Summary
In vitro testen van kolonies op zelfvernieuwing en differentiatie van progenitorcellen geïsoleerd uit volwassen muizen pancreas gedetecteerd worden gepland. In deze testen pancreatische voorlopercellen leiden tot cel kolonies in 3-dimensionale ruimte-methylcellulose bevattende halfvaste medium. Protocollen voor het manipuleren van enkelvoudige cellen en karakterisering van individuele kolonies worden beschreven.
Abstract
Stam en stamcellen uit volwassen pancreas zou een potentiële bron van therapeutische beta-achtige cellen voor de behandeling van patiënten met type 1 diabetes. Het is echter nog onbekend of stamcellen en voorlopercellen bestaan in de volwassen pancreas. Onderzoekstrategieën gebruik cre-lox-lineage tracing bij volwassen muizen resultaten die hetzij bevestigd of weerlegd het idee dat beta-cellen kunnen worden gegenereerd uit de leidingen, de vermoedelijke plaats waar volwassen pancreas voorlopercellen mogen verblijven opgeleverd. Deze in vivo cre-lox-lineage tracing, echter niet de vragen van zelfvernieuwing en multi-lijn differentiatie twee criteria die voor een stamcel definiëren beantwoorden. Om te beginnen met het aanpakken van deze technische kloof, we bedacht 3-dimensionale kolonie assays voor alvleesklier voorlopers. Kort na onze eerste publicatie, andere laboratoria onafhankelijk ontwikkelde een vergelijkbaar, maar niet identiek, methode genaamd de organoïde test. Vergeleken met de organoïde assay onze werkwijze pastmethylcellulose, waarin viskeuze oplossingen die de opname van extracellulaire matrixeiwitten bij lage concentraties mogelijk maakt. De methylcellulose-bevattende assays kan vergemakkelijken detectie en analyse van progenitorcellen bij de enkele-celniveau, die kritisch zijn als voorlopers kleine subpopulatie vormen, zoals het geval is voor vele organen volwassen stamcellen. Samen resultaten van verschillende laboratoria aan in vitro zelfvernieuwing en multi-lijn differentiatie van pancreatische voorlopercellen-achtige cellen van muizen. De huidige protocollen beschrijven twee-methylcellulose gebaseerde kolonie assays om de muis alvleesklier voorlopercellen te karakteriseren; één bevat een commercieel preparaat van muizen extracellulaire matrixeiwitten en de andere een kunstmatige extracellulaire matrix eiwit bekend als laminine hydrogel. De hier getoonde technieken zijn 1) dissociatie van de pancreas en sorteren van CD133 + SOX9 / EGFP + ductale cellen van volwassen muizen, 2) enkele cel manipulatie van de sorted cellen, 3) enkele kolonie geanalyseerd met behulp van microfluïdische qRT-PCR en hele-mount immunokleuring, en 4) dissociatie van primaire kolonies in single-cell schorsingen en re-plating in secundaire kolonie assays om zelfvernieuwing of differentiatie te beoordelen.
Introduction
De alvleesklier bestaat uit drie grote cellijnen; acinar cellen scheiden spijsverteringsenzymen, leidingen afscheiden mucine af te weren ziektekiemen en spijsverteringsenzymen vervoeren naar de darmen, en endocriene cellen scheiden hormonen, waaronder insuline en glucagon, die glucose homeostase te handhaven. Tijdens de embryonale ontwikkeling van de pancreas, de vroege ductale cellen zijn de bron van de tri-potente stamcellen kan leiden tot de drie lijnen in de pancreata van volwassen dieren 1,2. Omdat volwassen stamcellen en progenitor cellen, zoals beenmerg stamcellen, reeds met succes gebruikt om verschillende ziekten te behandelen 3, is er grote interesse in het vinden van de stamcellen en voorlopercellen in de volwassen pancreas. Als isolatie en manipulatie van volwassen pancreas stamcellen en progenitorcellen mogelijk was, konden deze cellen worden gebruikt om ziekten zoals type 1 diabetes, waarbij de insuline uitscheidende cellen vernietigd door autoimmuniteit.
in vivo cre-lox lineage-tracing technieken, Inada en collega's toonden aan dat volwassen muizen ductaal cellen gelabeld met een marker, koolzuuranhydrase II, aanleiding kan geven tot alle drie de alvleesklier lijnen 4 geven. Het gebruik van andere ductale merkers, zoals HNF1b 5 en SOX9 2, werd geconcludeerd dat ductale cellen niet de belangrijkste bron van beta-cellen in volwassen muizen.
Enkele jaren geleden stelden we voor dat de oorzaak van de bovengenoemde discussie door gebrek kan, in het gebied 6,7 van passende analytische instrumenten die kunnen worden gebruikt voor zelf-vernieuwing en multi-lijn differentiatie twee criteria die voor meten definieert een stamcel. De in vivo cre-lox-lineage tracing techniek genoemdhierboven kan bewijs voor de voorlopercellen-nageslacht relatie op een bevolking niveau. Echter, deze lineage tracing techniek beperkt in haar vermogen om te onderscheiden of enkele stamcellen kunnen zichzelf vernieuwen en differentiëren in meerdere lijnen. Eencellige analyse is belangrijk omdat wanneer verschillende mono-potente stamcellen elk met een verschillende afkomst potentieel, samen geanalyseerd, kunnen gezamenlijk lijken ze multi-lijn differentiatie capaciteiten. Bovendien stamcellen zijn meestal een kleine populatie van volwassen organen. De activiteiten van een kleine celpopulatie kan worden gemaskeerd door de grote bevolkingscentra. Daarom is een negatief resultaat van een studie populatie niet noodzakelijkerwijs de afwezigheid van stamcellen. Tenslotte wordt cre-lox lineage tracing niet toelaten dat de meting van zelfvernieuwing.
Beginnen aanpakken van de technische gat in het gebied van pancreatische voorlopercellen celbiologie, kolonie 7-11 of 12-15 organoïde werkwijzen en apparatuur Table), en de andere bevat laminine hydrogel, een gedefinieerde kunstmatige ECM eiwitten 7-11. Voorlopercellen worden gemengd in semi-vast medium dat methylcellulose. Methylcellulose is een biologisch inert en viskeus materiaal bereid uit houtvezels en werd routinematig gebruikt in hematopoietische Testen van kolonies 16. De methylcellulose bevattende halfvast medium beperkt de beweging van één progenitorcellen zodat ze niet opnieuw aggregaat. Toch is het medium is zacht genoeg om een voorlopercel te groeien en differentiëren in een kolonie van cellen in de 3D-ruimte. Volgens de traditie van de hematologen, een pancreas voorlopercellen cellen die in staat zijn die aanleiding geven tot een kolonie van cellen was, was named een pancreas-kiemgetal (PCFU). PCFUs, wanneer ze groeien in het muizen-bevattende ECM kolonie assay, aanleiding geven tot cystic kolonies die de naam "Ring" kolonies 7. Na toevoeging van een Wnt-agonist, R-spondin1, in het muizen-ECM met cultuur, sommige Ring kolonies te zetten in 'Dense "kolonies 7. In dit artikel worden deze twee soorten kolonies gegroeid in muizen ECM cultuur gezamenlijk aangeduid als "Ring / Dense" kolonies. Wanneer Ring / Dense kolonies kunnen worden gescheiden in enkele celsuspensie en opnieuw uitgeplaat in culturen die laminine hydrogel bevatten, "Endocrine / Acinaire" kolonies gevormd 7.
Met behulp van een kolonie analyses bleek dat de meeste Ring / Dense en endocriene / Acinaire kolonies, hetzij uit volwassen (2-4 maanden oud) 7,11 of jong (1 week oud) 9 muizen pancreas, druk alledrie lineage markers. Dit suggereert dat de meeste PCFUs oorsprong zijn tri-potente. In het muizen-bevattende ECM kolonie assay, volwassen muizen PCFUs robuust zichzelf te vernieuwen en uit te breiden ongeveer 500.000 keer meer dan 11 weken in de cultuur 7. Murine ECM ondersteunt bij voorkeur de differentiatie van ductale cellen over endocriene en acinaire lineages, terwijl in de aanwezigheid van laminine hydrogel, murine PCFUs aangemoedigd om bij voorkeur differentiëren tot endocriene en acinaire cellen en in mindere mate aan de ductale lijn 7,9,11. Belangrijk is Insuline + Glucagon - mono-hormonale cellen worden gegenereerd in de laminine hydrogel cultuur en uitscheiden van insuline in reactie op stimulatie glucose in vitro 7,9, wat suggereert functionele volwassenheid. De tri-lineage differentiatie potentieel 7,9 en zelf-vernieuwing 11 van de individuele PCFUs worden bevestigd door eencellige Micromanipulatie, dat wil zeggen, het kweken van een cel per putje voor de vorming van kolonies. Samen vormen deze resultaten tonen dat er een zelf-vernieuwing, tri-potent, voorlopercellen-achtige cellen in de postnatale muizen alvleesklier die activiteiten in 3D cultuur te laten zien.
De muizen PCFU assays beschreven in dit artikel worden afgeleid van een kolonie assay ontwikkeld voor progenitorcellen opzichte van muriene embryonale stamcellen (mESCs) 17. Dat protocol is vastgelegd in detail beschreven in een ander Jupiter publicatie 18. De cultuur componenten en technieken die nodig zijn om de murine-bevattende ECM kolonieproefmedium voor volwassen PCFUs voeren zijn dezelfde als voor mES afkomstige voorlopers 17,18. Daarom zijn deze aspecten van de bepaling hier niet worden herhaald; in plaats daarvan de volgende procedures aan de orde: 1) dissociatie van de volwassen pancreas en sorteren CD133 + SOX9 / EGFP + ductale cellen, die PCFUs verrijken van volwassen muizen 7, 2) eencellige manipulatie van de gesorteerde cellen, 3) single-kolonie analyseert het gebruik van microfluïdische qRT-PCR en hele-mount immunokleuring, en 4) dissociatie van colonies in single-cell schorsing en re-plating in muizen ECM of laminine hydrogel kolonie assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische verklaring: We houden aan de algemeen aanvaarde ethische normen in het uitvoeren van onderzoek naar de kwaliteit en de integriteit van de resultaten te garanderen. Dierproeven wordt uitgevoerd volgens de protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite in het City of Hope goedgekeurd.
1. Bereid Single-cell Suspension van volwassen muizen alvleesklieren
LET OP: In eerdere publicaties 7,11, CD-1 of B6 achtergrond muizen werden gebruikt; beide achtergronden leverden vergelijkbare resultaten op. Een transgene muis lijn (aangeduid SOX9 / EGFP) met verbeterde groene fluorescentie eiwit gedreven door SOX9 loci 19,20, werd opgericht in de CD-1 achtergrond.
- Euthanaseren 3-5 volwassen muizen met behulp van gas CO 2 voor 1-2 min of tot de ademhaling stopt. Voer daarna cervicale dislocatie op elke muis.
- Ontleden en te Bereid de pancreata.
OPMERKING: Prepareer de muizen zo snel mogelijk na euthanasie. Dit is belangrijk om automatisch digestie van de pancreas als gevolg voorkomenpost-mortem veranderingen.- Voeg een verticale insnijding op de scheiding van de buikwand van de muis met een schaar en open de buikholte. Vind de milt en een tang om voorzichtig te tillen. Snijd het bindweefsel tussen de milt en milt kwab van de alvleesklier met een schaar.
- Herhaal deze praktijk voor maagzweren en lobben van de pancreas. Plaats de pancreatische weefsels in een petrischaal op ijs met koude Dulbecco's gemodificeerd fosfaatbufferoplossing (DPBS), 0,1% runderserumalbumine (BSA) en penicilline en streptomycine (P / S; totaaloplossing aangeduid als PBS / BSA).
- Verwijder vetweefsel uit de alvleesklier onder een dissectie microscoop met fine-tip pincet.
Opmerking: Het is van cruciaal belang voor de gezondheid van de gedissocieerde pancreascellen in de volgende stappen.- (Optioneel) Controleer het pancreata voor groene fluorescentie onder de fluorescentie stereomicroscoop met behulp van 488-509 nm excitatie om ervoor te zorgenEGFP expressie.
- In een weefselkweek kap, spoel het weefsel driemaal achtereenvolgens in drie 100 mm platen met 10 ml koude PBS / BSA.
- Voeg een verticale insnijding op de scheiding van de buikwand van de muis met een schaar en open de buikholte. Vind de milt en een tang om voorzichtig te tillen. Snijd het bindweefsel tussen de milt en milt kwab van de alvleesklier met een schaar.
- Genereer Kleine stukjes weefsel.
- Breng de ontleed pancreata een droge steriele petrischaal om zoveel PBS / BSA te verwijderen mogelijk, en overbrengen naar een andere droge petrischaal op ijs.
- Bereid PBS / BSA met DNase I door toevoeging van 2 ul DNase I voorraad-oplossing (1 miljoen eenheden [ME] / ml) per 1 ml PBS / BSA.
Opmerking: Deze oplossing wordt aangeduid als PBS / BSA / DNase I. ~ Voeg 200 ml van deze oplossing in een keer, welke sortering experiment dekt. - Hak de pancreata behulp veer schaar voor 2-3 min of totdat het weefsel is in fijne stukjes. Voeg 2-3 ml koude PBS / BSA / DNase I bij het weefselstukken in de petrischaal op te schorten.
- Breng de stukken weefsel een 50 ml conische buis op ijs met een 10 ml pipet. Breng het totale volume op 10 ml met PBS / BSA / DNase l na het herstellen zoveel mogelijk weefsel.
- Verteren de pancreas Pieces in Meestal enkele cellen.
- Voeg collagenase B (100 mg / ml voorraad) bij 350-450 gl / 10 ml aan het weefsel stukjes en incubeer het weefsel bij 37 ° C in een waterbad gedurende 8 min wervelen elke 3-4 min. Gebruik een 10 ml spuit met een 16 ½ G naald op te stellen en vervolgens spuit het weefsel oplossing langs de wand van de 50 ml buis bij RT. Herhaal dit zeven keer.
LET OP: Gebruik voldoende kracht te breken van de cel clusters, maar voorkomen dat het genereren van bellen die de cellen kunnen doden. - Breng de buis in het waterbad bij 37 ° C gedurende 8 min en meng door zwenken om de 3-4 min. Spuit het weefsel op en neer zeven keer, zoals hierboven vermeld, en plaats een monster (10 ui) van het weefsel oplossing op droge petrischaal. Let op het weefsel oplossing onder een omgekeerde fase-contrast, licht microscoop met een 10x objectief. Verwacht enkele cellen en een aantal kleine cell clusters aanwezig zijn.
- Behandel de cellen op ijs van dit punt te vertragen of stoppen met de activiteit van collagenase. Stel het volume op 50 ml met koud PBS / BSA / DNase I. Centrifugeer de cellen bij 400 g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer in 5 ml koude PBS / BSA / DNase I met een P1000 pipet.
- Voeg collagenase B (100 mg / ml voorraad) bij 350-450 gl / 10 ml aan het weefsel stukjes en incubeer het weefsel bij 37 ° C in een waterbad gedurende 8 min wervelen elke 3-4 min. Gebruik een 10 ml spuit met een 16 ½ G naald op te stellen en vervolgens spuit het weefsel oplossing langs de wand van de 50 ml buis bij RT. Herhaal dit zeven keer.
- Filter naar Single Cell Schorsingen en Wash Opbrengst.
- Filter de cellen door een 70 um nylon mesh filter beker en vervolgens door een 40 pm nylon zeef cup.
- Resuspendeer de cellen in 5 ml koude PBS / BSA / DNase I en tel de cellen.
OPMERKING: 2-4 maanden oude B6 of CD-1 muizen, elk pancreas ~ 5 of 10 miljoen cellen verkregen, respectievelijk. Deze aantallen kunnen variëren tussen verschillende experimentalists. Als er te veel celresten wordt gevonden op tellen, breng het volume op 50 ml met koude PBS / BSA / DNase I en centrifugeer de cellen bij 400 g gedurende 5 min bij 4 ° C. - Het volume van de celsuspensie tot een concentratie van 2 x 107 cellen / ml met koud PBS / BSA / DNase I.
2. Sorteer de Cellen Alvleesklier- Kolonie-vormende voorouders Verrijk
LET OP: Vanaf B6 muizen, CD133 + maar niet CD133 - cellen zijn verrijkt voor PCFUs 7,9,11. CD133 + cellen vertegenwoordigen ~ 13% van de totale gedissocieerde pancreascellen immers gating parameters worden toegepast 11. Van CD-1 muizen, CD133 + SOX9-EGFP + cellen zijn kenmerkend ~ 4% van de totale pancreascellen, en deze celpopulatie is verrijkt PCFUs 7. Het sorteren van de CD133 + SOX9 / EGFP + cellen is beschreven.
- Vlekken op de Gescheiden cellen de alvleesklier.
- Blokkeer de gehele pancreas enkelvoudige celsuspensie om niet-specifieke binding te verminderen door het incuberen van enkel-celsuspensie met anti-muis CD16 / 32 bij 10 ug / ml uiteindelijke concentratie gedurende 5 minuten op ijs.
- Verwijder een monster van 1 x 10 6 cellen (50 &# 181; l) kleuren met de isotype controle antilichaam, biotine-geconjugeerd rat IgG1 bij 5 ug / ml uiteindelijke concentratie gedurende 20 min op ijs, wervelende elke 5-7 min.
- Verwijder een hoeveelheid van 1 x 10 6 cellen (50 pl) en blijf op ijs als een onbevlekte controle.
- Vlekken op de rest van de cellen met een biotine-geconjugeerd anti-muis CD133 primair antilichaam, bij 5 ug / ml uiteindelijke concentratie gedurende 20 min op ijs, wervelende elke 5-7 min.
- Wassen Cells.
- Was de isotype controle en primaire antilichaam gekleurde monsters door aanpassing van de volume op 1 ml met PBS / BSA / DNase I en centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Herhaal deze wasstap.
- Resuspendeer de isotype controle en primaire antilichaam gekleurde monsters in PBS / BSA / DNase I, zodat de uiteindelijke concentratie 2 x 10 7 cellen / ml.
- Vlekken op de isotype controle en primair-antilichaam gekleurd monsters met streptavidine (STV) -gemerkte allofycocyanine (APC) op 2 & #181; g / ml uiteindelijke concentratie. Incubeer gedurende 15 min op ijs, wervelende elke 5-7 min.
- Wassen cellen en 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring.
- Was de isotype controle en primair-antilichaam gekleurd monsters tweemaal met PBS / BSA / DNase I, zoals in stap 2,2. Resuspendeer de cellen in PBS / BSA / DNase I met DAPI (0,2 ug / ml eindconcentratie). Het eindvolume van het isotype controlemonster dient 0,5 ml.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de uiteindelijke dichtheid van het primaire antilichaam-gekleurde monster geschikt is voor de sorter worden gebruikt. Een concentratie van 5 x 10 6 cellen / ml wordt routinematig gebruikt voor het sorteren. - Het volume van de ongekleurde cellen 0,5 ml met PBS / BSA / PS / DNase I. Filter de cellen door een 20 urn gaas voor het sorteren en houd de cellen op ijs in het donker.
- Was de isotype controle en primair-antilichaam gekleurd monsters tweemaal met PBS / BSA / DNase I, zoals in stap 2,2. Resuspendeer de cellen in PBS / BSA / DNase I met DAPI (0,2 ug / ml eindconcentratie). Het eindvolume van het isotype controlemonster dient 0,5 ml.
- Sorteren van cellen.
- Gebruik een 80 micrometer of groter mondstuk voor het sorteren.
OPMERKING: Muizen alvleesklier endocriene cellen zijn gevoelig voor fysieke belasting. However, hebben murine PCFUs niet te worden beïnvloed door de stress veroorzaakt door het passeren van een sorteerinrichting 7. - Acquire cel gebeurtenissen en analyse parameters op de sorter. Poort de cellen voor voorwaartse en zijwaartse verstrooiing gebieden celresten 7 uitgesloten. Poort voor voorwaartse en zijwaartse verstrooiing breedtes naar cel wambuizen uit te sluiten. Poort aan DAPI + dode cellen 7 te sluiten. Choose gating parameters voor EGFP en CD133-APC signalen op basis van de waarden van het isotype controlecellen (figuur 1).
- Verzamel de gesorteerde cellen in 5 ml polystyreen buizen met 1,5 ml DMEM / F12 medium aangevuld met 5% foetaal kalfsserum (FCS). Centrifugeer de gesorteerde populaties bij 400 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer in een klein volume (~ 200 pl) van ofwel DMEM / F12 of PBS / BSA / DNase I aangevuld met 5% FCS. Houd de cellen op ijs tot gebruik.
- Gebruik een 80 micrometer of groter mondstuk voor het sorteren.
- Tel het aantal CD133 + SOX9-EGFP + cellen verkregen uit de sorter. Neem een10 gl celmonster en tel de cellen met een hemacytometer om de celdichtheid te bepalen.
LET OP: hemacytometer gebruik wordt aangeraden, omdat machine tellingen van de sorter zijn vaak onbetrouwbaar.
3. Plaat de gesorteerde cellen in de Kolonie Assay bevattende muizen ECM Eiwitten
LET OP: Raadpleeg de gedetailleerde protocollen voor de beplating van de cellen in de muizen-bevattende ECM kolonie assay in een ander Jupiter publicatie 18.
- Bereid Culture Media.
- Bereid een kweekmedium dat DMEM / F12-medium, 1% (gew / v) methylcellulose, 5% (v / v) muizen ECM proteïnen, 50% (v / v) geconditioneerd medium van mES afgeleide alvleesklier-achtige cellen, 5% (v / v) FCS, 10 mmol / L nicotinamide, 10 ng / ml humaan recombinant activine B, 0,1 nmol / L exendine-4 en 1 ng / ml vasculaire endotheliale groeifactor-A. Werkwijzen voor het genereren van het geconditioneerde medium worden elders 18 beschreven.
- Voeg 750 ng / ml van RSPO-1 aan het mediumAls Dichte kolonievorming gewenst.
- Incubeer de murine ECM eiwitten Kweken bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 3 weken.
4. Cultuur van de gesorteerde cellen 1 cel per putje
OPMERKING: De volgende procedures gelden voor het manipuleren van enkele cellen met behulp van de hand en mond pipetten. Een alternatieve benadering is om een micromanipulator schaffen. Een typische micromanipulator is voorzien van een omgekeerde microscoop met een joystick bediende, gemotoriseerde platform.
- Bereid Glass Pasteurpipetten.
- Met behulp van een bunsenbrander, trekken uit de punt van een glas Pasteur pipet met een fijne punt (~ 30 urn bij de opening). Het glas Pasteurpipetten moet een katoenen stop om een belemmering voor de luchtstroom van de operator te maken.
- Autoclaaf de gevlamde glas Pasteurpipetten bij 121 ° C gedurende 20 minuten voor sterilisatie.
- Bereid 96-well platen voor cultuur.
- Bereid koud semi-vast kweekmedium accordgens de eerder beschreven protocol 18.
- Verdeel het medium in de binnenste wells van een lage bindingsaffiniteit platte bodem 96-well plaat bij 100 ul / putje met behulp van een 1 ml spuit. Vul het buitenste putten met steriel water om de luchtvochtigheid te handhaven.
- Plaats de kweekschaal tot gebruik op ijs.
- Bereid de gesorteerde cellen.
- Voeg ~ 6000 cellen verzameld van een sorteerder 2,5 ml eindvolume van DMEM / F12 / PS met 10% FCS en 1% methylcellulose in een 5 ml polystyreen buis. Schud krachtig om de componenten te mengen. Wacht 5 minuten of totdat de belletjes naar boven drijven van de buis. Deze stap is niet te worden uitgevoerd op ijs.
- Verdeel de cel oplossing voor twee 35 mm gerechten in 1 ml / schaal met behulp van een 1 ml spuit met een 18 ½ G naald.
- Spreid de cel oplossing in de schotel door voorzichtig het schommelen van de schotel met de hand. Sta niet toe dat de semi-vast medium om de marge van de 35 mm schaal te bereiken, zoals de enkele cellen aan de rand van de put canonesot worden waargenomen duidelijk met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop.
- Bereid de Working gebied rond een microscoop.
- Voeg een oplossing bevattende DMEM / F-12 medium en 1% methylcellulose zonder cellen ( "no-cel medium) en de drank in (zoals in 4.3.2) in twee 35 mm petrischalen (1 ml per schaal) .
- Schoon en veeg het werkgebied rond een omgekeerde fase-contrast microscoop met een 70% alcohol oplossing.
- Monteer de pipet met het mondstuk.
- Kies een steriele glazen Pasteur pipet, dat bereid was in stap 4.1. Sluit het brede uiteinde van een 1 ml plastic pipet naar de top van de glazen Pasteur pipet. Sluit het kleine uiteinde van de 1 ml plastic pipetpunt met een einde van een dunwandige rubberen slang en het mondstuk aan het andere einde van de buis. Gebruik dezelfde glazen pipet voor het opnemen van meerdere cellen van dezelfde groep.
- Stellen, oraal afzuiging, een klein volume (~ 10 tot 50 pl) van de"No-cell" semi-vaste oplossing in stap 4.4.1 met de glazen Pasteur pipet.
OPMERKING: De semi-vaste oplossing in een kleine opening van de glazen Pasteur pipet creëert stromingsweerstand en een barrière om te voorkomen dat vervuiling van de cellen die moeten worden opgehaald.
- Kies een enkele cel.
- Plaats de 35 mm schaaltje met het gesorteerde cellen op de microscoop podium en verwijder het deksel.
- Vind de cellen met behulp van een 10X objectief en focus op een geschikte cel te plukken.
- Zoek en plaats de opening van de pipet tip naast de cel van belang. Afzuigen door de mond.
OPMERKING: De beweging van de cel moet heel langzaam, zodat er geen risico van verlies van de cel tijdens het proces later. De beweging van de cel die in de opening van de tube moet zichtbaar zijn. Als de stroom te snel beweegt, veranderen in een pipet met een smallere opening.
- Stort de Single Cell in een cultuur Well.
- Zodra de cel in de pipet, gebruikt de tong om de stroom te stoppen door het blokkeren van de opening van het mondstuk. Korte pauze voordat de tip trekken van de semi-vast medium dat de semi-vast medium gestopt is met lopen.
- Plaats de punt van de pipet in een putje in de 96-well plaat bereid in stap 4.2. Duw de cel langzaam door voorzichtig te blazen in het mondstuk. Markeer de put nadat de cel is aangebracht, om te voorkomen plating twee cellen in een put.
- Ervoor te zorgen dat een enkele cel wordt geplaatst in een cultuur Well.
- Plaats de pipet tip in de 'no-cell' medium bereid in stap 4.4.1. Met inachtneming van de opening van de punt onder de microscoop, druk de resterende half-vaste oplossing. Verwacht geen mobiele te laten stromen de punt van de pipet.
- Om dubbel te controleren, vindt de locatie in de cultuur goed waar de enkele cel werd geïmplanteerd.
- Cultuur van de afzonderlijke cellen bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende uptot 3 weken.
5. Kies Individuele kolonies van semi-vaste cultuur voor microfluïdische qRT-PCR-analyse
OPMERKING: Drie weken na plateren gesorteerd CD133 + SOX9 / EGFP + cellen in de muizen-bevattende ECM kolonieproefmedium, Ring of dichte kolonies gevormd 7 (figuur 2). Indien Ring / dichte kolonies worden gedissocieerd in enkele celsuspensie en opnieuw uitgeplaat in laminine hydrogel cultuur worden Endocrine / Acinaire kolonies na ongeveer een week gegenereerd 7 (figuur 2). De lijn samenstelling van elke kolonie te bepalen, wordt microfluïdische qRT-PCR analyse toegepast om de expressie van lijn 7 markers detecteren. Voor pre-amplificatie, een kolonie gemengd in een master mix met een TaqMan probe-mengsel, reactiebuffer en SuperScript III 21. De 48,48-array chip wordt vervolgens gebruikt voor het microfluïdische PCR-reacties 21.
- Bereid de pre-amplificatie PCRmeng met 48 probes.
- Pipet 1,5 pi van elke TaqMan sonde (20x voorraad) in een 1,5 ml buis. Voeg 78 ui TE-buffer om het volume op 150 pi passen.
- Bereid de master mix door het volgen van de protocollen van de fabrikant 21.
- Plaats 9 ul van master mix in elk 0,2 ml dunwandige buis reactie geschikt zijn voor PCR, en herhaal deze stap voor maximaal 48 buizen.
- Pick enkele kolonies van de semi-vaste cultuur.
LET OP: Ring / dichte kolonies zijn groter dan Endocriene / Acinaire kolonies, met diameters variërend van ~ 50 tot 400 um 9,11. Daarom worden enkele Ring / Dense kolonies opgepikt met behulp van een pipet P10 uitgerust met een 10 ul pipet tip die wordt gebogen in een gebogen vorm. Voor het kiezen van de kleine Endocriene / Acinaire kolonies (figuur 2), wordt verwezen naar stap 4.- Zoek een kolonie van belang onder hoge vergroting (bijvoorbeeld 20X objectief), de vergroting te verminderen, en aspirate de kolonie. (Optioneel) Neem een fase-contrast beeld van de kolonie op deze stap om de zichtbare kenmerken van de kolonie te documenteren.
- Breng de kolonie in de PCR-buis met 9 pl master mix.
- Kies de volgende kolonie. Tot 45 kolonies in totaal kunnen per PCR run worden geanalyseerd, waardoor er 3 plaatsen voor de controles.
- RNA-extractie en cDNA-synthese met pre-amplificatie.
- Vortex de monsters krachtig voor het uitvoeren van de thermische reactie.
- Voer de thermale cycli reacties volgens de instructies van de fabrikant 21. Ring / Dense kolonies vereisen 14 cycli, Endocrine / Acinaire kolonies nodig 16-20 cycli en enkele cellen vereisen 22 cycli.
OPMERKING: Pre-amplificatie cDNA's kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C voorafgaand aan microfluïdische PCR analyse.
- Run daaropvolgende PCR-reacties met behulp van een microfluïdische chip volgens de instructies van de fabrikant 21.
- Harvest en Fix Koloniën.
- Pak de kolonies onder de microscoop, zoals in stappen 4 of 5,4, en voeg ze toe aan een 4% paraformaldehyde oplossing. Incubeer O / N bij 4 ° C onder zacht schudden.
- Was de kolonies met 1X PBS tweemaal gedurende 10-30 minuten bij kamertemperatuur. Bewaar de vaste kolonies bij 4 ° C in 1,5 ml buisjes afgesloten met paraffine.
- Vlekken op de koloniën met antilichamen.
- Overdracht kolonies een putje van een 96-wells zwarte platen met heldere bodem met 200 ui blokkerende buffer (5% ezel en / of geit serum, 0,1% Triton X-100 in 1 x PBS). Incubeer O / N bij 4 ° C onder zacht schudden.
- Verdun het primaire antilichaam aan een vooraf bepaalde concentratie (bijvoorbeeld 1: 500 voor hamster anti-mucine antilichaam 1) middels blokkerende buffer. Breng de kolonies een schone goed met 200 gl primair antilichaam en geïncubeerd O / N bij 4 ° C onder zacht schudden. was de kolonies 3 keer met PBS dat 0,1% Tween 20. Breng de kolonies in een nieuwe put met 200 pl 1x PBS / 0,1% Tween 20 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur elke wasbeurt.
- Verdun het secundaire antilichaam aan een vooraf bepaalde concentratie (bijvoorbeeld 1: 2000 voor geit anti-Armeens hamster antilichaam) middels blokkerende buffer. Bewaar de oplossing in het donker. Breng de kolonies putjes die 200 ul secundair antilichaam reinigen en incubeer gedurende 2 uur bij KT. Was de kolonies 3 maal met PBS / 0,1% Tween 20, zoals in stap 6.2.2.
- Counter-vlek kolonies met DAPI en te visualiseren met confocale microscopie.
- Breng de kolonies in putjes met PBS dat 300 nM DAPI en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng de DAPI-gekleurde kolonies op een 35 mm glazen bodem petrischaal voor visualisatie. Plaats een dekglas op de top van de kolonies om verdamping te voorkomen.
- Gebruik een confocale microscoop om de beelden vast te leggen. Om DAPI stainin visualisereng gebruik van twee-foton excitatie golflengte van 730-950 nm. Gebruik een argon laser met een golflengte van 458 nm tot fluorochromen met emissie golflengten van 519 en 561 nm prikkelen. Gebruik een helium-neon laser met een golflengte van 633 nm tot fluorochromen prikkelen met emissiegolflengte van 665 nm.
7. distantiëren en Re-plate Primaire Ring / Dense Koloniën tot secundaire Kolonie assays
LET OP: Alle procedures moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Vermijd koude schok voor de cellen in deze procedure zoveel mogelijk, zoals putting cellen op ijs of wassen cellen met koude PBS / BSA. Dergelijke praktijken verminderen de levensvatbaarheid van re-plated cellen.
- Bereid Solutions.
- Pre-warm was buffer (DMEM / F12; P / S; 0,1% BSA) in een 37 ° C waterbad.
- Pre-warm een 96-well plaat (vlakke bodem; lage binding) in een 37 ° C incubator. Voeg 100 ul 100% FCS één putje van de plaat en 100 pi 0,25% trypsine-EDTA oplossing voor een tweedegoed.
- Verzamel Colonies.
- Pick en zwembad een totaal van 20 of meer Ring / Dense kolonies in primaire kweken met behulp van 10 pi pipet tips, zoals beschreven in stap 5.4.
- Plaats de kolonies in warme (tenminste KT) wasbuffer (~ 1000 ui) in een 1,5 ml buis en draaien op 400 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
- Distantiëren de koloniën in Single-cell schorsingen met trypsine.
- Breng de resterende hoeveelheid (20 pi of minder), die de kolonies bevat, in de bron die warme trypsine-oplossing (bereid in 7,1) bevat.
- Incubeer de plaat in een 37 ° C incubator (geen waterbad) gedurende 1,5 min. Verwijder de plaat en pipet de koloniën een paar keer. Incubeer bij 37 ° C nog eens 1,5 min.
- Verwijder de plaat en pipet op en neer een paar keer te breken van de kolonies. Kijk onder de microscoop te zien of de kolonies overwegend gedispergeerd in enkele-celsuspensie.Vermijd over-vergisting van de kolonies.
- Stop de Trypsine reactie door het toevoegen van FCS.
- Transfer 100 pl warm FCS in de put dat de cellen bevat. Pipet op en neer een paar keer. Overdracht van de cellen in een 1,5 ml buis die 1000 ul warm was buffer. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Was tweemaal met warm buffer.
- Resuspendeer de cellen in ~ 200 ul buffer en kweekmedium.
- Tel het aantal cellen met een hemacytometer. Houd de celsuspensie bij kamertemperatuur.
- Opnieuw plaat gedissocieerde cellen in secundaire Testen van kolonies die ofwel murine ECM eiwitten (5% v / v) of laminine hydrogel (100 ug / ml) en incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2.
LET OP: Voor re-plating cellen in muizen ECM eiwitten, gebruiken 2.500-5.000 cellen per putje en cultuur voor 2-3 weken. Voor re-mende in laminine hydrogel cultuur, gebruiken 10,000-25,000 cellen per putje en cultuur voor 7-12 dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volwassen pancreas progenitorcellen kunnen worden verrijkt door fluorescentie-geactiveerde celsortering (figuur 1). De SOX9 / EGFP transgene muizenlijn hier gebruikt werd eerst gegenereerd als gevolg van de GENSAT Breinwijzer Project 19 en het EGFP reporter onder de controle van een bacteriële kunstmatige chromosoom bevattende ~ 75 kb stroomopwaarts en ~ 150 kb stroomafwaarts sequenties van SOX9 20 . In deze muizen, EGFP etiketten ductus pancreaticus efficiënt en specifiek 22. Pancreas verkregen en gedissocieerd in een enkele-celsuspensie en gekleurd met anti-CD133 antilichamen geconjugeerd met biotine, gevolgd door kleuring met secundaire antilichamen geconjugeerd met STV-APC. De verkregen cellen werden door stroomcytometrie geanalyseerd met geschikte gating parameters (figuur 1). Cellen verkregen met verschillende gating parameters kunnen worden gesorteerd en uitgeplaat in methylcellulose bevattende het Testen van kolonies vankolonievorming. In eerdere studies, werd opgemerkt dat kolonievormende vermogen is alleen te vinden in de gesorteerde CD133 + SOX9 / EGFP + ductale cellen 7.
De kolonies gevormd in de methylcellulose-bevattende Testen van kolonies werden geclassificeerd volgens hun morfologie, zoals waargenomen onder gebruikmaking van een omgekeerde fase-contrast, lichtmicroscoop (figuur 2). Vervolgens individuele kolonies werden met de hand uitgekozen en geanalyseerd door microfluïdische qRT-PCR analyse van genexpressie (figuur 3) of volledig gemonteerde immunokleuring voor eiwitexpressie (figuur 4). In gepubliceerde studies 7,9,11 bleek dat veel individuele kolonies uitgedrukt lineage markers voor buis (mucine-1), acinaire (amylase) en endocriene (insuline) cellen, wat aangeeft dat de meerderheid van de initiërende PCFUs deze kolonies tri-potente. Het aandeel van de drie cellijnen in elke kolonie Echter werd beïnvloed door de soorten en concentraties van ECM eiwitten in de methylcellulose-bevattende Testen van kolonies van 7,9. Murine ECM eiwitten gestimuleerd zelf-vernieuwing van PCFUs en ductale celdifferentiatie terwijl laminine hydrogel bij voorkeur de differentiatie van endocriene en acinar cellijnen 7,9,11 ondersteund.
Figuur 1. Flowcytometrie analyse van gedissocieerde alvleesklier cellen van volwassen muizen toont kleurpatronen volgens twee ductale cel markers, CD133 en SOX9. SOX9 / EGFP transgene muizen die bevatte SOX9-loci gedreven EGFP reporter werden gebruikt. Een vertegenwoordiger sorteren gate (rode doos) voor de alvleesklier CD133 + SOX9 / EGFP + cellen wordt getoond. CD133 + SOX9 / EGFP + cellen zijn verrijkt PCFUs 7.les / ftp_upload / 54016 / 54016fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 Kolonies met verschillende morfologieën werden in methylcellulose bevattende Testen van kolonies gegenereerd. Representatieve microfoto van Ring, zijn zwaar en Endocriene / Acinaire kolonies van een fasecontrastmicroscoop verlicht door zichtbaar licht getoond. Ring en dichte kolonies worden gegenereerd wanneer vers gesorteerd PCFUs uitgeplaat in kweekmedium dat muizen ECM eiwitten en gedurende 3 weken 7. Endocriene / Acinaire kolonies worden gevormd na re-plating de gedissocieerde Ring of Dense kolonie cellen in kweekmedium dat een laminine hydrogel en gedurende ~ 1 week 7. Schaalbalken Ring en dichte kolonies = 100 urn. Schaal bar voor Endo / Acinaire kolonies = 25 μ; m. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Afzonderlijke kolonies gegroeid in muizen ECM eiwitten tot expressie merkers voor ductale, acinaire en endocrine cellen. Representatieve resultaten van microfluïdische qRT-PCR-analyse van individuele kolonies Ring. Elke kolom stelt een enkele kolonie. De expressieniveaus van genen tot expressie gebracht als een warmte-kaart hier met warmere kleuren indicatief voor hogere expressie en kouder kleuren indicatief lagere expressie. Veel van de afzonderlijke kolonies expressie van ten minste één van de genen in elk paneel de merkers indicatief duct, endocrine of acinaire cellijn. Deze gegevens tonen aan dat veel van de individuele kolonies expressie tri-lineage markers, en suggereren dat de meestePCFUs afkomstig zijn tri-potente. Dit cijfer wordt aangepast van een eerder gepubliceerde cijfer 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Twee Ring kolonies geuit ductaal eiwit marker Mucine 1. Representatieve resultaten van de hele-mount immunokleuring van Ring kolonies, waarin eiwit expressie van een ductaal marker Mucine 1 (groene kleur). De kernen zijn contra-gekleurd met DAPI (blauw). Veel cellen in deze Ring kolonies te uiten mucine 1-eiwit. Dit strookt met de microfluïdische qRT-PCR resultaten blijkt dat Ring kolonies gegroeid in muizen ECM eiwitten tot expressie hoog niveau (warmere kleuren in figuur 3) van mucin1 en andere ductale celmarkers. De schaal bar vertegenwoordigens 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Pancreatic kolonie assays voor het meten van zelfvernieuwing en multi-lijn differentiatie van afzonderlijke voorlopercellen in kweek. Representatieve workflow wordt gepresenteerd. Onze alvleesklier Testen van kolonies bevatten viskeus materiaal, methylcellulose, zodat het kweekmedium wordt halfvast. Semi-vast medium beperkt de beweging en voorkomt aggregatie van enkele stamcellen (in rood aangegeven). Echter, het medium is zacht genoeg om een enkele voorlopercellen cel om zichzelf te vernieuwen en / of differentiëren, en uitgroeien tot een kolonie van cellen (vertegenwoordigd door meerdere rode cirkels). Daarentegen losse cellen die niet kolonievormende vermogen, <em> dat wil zeggen, niet-voorlopercellen (vermeld in het blauw), blijven als afzonderlijke cellen of sterven na verloop van tijd in de cultuur. Methylcellulose maakt het ook mogelijk de opname van ECM eiwitten bij lage concentraties, zoals 5% muizen ECM eiwitten of 100 ug / ml laminine hydrogel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De alvleesklier kolonie assays en enkele kolonie analyses die hier beschreven werden geïnspireerd door de methylcellulose-bevattend hematopoietische kolonie testen die belangrijke rollen in het ontcijferen van de biologie van hematopoietische stamcellen in de afgelopen decennia 23 hebben gespeeld. In deze assays (figuur 5), gescheiden pancreatische cellen uitgeplaat in methylcellulose bevattende halfvaste media met geschikte groeifactoren en ECM eiwitten die de vorming van Ring, Dense of endocriene / Acinaire kolonies 7 ondersteunen. Een enkele voorlopercellen cel die in staat zijn die aanleiding geven tot een kolonie van cellen wordt aangeduid als een PCFU. Door het karakteriseren van individuele kolonies met behulp van microfluïdische qRT-PCR en hele-mount immunokleuring, kan het geslacht mogelijkheden van de PCFUs uit worden afgeleid. Het bleek dat de meeste volwassen muizen PCFUs tri-potente, kan leiden tot ductaal, acinaire en endocriene cellen in vitro lineage 7,9. terwijl murine ECM eiwitten bevorderen de differentiatie van tri-potente PCFU richting kanaal lijn, de laminine hydrogel maakt robuuste endocriene en acinaire cellijn differentiatie 7,9. Om de in vitro zelfvernieuwingscapaciteit van PCFUs, de ring of dichte kolonies gekweekt in een primaire murine ECM kolonieproefmedium kunnen worden gedissocieerd in enkele-celsuspensie en evalueren opnieuw uitgeplaat in een tweede murine ECM kolonieproefmedium 7. Het bleek dat PCFUs geëxpandeerde ~ 500.000 keer in muizen ECM eiwitten dan 11 weken 7. De kritische stappen omvatten het verwijderen van het vetweefsel van de ontleed pancreata vermijden over-digestie van pancreascellen door collagenase en minimaliseren koude schok voor de gedissocieerde Ring / Dense kolonie cellen alvorens opnieuw plating. Mastering micromanipulation van enkele cellen kan enige tijd duren; geduld en oefening nodig.
Vergeleken met andere pancreatische voorlopercellen assays, waaronder 2D cultuur 24, de suspension "pancreasphere" 25 en de organoïde assays 12-15, de grote voordelen van de methylcellulose-bevattende Testen van kolonies hier beschreven als volgt. Ten eerste kan de toevoeging en verfijning van ECM eiwitten met uiteenlopende concentraties gemakkelijk zijn. Dit komt omdat methylcellulose is de stof die de 3D aard van de semi-vast medium verleent. In tegenstelling, de organoïde kweekmethoden afhankelijk van de stolling van het muizen ECM eiwitten die aanwezig 33% v / v of hoger zijn. Opgemerkt wordt dat slechts 1% murine ECM eiwitten differentiatie van endocriene cellen 9 kan remmen, benadrukken het belang van ECM eiwitconcentratie in de progenitor cel assay. Ten tweede worden de kolonies gelijkmatig verdeeld over de cultuur goed en kan nauwkeurig worden geteld. Ten derde, afzonderlijke kolonies kunnen gemakkelijk worden uitgekozen voor verdere analyse. Ten vierde, de methylcellulose-bevattende halfvast medium is gemakkelijk te onderhouden en geen mediummoet worden gewijzigd tijdens de kweek. Tenslotte kunnen grote aantallen cellen (tot 25.000 cellen per 24-well plaat) worden uitgeplaat en onderzocht in deze kolonie assays, waardoor ze efficiënt voor het detecteren voorlopercel activiteiten, zelfs als ze een kleine populatie van de cellen uitgeplaat.
De pancreatische voorlopercellen assays hierin beschreven zijn gebaseerd op functioneel, maar niet marker-gebaseerde analyses van de pancreas progenitorcellen. Dit betekent dat de pancreas voorlopercellen cellen kunnen worden bestudeerd zonder te weten wat ze markers te uiten. Dit is belangrijk omdat er weinig kennis over wat specifieke markers de volwassen pancreas stamcellen kunnen uiten. Bovendien kunnen markers voor embryonale pancreas progenitorcellen ongeschikt voor het bestuderen van de volwassen voorlopercellen zijn. Via functionele analyses, kan men beginnen specifieke voorlopercellen markers door eerst de subpopulatie die PCFU activiteit, zoals CD133 + </ sup> SOX9 / EGFP + cellen hier afgebeeld. Dit kan worden gevolgd door het identificeren, gebruikmakend van RNA-seq, genen die differentieel de PCFU-bevattende bevolking uitgedrukt. De kandidaat merkers kunnen vervolgens worden getest en geverifieerd door testen zoals in vitro en in vivo lineage tracing technieken die de differentiatie mogelijkheden van de progenitorcellen te volgen.
De beperkingen van de in vitro-methylcellulose bevattende Testen van kolonies zijn drieledig. Ten eerste, hoewel de testen bootsen de in vivo micro-omgeving van de alvleesklier door ECM proteïnen en groeifactoren voor de pancreatische voorlopercellen in 3D ruimte cultuur condities niet identiek. Bovendien zijn de structuren van de epitheelcellen in vivo verbroken door dissociatie in enkele cellen, die belangrijke gevolgen kan hebben. Daarom zal het belangrijk zijn om stamcellen te controleren in de follow-up studies met behulp van in vivo 18. Deze ongedefinieerde componenten kan de functie van specifieke groeifactoren van invloed op de stamcellen indirect en meer werk nodig is om een volledig gedefinieerde set van cultuur te creëren. Tenslotte lineage tracing experimenten toonden acinaire naar betacellen 26,27 of alfa-cellen te bètacellen 28 omzettingen in vivo bij volwassen muizen. De hier beschreven methylcellulose kweekomstandigheden kunnen specifieke alleen duct naar beta cel conversie. Andere onbekende kweekomstandigheden kan nodig zijn voor niet-ductale cellen converteren beta cellen in kweek.
Er zijn verschillende gevallen waarin probleemoplossing nodig zijn. Als bijvoorbeeld gedissocieerde cellen samen samengeklonterd Gebruik hogere doses van DNase I in oplossing. DNase I is belangrijk om verstrengeling van gedissocieerde pancreascellen door DNA mo voorkomenlecules vrijgegeven door de dode cellen (zie stap 1.3.2).
Alternatief, indien gehakt weefsel steken in de 10 ml pipet, gehakt het weefsel in kleinere stukken. De opening van de 10 ml pipet moet breed genoeg voor de weefselstukken doorlaat na collagenase spijsvertering. Als stukken blijven steken aan het uiteinde van de pipet 10 ml, geeft dit aan dat het hakken van het weefsel door de veer schaar onvoldoende (zie stap 1.3.4).
Een ander probleem dat kan ontstaan geen koloniegroei in muizen ECM eiwitten uit gedissocieerd pancreascellen (dwz ongesorteerde cellen). Als dit gebeurt, probeer dan niet om alle clusters in enkele cellen breken tijdens de alvleesklier dissociatie stap, omdat dit kan leiden tot overdigestion en celdood. Als er grote stukken terug de buis 37 ° C gedurende enkele (4) min injectiespuit 7 keer of minder. Controleer de cellen onder de microscoop. De maximale tijd voor collagenase B behandeling is 30 min. DNaargelang de collagenase gebruikt, kan het optimale tijdstip voor de vertering verschillen (zie stap 1.4.2).
Bovendien kunnen bosjes muizen extracellulaire matrixeiwitten in kweekputjes worden waargenomen na incubatie. Om dit te vermijden, zorg ervoor dat alle van de cultuur onderdelen die in aanraking komen met muizen extracellulaire matrix eiwitten komen kou op ijs worden bewaard, om voortijdige stolling voorafgaand aan incubatie in 37 ° C (zie stap 3) te vermijden.
Bovendien kan het moeilijk oppakken één cel tegelijk in een glazen Pasteur pipet. Een oplossing hiervoor is om de dichtheid van het vers gesorteerde cellen uitgeplaat in halfvast medium te zorgen dat een cel voldoende afstand van de andere cellen te verminderen. Dit voorkomt oppakken meerdere cellen tegelijk. Bovendien, is het beter om de focus van de microscoop dichtbij de bodem van de halfvast medium te plaatsen, aangezien het gemakkelijker is te halen enkele cellen hand dichtbij dat vliegtuig zonder micromanipulator (zie stap 4.6.2).
Bovendien kan het onduidelijk of één celmanipulatie geslaagd is. Een oplossing is om de cel micromanipulatie treden voor het eigenlijke experiment. Zodra de cel wordt opgenomen in de glazen Pasteur pipet de cel een 35 mm petrischaal met 1 ml van 1% methylcellulose oplossing zonder cellen ( "no-cel medium bereid in stap 4.4.1). Visualiseren en plaats de opening van de top van het Pasteur pipet in focus onder de microscoop, en duw de cel langzaam. Verwachten dat de enkele cel langzaam verschijnen rond de punt van de pipet en vervolgens te verplaatsen naar de 'no-cell' medium (zie stap 4.8.2).
Ten slotte kan geen kolonie groei optreden in het voortgezet culturen uit gedistantieerd primaire Ring / Dense kolonies. Voor het oplossen van problemen, zorgen ervoor dat cellen uit gedissocieerde primaire kolonies in RT worden gehouden voordat plating in secundaire culturen. Voor kweken in muriene ECM proteïnen, voegde laatste cellen de buis met koud kweekmedium voor het mengen 18, waardoor de blootstelling van de cellen aan koude temperaturen, waarbij de gedissocieerde cellen verkregen uit primaire kolonies kunnen doden minimaliseren. Echter, het opnieuw uitplaten van cellen in laminine hydrogel niet te worden uitgevoerd op ijs voor 37 ° C incubatie (zie stap 7).
Samenvattend zijn er twee-methylcellulose bevattende Testen van kolonies gebruikt om voorlopercellen-achtige cellen te karakteriseren van de pancreata van volwassen 7,11 en postnatale jonge muizen 9,10, en uit de lever van jonge muizen 10. Toekomstige toepassingen zijn gericht op de identificatie en karakterisering van de humane kolonievormende voorlopercellen van postmortale pancreas organen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Lucy Brown en Alexander Spalla uit de Analytical Cytometry Core in het City of Hope voor hulp bij het sorteren. Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) verleent R01DK081587 en R01DK099734 om HTK en U01DK089533 ADR, en door de National Science Foundation subsidie NSF-DMR-1206121 en California Institute for Regenerative Medicine subsidie RB5-07398 naar DAT Supports uit de Joseph J. Jacobs Institute for Molecular engineering voor Geneeskunde bij Caltech naar dAT, en die van Oxnard Foundation en Ella Fitzgerald Stichting HTK zijn ook dankbaar erkend.
Financiering: Dit werk is gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) verleent R01DK081587 en R01DK099734 om HTK en U01DK089533 ADR, en door de National Science Foundation subsidie NSF-DMR-1206121 en California Institute for Regenerative Medicine subsidie RB5-07398 aan DAT Ondersteunt uit de Joseph J. JacobsInstitute for Molecular Engineering voor Geneeskunde bij Caltech naar DAT, en die van Oxnard Foundation en Ella Fitzgerald Stichting HTK zijn ook dankbaar erkend. Onderzoek gemeld in deze publicatie opgenomen werkzaamheden in de Analytical Cytometry Core and Light Microscopie Digital Imaging Core ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder award nummer P30CA33572.
Studie sponsor: De sponsor heeft niet deelgenomen aan de onderzoeksopzet, het verzamelen, analyseren, of de interpretatie van de gegevens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20 °C |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20 °C | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1,500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15 g/cm/sec) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50 ml Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100 mm x 20 mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20 °C |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40 μm Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 μm filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20 °C |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80 °C |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80 °C |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20 °C |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80 °C |
| Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18 G x1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16 G x 1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | ||
| PBS/BSA | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) |
||
| PBS/BSA/Dnase1 | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) Dnase 1 (2,400 Units/ml per pancreas) |
References
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).
- Inada, A., et al. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Fu, X., et al. MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).
- Ghazalli, N., et al. Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jin, L., et al. Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures. Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).
- Jin, L., et al. In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. 32, 2708-2721 (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Lee, J., et al. Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells. Elife. 2, e00940 (2013).
- Dorrell, C., et al. The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar. Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).
- Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice. Blood. 87, 4544-4551 (1996).
- Ku, H. T., et al. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Winkler, M., et al. A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors. J Vis Exp. , e3148 (2011).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Formeister, E. J., et al. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).
- Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide (PN) 68000088 K1. , Available from: http://www.fluidigm.com/documents (2015).
- Seymour, P. A., et al. A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation. Dev Biol. 323, 19-30 (2008).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455, 627-632 (2008).
- Baeyens, L., et al. Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice. Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).
- Thorel, F., et al. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature. 464, 1149-1154 (2010).
