Summary
Dans les essais de colonies in vitro pour détecter l' auto-renouvellement et la différenciation des cellules progénitrices isolées à partir de pancréas de souris adultes sont mis au point. Dans ces essais, les progéniteurs du pancréas donnent naissance à des colonies de cellules dans un espace en 3 dimensions dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Les protocoles pour la manipulation des cellules individuelles et la caractérisation des colonies individuelles sont décrites.
Abstract
Souches et les cellules progénitrices du pancréas adultes pourraient être une source potentielle de cellules bêta comme thérapeutiques pour le traitement de patients atteints de diabète de type 1. Cependant, il est encore impossible de savoir si les cellules souches et progénitrices existent dans le pancréas adulte. Les stratégies de recherche à l'aide de cre-lox lignée-tracing chez les souris adultes ont donné des résultats qui soutiennent ou réfutent l'idée que les cellules bêta peuvent être générées à partir des canaux, l'emplacement présumé où adultes progéniteurs pancréatiques peuvent résider. Ces méthodes de lignage-tracing in vivo cre-lox, cependant, ne peuvent pas répondre aux questions de l' auto-renouvellement et multi-lignage différenciation-deux critères nécessaires pour définir une cellule souche. Pour commencer à répondre à cette lacune technique, nous avons conçu des essais de colonies en 3 dimensions pour progéniteurs pancréatiques. Peu après notre publication initiale, d'autres laboratoires développés indépendamment un similaire, mais pas identique, méthode appelée le test organoide. Par rapport à l'essai organoide, notre méthode emploieméthylcellulose, qui forme des solutions visqueuses qui permettent l'inclusion de protéines de matrice extracellulaire à faibles concentrations. Les essais contenant méthylcellulose-permettent la détection et l'analyse de cellules progénitrices au niveau d'une seule cellule, qui sont critiques quand progéniteurs constituent un petit sous-population plus facile, comme cela est le cas pour de nombreuses cellules souches d'organes adultes. Ensemble, les résultats de plusieurs laboratoires démontrent dans la différenciation in vitro auto-renouvellement et multi-lignée de cellules progénitrices comme pancréatiques de souris. Les protocoles actuels décrivent deux colonies des essais à base de méthylcellulose à caractériser les progéniteurs pancréatiques de souris; une contient une préparation commerciale de protéines de la matrice extracellulaire de souris et l'autre une protéine de matrice extracellulaire artificielle connue sous le nom d'un hydrogel de la laminine. Les techniques présentées ici sont 1) la dissociation du pancréas et le tri des CD133 + Sox9 / EGFP + cellules canalaires de souris adultes, 2) la manipulation de la cellule unique des scellules SOUTENUS, 3) analyse seule colonie en utilisant microfluidique qRT-PCR et l'ensemble de montage immunocoloration, et 4) la dissociation des colonies primaires dans une seule cellule suspensions et re-placage dans des essais de colonies secondaires pour évaluer l'auto-renouvellement ou de la différenciation.
Introduction
Le pancréas se compose de trois principales lignées cellulaires; cellules acineuses sécrètent des enzymes digestives, les conduits sécrètent mucine pour repousser les agents pathogènes et le transport des enzymes digestives dans l'intestin, et les cellules endocrines sécrètent des hormones, y compris l'insuline et le glucagon, qui maintiennent l'homéostasie du glucose. Au cours du développement embryonnaire du pancréas, les cellules canalaires précoces sont la source des cellules progénitrices tri-puissant capable de donner naissance aux trois lignées dans le pancréas d'animaux adultes 1,2. Parce que les cellules souches et progénitrices adultes, telles que les cellules souches de la moelle osseuse, sont déjà utilisés avec succès pour traiter diverses maladies 3, il y a un intérêt intense pour trouver les cellules souches et progénitrices dans le pancréas adulte. Si l'isolement et la manipulation de cellules souches et progénitrices pancréatiques adultes étaient possibles, ces cellules peuvent être utilisées pour traiter des maladies telles que le diabète de type 1, dans lequel les cellules sécrétant de l'insuline sont détruites par auto-immunité.
in vivo cre-lox lignage techniques de traçage, Inada et ses collègues ont montré que les cellules canalaires murins adultes marqués avec un marqueur, l' anhydrase carbonique II, pourraient donner lieu à tous les trois lignées pancréatiques 4. Cependant, l' utilisation d' autres marqueurs, tels que canalaires HNF1B 5 et Sox9 2, on a conclu que les cellules canalaires ne sont pas la principale source des cellules bêta chez des souris adultes.
Il y a plusieurs années, nous avons proposé que la cause du débat précité peut être dû à l'absence, dans le domaine de 6,7, des outils d' analyse appropriés qui peuvent être utilisés pour mesurer l' auto-renouvellement et de multi-lignage différenciation-deux critères nécessaires pour définir une cellule souche. La technique in vivo de la lignée de traçage cre-lox dans mentionnéci-dessus peuvent fournir des preuves de la relation progéniteur-descendants au niveau de la population. Cependant, cette technique de traçage de la lignée est limitée dans son pouvoir de discerner si les cellules progénitrices simples peuvent se renouveler et de se différencier en plusieurs lignées. analyse unicellulaire est importante, car si plusieurs progéniteurs mono puissants, chacun ayant un potentiel de lignée différente, ont été analysés ensemble, ils peuvent apparaître collectivement avoir de lignées multiples capacités de différenciation. En outre, les cellules souches sont habituellement une population mineure d'un organe adulte. Les activités d'une population de cellules mineures pourraient être masqués par la population majeure. Par conséquent, un résultat négatif à partir d'une étude de population ne signifie pas nécessairement l'absence de cellules souches. Enfin, cre-lox lignée traçage ne permet pas actuellement la mesure de l'auto-renouvellement.
Pour commencer à répondre à l'écart technique dans le domaine de la biologie du pancréas de cellules progénitrices, colonie 7-11 ou 12-15 organoide Méthodes et Tableau équipement), et l'autre contient la laminine hydrogel, une artificielle protéine ECM définie 7-11. Les cellules progénitrices sont mélangés dans un milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose. Methylcellulose est un matériau biologiquement inerte et visqueux préparé à partir de fibres de bois et a été utilisée en routine dans des essais de colonies hématopoïétiques 16. La méthylcellulose contenant un milieu semi-solide limite le mouvement de cellules souches individuelles de sorte qu'elles ne peuvent pas re-agrégat. Pourtant, le milieu est suffisamment souple pour permettre une cellule progénitrice de croître et de se différencier en une colonie de cellules dans l'espace 3D. Suivant la tradition des hématologues, une cellule pancréatique progénitrices qui a été capable de donner naissance à une colonie de cellules était named une unité formant colonie pancréatique (PCFU). PCFUs, lorsqu'il est cultivé dans l'essai de colonie contenant ECM-murin, donnent naissance à des colonies kystiques qui sont nommés colonies "Ring" 7. Lors de l' addition d'un agoniste Wnt, R-spondin1, dans la culture contenant de l' ECM-murin, certaines colonies Anneau transformer en colonies "denses" 7. Dans cet article, ces deux types de colonies cultivées dans la culture de l'ECM murin sont collectivement appelés «anneaux / denses" colonies. Lorsque Ring / colonies denses sont dissociées en suspension cellulaire unique et re-plaqué dans les cultures qui contiennent laminine hydrogel, colonies "Endocrine / acineuses" sont formés 7.
En utilisant une seule colonie analyses, il a été constaté que la majorité des colonies Ring / denses et Endocrine / acineuses, soit à partir des adultes (2-4 month-old) 7,11 ou jeune (1 week-old) 9 pancréas de souris, d' exprimer tous les trois marqueurs de la lignée. Cela suggère que la plupart des PCFUs originaires sont tri-puissant. Dans l'essai de colonies contenant ECM-murin, PCFUs murin adulte robuste auto-renouvellement et l' expansion d' environ 500.000 fois plus de 11 semaines dans la culture 7. ECM murine supporte de préférence la différenciation des cellules canalaires sur le système endocrinien et acineuses lignées, tandis qu'en présence de laminine hydrogel PCFUs murins sont encouragés à se différencier préférentiellement dans les cellules endocrines et acineuses et moins à la lignée canalaire 7,9,11. Surtout, Insuline Glucagon + - Les cellules mono-hormonal sont générés dans la culture d'hydrogel de la laminine et de sécréter de l' insuline en réponse au glucose in vitro de stimulation de 7,9, ce qui suggère la maturité fonctionnelle. La différenciation potentielle 7,9 tri-lignée et l' auto-renouvellement de 11 PCFUs individuels sont confirmés par micromanipulation une seule cellule, à savoir, la mise en culture d' une cellule par puits pour la formation de colonies. Ensemble, ces résultats fournissent des preuves qu'il existe des auto-renouvellement, le tri-potenT, des cellules souches, comme dans le pancréas de souris post-natale qui montrent des activités dans la culture 3D.
Les essais de PCFU murins décrits dans cet article sont issus d'un essai de colonie avant conçu pour les cellules progénitrices différenciées à partir de cellules murines embryonnaires souches (mESCs) 17. Ce protocole est documenté en détail dans une autre publication JoVE 18. Les composants et les techniques nécessaires pour réaliser le dosage de la colonie de souris contenant ECM pour adultes PCFUs culture sont les mêmes que pour les progéniteurs MESC dérivées 17,18. Par conséquent, ces aspects de l'essai ne seront pas répétées ici; place les procédures suivantes seront abordées: 1) la dissociation du pancréas adulte et de tri CD133 + Sox9 / EGFP + cellules canalaires, qui enrichissent PCFUs de souris adultes 7, 2) la manipulation de cellules isolées des cellules triées, 3) une seule colonie analyses utilisant microfluidique qRT-PCR et l'ensemble de montage immunocoloration, et 4) la dissociation de colonies en suspension à cellule unique et re-placage dans ECM murin ou laminine essais hydrogel de colonies.
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Protocol
Déclaration éthique: Nous adhérons aux normes éthiques largement acceptées dans la conduite de la recherche pour assurer la qualité et l'intégrité des résultats. L'expérimentation animale est effectuée selon des protocoles approuvés par le Institutional Animal Care et utilisation Comité à City of Hope.
1. Préparer Suspension simple cellule à partir de Adult murin pancreata
NOTE: Dans les publications antérieures 7,11, souris CD-1 ou de fond B6 ont été utilisés; les deux milieux ont donné des résultats similaires. Une lignée transgénique de souris (désigné Sox9 / EGFP) avec une meilleure protéine de fluorescence verte tirée par Sox9 loci 19,20, a été créé dans le CD-1 fond.
- Euthanasier 3 à 5 souris adultes en utilisant le CO 2 gazeux pendant 1-2 min ou jusqu'à ce que les arrêts respiratoires. Ensuite, effectuez la dislocation cervicale sur chaque souris.
- Disséquer et Préparer le pancreata.
NOTE: Disséquer les souris dès que possible après l'euthanasie. Ceci est important pour éviter l'auto-digestion du pancréas en raisonaux changements post-mortem.- Faire une incision verticale sur la ligne médiane de la paroi abdominale de la souris à l'aide de ciseaux et d'ouvrir la cavité abdominale. Trouver la rate et l'utilisation de pinces pour soulever doucement. Coupez le tissu conjonctif entre la rate et le lobe splénique du pancréas avec des ciseaux.
- Répétez cette pratique pour les lobes duodénaux et gastriques du pancréas. Placer les tissus du pancréas dans une boîte de Petri sur de la glace contenant de modification du tampon phosphate de la solution froide Dulbecco (DPBS), 0,1% d'albumine de sérum bovin (BSA) et de la pénicilline et de la streptomycine (P S /; solution complète désignée comme PBS / BSA).
- Retirer les tissus adipeux du pancréas sous un microscope à dissection en utilisant une pince à pointe fine.
NOTE: Ceci est essentiel pour la santé des cellules pancréatiques dissociées dans les étapes suivantes.- (Facultatif) Cochez la pancreata pour la fluorescence verte sous le stéréomicroscope de fluorescence en utilisant 488-509 nm d'excitation pour assurerexpression EGFP.
- Dans une culture tissulaire capot, rincer le tissu trois fois successivement dans trois boîtes de Pétri de 100 mm contenant 10 ml de froid du PBS / BSA.
- Faire une incision verticale sur la ligne médiane de la paroi abdominale de la souris à l'aide de ciseaux et d'ouvrir la cavité abdominale. Trouver la rate et l'utilisation de pinces pour soulever doucement. Coupez le tissu conjonctif entre la rate et le lobe splénique du pancréas avec des ciseaux.
- Générer des petits morceaux de tissus.
- Transférez le pancreata disséqués à une boîte de Pétri stérile sec pour enlever autant PBS / BSA que possible, et de les transférer à une autre boîte de Pétri à sec sur la glace.
- Préparer PBS / BSA contenant DNase I en ajoutant DNase I solution mère de 2 pi (1 million d'unités [MU] / ml) par 1 ml de PBS / BSA.
NOTE: Cette solution est désignée PBS / BSA / DNase I. Faire ~ 200 ml de cette solution à la fois, qui couvrira une expérience de tri. - Émincer le pancreata avec des ciseaux à ressort pendant 2-3 min ou jusqu'à ce que le tissu est en petits morceaux. Ajouter 2 à 3 ml de froid du PBS / BSA / DNase I aux morceaux de tissus dans la boîte de Petri pour les suspendre.
- Transférer les morceaux de tissu dans un tube conique de 50 ml sur de la glace avec une pipette de 10 ml. Porter le volume total à 10 ml avec du PBS / BSA / DNase l après avoir récupéré autant de tissu que possible.
- Digest du pancréas en cellules Pièces Mostly simples.
- Ajouter collagénase B (100 mg / ml stock) 350-450 pi / 10 ml aux morceaux de tissu et incuber le tissu à 37 ° C dans un bain d'eau pendant 8 min, en remuant toutes les 3-4 min. Utiliser une seringue de 10 ml avec une aiguille 16 G ½ à élaborer et ensuite pulvériser la solution de tissu vers le bas de la paroi du tube de 50 ml à la température ambiante. Répétez cette opération sept fois.
REMARQUE: Utilisez assez de force pour briser les amas de cellules, mais éviter les bulles de génération qui peuvent tuer les cellules. - Retourner le tube dans le bain d'eau à 37 ° C ° C pendant 8 minutes et mélanger par tourbillonnement toutes les 3-4 min. Seringue le tissu vers le haut et vers le bas jusqu'à sept fois, comme mentionné ci-dessus, et de placer un échantillon (10 ul) de la solution de tissu sur une boîte de Petri à sec. Observer la solution de tissu sous, à contraste de phase inversée, microscope optique avec un objectif 10X. Attendez-vous à des cellules individuelles et une petite taille cgrappes ell d'être présents.
- Manipuler les cellules sur la glace à partir de ce moment pour ralentir ou arrêter l'activité de la collagénase. Ajuster le volume à 50 ml en utilisant le froid du PBS / BSA / DNase I. centrifuge les cellules à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 5 ml de froid du PBS / BSA / ADNase I à l'aide d'une pipette P1000.
- Ajouter collagénase B (100 mg / ml stock) 350-450 pi / 10 ml aux morceaux de tissu et incuber le tissu à 37 ° C dans un bain d'eau pendant 8 min, en remuant toutes les 3-4 min. Utiliser une seringue de 10 ml avec une aiguille 16 G ½ à élaborer et ensuite pulvériser la solution de tissu vers le bas de la paroi du tube de 50 ml à la température ambiante. Répétez cette opération sept fois.
- Filtre à Rendement Suspensions cellulaires simples et Wash.
- Filtrer les cellules à travers un 70 um maille de nylon tasse de filtre, puis à travers un 40 um maille de nylon filtre coupe.
- Resuspendre les cellules dans 5 ml de PBS froid / BSA / DNase I et compter les cellules.
NOTE: Pour 2-4 mois vieux B6 ou des souris CD-1, chaque pancréas peut produire ~ 5 ou 10 millions de cellules, respectivement. Ces chiffres peuvent varier entre les différents expérimentateurs. Si les débris cellulaires en excès est trouvé à comptage, amener le volume à 50 ml avec du PBS froid / BSA / ADNase I et centrifuger les cellules à 400 xg pendant 5 min à 4 ° C. - Régler le volume de la suspension cellulaire à une concentration de 2 x 107 cellules / ml en utilisant froid PBS / BSA / DNase I.
2. Trier les cellules pancréatiques à Enrichissez progéniteurs formant des colonies
NOTE: De souris B6, CD133 + mais pas CD133 - cellules sont enrichies en PCFUs 7,9,11. Les cellules CD133 + représentent environ 13% du total dissocie les cellules pancréatiques après que tous les paramètres de déclenchement sont appliqués 11. De souris CD-1, les cellules CD133 + Sox9-EGFP + représentent généralement 4% de cellules pancréatiques totales, et cette population cellulaire est enrichie pour PCFUs 7. Tri des cellules / EGFP + Sox9 CD133 + est décrite ici.
- Colorer les cellules dissociées pancréatiques.
- Bloquer la totalité de la suspension de cellules isolées du pancréas pour réduire la liaison non spécifique en faisant incuber la suspension à cellule unique avec un anti-souris CD16 / 32 à 10 pg / ml de concentration finale pendant 5 min sur la glace.
- Retirer une aliquote de 1 x 10 6 cellules (50 &# 181; l) pour colorer avec l'anticorps de contrôle d'isotype, IgG1 de rat conjugué à la biotine à 5 ug / ml de concentration finale, pendant 20 minutes sur la glace, en agitant chaque 5-7 min.
- Retirer une aliquote de 1 x 10 6 cellules (50 pi) et de garder sur la glace comme un témoin non coloré.
- Teindre le reste des cellules avec un anticorps primaire anti-souris conjugué à la biotine CD133, à 5 ug / ml de concentration finale, pendant 20 min sur de la glace, en agitant toutes les 5-7 min.
- Les cellules de lavage.
- Laver le contrôle isotypique des anticorps et des échantillons tachés primaires en amenant le volume à 1 ml avec du PBS / BSA / ADNase I et centrifuger à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. Répéter cette étape de lavage.
- Remettre en suspension le contrôle isotypique des anticorps et des échantillons tachés primaires dans du PBS / BSA / ADNase I, de sorte que la concentration finale est de 2 x 10 7 cellules / ml.
- Colorer le contrôle isotypique et des échantillons d'anticorps colorés primaires avec de la streptavidine (STV) de allophycocyanine marqué au (APC) à 2 & #181, g / ml de concentration finale. Incuber pendant 15 min sur la glace, tourbillonnant chaque 5-7 min.
- Lavage des cellules et 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
- Laver le contrôle isotypique et des échantillons d'anticorps primaires tachée deux fois avec PBS / BSA / DNase I, comme dans l'étape 2.2. Resuspendre les cellules dans PBS / BSA / DNase I avec DAPI (0,2 pg / ml concentration finale). Le volume final de l'échantillon témoin d'isotype doit être de 0,5 ml.
REMARQUE: Assurez-vous que la densité finale de l'échantillon d'anticorps teinté primaire est approprié pour la trieuse à utiliser. Une concentration de 5 x 10 6 cellules / ml est couramment utilisée pour le tri. - Réglez le volume des cellules non colorées à 0,5 ml avec du PBS / BSA / PS / DNase I. Filtrez toutes les cellules à travers un maillage de 20 um avant le tri et de garder les cellules sur la glace dans l'obscurité.
- Laver le contrôle isotypique et des échantillons d'anticorps primaires tachée deux fois avec PBS / BSA / DNase I, comme dans l'étape 2.2. Resuspendre les cellules dans PBS / BSA / DNase I avec DAPI (0,2 pg / ml concentration finale). Le volume final de l'échantillon témoin d'isotype doit être de 0,5 ml.
- Tri des cellules.
- Utiliser une buse de 80 um ou plus pour le tri.
REMARQUE: les cellules endocrines pancréatiques murins sont sujettes à un stress physique. However, PCFUs murins ne semblent pas être affectés par le stress causé par le passage à travers un trieur 7. - Acquérir des événements cellulaires et des paramètres d'analyse sur la trieuse. Porte des cellules pour l' avant et les zones de dispersion latérale pour exclure les débris cellulaires 7. Porte pour des largeurs de l'avant et de dispersion latérale pour exclure doublets cellulaires. Porte d'exclure DAPI + cellules mortes 7. Gating choisir les paramètres pour les signaux EGFP et CD133-APC en fonction des valeurs issues des cellules de contrôle isotypique (figure 1).
- Recueillir les cellules triées dans 5 ml de tubes de polystyrène contenant 1,5 ml de milieu DMEM / F12 supplémenté avec 5% de sérum de foetus de veau (FCS). Centrifuger les populations triées à 400 g pendant 5 minutes et remise en suspension dans un petit volume (~ 200 ul) soit de DMEM / F12 ou du PBS / BSA / DNase I additionné de 5% de FCS. Gardez les cellules sur la glace jusqu'à utilisation.
- Utiliser une buse de 80 um ou plus pour le tri.
- Comptez le nombre de cellules CD133 + Sox9-EGFP + obtenus à partir de la trieuse. Prenez un10 ul de l'échantillon de cellules et compter les cellules avec un hémocytomètre pour déterminer la densité cellulaire.
NOTE: L'utilisation de Hémacytomètre est recommandée car la machine compte de la trieuse sont souvent peu fiables.
3. Plate les cellules triées dans la colonie de dosage contenant murins ECM Protéines
NOTE: S'il vous plaît se référer aux protocoles détaillés pour le dépôt des cellules dans le dosage de la colonie contenant ECM-murin dans une autre publication JoVE 18.
- Préparer Culture Media.
- Préparer un milieu de culture contenant du milieu DMEM / F12, 1% (poids / volume) de méthylcellulose, 5% (v / v) de protéines d'ECM murines, 50% (v / v) de milieu conditionné à partir de cellules pancréatiques analogue MESC dérivés, 5% (v / v) de FCS, de 10 mmol / l de nicotinamide, 10 ng / ml d'activine B humaine recombinante, 0,1 nmol / L Exendin-4, et 1 ng / ml de facteur vasculaire, une croissance endothélial. Des procédés pour générer le milieu conditionné sont détaillées ailleurs 18.
- Ajouter 750 ng / ml de 1 RSPO au milieusi la formation de colonies denses est souhaitée.
- Incuber la culture des protéines ECM murin à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 3 semaines.
4. Culture des cellules triées à 1 cellule par puits
REMARQUE: Les procédures suivantes sont applicables à la manipulation des cellules individuelles à l'aide de pipettes à la main et la bouche. Une approche alternative est d'acheter un micromanipulateur. Un micromanipulateur typique comprend un microscope inversé avec une plate-forme motorisée joystick actionné.
- Préparer verre Pasteur Pipettes.
- L'utilisation d'un brûleur Bunsen, tirer la pointe d'une pipette Pasteur en verre à une pointe fine (~ 30 pm à l'ouverture). Les pipettes Pasteur en verre doivent avoir un bouchon de coton pour créer une barrière à l'écoulement d'air de l'opérateur.
- Autoclave les flammées pipettes Pasteur en verre à 121 ° C pendant 20 min pour la stérilisation.
- Préparer des plaques à 96 puits pour la culture.
- Préparer froid semi-solide milieu de culture accordment le protocole décrit précédemment 18.
- Répartir le milieu dans les puits internes d'une plaque de 96 puits à fond plat à faible liaison à 100 pl / puits en utilisant une seringue de 1 ml. Remplir les puits extérieurs avec de l'eau stérile pour maintenir l'humidité.
- Placer le plat de la culture sur la glace jusqu'à utilisation.
- Préparer les cellules triées.
- Ajouter ~ 6.000 cellules recueillies à partir d'une trieuse à 2,5 volume final ml de DMEM / F12 / PS contenant 10% de FCS et 1% de méthylcellulose dans un tube 5 ml de polystyrène. Agiter vigoureusement pour mélanger les composants. Attendez 5 min ou jusqu'à ce que les bulles flottent à la surface du tube. Cette étape n'a pas besoin d'être effectuée sur la glace.
- Distribuer la solution de cellules à deux boîtes de 35 mm à 1 ml / plat en utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de 18 G ½.
- Répartir la solution de cellules dans le plat en secouant délicatement le plat à la main. Ne pas laisser le milieu semi-solide pour atteindre le bord de la boîte de 35 mm, comme les cellules individuelles à la marge de l'cann de puitsot être observée en utilisant clairement un microscope à lumière inversée.
- Préparer la zone de travail autour d'un microscope.
- Préparer une solution contenant du DMEM / F-12 et 1% de méthylcellulose sans cellules (milieu «sans cellule), et distribuer la solution (comme décrit au point 4.3.2) en deux boîtes de Petri de 35 mm (1 ml par boîte) .
- Nettoyez et essuyez la zone de travail autour d'un microscope inversé à contraste de phase avec une solution d'alcool à 70%.
- Assembler le Pipette avec la pièce Mouth.
- Choisissez une pipette Pasteur en verre stérile qui a été préparé à l'étape 4.1. Attacher la grande extrémité d'une pointe de pipette en plastique de 1 ml en haut de la pipette Pasteur en verre. Fixer la petite extrémité de l'embout de pipette en plastique de 1 ml à une extrémité d'un tube en caoutchouc à paroi mince, et l'embout buccal à l'autre extrémité du tube. Utiliser la même pipette en verre pour capter plusieurs cellules du même groupe.
- Dresser, par la bouche d'aspiration, un petit volume (~ 10 à 50 pi) de la«Non-cell" solution semi-solide faite à l'étape 4.4.1 avec la pipette Pasteur en verre.
REMARQUE: La solution semi-solide à l'ouverture étroite de la pipette Pasteur en verre crée une résistance d'écoulement et fournit une barrière pour empêcher la contamination des cellules à prélever.
- Choisissez une cellule unique.
- Placer le plat de 35 mm contenant les cellules triées sur la platine du microscope et retirez le couvercle.
- Trouver les cellules en utilisant une lentille et mise au point objectif 10X sur une cellule apte à être choisi.
- Trouvez et placer l'ouverture de la pointe de la pipette à côté de la cellule d'intérêt. Appliquer aspiration par la bouche.
NOTE: La motion de la cellule devrait être assez lent, de sorte qu'il n'y a aucun risque de perdre la cellule pendant le processus plus tard. Le mouvement de la cellule entrant dans l'ouverture de la pipette doit être visible. Si le flux se déplace trop vite, changer pour une pipette avec une ouverture plus étroite.
- Déposez la cellule unique dans une culture bien.
- Une fois que la cellule se trouve dans la pipette, utiliser la langue pour arrêter l'écoulement en bloquant l'ouverture de l'embout buccal. Faites une courte pause avant de retirer la pointe du milieu semi-solide pour assurer que le milieu semi-solide a cessé de couler.
- Placez la pointe de la pipette dans un puits dans la plaque de 96 puits préparé à l'étape 4.2. Poussez la cellule lentement en soufflant doucement dans la pièce de bouche. Marquer le puits après que la cellule est déposée, afin d'éviter le placage deux cellules dans un puits.
- Assurez-vous que une seule cellule est placée dans un puits de culture.
- Placez la pointe de la pipette dans le «non-cellule" milieu préparé à l'étape 4.4.1. Tout en observant l'ouverture de la pointe sous le microscope, pousser la solution semi-solide restant. Attendez-vous pas de cellule à écouler la pointe de la pipette.
- Pour une double vérification, trouver l'emplacement dans le puits de culture où la cellule unique a été implantée.
- Cultiver les cellules isolées à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant3 semaines.
5. Choisissez individuelle Colonies de culture semi-solide pour l'analyse microfluidique qRT-PCR
REMARQUE: Trois semaines après le placage triée CD133 + / eGFP + Sox9 dans l'essai de colonie contenant ECM-souris, l' anneau ou des colonies denses sont formées 7 (figure 2). Lorsque Ring / colonies denses sont dissociées en suspension cellulaire unique et re-plaqué dans la culture d'hydrogel de la laminine, les colonies Endocrine / acineuses sont générées après environ une semaine 7 (Figure 2). Pour déterminer la composition de la lignée de chaque colonie, l' analyse microfluidique qRT-PCR est utilisée pour détecter l'expression des marqueurs de la lignée 7. Pour la pré-amplification, une colonie est mélangé dans un mélange maître contenant une sonde mix TaqMan, tampon de réaction, et SuperScript III 21. La puce 48.48 de tableau est ensuite utilisé pour des réactions PCR microfluidiques 21.
- Préparer la pré-amplification par PCRmélanger contenant 48 sondes.
- Pipette 1,5 pi de chaque sonde TaqMan (20x stock) dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 78 ul de tampon TE pour régler le volume à 150 pi.
- Préparer le mélange maître en suivant les protocoles du fabricant 21.
- Placez 9 pi de mélange maître dans chacun 0,2 ml tube de réaction à paroi mince appropriés pour la PCR, et répétez cette étape jusqu'à 48 tubes.
- Choisissez des colonies isolées de la culture semi-solide.
NOTE: Ring / colonies denses sont plus grandes que les colonies Endocrine / acineuses, avec des diamètres allant de ~ 50 à 400 um 9,11. Par conséquent, seul anneau / colonies denses sont cueillies à l'aide d'une pipette P10 équipé d'une pointe de pipette 10 ul qui est plié en une forme incurvée. Pour choisir le petit Endocrine / colonies acineuses (Figure 2), reportez - vous à l' étape 4.- Localiser une colonie d'intérêt à fort grossissement (par exemple, 20X objectif), réduire l'agrandissement, et aspirate la colonie. (Facultatif) Prendre une image à contraste de phase de la colonie à cette étape afin de documenter les caractéristiques visibles de la colonie.
- Transférer la colonie dans le tube PCR contenant 9 pi de mélange maître.
- Choisissez la prochaine colonie. Jusqu'à 45 colonies au total peuvent être analysés par essai PCR, en laissant 3 points pour les contrôles.
- Extraction d'ARN et synthèse d'ADNc avec pré-amplification.
- Vortex les échantillons vigoureusement avant d'effectuer la réaction thermique.
- Effectuez les réactions de cyclage thermique selon les instructions du fabricant 21. Anneau / colonies denses nécessitent 14 cycles, les colonies Endocrine / acineuses nécessitent 16-20 cycles, et des cellules individuelles nécessitent 22 cycles.
NOTE: Pré-amplification des ADNc peuvent être conservés à -20 ° C avant l'analyse microfluidique PCR.
- Exécuter des réactions de PCR ultérieures, en utilisant une puce microfluidique, selon les instructions du fabricant 21.
- Récolte et Fix Colonies.
- Ramassez les colonies sous le microscope, comme dans les étapes 4 ou 5.4, et les ajouter à une solution de paraformaldéhyde à 4%. Incuber O / N à 4 ° C sous agitation douce.
- Laver les colonies avec 1X PBS deux fois pour 10-30 min à température ambiante. Stocker les colonies fixées à 4 ° C dans 1,5 ml des tubes scellés avec de la paraffine.
- Colorer les colonies avec des anticorps.
- colonies de transfert à un puits d'une plaque de 96 puits noir avec un fond clair contenant 200 pi de tampon de blocage (5% âne et / ou de sérum de chèvre, 0,1% de Triton X-100 dans PBS 1x). Incuber O / N à 4 ° C sous agitation douce.
- Diluer l'anticorps primaire à une concentration prédéterminée (par exemple, 1: 500 pour le hamster anti mucine anticorps 1) en utilisant un tampon de blocage. Transférer les colonies à un endroit propre bien avec 200 pi d'anticorps primaire, et incuber O / N à 4 ° C sous agitation douce. Wcendres des colonies 3 fois avec du PBS contenant 0,1% de Tween 20. Transfert des colonies dans un nouveau puits avec 200 ul de 1 x PBS / Tween 20 0,1% pendant 10 min à température ambiante pour chaque lavage.
- Diluer l'anticorps secondaire à une concentration pré-déterminée (par exemple, 1: 2000 pour l' anticorps de hamster anti-arménienne de chèvre) en utilisant un tampon de blocage. Conserver la solution dans l'obscurité. Transférer les colonies pour nettoyer les puits contenant 200 pi d'anticorps secondaire, et incuber pendant 2 heures à température ambiante. Laver les colonies 3 fois avec PBS / 0,1% de Tween 20, comme dans l'étape 6.2.2.
- colonies contre-tache avec DAPI et visualiser par microscopie confocale.
- Transférer les colonies dans les puits avec du PBS contenant 300 nM DAPI et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
- Transférer les colonies DAPI-colorées à un plat à fond de verre de Pétri 35 mm pour la visualisation. Placez une lamelle sur le dessus des colonies pour empêcher l'évaporation.
- Utiliser un microscope confocal pour capturer les images. Pour visualiser DAPI staining, utiliser excitation à deux photons longueur d'onde de 730-950 nm. Utiliser un laser à argon à une longueur d'onde de 458 nm pour exciter des fluorochromes ayant des longueurs d'onde d'émission de 519 et 561 nm. Utiliser un laser hélium-néon avec une longueur d'onde de 633 nm pour exciter des fluorochromes avec des longueurs d'onde d'émission de 665 nm.
7. Dissocier et Re-plaque primaire Ring / Dense Colonies dans secondaires Colony Assays
NOTE: Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles. Éviter le choc froid aux cellules dans cette procédure, autant que possible, comme mettre les cellules sur la glace ou le lavage des cellules avec PBS froid / BSA. De telles pratiques réduisent la viabilité des cellules re-plaquées.
- Préparer Solutions.
- tampon de lavage pré-chaud (DMEM / F12; P / S, 0,1% de BSA) dans un bain d'eau à 37 °.
- Préchauffer une plaque de 96 puits (fond plat, une faible liaison) dans un incubateur à 37 °. Ajouter 100 ul de 100% de FCS, à un puits de la plaque et d'une solution de trypsine-EDTA 100 ul de 0,25% à une deuxièmebien.
- Collecter Colonies.
- Choisissez et mettre en commun un total de 20 ou plus Anneau / colonies denses dans des cultures primaires à l'aide de pointes de pipette 10 pi, tel que décrit à l'étape 5.4.
- Placez les colonies dans un endroit chaud (au moins RT) tampon de lavage (~ 1000 pi) dans un tube de 1,5 ml et un essorage à 400 g pendant 5 min. Retirer le surnageant.
- Dissocier les colonies dans Suspensions de cellules uniques à l'aide de trypsine.
- Transférer le volume restant (20 pi ou moins), qui contient les colonies dans le puits contenant une solution de trypsine à chaud (préparé en 7.1).
- Incuber la plaque dans un incubateur à 37 ° (et non un bain d'eau) pendant 1,5 min. Retirer la plaque et la pipette les colonies à quelques reprises. Incuber à 37 ° C pendant encore 1,5 min.
- Retirer la plaque et la pipette de haut en bas un peu plus de temps pour briser les colonies. Vérifiez sous le microscope pour voir si les colonies ont été dispersées principalement en suspension à cellule unique.Évitez de trop-digestion des colonies.
- Arrêter la réaction de la trypsine en ajoutant FCS.
- Transférer 100 ul de FCS chaud dans le puits qui contient les cellules. Pipette monter et descendre plusieurs fois. Transférer les cellules dans un tube de 1,5 ml contenant 1000 pi de tampon de lavage chaud. Centrifuger à 400 g pendant 5 min à température ambiante.
- Laver deux fois avec un tampon chaud.
- Resuspendre les cellules dans ~ 200 pi de tampon ou un milieu de culture.
- Comptez le nombre de cellules en utilisant un hématimètre. Gardez la suspension cellulaire à la température ambiante.
- Re-plaque cellules dans des essais de colonies secondaires contenant soit des protéines de la MEC de souris (5% v / v) ou de la laminine hydrogel (100 pg / ml) dissociées et incuber les cellules à 37 ° C avec 5% de CO 2.
NOTE: Pour ré-étalement des cellules dans les protéines d'ECM murins, utilisez 2,500-5,000 cellules par puits et de la culture pendant 2-3 semaines. Pour re-cipants dans la culture d'hydrogel de laminine, utilisez 10,000-25,000 cellules par puits et la culture pour 7-12 jours.
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Representative Results
Cellules progénitrices pancréatiques adultes peuvent être enrichis par fluorescence activée par tri cellulaire (Figure 1). La lignée de souris transgéniques Sox9 / EGFP utilisé ici d' abord été généré à la suite du projet GENSAT Brain Atlas 19, et le rapporteur de l' EGFP est sous le contrôle d'un chromosome bactérien artificiel contenant ~ 75 kb en amont et ~ 150 kb des séquences en aval de Sox9 20 . Chez ces souris, EGFP étiquettes canaux pancréatiques efficacement et spécifiquement 22. Pancréas a été acheté et dissocié en une suspension monocellulaire, et colorées avec des anticorps anti-CD133 conjugué avec de la biotine, suivie par une coloration avec des anticorps secondaires conjugués avec STV-APC. Les cellules résultantes ont été analysées par cytométrie de flux avec des paramètres de déclenchement appropriés (figure 1). Les cellules obtenues à l'aide de différents paramètres de déclenchement peuvent être triées et étalées dans des dosages de colonies contenant de la méthylcellulose, dela formation de colonies. Dans des études antérieures, il a été noté que la capacité de formation des colonies ne se trouve que dans le tri CD133 + Sox9 / EGFP + cellules canalaires 7.
Les colonies formées dans les dosages de colonies contenant de méthylcellulose ont été classés en fonction de leur morphologie, comme observé à l' aide d' un, à contraste de phase inversée, au microscope optique (figure 2). Par la suite, des colonies individuelles ont été analysées et cueillies à la main par l' analyse microfluidique qRT-PCR pour l' expression génique (figure 3) ou par toute-mount immunocoloration pour l' expression de la protéine (figure 4). Dans les études publiées 7,9,11, il a été constaté que de nombreuses colonies individuelles ont exprimé des marqueurs de la lignée de conduit (mucine-1), acineuse (amylases) et endocrines (insuline) , les cellules, ce qui indique que la majorité des PCFUs initiant ces colonies tri-puissant. La proportion des trois lignées de cellules dans chaque colonie Cependant, a été influencée par les types et les concentrations des protéines ECM présentes dans les dosages de colonies contenant 7,9 méthylcellulose. Protéines ECM murins stimulés auto-renouvellement des PCFUs et la différenciation des cellules canalaires alors hydrogel laminine préférentiellement soutenu la différenciation des endocrines et cellules acineuses lignées 7,9,11.
Figure 1. cytométrie de flux analyse des cellules pancréatiques dissociées de souris adultes montrant des motifs de coloration selon deux marqueurs de cellules canalaires, CD133 et Sox9 / souris transgéniques Sox9. EGFP qui contenait Sox9 EGFP journaliste conduit loci-ont été utilisés. Une porte de tri représentatif (boîte rouge) pour CD133 pancréatique + cellules / EGFP + Sox9 est affiché. Cellules / EGFP + CD133 + Sox9 sont enrichies en PCFUs 7.les / ftp_upload / 54016 / 54016fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Colonies avec des morphologies différentes ont été produites dans des essais de colonies contenant méthylcellulose. Photomicrographies représentatifs de Ring, colonies denses et Endocrine / acineuses d'un microscope à contraste de phase éclairée par la lumière visible sont présentés. Anneau et des colonies denses sont générées lorsque PCFUs fraîchement triées sont étalées dans un milieu de culture contenant des protéines de la MEC de souris et cultivées pendant 3 semaines 7. Endocrine colonies / acineuses sont formées après re-placage de la bague ou des cellules dissociées de colonies denses dans un milieu de culture contenant un hydrogel de laminine et on les cultive pendant environ 1 semaine 7. Les barres d'échelle pour Ring et colonies denses = 100 um. Barre d'échelle pour Endo / acineuse colonies = 25 μ;. m S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Des colonies individuelles cultivées dans des protéines ECM murins marqueurs pour les cellules canalaires, acineuses et endocriniens exprimés. Les résultats représentatifs de l' analyse qRT-PCR microfluidique de colonies individuelles en anneau. Chaque colonne représente une seule colonie. Les niveaux d'expression des gènes sont exprimés par une carte de chaleur ici, avec des couleurs plus chaudes indicatives d'une expression plus élevée et les couleurs froides indicatives d'expression plus faible. Un grand nombre des colonies individuelles expriment au moins l'un des gènes dans chaque panneau pour les marqueurs indicatifs de la gaine, du système endocrinien ou de la lignée des cellules acineuses. Ces données démontrent que la plupart des colonies individuelles expriment des marqueurs de la lignée de tri, et suggèrent que la plupart desPCFUs originaires sont tri-puissant. Ce chiffre est modifié à partir d' un chiffre déjà publié 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Deux colonies Anneau ont exprimé un marqueur protéique canalaire mucine 1. Les résultats représentatifs de l' immunocoloration des colonies Anneau entier montent, montrant l' expression de la protéine d'un marqueur ductal mucine 1 (couleur verte). Les noyaux sont contre-colorées avec du DAPI (couleur bleue). De nombreuses cellules dans ces colonies anneau expriment mucine 1 protéine. Ceci est cohérent avec les résultats microfluidiques qRT-PCR montrent que les colonies cultivées dans des anneaux protéines ECM murines expriment des niveaux élevés (couleurs plus chaudes de la figure 3) de mucin1 et d' autres marqueurs de cellules canalaires. La barre d'échelle représentes 50 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. essais de colonies pancréatiques pour la mesure de l' auto-renouvellement et la différenciation multi-lignée de cellules progénitrices individuels dans la culture. Flux de travail représentatif est présenté. Nos essais de colonies du pancréas contiennent une matière visqueuse, de la méthylcellulose, de sorte que le milieu de culture devient semi-solide. milieu semi-solide limite le mouvement et empêche l'agrégation de cellules progénitrices individuelles (indiqué en rouge). Cependant, le milieu est suffisamment souple pour permettre à une seule cellule de progéniteur à l'auto-renouvellement et / ou différencier et se développer dans une colonie de cellules (représenté par plusieurs cercles rouges). En revanche, les cellules simples qui ne possèdent pas les capacités de formation de colonies, <em> à- dire, les cellules non-progéniteurs (indiqué en bleu), restent comme des cellules individuelles ou meurent au fil du temps dans la culture. Méthylcellulose permet également l'inclusion de protéines d'ECM à de faibles concentrations, telles que 5% de protéines d'ECM murin ou 100 pg / ml d' hydrogel laminine. S'il vous plaît , cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les essais de colonies pancréatiques et seule colonie analyses décrites ici ont été inspirés par les hématopoïétiques essais de colonies contenant de méthylcellulose qui ont joué un rôle majeur dans le décryptage de la biologie des cellules souches hématopoïétiques dans les dernières décennies 23. Dans ces essais (Figure 5), dissociées des cellules pancréatiques sont étalées dans des milieux semi-solides avec des facteurs de croissance appropriés et des protéines d'ECM qui soutiennent la formation d'anneaux, des colonies denses ou Endocrine / acineuses 7 contenant de la méthylcellulose. Une seule cellule progénitrice qui est capable de donner naissance à une colonie de cellules est appelée PCFU. En caractérisant les colonies individuelles en utilisant microfluidique qRT-PCR et l'ensemble de montage immunocoloration, les potentiels de la lignée des PCFUs originaires peuvent être déduites. Il a été constaté que la majorité des PCFUs murins adultes sont tri-puissants, capables de donner naissance à canalaire, acineuses, et les cellules endocrines de la lignée in vitro 7,9. Bien murprotéines ECM ine favorisent la différenciation des PCFU tri-puissant conduit vers la lignée, l'hydrogel de la laminine permet endocrine robuste et la différenciation de la lignée des cellules acineuses 7,9. Afin d' évaluer la capacité d' auto-renouvellement in vitro de la PCFUs, l'Anneau ou colonies denses cultivées dans un essai ECM colonie murine primaire peut être dissociée en suspension à cellule unique et re-plaqué dans un ECM murin colonie dosage secondaire 7. On a constaté que PCFUs élargie ~ 500.000 fois dans les protéines de la MEC de souris pendant 11 semaines 7. Les étapes critiques comprennent l'élimination des tissus adipeux du pancréas disséqués, évitant une digestion des cellules pancréatiques par la collagénase, et en minimisant le choc froid aux cellules de colonies denses dissociées Anneau / avant de re-placage. Maîtriser micromanipulation de cellules individuelles peut prendre un certain temps; patience et de pratique sont nécessaires.
Par rapport à d' autres dosages de cellules progénitrices pancréatiques, y compris la culture 2D 24, le sUSPENSION "pancreasphere" 25 et les essais organoïdes 12-15, les principaux avantages des dosages de colonies contenant de la méthylcellulose décrits ici sont comme suit. En premier lieu, l'addition et le réglage des protéines ECM à un large éventail de concentrations peuvent être facilement atteints. En effet, la méthylcellulose est la substance qui confère à la nature 3D du milieu semi-solide. En revanche, les méthodes de culture organoïdes dépendent de la solidification des protéines de la MEC de souris, qui sont présents à 33% v / v ou plus. Il est à noter que aussi peu que 1% de protéines d'ECM murin peut inhiber la différenciation des cellules endocrines 9, ce qui souligne l'importance de la concentration en protéines ECM dans le dosage de cellules progénitrices. Deuxièmement, les colonies sont réparties uniformément sur toute la culture bien et peuvent être comptés avec précision. Troisièmement, les colonies individuelles peuvent être facilement triés sur le volet pour une analyse ultérieure. Quatrièmement, le milieu semi-solide contenant de la méthylcellulose-est facile à entretenir, et aucun moyenmodification est nécessaire au cours de la culture. Enfin, un grand nombre de cellules (jusqu'à 25.000 cellules par plaque de 24 puits) peuvent être plaqués et examinés dans ces essais de colonies, ce qui les rend efficaces pour détecter les activités de cellules progénitrices même si elles sont une population mineure parmi les cellules étalées.
Les essais de cellules souches pancréatiques décrits ici sont basés sur fonctionnelle, mais basée sur les marqueurs non, analyses des cellules progénitrices pancréatiques. Cela signifie que les cellules progénitrices pancréatiques peuvent être étudiés sans savoir ce qu'ils expriment des marqueurs. Ceci est important car il y a peu de connaissances sur les marqueurs spécifiques des cellules progénitrices pancréatiques adultes peuvent exprimer. En outre, des marqueurs pour les cellules progénitrices pancréatiques embryonnaires peuvent ne pas être suffisant pour étudier les progéniteurs adultes. En utilisant des analyses fonctionnelles, on peut commencer à identifier des marqueurs spécifiques de cellules progénitrices en déterminant d' abord la sous-population qui a une activité PCFU, tel que le CD133 + </ sup> cellules / EGFP + de Sox9 illustrés ici. Ceci peut être suivi par l'identification, en utilisant l'ARN-seq, des gènes qui sont exprimés de manière différentielle par la population contenant PCFU. Les marqueurs candidats peuvent être ensuite testés et vérifiés par des tests tels que in vitro et dans des techniques in vivo de la lignée de traçage permettant de suivre les capacités de différenciation des cellules progénitrices.
Les limites des tests in vitro de colonies contenant méthylcellulose-sont triples. Tout d' abord, bien que les essais simulent le microenvironnement in vivo du pancréas en fournissant des protéines d'ECM et les facteurs de croissance des cellules progénitrices pancréatiques dans un espace 3D dans la culture, les conditions ne sont pas identiques. En outre, les structures des cellules épithéliales in vivo sont perturbées par la dissociation dans des cellules individuelles, ce qui peut avoir des conséquences importantes. Par conséquent, il sera important de vérifier les cellules progénitrices dans les études de suivi en utilisant in vivo 18. Ces composants non définis peuvent affecter la fonction de facteurs de croissance spécifiques sur les cellules progénitrices et indirectement plus de travail est nécessaire pour créer un ensemble entièrement défini des conditions de culture. Enfin, des expériences de la lignée de traçage ont démontré les cellules acineuses-à-bêta cellules 26,27 ou alpha cellules-to-bêta 28 conversions in vivo chez la souris adulte. Les conditions de culture de méthylcellulose décrites ici peuvent être spécifiques pour la conversion seulement conduit à des cellules bêta. D'autres conditions de culture inconnues peuvent être nécessaires pour les cellules non conduits pour convertir des cellules bêta dans la culture.
Il y a plusieurs cas où le dépannage peut être nécessaire. Par exemple, si les cellules dissociées sont agglutinés, utiliser des doses plus élevées de la DNase I en solution. DNase I est important de prévenir l'emmêlement des cellules pancréatiques dissociées causées par l'ADN molaires organiques libérés par les cellules mortes (voir étape 1.3.2).
Par ailleurs, si les tissus émincés collent dans la pipette de 10 ml, hacher le tissu en petits morceaux. L'ouverture de la pipette de 10 ml doit être suffisamment large pour que les morceaux de tissu de passer à travers, après digestion par la collagénase. Si les morceaux se coincent à la pointe de la pipette de 10 ml, ce qui indique que le hachage du tissu par les ciseaux à ressort ne suffit pas (voir étape 1.3.4).
Un autre problème qui peut se poser est pas la croissance de la colonie murins protéines ECM à partir de cellules pancréatiques dissociées (ie, les cellules non triées). Si cela se produit, ne pas tenter de briser toutes les grappes dans des cellules individuelles pendant l'étape de dissociation du pancréas, car cela peut entraîner une digestion excessive et la mort cellulaire. S'il y a de gros morceaux, le retour du tube à 37 ° C pendant quelques (4) min et une seringue 7 fois ou moins. Revérifier les cellules sous le microscope. La durée maximale de traitement collagénase B est de 30 min. réelon la collagénase utilisée, le moment optimal pour la digestion peut être différente (voir étape 1.4.2).
En outre, les amas de protéines de matrice extracellulaire dans murines puits de culture peut être observée après incubation. Pour éviter cela, assurez-vous que tous les composants de la culture qui entrent en contact avec des protéines de la matrice extracellulaire murins sont maintenus à froid sur la glace pour éviter la solidification prématurée avant l'incubation à 37 ° C (voir l'étape 3).
En outre, il peut être difficile à ramasser une cellule à la fois dans une pipette Pasteur en verre. Une solution est de réduire la densité des cellules fraîchement triées plaquées dans le milieu semi-solide pour faire en sorte qu'une cellule a une distance suffisante des autres cellules. Cela permettra d'éviter de capter plusieurs cellules en même temps. En outre, il est préférable de placer le focus du microscope près du fond du milieu semi-solide, comme il est plus facile à ramasser des cellules individuelles à la main près de ce plan sans micromanipulateur (voir étape 4.6.2).
En outre, il peut être difficile de déterminer si une manipulation de la cellule unique est réussie. Une solution est de pratiquer la micromanipulation cellulaire unique avant l'expérience réelle. Une fois que la cellule est prélevée dans la pipette Pasteur en verre, le transfert de la cellule dans une boîte de Petri de 35 mm contenant 1 ml d'une solution de méthylcellulose à 1% sans cellules ( «non-cellule" milieu préparé à l'étape 4.4.1). Visualiser et placer l'ouverture de la pointe de la pipette Pasteur mise au point sous le microscope, et pousser la cellule lentement. Attendez-vous à la cellule unique apparaisse lentement autour de la pointe de la pipette et ensuite passer dans le milieu «non-cellule» (voir étape 4.8.2).
Enfin, aucune croissance des colonies peut se produire dans des cultures secondaires de l'anneau primaire / colonies denses dissociées. Pour le dépannage, assurez-vous que les cellules provenant de colonies primaires dissociées sont conservés dans RT avant l'ensemencement dans des cultures secondaires. Pour la culture en protéines ECM murins, ajouterles cellules derniers dans le tube contenant du milieu de culture avant de les mélanger à froid 18, minimisant ainsi l'exposition des cellules à une température froide, ce qui peut tuer les cellules dissociées obtenues à partir de colonies primaires. Cependant, la re-placage de cellules dans la laminine hydrogel n'a pas besoin d'être effectuée sur la glace avant 37 ° C incubation (voir étape 7).
En résumé, deux essais de colonies contenant méthylcellulose ont été utilisées pour caractériser les cellules progénitrices comme du pancréas de souris adultes 7,11 et postnatal jeune 9,10, ainsi que des foies de souris jeunes 10. Les applications futures seront dirigés à l'identification et la caractérisation des cellules humaines formant des colonies progénitrices d'organes pancréatiques cadavériques.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions Lucy Brown et Alexander Spalla de l'analyse de cytométrie de base à City of Hope de l'aide pour le tri. Ce travail est soutenu en partie par les Instituts nationaux de la santé (NIH) accorde R01DK081587 et R01DK099734 à HTK et U01DK089533 à l'ADR, et par la National Science Foundation subvention NSF-DMR-1206121 et en Californie Institute for Regenerative Medicine subvention RB5-07398 à DAT Supports de l'Institut J. Joseph Jacobs pour le génie moléculaire pour la médecine à Caltech à DAT, et ceux de la Fondation Oxnard et la Fondation Ella Fitzgerald à HTK sont également appréciés.
Financement: Ce travail est soutenu en partie par les Instituts nationaux de la santé (NIH) accorde R01DK081587 et R01DK099734 à HTK et U01DK089533 à l' ADR, et par la National Science Foundation subvention NSF-DMR-1206121 et en Californie Institute for Regenerative Medicine subvention RB5-07398 à DAT Prise en charge de la Joseph J. JacobsInstitut d'ingénierie moléculaire pour la médecine à Caltech à DAT, et ceux de la Fondation Oxnard et Ella Fitzgerald Foundation à HTK sont également très précieuse. La recherche rapportée dans cette publication inclus les travaux effectués dans l'analyse de cytométrie de base et de microscopie optique numérique Imaging Core soutenu par le National Cancer Institute des National Institutes of Health sous le numéro d'attribution P30CA33572.
Commanditaire de l' étude: Le promoteur n'a pas participé à la conception de l' étude, la collecte, l' analyse ou l' interprétation des données.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20 °C |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20 °C | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1,500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15 g/cm/sec) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50 ml Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100 mm x 20 mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20 °C |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40 μm Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 μm filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20 °C |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80 °C |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80 °C |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20 °C |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80 °C |
| Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18 G x1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16 G x 1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | ||
| PBS/BSA | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) |
||
| PBS/BSA/Dnase1 | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) Dnase 1 (2,400 Units/ml per pancreas) |
References
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).
- Inada, A., et al. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Fu, X., et al. MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).
- Ghazalli, N., et al. Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jin, L., et al. Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures. Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).
- Jin, L., et al. In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. 32, 2708-2721 (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Lee, J., et al. Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells. Elife. 2, e00940 (2013).
- Dorrell, C., et al. The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar. Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).
- Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice. Blood. 87, 4544-4551 (1996).
- Ku, H. T., et al. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Winkler, M., et al. A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors. J Vis Exp. , e3148 (2011).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Formeister, E. J., et al. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).
- Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide (PN) 68000088 K1. , Available from: http://www.fluidigm.com/documents (2015).
- Seymour, P. A., et al. A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation. Dev Biol. 323, 19-30 (2008).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455, 627-632 (2008).
- Baeyens, L., et al. Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice. Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).
- Thorel, F., et al. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature. 464, 1149-1154 (2010).
