marcadores, tais como ductais HNF1B 5 e 2 Sox9, concluiu-se que as células ductais não são a principal fonte de células beta em ratos adultos.
Vários anos atrás, foi proposto que a causa da discussão acima mencionado pode ser devido à falta, na área 6,7, de ferramentas analíticas adequadas que podem ser utilizadas para medir a auto-renovação e multi-linhagem diferenciação dois critérios necessário definir uma célula estaminal. O vivo técnica de rastreamento de linhagem em cre-lox mencionadoacima pode fornecer evidência para a relação progenitor-descendência em um nível populacional. No entanto, esta técnica traçar a linhagem é limitado em seu poder para discernir se as células progenitoras individuais podem auto-renovar e diferenciar em várias linhagens. análise de uma única célula é importante porque se vários progenitores mono-potente, cada um com um potencial de linhagem diferente, foram analisados em conjunto, eles podem aparecer em conjunto para ter capacidades de diferenciação multi-linhagem. Além disso, as células estaminais são normalmente uma população menor de um órgão adulto. As actividades de uma população de células menor pode ser mascarado pela maior população. Portanto, um resultado negativo de um estudo populacional não indica necessariamente a ausência de células-tronco. Finalmente, cre-lox linhagem rastreamento atualmente não permite a medição de auto-renovação.
Para começar a abordar a lacuna técnica no campo da biologia de células progenitoras do pâncreas, colônia 7-11 ou 12-15 organ�de Tabela Métodos e do equipamento), e o outro contém hidrogel laminina, uma proteína da MEC artificial definido 7-11. As células progenitoras são misturados em meio semi-sólido contendo metilcelulose. A metilcelulose é um material biologicamente inerte e viscosa preparada a partir de fibras de madeira, e tem sido utilizada rotineiramente em ensaios de colónias hematopoiéticas 16. O meio semi-sólido contendo metilcelulose-restringe o movimento das células progenitoras individuais de modo que não pode voltar a agregado. No entanto, a forma é suficientemente mole para permitir que uma célula progenitora para crescer e se diferenciam em células de uma colónia no espaço 3D. Seguindo a tradição dos hematologistas, uma célula progenitora pancreático que foi capaz de dar origem a uma colônia de células foi named uma unidade de formação de colónias do pâncreas (PCFU). PCFUs, quando cultivada no ensaio colónia contendo ECM murino, dão origem a colônias císticos que são nomeados "anel" colônias 7. Após a adição de um agonista de Wnt, R-spondin1, na cultura contendo ECM murino, algumas colónias anel transformar em colónias "densas" 7. Neste artigo, estes dois tipos de colônias crescidas em cultura ECM murino são colectivamente referidos como colônias "anel / densas". Quando anel / colônias densas são dissociados em suspensão única célula e re-banhado em culturas que contêm laminina hidrogel, colônias "Endocrine / acinares" são formadas 7.
Usando única colônia análises, verificou-se que a maioria das colônias Anel / densas e Endócrino / acinares, quer a partir de adultos (2-4 meses de idade) 7,11 ou jovens (1 semana de idade) 9 pâncreas murino, expressar todos os três marcadores de linhagem. Isto sugere que a maioria dos PCFUs originárias são tri-potente. No ensaio colónia contendo ECM murino, adulto PCFUs murino robustamente auto-renovar e expandir cerca de 500.000 vezes mais de 11 semanas em cultura 7. ECM murino preferencialmente apoia a diferenciação de células ductais mais endócrinas e acinares linhagens, ao passo que na presença de hidrogel laminina, PCFUs murino são encorajados a diferenciar-se preferencialmente em células endócrinas e acinares e menos para a linhagem ductal 7,9,11. Importante, Insulina Glucagon + - células mono-hormonal são geradas na cultura hidrogel laminina e segregam insulina em resposta à glicose estimulação in vitro de 7,9, sugerindo a maturidade funcional. A diferenciação tri-linhagem potencial de 7,9 e auto-renovação 11 de PCFUs individuais são confirmados por micromanipulação de uma única célula, ou seja, a cultura de uma célula por poço para a formação de colónias. Juntos, estes resultados fornecem evidências de que há auto-renovação, tri-potent, células progenitoras-like no pâncreas murino pós-natal que mostram actividades na cultura 3D.
Os ensaios PCFU murino descritas neste artigo são derivados a partir de um ensaio de colónias antes concebido para células progenitoras diferenciadas a partir de células estaminais embrionárias de murídeo (17) mESCs. Esse protocolo está documentada em detalhes em outra publicação JoVE 18. Os componentes e as técnicas necessárias para realizar o ensaio de colónias contendo ECM murino para adultos PCFUs cultura são os mesmos que para os progenitores derivados MESC-17,18. Portanto, estes aspectos do ensaio não será repetido aqui; em vez disso, ser dirigida os seguintes procedimentos: 1) dissociação do pâncreas adulto e triagem + células CD133 + Sox9 / EGFP ductais, que enriquecem PCFUs a partir de ratinhos adultos 7, 2) manipulação de uma única célula das células separadas, 3) uma única colónia análises usando 4) dissociação do colonie microfluídico qRT-PCR e montagem-toda a imunocoloração, es em suspensão de uma única célula e re-plaqueamento em ECM murino ou laminina ensaios hidrogel colônia.
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Protocol
Declaração de Ética: Nós aderir aos padrões éticos amplamente aceitas na realização de pesquisas para garantir a qualidade ea integridade dos resultados. A experimentação animal é conduzido de acordo com protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da City of Hope.
1. Prepare suspensão de célula individual desde Adulto Murino pancreata
NOTA: Em publicações anteriores 7,11, foram utilizados ratos CD-1 ou fundo B6; ambos os fundos obtiveram resultados semelhantes. Uma linha de rato transgénico (designado Sox9 / EGFP) com reforçada proteína verde fluorescente conduzido por Sox9 loci 19,20, foi criado no CD-1 de fundo.
- Eutanásia 3 a 5 ratos adultos, usando CO 2 do gás para 1-2 min ou até que a respiração pára. Em seguida, executar deslocamento cervical em cada rato.
- Dissecar e Preparar o pâncreas.
NOTA: dissecar os ratinhos, logo que possível após a eutanásia. Isto é importante para evitar a auto-digestão no pâncreas devidoàs mudanças post-mortem.- Adicione uma incisão vertical na linha média da parede abdominal do rato utilizando tesouras e abrir a cavidade abdominal. Encontre o baço e utilize uma pinça para levantá-lo delicadamente. Corte o tecido conjuntivo entre o baço e o lobo do baço do pâncreas com uma tesoura.
- Repita esta prática para os lobos duodenais e gástricas do pâncreas. Colocar os tecidos pancreáticos num prato de Petri contendo solução em gelo frio de Dulbecco modificado de tampão fosfato (DPBS), 0,1% de albumina de soro bovino (BSA), e penicilina e estreptomicina (P / S; solução completa designada como PBS / BSA).
- Remover tecidos gordos do pâncreas sob um microscópio de dissecação com a pinça de ponta fina.
NOTA: Este é crítico para a saúde das células pancreáticas dissociados nos seguintes passos.- (Opcional) Marque a pancreata para fluorescência verde sob o estereomicroscópio de fluorescência usando 488-509 nm de excitação para garantirexpressão EGFP.
- Em uma capa de cultura de tecidos, lavar o tecido três vezes consecutivamente em três pratos de 100 milímetros de Petri contendo 10 ml de frio PBS / BSA.
- Adicione uma incisão vertical na linha média da parede abdominal do rato utilizando tesouras e abrir a cavidade abdominal. Encontre o baço e utilize uma pinça para levantá-lo delicadamente. Corte o tecido conjuntivo entre o baço e o lobo do baço do pâncreas com uma tesoura.
- Gerar pequenos pedaços de tecidos.
- Transferir o pâncreas dissecada para uma placa de Petri estéril e seco para remover o máximo de PBS / BSA como possível, e transferi-los para uma outra placa de Petri sobre gelo seco.
- Prepare de PBS / BSA contendo ADNase I por adição de 2 ul de ADNase I solução de reserva (1 milhão de unidades [MU] / mL) por 1 ml de PBS / BSA.
NOTA: esta solução é designado PBS / BSA / ADNase I. ~ Adicione 200 ml desta solução ao mesmo tempo, que vai cobrir uma experiência de triagem. - Picar o pancreata usando uma tesoura primavera por 2-3 min ou até que o tecido está em pedaços finos. Adicionar 2-3 ml de PBS frio / BSA / ADNase I para os pedaços de tecido na placa de Petri a suspendê-las.
- Transferir os pedaços de tecido para um tubo cónico de 50 mL em gelo com uma pipeta de 10 mL. Levar o volume total a 10 ml com PBS / BSA l / DNase após recuperar o máximo de tecido possível.
- Digerir o pâncreas Pieces em células Principalmente individuais.
- Adicionar colagenase B (100 mg / ml de caldo) em 350-450 ul / 10 ml para os pedaços de tecido e o tecido incubar a 37 ° C num banho de água durante 8 min, agitando a cada 3-4 minutos. Use uma seringa de 10 ml com uma agulha de 16 ½ G a elaborar e, posteriormente, pulverizar a solução de tecido para baixo a parede do tubo de 50 ml à temperatura ambiente. Repita isso sete vezes.
NOTA: Use força suficiente para quebrar os aglomerados de células, mas evitar a geração de bolhas que podem matar as células. - Retorno do tubo para o banho de água a 37 ° C durante 8 minutos e misture agitando a cada 3-4 min. Seringa o tecido cima e para baixo sete vezes, conforme mencionado acima, e colocar uma amostra (10 ul) da solução de tecidos em uma caixa de Petri seco. Observe a solução tecido sob um, de contraste de fase invertido, microscópio óptico com uma lente objetiva de 10X. Esperar células individuais e alguns de pequeno porte cclusters de ell para estar presente.
- Lidar com as células no gelo a partir deste ponto para retardar ou parar a atividade de colagenase. Ajustar o volume para 50 ml usando frio PBS / BSA / ADNase I. Centrifugar as células a 400 xg durante 5 min a 4 ° C, e ressuspender em 5 ml de PBS frio / BSA / ADNase I usando um pipetador P1000.
- Adicionar colagenase B (100 mg / ml de caldo) em 350-450 ul / 10 ml para os pedaços de tecido e o tecido incubar a 37 ° C num banho de água durante 8 min, agitando a cada 3-4 minutos. Use uma seringa de 10 ml com uma agulha de 16 ½ G a elaborar e, posteriormente, pulverizar a solução de tecido para baixo a parede do tubo de 50 ml à temperatura ambiente. Repita isso sete vezes.
- Filtro para produzir suspensões de células individuais e lavar.
- Filtrar as células através de um copo do filtro de malha de nylon de 70 ^ m e, em seguida, através de um copo do filtro de malha de nylon de 40? M.
- Ressuspender as células em 5 ml de PBS frio / BSA / ADNase I e contar as células.
NOTA: Para 2-4 meses de idade B6 ou camundongos CD-1, cada um pâncreas pode produzir ~ 5 ou 10 milhões de células, respectivamente. Estes números podem variar entre diferentes experimentalistas. Se os detritos celulares excessiva é encontrada na contagem, levar o volume até 50 ml com PBS frio / BSA / ADNase I e centrifugar as células a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. - Ajustar o volume da suspensão de células a uma concentração de 2 x 107 células / ml, utilizando solução PBS frio / BSA / ADNase I.
2. Organizar os Cells para enriquecer pancreáticas Progenitores Colony formadoras
NOTA: A partir de ratinhos B6, CD133 +, mas não CD133 - células são enriquecidos para PCFUs 7,9,11. Células CD133 + ~ representam 13% do total dissociado células pancreáticas depois de todos os parâmetros de propagação são aplicados 11. A partir de ratinhos CD-1, CD133 + Sox9-EGFP + células normalmente representam ~ 4% de células pancreáticas no total, e essa população celular é enriquecido para PCFUs 7. Triagem dos CD133 + células / EGFP + Sox9 é descrito aqui.
- Corar as células dissociadas de pâncreas.
- Bloquear toda a suspensão de uma única célula pancreática para reduzir a ligação não específica através da incubação da suspensão de uma única célula com anti-rato de CD16 / 32 a 10 ug / ml de concentração final durante 5 min em gelo.
- Remove-se uma alíquota de 1 x 10 6 células (50 &# 181; l) para corar com o anticorpo de controlo do isotipo, IgG1 de rato conjugado com biotina a 5 ug / ml de concentração final, durante 20 min em gelo, agitando a cada 5-7 minutos.
- Remove-se uma alíquota de 1 x 10 6 células (50 uL) e manter em gelo como um controlo não corado.
- Manchar o restante das células com um anticorpo primário anti-rato conjugado com biotina CD133, a 5 ug / ml de concentração final, durante 20 min em gelo, agitando a cada 5-7 minutos.
- Células de lavagem.
- Lavar o controlo de isotipo e as amostras marcadas com o anticorpo primário por trazer o volume para 1 ml com PBS / BSA / ADNase I e centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Repita este passo de lavagem.
- Ressuspender o controlo de isotipo e as amostras marcadas com o anticorpo primário em PBS / BSA / ADNase I, de modo que a concentração final é de 2 x 10 7 células / ml.
- Manchar o controlo do isotipo e amostras marcadas com o anticorpo primário com estreptavidina (STV) aloficocianina marcado com (APC) a 2 & #181; g / ml de concentração final. Incubar durante 15 min em gelo, agitando a cada 5-7 minutos.
- Lavar as células e ', 6-diamidino-2-fenilindole coloração 4 (DAPI).
- Lavar o controlo de isotipo e as amostras marcadas com o anticorpo primário por duas vezes com PBS / BSA / ADNase I, tal como no passo 2.2. Ressuspender as células em PBS / BSA / ADNase I com DAPI (0,2 ug / ml de concentração final). O volume final da amostra de controlo de isotipo deve ser de 0,5 ml.
NOTA: Certifique-se que a densidade final da amostra manchada de anticorpo primário é apropriado para o classificador a ser utilizado. Uma concentração de 5 X 10 6 células / ml é utilizada rotineiramente para a classificação. - Ajustar o volume das células não coradas para 0,5 ml com PBS / BSA / PS / ADNase I. Filtrar todas as células através de uma malha de 20 um antes da separação e manter as células em gelo, no escuro.
- Lavar o controlo de isotipo e as amostras marcadas com o anticorpo primário por duas vezes com PBS / BSA / ADNase I, tal como no passo 2.2. Ressuspender as células em PBS / BSA / ADNase I com DAPI (0,2 ug / ml de concentração final). O volume final da amostra de controlo de isotipo deve ser de 0,5 ml.
- Triagem de células.
- Use um de 80 mm ou maior do bocal para a classificação.
NOTA: células endócrinas pancreáticas murino são propensas ao estresse físico. HoWever, PCFUs murino não parecem ser afetados pelo estresse causado pela passagem através de um classificador 7. - Adquirem eventos celulares e parâmetros de análise no separador. Portão as células para a frente e áreas de dispersão lateral para excluir restos de células 7. Portão de dispersão frontal e lateral larguras de excluir dobletes celulares. Portão de excluir + células mortas DAPI 7. Escolha gating parâmetros para os sinais de EGFP e CD133-APC com base nos valores das células de controlo de isotipo (Figura 1).
- Recolher as células separadas em 5 ml de tubos de poliestireno que contêm 1,5 ml de meio DMEM / F12 suplementado com soro de vitelo fetal a 5% (FCS). Centrifugar as populações classificadas a 400 xg durante 5 min e ressuspender em um pequeno volume (~ 200 mL), quer de meio DMEM / F12 ou PBS / BSA / ADNase I suplementado com 5% de FCS. Manter as células em gelo até à sua utilização.
- Use um de 80 mm ou maior do bocal para a classificação.
- Contar o número de células CD133 + Sox9-EGFP + obtidos a partir do classificador. Dê uma10 ul de amostra de células e contagem das células com um hemacitómetro para determinar a densidade celular.
NOTA: O uso hemocitômetro é recomendado porque contagens de máquina do classificador são pouco confiáveis.
3. Placa as células classificadas para a colônia de ensaio contendo murino ECM Proteínas
NOTA: Por favor, consulte os protocolos detalhados para o chapeamento de células para o ensaio colónia contendo ECM murino em outra publicação JoVE 18.
- Prepare Meios de Cultura.
- Preparar um meio de cultura contendo meio DMEM / F12, 1% (p / v) de metilcelulose, 5% (v / v) proteínas de ECM de murino, 50% (v / v) de meio condicionado a partir de células pancreáticas como MESC-derivados, 5% (v / v) de FCS, 10 mmol / L de nicotinamida, 10 ng / ml de activina B recombinante humana, de 0,1 nmol / L de exendina-4, e 1 ng / ml de factor de crescimento endotelial vascular-A. Métodos para gerar o meio condicionado são detalhados em outros lugares 18.
- Adicionar 750 ng / mL de RSPO-1 ao meio deSe é desejada a formação de colónias densas.
- Incubar a cultura da proteína de murino ECM a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 3 semanas.
4. Cultura das células classificadas em 1 celular por poço
NOTA: Os procedimentos a seguir aplicam-se a manipulação de células individuais usando a mão e boca pipetas. Uma abordagem alternativa é a compra de um micromanipulador. Um micromanipulador típico inclui um microscópio invertido com uma plataforma motorizada operada-joystick.
- Prepare vidro Pasteur Pipettes.
- Usando um bico de Bunsen, tirar a ponta de uma pipeta Pasteur de vidro para uma ponta fina (~ 30 mm na abertura). As pipetas de Pasteur de vidro devem ter uma rolha de algodão para criar uma barreira para o fluxo de ar a partir do operador.
- Autoclave as pipetas de Pasteur de vidro ardido a 121 ° C durante 20 min para a esterilização.
- Prepare placas de 96 poços para a Cultura.
- Prepare semi-sólida frio acordo meio de culturaing com o protocolo descrito anteriormente 18.
- Repartir o meio nas cavidades interiores de uma placa de 96 poços de fundo plano de ligação a partir de 100 ul / poço usando uma seringa de 1 ml. Encha as cavidades exteriores com água estéril para manter a humidade.
- Colocar a placa de cultura sobre gelo até à sua utilização.
- Prepare as células separadas.
- Adicionar ~ 6.000 células colhidas a partir de um classificador a 2,5 volume final ml de DMEM / F12 / PS contendo 10% de FCS e 1% de metilcelulose em um tubo de poliestireno de 5 ml. Agitar vigorosamente para misturar os componentes. Espera durante 5 min ou até que as bolhas flutuam para o topo do tubo. Este passo não necessita de ser realizada em gelo.
- Dispensar a solução de células para dois pratos de 35 mm a 1 mL / prato usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 18 G ½.
- Espalhe a solução de células no prato-o suavemente o prato com a mão. Não permitir que o meio semi-sólido para atingir a margem do prato de 35 mm, como as células individuais na margem do Cann bemot ser observado claramente usando um microscópio de luz invertida.
- Prepare a área de trabalho em torno de um microscópio.
- Adicione uma solução contendo DMEM / F-12 e 1% de metilcelulose sem quaisquer células (forma "não-célula '), e administrar a solução (tal como descrito em 4.3.2) em duas placas de Petri de 35 milímetros (1 ml por placa) .
- Limpo e limpe a área de trabalho em torno de um microscópio de contraste de fase invertida com uma solução de álcool 70%.
- Monte a pipeta com a parte de boca.
- Escolha uma pipeta Pasteur de vidro estéril que foi preparado no passo 4.1. Anexar a extremidade de uma ponta de pipeta de 1 ml de plástico para o topo da pipeta Pasteur de vidro. Anexar a extremidade mais pequena da ponta de pipeta de 1 ml de plástico a uma extremidade de um tubo de borracha de parede fina, e o bocal para a outra extremidade do tubo. Utilizar a mesma pipeta de vidro para retirar várias células do mesmo grupo.
- Elaborar, por sucção boca, um pequeno volume (~ 10 a 50 ul) do"Não-cell" solução semi-sólido feito na etapa 4.4.1 com a pipeta Pasteur de vidro.
NOTA: A solução semi-sólida, na abertura estreita da pipeta de Pasteur de vidro cria resistência ao escoamento e proporciona uma barreira para evitar a contaminação das células a serem colhidos.
- Escolha uma única célula.
- Colocar a placa de 35 mm contendo as células separadas na platina do microscópio e remover a tampa.
- Encontrar as células utilizando uma lente da objectiva de 10X e foco numa célula adequada para ser retirado.
- Localizar e colocar a abertura da ponta da pipeta junto à célula de interesse. Aplicar sucção pela boca.
NOTA: O movimento da célula deve ser muito lenta, de modo que não há risco de perda da célula durante o processo posterior. O movimento da célula de entrar na abertura da pipeta deve ser visível. Se o fluxo move-se demasiado rápido, mudar para uma pipeta com uma abertura mais estreita.
- Depositar a única célula em um poço Cultura.
- Uma vez que a célula está no pipeta, utilizar a língua para interromper o fluxo através do bloqueio da abertura da peça de boca. Pause brevemente antes de se retirar a ponta a partir do meio semi-sólido para assegurar que o meio semi-sólido parou de fluir.
- Colocar a ponta da pipeta a um poço na placa de 96 poços, preparado no passo 4.2. Empurre a pilha para fora lentamente soprando suavemente na peça de boca. Marcar o bem após a célula é depositado, a fim de evitar o plaqueamento duas células num poço.
- Certifique-se de que uma única célula é colocada em uma Bem Cultura.
- Coloque a ponta da pipeta na "não-cell 'meio preparado no passo 4.4.1. Ao observar a abertura da ponta sob o microscópio, empurrar para fora a solução semi-sólido remanescente. Esperar nenhuma célula a fluir para fora da ponta da pipeta.
- Para verificar novamente, encontrar a localização no poço cultura onde foi implantada a única célula.
- Cultura das células individuais a 37 ° C em 5% de CO 2 para cimaa 3 semanas.
5. Escolha Individual colônias de cultura semi-sólida para Análise Microfluidic qRT-PCR
NOTA: Três semanas após o plaqueamento classificados CD133 + células Sox9 / + EGFP para o ensaio de colónias contendo ECM murino, anel ou colónias densas são formadas 7 (Figura 2). Quando o Anel / colónias densas são dissociados em suspensão de células isoladas e re-plaqueadas em placas de cultura de hidrogel laminina, Endocrine colónias / acinares são gerados após aproximadamente uma semana 7 (Figura 2). Para determinar a composição de cada linhagem de colónias, análise de qRT-PCR de microfluidos é usado para detectar a expressão de marcadores de linhagem 7. Para o pré-amplificação, uma colônia é misturado numa mistura principal contendo uma mistura TaqMan sonda, tampão de reação e SuperScript III 21. O chip 48,48 matriz é posteriormente utilizado para reacções de PCR microfluídicos 21.
- Prepara-se o pré-amplificação por RCPmisture contendo 48 sondas.
- Pipetar 1,5 mL de cada sonda TaqMan (20x estoque) em um tubo de 1,5 ml. Adicionar 78 ul de tampão TE para ajustar o volume para 150 ul.
- Prepare a mistura principal, seguindo os protocolos do fabricante 21.
- Coloque 9 ul de mistura principal em cada 0,2 ml tubo de reacção de parede fina adequados para PCR, e repita essa etapa para até 48 tubos.
- Escolha colónias isoladas a partir da cultura semi-sólida.
NOTA: anel / colônias densas são maiores do que as colónias Endócrino / acinares, com diâmetros variando de ~ 50 a 400 mm 9,11. Portanto, único anel / colônias densas são colhidos usando uma pipeta P10 equipado com uma ponta de pipeta 10 ul que são dobradas em uma forma curva. Para escolher o pequeno Endócrino / colônias acinares (Figura 2), consulte o passo 4.- Localizar uma colônia de interesse sob alta ampliação (por exemplo, 20X lente objetiva), reduzir a ampliação e aspirate A colônia. (Opcional) Tome uma imagem de contraste de fase da colônia nesta etapa para documentar as características visíveis da colônia.
- Transferir a colônia dentro do tubo de PCR contendo 9 ul de mistura principal.
- Escolher o próximo colônia. Até 45 colônias no total podem ser analisadas por corrida PCR, deixando 3 pontos para controles.
- extracção de ARN e a síntese de ADNc com a pré-amplificação.
- Agitar as amostras vigorosamente antes de realizar a reacção térmica.
- Realizar as reacções de ciclos térmicos de acordo com as instruções do fabricante 21. Anel / colônias densas requerem 14 ciclos, colônias Endócrino / acinares exigem 16-20 ciclos, e as células individuais exigem 22 ciclos.
NOTA: Pré-amplificação de ADNc pode ser armazenado a -20 ° C antes da análise por PCR de microfluidos.
- Executar reacções de PCR subsequentes, utilizando um chip de microfluidos, de acordo com as instruções do fabricante 21.
- Colheita e Fix Colonies.
- Pegar as colónias sob o microscópio, como nos passos 4 ou 5.4, e adicioná-los a uma solução de paraformaldeído a 4%. Incubar O / N a 4 ° C com agitação suave.
- Lavam-se as colónias com 1X PBS duas vezes durante 10-30 min à temperatura ambiente. Armazenar as colónias fixas, a 4 ° C em tubos de 1,5 ml selados com parafina.
- Manchar as colônias com anticorpos.
- colónias de transferência para uma cavidade de uma placa de 96 poços pretas com fundo claro contendo 200 ul de tampão de bloqueio (5% de burro e / ou soro de cabra, 0,1% de Triton X-100 em PBS 1x). Incubar O / N a 4 ° C com agitação suave.
- Dilui-se o anticorpo primário a uma concentração pré-determinada (por exemplo, 1: 500 para hamster anti-mucina um anticorpo) usando tampão de bloqueio. Transferir as colónias a um limpa bem com 200 uL de anticorpo primário, e incubar O / N a 4 ° C com agitação suave. Wash as colónias 3 vezes com PBS contendo 0,1% de Tween 20. Transferir as colónias em um novo poço com 200 ul de PBS 1x / Tween 20 a 0,1% durante 10 min à temperatura ambiente para cada lavagem.
- Dilui-se o anticorpo secundário a uma concentração pré-determinada (por exemplo, 1: 2000 para o anticorpo de hamster de cabra anti-arménio) usando tampão de bloqueio. Manter a solução no escuro. Transferir as colónias para limpar poços contendo 200 uL de anticorpo secundário, e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavam-se as colónias 3 vezes com PBS / 0,1% de Tween 20, tal como no passo 6.2.2.
- colónias Counter-mancha com DAPI e visualizar com microscopia confocal.
- Transferir as colónias nos poços com PBS contendo 300 nM de DAPI e incubar durante 5 min à TA.
- Transferir as colónias DAPI coradas para uma placa de Petri com fundo de vidro 35 mm para visualização. Coloque uma lamela por cima das colónias para evitar a evaporação.
- Usar um microscópio confocal para capturar as imagens. Para visualizar DAPI staining, usar de dois fótons de excitação comprimento de onda de 730-950 nm. Use um laser de argônio com um comprimento de onda de 458 nm para excitar fluorocromos com comprimentos de onda de emissão de 519 e 561 nm. Use um laser de hélio-neon com um comprimento de onda de 633 nm para excitar fluorocromos com comprimentos de onda de emissão de 665 nm.
7. dissociar e Re-placa primária Anel / Dense Colonies em secundários Colony Ensaios
Nota: Todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis. Evite choque frio para as células desse procedimento, tanto quanto possível, tais como colocar as células no gelo ou lavar as células com frio PBS / BSA. Tais práticas reduzem a viabilidade das células banhado a re.
- Prepare Solutions.
- tampão de lavagem pré-aquecido (DMEM / F12; P / S; 0,1% de BSA) num banho de água a 37 ° C.
- Pré-aquecer uma placa de 96 poços (fundo plano; fraca ligação) em uma temperatura de 37 ° C incubadora. Adicionam-se 100 ul 100% de FCS a uma cavidade da placa e uma solução de tripsina-EDTA a 100 uL de 0,25% para uma segundabem.
- Recolha Colonies.
- Escolher e reunir um total de 20 ou mais / anel de colônias densas em culturas primárias, utilizando pontas de pipeta 10 ml, como descrito no passo 5.4.
- Coloque as colónias em água morna (pelo menos RT) tampão de lavagem (~ 1000 mL) num tubo de 1,5 mL e centrifugação a 400 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante.
- Dissociar as colônias em uma única célula suspensões utilizando tripsina.
- Transferir o volume restante (20 ul ou menos), que contém as colónias, para o poço que contém uma solução de tripsina quente (preparado em 7.1).
- Incubar a placa numa incubadora a 37 ° C (não um banho de água) durante 1,5 min. Remover a placa e pipetar as colónias algumas vezes. Incubar a 37 ° C durante mais 1,5 min.
- Retirar a placa e pipeta cima e para baixo mais algumas vezes para acabar com as colónias. Verifique sob o microscópio para ver se as colónias foram dispersos predominantemente em suspensão de uma única célula.Evitar o excesso de digestão das colônias.
- Parar a reacção de tripsina por adição de FCS.
- Transferir 100 ul de FCS a quente para o poço que contém as células. Pipeta cima e para baixo algumas vezes. Transferência das células em um tubo de 1,5 ml contendo 1.000 mL tampão de lavagem quente. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à TA.
- Lavar duas vezes com tampão quente.
- Re-suspender as células em ~ 200 ul de tampão ou meio de cultura.
- Contar o número de células utilizando um hemacitómetro. Manter a suspensão de células à TA.
- Re-placa de células em ensaios de colónias secundárias que contêm tanto proteínas de ECM de murino (5% v / v) ou hidrogel laminina (100 ug / ml) e dissociada Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2.
NOTA: Para as células re-plaqueamento em proteínas ECM murinos, usar 2.500-5.000 células por poço e cultura durante 2-3 semanas. Para re-pantes na cultura hidrogel laminina, use 10,000-25,000 células por poço e cultura para 7-12 dias.
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Representative Results
Células progenitoras pancreáticas mediana pode ser enriquecida por activadas por fluorescência de células (Figura 1). A linha de ratinhos transgénicos Sox9 / EGFP utilizado aqui foi gerado em primeiro lugar como um resultado do Projecto GENSAT Atlas Cerebral 19, e o repórter EGFP está sob o controlo de um cromossoma artificial bacteriano contendo ~ 75 kb a montante e ~ 150 kb sequências a jusante de Sox9 20 . Nestes ratinhos, EGFP etiquetas ductos pancreáticos eficientemente e especificamente 22. Pâncreas foi obtido e dissociadas numa suspensão de uma única célula, e coradas com anticorpos anti-CD133 conjugado com biotina, seguido de coloração com anticorpos secundários conjugados com STV-APC. As células resultantes foram analisadas por citometria de fluxo com os parâmetros de propagação apropriados (Figura 1). Células obtidas utilizando diferentes parâmetros de propagação podem ser classificados e banhado para os ensaios de colónias contendo metilcelulose paraa formação de colónias. Em estudos anteriores, observou-se que a capacidade de formação de colónias só é encontrado na ordenada CD133 + Sox9 / eGFP + 7 ductais.
As colónias formadas nos ensaios de colónias em metilcelulose contendo foram classificados de acordo com as suas morfologias, como observado utilizando um, de contraste de fase invertida, microscópio de luz (Figura 2). Subsequentemente, as colónias individuais foram colhidas e analisadas por análise de qRT-PCR de microfluidos para a expressão do gene (Figura 3) ou por toda a imunocoloração de montagem para a expressão da proteína (Figura 4). Em estudos publicados 7,9,11, verificou-se que muitas colónias individuais expressa marcadores de linhagem para a conduta (mucina-1), acinar (amilase) e células endócrinas (insulina), indicando que a maioria das PCFUs iniciadores para estas colónias são tri-potente. A proporção dos três linhagens de células em cada colónia , No entanto, foi influenciada pelos tipos e concentrações de proteínas de ECM presente em ensaios de colónias contendo 7,9-metilcelulose. Proteínas da MEC murinos estimulada de auto-renovação e diferenciação celular PCFUs ductal ao passo que a laminina hidrogel preferencialmente suportado a diferenciação de células acinares e do sistema endócrino linhagens 7,9,11.
Figura 1. A análise de citometria de fluxo de células pancreáticas dissociadas a partir de ratinhos adultos mostrando padrões de coloração de acordo com dois marcadores de células ductais, CD133 e Sox9 ratinhos transgénicos Sox9. / EGFP que continha Sox9 repórter EGFP-driven loci foram usadas. Um portão de triagem representante (caixa vermelha) para CD133 pancreático + / EGFP + células Sox9 é mostrado. Células / EGFP + CD133 + Sox9 são enriquecidos para PCFUs 7.les / ftp_upload / 54016 / 54016fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. colônias com diferentes morfologias foram gerados em ensaios de colónias contendo metilcelulose. Microfotografias representativos de Ring, colônias densas e Endócrino / acinares de um microscópio de contraste de fase iluminada por luz visível são mostrados. Anel e colónias densas são gerados quando PCFUs recém-ordenadas são plaqueadas em meio de cultura contendo proteínas da MEC murinos e cultivadas durante 3 semanas 7. Endocrine colónias / acinares são formados após a re-plaqueamento o Anel dissociada ou células de colónias densas em meio de cultura contendo um hidrogel laminina e cultivou-se durante ~ 1 semana sete. Barras de escala para Ring e colônias densas = 100 mm. barra de escala para Endo / acinares colônias = 25 μ;. m Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. As colónias individuais cultivadas em proteínas ECM murino marcadores de células ductais, acinares e endócrinos expressas. Os resultados representativos de análise qRT-PCR microfluídico de colônias Anel individuais. Cada coluna representa uma única colónia. Os níveis de expressão de genes são expressos como uma de mapa de calor aqui, com as cores mais quentes indicativos de maior expressão e cores mais frias indicativos de expressão inferior. Muitas das colónias individuais expressam pelo menos um dos genes em cada painel para os marcadores indicativos de conduta, endócrina ou linhagem de células acinares. Estes dados demonstram que muitas das colónias individuais expressam marcadores de tri-linhagem, e sugerem que a maior parte doPCFUs originárias são tri-potente. Este valor é modificado a partir de uma figura publicado anteriormente 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Duas colónias anel expressa uma proteína marcador ductal mucina 1. Os resultados representativos de imunocoloração de colônias anel inteiro de montagem, mostrando a expressão da proteína de um marcador ductal mucina 1 (cor verde). Os núcleos são contra-coradas com DAPI (cor azul). Muitas células nessas colônias Anel expressam mucina 1 proteína. Isto é consistente com os resultados de microfluidos qRT-PCR que mostram que as colónias de anel cultivadas em proteínas de ECM de murino expressam níveis elevados (cores mais quentes na Figura 3) de Mucina1 e outros marcadores de células ductais. A barra de escala representams 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. ensaios de colónias pâncreas para medição de auto-renovação e diferenciação de várias linhagens de células progenitoras em cultura individuais. Representativas fluxo de trabalho é apresentado. Os nossos ensaios de colónias pancreáticas conter um material viscoso, metilcelulose, de modo que o meio de cultura torna-se semi-sólido. meio semi-sólido restringe o movimento e previne a agregação de células progenitoras individuais (indicados a vermelho). No entanto, a forma é suficientemente mole para permitir que uma única célula de progenitor de auto-renovação e / ou diferenciar-se, e crescer até uma colónia de células (representado por vários círculos vermelhos). Em contraste, as células individuais que não têm capacidades formadoras de colónias, <em> ou seja, as células não-progenitor (indicado em azul), permanecem como células individuais ou morrer ao longo do tempo em cultura. Metilcelulose também permite a inclusão de proteínas de ECM em baixas concentrações, proteínas ECM murino tal como 5% ou 100 ug / hidrogel laminina ml. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os ensaios de colónias pancreáticas e colónia única análises descritas aqui foram inspirados pelos ensaios de colónias hematopoiéticas contendo metilcelulose que têm desempenhado papéis importantes em decifrar a biologia das células progenitoras hematopoiéticas nas últimas décadas 23. Nestes ensaios (Figura 5), dissociado células pancreáticas são plaqueadas em metilcelulose contendo meio de cultura semi-sólido com factores de crescimento apropriadas e proteínas da MEC que suportam a formação de anel, denso ou endócrina / acinares colónias 7. Uma única célula progenitora que seja capaz de dar origem a uma colónia de células é designada por PCFU. Ao caracterizar as colónias individuais utilizando microfluídico qRT-PCR e montagem-toda a imunocoloração, os potenciais linhagem dos PCFUs originários podem ser deduzidas. Verificou-se que a maioria dos PCFUs murino adulto são tri-potentes, capazes de dar origem a ductal, acinar, e células endócrinas in vitro da linhagem 7,9. enquanto murproteínas da MEC ine estimular a diferenciação de PCFU tri-potente no sentido de linhagem duto, o hidrogel laminina permite endócrino robusto e células acinar linhagem diferenciação 7,9. Para avaliar a capacidade de auto-renovação in vitro da PCFUs, o Anel ou colónias densas cultivadas num ensaio de colónia ECM murino primário pode ser dissociada em suspensão de uma única célula e re-plaqueadas em um ensaio de colónias de ECM murino secundária 7. Verificou-se que PCFUs expandido ~ 500.000 vezes em proteínas de ECM de murino ao longo de 11 semanas 7. As etapas críticas incluem a remoção dos tecidos gordos do pancreata dissecado, evitando o excesso de digestão de células pancreáticas pela colagenase, e minimizando o choque frio para as células de colónias densas dissociados anel / antes de voltar a galvanização. Dominando micromanipulação de células individuais pode levar algum tempo; paciência e prática são necessários.
Em comparação com outros ensaios de células progenitoras pancreáticas, incluindo cultura 2D 24, as sUSPENSÃO "pancreasphere" 25 e os ensaios organ�de 12-15, as principais vantagens dos ensaios de colónias em metilcelulose contendo descritos aqui são como se segue. Em primeiro lugar, a adição de sintonização e de proteínas de ECM com uma vasta gama de concentrações pode ser facilmente conseguida. Isto é porque a metilcelulose é a substância que confere a natureza 3D do meio semi-sólido. Em contraste, os métodos de cultura organ�de dependem da solidificação das proteínas da MEC murino, que estão presentes em 33% v / v ou superior. Note-se que tão pouco como 1% da proteína murina ECM podem inibir a diferenciação das células endócrinas 9, ressaltando a importância da concentração de proteína da MEC no ensaio de células progenitoras. Em segundo lugar, as colónias são uniformemente distribuídas em todo o poço de cultura e pode ser contado com precisão. Em terceiro lugar, colónias únicas podem ser facilmente colhido para análise subsequente. Em quarto lugar, o meio semi-sólido contendo metilcelulose é fácil de manter, e nenhum meiomudança é necessária durante o curso da cultura. Finalmente, um grande número de células (até 25.000 células por placa de 24 poços) pode ser preparada e analisada nestes ensaios de colónias, tornando-as mais eficientes para a detecção de actividades de células progenitoras, mesmo se eles são uma população menor entre as células plaqueadas.
Os ensaios de células progenitoras pancreáticas aqui descritos baseiam-se no funcional, mas não se baseia-Marker, análises das células progenitoras pancreáticas. Isto significa que as células progenitoras pancreáticas podem ser estudados sem saber o que os marcadores que expressam. Isto é importante porque há pouco conhecimento sobre o que os marcadores específicos das células progenitoras adultas do pâncreas pode expressar. Além disso, os marcadores de células embrionárias progenitoras pancreáticas podem não ser adequados para estudar as progenitoras adultas. Usando análises funcionais, pode-se começar a identificar marcadores específicos de células progenitoras, determinando primeiro o sub-população que tem actividade PCFU, tais como a CD133 + </ sup> / EGFP + células Sox9 ilustrado aqui. Isto pode ser seguido pela identificação, utilizando ARN-SEQ, de genes que são expressos diferencialmente pela população contendo PCFU. Os marcadores candidatos podem então ser testados e verificados por ensaios, tais como in vitro e in vivo técnicas de rastreio de linhagem que controlam a capacidade de diferenciação das células progenitoras.
As limitações dos ensaios in vitro de colónias contendo metilcelulose são três. Em primeiro lugar, embora os ensaios imitam o microambiente in vivo do pâncreas, fornecendo proteínas da MEC e factores de crescimento para as células progenitoras pancreáticas no espaço 3D em cultura, as condições não são idênticos. Além disso, as estruturas das células epiteliais in vivo são interrompidos por dissociação em células individuais, que podem ter consequências importantes. Por conseguinte, será importante para verificar as células progenitoras em estudos de seguimento utilizando in vivo 18. Estes componentes indefinidos podem afetar a função de fatores de crescimento específicos sobre as células progenitoras indiretamente e mais trabalho é necessário para criar um conjunto totalmente definida das condições de cultivo. Finalmente, o rastreio de linhagem experiências demonstraram células acinares-a-beta ou alfa células 26,27 células-a-beta 28 conversões in vivo em ratos adultos. As condições de cultura aqui descritas metilcelulose pode ser específica para a conversão de célula única ducto-beta. Outras condições de cultura desconhecidos podem ser necessários para células não-adesiva para converter a células beta em cultura.
Há vários casos em que pode ser necessário solucionar problemas. Por exemplo, se as células dissociadas são aglutinados, utilizar doses mais elevadas de ADNase I em soluções. ADNase I é importante para evitar o enrolamento de células pancreáticas dissociadas causadas por ADN MOlecules liberada pelas células mortas (veja o passo 1.3.2).
Alternativamente, se os tecidos picados ficar nos 10 ml pipeta, mediu o tecido em pedaços menores. A abertura da pipeta de 10 mL deve ser grande o suficiente para os pedaços de tecido a passar através após digestão com colagenase. Se peças ficar preso na ponta da pipeta de 10 ml, isto indica que a trituração do tecido por a tesoura de mola não é suficiente (ver o passo 1.3.4).
Outro problema que pode surgir é nenhum crescimento de colónias em proteínas de ECM de murino a partir de células pancreáticas dissociadas (isto é, células não separados). Se isso acontecer, não tente quebrar todos os clusters em células individuais durante a etapa de pâncreas dissociação, pois isso pode resultar em overdigestion e morte celular. Se existem grandes pedaços, devolver o tubo a 37 ° C durante algumas (4) minutos e seringa 7 vezes ou menos. Verifique novamente as células ao microscópio. O tempo máximo para o tratamento de colagenase B é de 30 min. Depending na colagenase usada, o tempo ideal para a digestão pode ser diferente (veja o passo 1.4.2).
Além disso, os aglomerados de proteínas da matriz extracelular de murino em poços de cultura pode ser observada após a incubação. Para evitar isso, certifique-se de que todos os componentes da cultura que entram em contacto com as proteínas da matriz extracelular murino são mantidos frio em gelo para evitar a solidificação prematura antes da incubação em 37 ° C (veja o passo 3).
Além disso, pode ser difícil em escolher-se uma célula de cada vez para uma pipeta de Pasteur de vidro. Uma solução para isto é para reduzir a densidade das células recentemente classificadas plaqueadas em meio semi-sólido para certificar-se de que tem uma célula de uma distância suficiente a partir das outras células. Isto irá evitar a captação de várias células, ao mesmo tempo. Além disso, é preferível colocar o foco do microscópio perto da parte inferior do meio semi-sólido, uma vez que é mais fácil de pegar células individuais por mão perto que um avião sem micromanipulador (veja o passo 4.6.2).
Além disso, pode não ser claro se a manipulação de célula única é bem sucedido. Uma solução é a prática da micromanipulação de células individuais antes da experiência real. Uma vez que a célula é captado na pipeta de Pasteur de vidro, a transferência de células para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo 1 ml de solução de metilcelulose a 1% sem células ( "não-célula" meio preparado no passo 4.4.1). Visualizar e colocar a abertura da ponta da pipeta Pasteur em foco sob o microscópio, e empurrar a célula lentamente. Espere o única célula a aparecer lentamente em torno da ponta da pipeta e depois passar para o meio 'não-cell "(veja o passo 4.8.2).
Finalmente, há o crescimento da colônia pode ocorrer em culturas secundárias de anel primário / colônias densas dissociados. Para solucionar o problema, certifique-se que as células de colónias primárias dissociadas são mantidos em RT antes do plaqueamento em culturas secundárias. Para cultura em proteínas da MEC murinos, adicionaras células passado para o tubo contendo meio de cultura frio antes de misturar 18, minimizando assim a exposição das células à temperatura fria, o que pode matar as células dissociadas obtidas a partir de colónias primárias. No entanto, o re-plaqueamento das células em hidrogel laminina não necessita de ser realizada em gelo antes de incubação a 37 ° C (ver passo 7).
Em resumo, dois ensaios de colónias contendo metilcelulose foram utilizados para caracterizar as células progenitoras semelhantes a partir do pâncreas de adulto jovem e pós-natal 7,11 9,10 ratinhos, bem como a partir de fígados de ratos jovens 10. As aplicações futuras irá ser dirigido para a identificação e caracterização das células progenitoras formadoras de colónias humanas a partir de órgãos de cadáveres pancreáticas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Lucy Brown e Alexander Spalla da Analytical Citometria Núcleo at City of Hope para assistência na classificação. Este trabalho é apoiado em parte pelo National Institutes of Health (NIH) concede R01DK081587 e R01DK099734 para HTK e U01DK089533 de ADR, e pela National Science Foundation subvenção NSF-DMR-1206121 e California Institute for Regenerative Medicine RB5-07398 concessão para DAT Apoia do J. Instituto Joseph Jacobs para a engenharia molecular de Medicina da Caltech para DAT, e os da Fundação Oxnard e Ella Fitzgerald Fundação para HTK também são reconhecido agradecimento.
Financiamento: Este trabalho é apoiado em parte pelo National Institutes of Health (NIH) concede R01DK081587 e R01DK099734 para HTK e U01DK089533 para ADR e pelo Instituto Nacional Science Foundation subvenção NSF-DMR-1206121 e Medicina Regenerativa da Califórnia RB5-07398 subvenção para DAT Suporta do Joseph J. JacobsInstituto de Engenharia Molecular de Medicina da Caltech para DAT, e os da Fundação Oxnard e Ella Fitzgerald Fundação para HTK também estão reconhecido agradecimento. Pesquisa relatada nesta publicação incluiu o trabalho realizado no Analytical Citometria Core e Microscopia de Luz Digital Imaging Núcleo apoiado pelo National Cancer Institute dos Institutos Nacionais de Saúde com o número prêmio P30CA33572.
Patrocinador do estudo: O patrocinador não participou no desenho do estudo, coleta, análise ou interpretação dos dados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20 °C |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20 °C | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1,500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15 g/cm/sec) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50 ml Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100 mm x 20 mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20 °C |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40 μm Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 μm filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20 °C |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80 °C |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80 °C |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20 °C |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80 °C |
| Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18 G x1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16 G x 1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | ||
| PBS/BSA | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) |
||
| PBS/BSA/Dnase1 | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) Dnase 1 (2,400 Units/ml per pancreas) |
References
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