Summary
In vitro - Kolonie - Assays Selbsterneuerung und Differenzierung von Vorläuferzellen , isoliert aus adulten murinen Bauchspeicheldrüse sind entwickelt zu detektieren. In diesen Assays geben Bauchspeicheldrüsen Progenitoren Anlass zu Zellkolonien in 3-dimensionalen Raum in Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medium. Protokolle für die sind einzelne Zellen und Charakterisierung von einzelnen Kolonien Handhabung beschrieben.
Abstract
Stamm- und Vorläuferzellen aus der Bauchspeicheldrüse erwachsener könnte eine potentielle Quelle von therapeutischen beta-ähnlichen Zellen werden zur Behandlung von Patienten mit Typ 1 Diabetes. Es ist jedoch noch nicht bekannt, ob Stamm- und Vorläuferzellen im erwachsenen Bauchspeicheldrüse existieren. Forschungsstrategien mit cre-lox abstammungs Tracing in erwachsenen Mäusen haben Ergebnisse erzielt, dass entweder unterstützen oder die Idee zu widerlegen, dass Beta-Zellen aus den Kanälen erzeugt werden kann, der vermuteten Stelle, an der erwachsenen Pankreas-Vorläufern vorhanden sein können. Diese in - vivo - cre-lox abstammungs Tracing - Verfahren kann jedoch nicht beantworten die Fragen der Selbsterneuerung und Multilinien - Differenzierung zwei Kriterien notwendig , um eine Stammzelle zu definieren. Zunächst diese technische Lücke Adressierung erarbeiteten wir 3-dimensionale Kolonie-Assays für Pankreas-Vorläufern. Bald nach unserer ersten Veröffentlichung, andere Labors entwickelt unabhängig eine ähnliche, aber nicht identische Verfahren die organoiden Test genannt. Im Vergleich zum organoiden Assay unser Verfahren verwendetMethylcellulose, die viskose Lösungen bildet, der die Aufnahme von extrazellulären Matrixproteinen in niedrigen Konzentrationen ermöglichen. Die Methylcellulose enthaltenden Assays erlauben einfachere Erkennung und Analyse von Vorläuferzellen auf der Ebene einzelner Zellen, die entscheidend sind, wenn Vorläufern eine kleine Subpopulation bilden, wie es der Fall für viele erwachsene Orgel Stammzellen ist. Zusammen zeigen Ergebnisse von mehreren Laboratorien in vitro Selbsterneuerung und multi-lineage Differenzierung von Pankreas - Vorläuferähnlichen Zellen von Mäusen. Die aktuellen Protokolle beschreiben zwei Methylcellulose-basierte Kolonie-Assays Maus Pankreas-Vorläufern zu charakterisieren; einer enthält eine kommerzielle Herstellung von murine extrazellulären Matrixproteinen und die andere eine künstliche extrazelluläre Matrixprotein als Laminin Hydrogel bekannt. Die Techniken , die hier gezeigt werden , sind 1) die Dissoziation des Pankreas und Sortieren von CD133 + Sox9 / EGFP + duktalen Zellen von erwachsenen Mäusen, 2) Einzelzell Manipulation der sorted Zellen, 3) analysiert einzelne Kolonie mikrofluidischen qRT-PCR und ganze-mount Immunfärbung verwendet und 4) Dissoziation von primären Kolonien in Einzelzellsuspensionen und Wiederbeschichtung in sekundäre Kolonie-Assays Selbsterneuerung oder Differenzierung zu beurteilen.
Introduction
Das Pankreas besteht aus drei Hauptzelllinien; acinar Zellen sezernieren Verdauungsenzyme, Kanäle Krankheitserreger abzuwehren und zu transportieren Verdauungsenzyme im Darm und endokrinen Zellen sezernieren Hormone, einschließlich Insulin und Glucagon, das Glukose-Homöostase aufrechtzuerhalten absondern Mucin. Während der embryonalen Entwicklung der Bauchspeicheldrüse, sind die frühen duktalen Zellen die Quelle der tri-potent Vorläuferzellen fähig ist , die zu den drei Linien in den Bauchspeicheldrüsen von erwachsenen Tieren 1,2. Da adulten Stammzellen und Vorläuferzellen, wie Knochenmark - Stammzellen werden bereits erfolgreich verwendet , um verschiedene Krankheiten 3, behandeln es intensive Interesse , die Stamm- und Vorläuferzellen im erwachsenen Bauchspeicheldrüse bei der Suche. Wenn die Isolierung und Manipulation von adulten Pankreas Stamm- und Vorläuferzellen möglich waren, konnten diese Zellen verwendet werden, um Krankheiten wie Typ-1-Diabetes zu behandeln, in denen die insulinsezernierenden Zellen durch Autoimmunität zerstört werden.
in - vivo - cre-lox abstammungsVerfolgungsTechniken, Inada und Mitarbeiter zeigten , dass erwachsene Maus mit einem Marker markiert duktalen Zellen, Carboanhydrase II, was zu allen 4 drei pankreatischen Linien geben könnte. Jedoch unter Verwendung anderer duktalen Marker, wie HNF1B 5 und Sox9 2, wurde geschlossen , dass duktalen Zellen nicht die Hauptquelle von Beta - Zellen in erwachsenen Mäusen sind.
Vor einigen Jahren vorgeschlagen, wir , dass die Ursache der oben erwähnten Diskussion des Fehlens liegen kann im Bereich 6,7, geeigneter Analysewerkzeuge, die verwendet werden können Selbsterneuerung und multi-lineage differenzierungs zwei Kriterien notwendig zu messen , eine Stammzelle definieren. Die in - vivo - cre-lox lineage-Tracing - Technik erwähntoben kann Hinweise auf die Beziehungsebene an einer Population Vorläufer-Nachkommen zur Verfügung stellen. Allerdings ist diese Linie Tracing-Technik in ihrer Macht beschränkt auf, ob Zellen können einzelne Vorläufer erkennen Selbsterneuerung und Differenzierung in mehrere Linien. Einzelzellanalyse ist wichtig, weil, wenn mehrere Mono potent Vorläufern, die jeweils mit einem unterschiedlichen Potential lineage zusammen analysiert wurden, sie gemeinsam mit mehreren lineage Differenzierung Fähigkeiten haben können auftreten. Außerdem sind Stammzellen der Regel eine kleinere Population von einem Erwachsenen organ. Die Aktivitäten eines kleinen Zellpopulation könnte von der großen Bevölkerung maskiert werden. Daher wird ein negatives Ergebnis aus einer Population Studie nicht notwendigerweise das Fehlen von Stammzellen an. Schließlich hat cre-lox-Linie Tracing ist nicht die Messung der Selbsterneuerung ermöglichen.
Zu Beginn der Bewältigung der technischen Lücke im Bereich der Pankreas - Vorläufer Zellbiologie, Kolonie 7-11 oder 12-15 organoiden Methods and Equipment Table) und die andere enthält Laminin - Hydrogel, ein definiertes künstliches ECM - Protein 7-11. Progenitorzellen sind in halbfesten Medium, das Methylcellulose gemischt. Methylcellulose ist ein biologisch inert und viskoses Material aus Holzfasern hergestellt, und 16 in hämatopoetische Kolonie - Assays routinemäßig verwendet worden ist. Die Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medium beschränkt die Bewegung der einzelnen Vorläuferzellen, so dass sie nicht wieder aggregieren. Noch ist das Medium weich genug, um eine Vorläuferzelle zu erlauben, in einer Kolonie von Zellen in dem 3D-Raum zu wachsen und differenzieren. Im Anschluss an die Tradition der Hämatologen, eine Zelle, die Pankreas-Vorläufer von was zu einer Kolonie von Zellen in der Lage war, named eine Pankreas-Kolonie bildende Einheit (PCFU). PCFUs, wenn sie in der Maus - ECM-enthaltenden Kolonie - Assay, geben Anlass zu zystischer Kolonien gewachsen , die "Ring" Kolonien 7 genannt werden. Nach Zugabe eines Wnt - Agonist R-spondin1, in die murine ECM-enthaltenden Kultur, schalten einige Ring Kolonien in "Dense" Kolonien 7. In diesem Artikel werden diese beiden Arten von Kolonien in murine ECM Kultur gezüchtet zusammenfassend als "Ring / Dense" Kolonien. Wenn Ring / Dense Kolonien in einzelne Zellsuspension dissoziiert sind und neu plattiert in Kulturen , die Laminin Hydrogel enthalten, "Endokrine / acinar" Kolonien werden 7 gebildet.
Mit einzelnen Kolonie - Analysen wurde festgestellt , dass die Mehrheit der Ring / Dense und Endokrine / acinar Kolonien, entweder von Erwachsenen (2-4 Monate alt) 7,11 oder junge (1 Woche alt) 9 Maus - Pankreas exprimieren alle drei Lineage Marker. Dies legt nahe, dass die meisten der Ursprung PCFUs sind Tri-potent. Im Maus - ECM-enthaltenden Kolonie - Assay, erwachsenen Maus PCFUs robust selbst zu erneuern und zu erweitern etwa 500.000 Mal über 11 Wochen in Kultur 7. Murine ECM unterstützt vorzugsweise die Differenzierung von duktalen Zellen über endokrine und acinar Linien, wohingegen in Gegenwart von Laminin - Hydrogels sind murine PCFUs gefördert bevorzugt in endokrinen und Azinuszellen zu differenzieren und weniger auf die duktale lineage 7,9,11. Wichtig ist , dass Insulin Glucagon + - mono-hormonellen Zellen werden in der Laminin Hydrogel Kultur erzeugt und Insulin in Reaktion sekretieren Stimulation in vitro zu Glucose 7,9, was darauf hindeutet funktionelle Reife. Die Tri-Linie Differenzierungspotential 7,9 und Selbsterneuerung 11 einzelner PCFUs werden durch einzellige Mikromanipulations bestätigt, dh die Kultivierung einer Zelle pro Vertiefung für die Koloniebildung. Zusammen bieten diese Ergebnisse Hinweise darauf, dass es sich selbst erneuernden, Tri-potent, Progenitor-ähnlichen Zellen in der postnatalen Maus Bauchspeicheldrüse, die Aktivitäten in 3D-Kultur zeigen.
Die murine PCFU Assays in diesem Artikel beschrieben werden , aus einer früheren Kolonie - Assay für abgeleitete Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) 17 differenziert gestaltet. Das Protokoll 18 im Detail in einem anderen JoVE Publikation dokumentiert. Die Kultur Komponenten und Techniken erforderlich 17,18 die murine ECM-enthaltenden Kolonie - Assay für erwachsene PCFUs sind die gleichen wie für MESC abgeleiteten Vorläufern durchzuführen. Daher werden diese Aspekte des Assays hier nicht wiederholt werden; statt dessen werden die folgenden Verfahren werden behandelt: 1) Dissoziation des adulten Pankreas und Sortieren CD133 + Sox9 / EGFP + duktalen Zellen, die PCFUs von erwachsenen Mäusen 7, 2) Einzelzellmanipulation der sortierten Zellen, 3) Einzelkolonie bereichern Analysen mikrofluidischen qRT-PCR und ganze-mount Immunfärbung verwendet und 4) Dissoziation von colonies in Einzelzellsuspension und Wiederbeschichtung in murine ECM oder Laminin-Hydrogel-Kolonie-Assays.
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Protocol
Ethische Erklärung: Wir halten uns an den allgemein anerkannten ethischen Standards in Durchführung von Forschung, die Qualität und die Integrität der Ergebnisse zu gewährleisten. Tierversuche wird nach Protokollen, die von der Institutional Animal Care und Use Committee bei City of Hope genehmigt durchgeführt.
1. Bereiten Sie Einzelzellsuspension von Adult Murine Bauchspeicheldrüsen
HINWEIS: In Vorveröffentlichungen 7,11, CD-1 oder B6 Hintergrund Mäuse wurden verwendet; beide Hintergründe ergaben ähnliche Ergebnisse. Eine transgene Mauslinie (bezeichnet Sox9 / EGFP) mit verbesserter grün fluoreszierendes Protein durch Sox9 angetrieben loci 19,20, wurde in der CD-1 Hintergrund erstellt.
- Euthanize 3 bis 5 erwachsenen Mäusen unter Verwendung von Gas CO 2 für 1-2 Minuten oder bis zum Atemstillstand . Als nächstes wird auf jeder Maus zervikale Dislokation auszuführen.
- Präparieren und die Bauchspeicheldrüsen vorbereiten.
HINWEIS: Präparieren die Mäuse so bald wie möglich nach der Euthanasie. Dies ist wichtig, Selbstverdauung der Bauchspeicheldrüse zu vermeiden, aufgrundIn den postmortalen Veränderungen.- Machen Sie einen vertikalen Schnitt auf der Mittellinie der Bauchwand der Maus Schere und öffnen Sie die Bauchhöhle mit. Finden Sie die Milz und Zange verwenden, um sie vorsichtig. Schneiden Sie das Bindegewebe zwischen der Milz und der Milz Keule der Bauchspeicheldrüse mit einer Schere.
- Wiederholen Sie diese Übung für den Zwölffingerdarm und Magen-Lappen der Bauchspeicheldrüse. Platzieren Sie die pankreatische Gewebe in einer Petrischale auf eiskaltem Dulbeccos modifiziertes Phosphatpufferlösung, enthaltend (DPBS), 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) und Penicillin und Streptomycin (P / S; vollständige Lösung bezeichnet als PBS / BSA).
- Entfernen Fettgewebe aus der Bauchspeicheldrüse unter einem Binokular mit fein Spitze Pinzette.
Hinweis: Dies ist von entscheidender Bedeutung für die Gesundheit der dissoziiertem Pankreaszellen in den folgenden Schritten.- (Optional) Überprüfen Sie die Bauchspeicheldrüsen für grüne Fluoreszenz unter dem Fluoreszenz-Stereo mit 488-509 nm Anregung, um sicherzustellen,EGFP-Expression.
- In einer Kultur, Kapuze Gewebe, spülen Sie das Gewebe dreimal nacheinander in drei 100-mm-Petrischalen von 10 ml kaltem PBS / BSA enthält.
- Machen Sie einen vertikalen Schnitt auf der Mittellinie der Bauchwand der Maus Schere und öffnen Sie die Bauchhöhle mit. Finden Sie die Milz und Zange verwenden, um sie vorsichtig. Schneiden Sie das Bindegewebe zwischen der Milz und der Milz Keule der Bauchspeicheldrüse mit einer Schere.
- Generieren Sie kleine Stücke von Gewebe.
- Übertragen Sie die seziert Bauchspeicheldrüsen zu einem trockenen und sterilen Petrischale so viel PBS / BSA wie möglich zu entfernen, und sie auf einen anderen trockenen Petrischale auf Eis.
- Bereiten PBS / BSA DNase I durch Zugabe von 2 ul DNase I-Stammlösung (1 Million Einheiten [MU] / ml) pro 1 ml PBS / BSA.
HINWEIS: Diese Lösung wird bezeichnet PBS / BSA / DNase I Make ~ 200 ml dieser Lösung auf einmal, was ein Sortier Experiment abdecken wird. - Mince die Bauchspeicheldrüsen mit Federschere für 2-3 Minuten oder bis das Gewebe ist in feine Stücke. Hinzufügen 2-3 ml kaltem PBS / BSA / DNase I auf die Gewebestücke in der Petrischale, sie zu suspendieren.
- Übertragen Sie die Gewebestücke zu einem 50 ml konischen Röhrchen auf Eis mit einer 10 ml Pipette. Bringt das Gesamtvolumen auf 10 ml mit PBS / BSA / DNase l nach so viel Gewebe wie möglich zu erholen.
- Digest den Bauchspeicheldrüsen Stück in Meist Einzelzellen.
- In Kollagenase B (100 mg / ml Lager) 350-450 ul / 10 ml auf die Gewebestücke und Inkubation das Gewebe bei 37 ° C in einem Wasserbad für 8 min, alle 3-4 min wirbeln. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze mit einer 16 ½ G-Nadel zu erstellen und anschließend das Gewebe Lösung auf der Wand des 50-ml-Röhrchen bei RT sprühen. Wiederholen Sie diesen Vorgang siebenmal.
HINWEIS: Verwenden Sie genug Kraft, um die Zellhaufen zu brechen, aber die Erzeugung Blasen zu vermeiden, die die Zellen töten kann. - Rück das Röhrchen in das Wasserbad bei 37 ° C für 8 min und mischen alle 3-4 min durch Verwirbelung. Spritze in das Gewebe auf und ab siebenmal, wie oben erwähnt, und legen eine Probe (10 ul) der Gewebelösung auf einer trockenen Petrischale. Beachten Sie die Gewebelösung unter einem umgekehrten, Phasenkontrast-Lichtmikroskop mit einer 10fach Objektiv. Erwarten Sie einzelne Zellen und einige kleine cell Cluster vorhanden sein.
- Behandeln Sie die Zellen auf Eis von diesem Zeitpunkt an zu verlangsamen oder die Aktivität der Kollagenase zu stoppen. Stellen Sie die Lautstärke auf 50 ml mit kaltem PBS / BSA / DNase I. Zentrifuge die Zellen bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C und Resuspension in 5 ml kaltem PBS / BSA / DNase I eine P1000 Pipette.
- In Kollagenase B (100 mg / ml Lager) 350-450 ul / 10 ml auf die Gewebestücke und Inkubation das Gewebe bei 37 ° C in einem Wasserbad für 8 min, alle 3-4 min wirbeln. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze mit einer 16 ½ G-Nadel zu erstellen und anschließend das Gewebe Lösung auf der Wand des 50-ml-Röhrchen bei RT sprühen. Wiederholen Sie diesen Vorgang siebenmal.
- Filter zu Einzelzellsuspensionen und Wash-Ausbeute.
- Filtern Sie die Zellen durch ein 70 & mgr; m Nylon-Mesh-Filtertasse und dann durch ein 40 & mgr; m Nylon-Mesh-Filtertasse.
- Resuspendieren der Zellen in 5 ml kaltem PBS / BSA / DNase I und die Zellen zu zählen.
HINWEIS: Für 2-4 Monate alten B6 oder CD-1-Mäuse kann jede Bauchspeicheldrüse ergeben ~ 5 oder 10 Millionen Zellen. Diese Zahlen können zwischen verschiedenen Experimentatoren variieren. Wenn übermäßige Zelltrümmer Zählung gefunden wird, bringt das Volumen auf 50 ml mit kaltem PBS / BSA / DNase I und zentrifugieren die Zellen bei 400 · g für 5 min bei 4 ° C. - Stellen Sie das Volumen der Zellsuspension auf eine Konzentration von 2 x 107 Zellen / ml mit kaltem PBS / BSA / DNase I.
2. Ordnen Sie die Zellen Bauchspeicheldrüsenkoloniebildende Vorläufern zu Bereichern
HINWEIS: Von B6 - Mäusen, CD133 + aber nicht CD133 - Zellen für PCFUs 7,9,11 angereichert sind. CD133 + Zellen stellen ~ 13% der gesamten Pankreaszellen , nachdem alle Gating - Parameter dissoziiert 11 angewendet werden. Von CD-1 - Mäuse, CD133 + Sox9-EGFP + Zellen typischerweise stellen ~ 4% der gesamten Pankreaszellen, und diese Zellpopulation ist für PCFUs 7 angereichert. Sortieren der CD133 + Sox9 / EGFP + Zellen wird hier beschrieben.
- Stain die dissoziierten Zellen der Bauchspeicheldrüse.
- Blockieren die gesamte Pankreas Einzelzellsuspension zu reduzieren unspezifische Bindung durch die Einzelzellsuspension mit Anti-Maus-CD16 Inkubieren / 32 bei 10 & mgr; g / ml Endkonzentration für 5 min auf Eis.
- Entfernen eines Aliquots von 1 x 10 6 Zellen (50 &# 181; l) mit dem Isotypkontrollantikörper, biotinkonjugierten Ratte IgG1 bei 5 ug / ml Endkonzentration, für 20 Minuten auf Eis zu färben, alle 5-7 min wirbeln.
- Entfernen eines Aliquots von 1 x 10 6 Zellen (50 ul) und auf Eis halten als ungefärbte Kontrolle.
- Beflecken den Rest der Zellen mit einem Biotin-konjugierten Anti-Maus-CD133 primären Antikörper, bei 5 & mgr; g / ml Endkonzentration, für 20 min auf Eis, alle 5-7 min wirbelnden.
- Waschen Zellen.
- Waschen Sie die Isotyp-Kontrolle und Primärantikörper-gefärbten Proben, die durch das Volumen auf 1 ml mit PBS / BSA / DNase I und Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei 4 ° C zu bringen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt.
- Resuspendieren Isotypenkontrolle und Primärantikörper-gefärbte Proben in PBS / BSA / DNase I, so dass die Endkonzentration 2 x 10 7 Zellen / ml.
- Stain die Isotyp-Kontrolle und primärer Antikörper-gefärbten Proben mit Streptavidin (STV) -markierten Allophycocyanin (APC) bei 2 & #181; g / ml Endkonzentration. Inkubieren für 15 Minuten auf Eis, alle 5-7 min wirbeln.
- Waschen Zellen und 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) -Färbung.
- Waschen Sie die Isotyp-Kontrolle und Primärantikörper-gefärbte Proben zweimal mit PBS / BSA / DNase I, wie in Schritt 2.2. Resuspendieren der Zellen in PBS / BSA / DNase I mit DAPI (0,2 ug / ml Endkonzentration). Das endgültige Volumen der Isotyp Kontrollprobe sollte 0,5 ml betragen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die endgültige Dichte des primären Antikörper gefärbten Probe geeignet ist für die Sortierer verwendet werden. Eine Konzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml wird zum Sortieren routinemäßig eingesetzt. - Stellen Sie die Lautstärke der ungefärbten Zellen zu 0,5 ml mit PBS / BSA / PS / DNase I. Filter alle Zellen durch ein 20 & mgr; m Maschen vor dem Sortieren und halten Sie die Zellen auf Eis im Dunkeln.
- Waschen Sie die Isotyp-Kontrolle und Primärantikörper-gefärbte Proben zweimal mit PBS / BSA / DNase I, wie in Schritt 2.2. Resuspendieren der Zellen in PBS / BSA / DNase I mit DAPI (0,2 ug / ml Endkonzentration). Das endgültige Volumen der Isotyp Kontrollprobe sollte 0,5 ml betragen.
- Sortierung der Zellen.
- Verwenden Sie ein 80 & mgr; m oder größer Düse zum Sortieren.
HINWEIS: Murine endokrinen Pankreaszellen zu körperlicher Belastung anfällig sind. HoWever, murine PCFUs scheinen nicht durch die , indem sie durch einen Sortierer 7 verursacht Stress betroffen sein. - Erwerben Zelle Ereignisse und Analyseparameter auf der Sortierer. Tor die Zellen für Vorwärts- und Seitenstreubereiche ausschließen Zelltrümmer 7. Tor für Vorwärts- und Seitenstreubreiten Zelle Dubletten auszuschließen. Tor auszuschließen DAPI + tote Zellen 7. Wählen Gating - Parameter für die EGFP und CD133-APC - Signale auf der Basis der Werte aus den Isotyp - Kontrollzellen (Abbildung 1).
- Sammeln der sortierten Zellen in 5 ml Polystyrolröhrchen, das 1,5 ml DMEM / F12 Medium mit 5% fötalem Kälberserum (FCS). Zentrifuge die sortierten Populationen bei 400 xg für 5 min und resuspendieren in einem kleinen Volumen (~ 200 & mgr; l) entweder DMEM / F12 oder PBS / BSA / DNase I mit 5% FCS ergänzt. Halten Sie die Zellen auf Eis bis zum Gebrauch.
- Verwenden Sie ein 80 & mgr; m oder größer Düse zum Sortieren.
- Zählen Sie die Anzahl von CD133 + Sox9-EGFP + Zellen aus dem Sortierer erhalten. Nehmen Sie ein10 ul Zellprobe und Zählen der Zellen mit einem Hämozytometer die Zelldichte zu bestimmen.
HINWEIS: Hemacytometer Verwendung wird empfohlen, da Maschine zählt von dem Sortierer oft unzuverlässig sind.
3. Platte der sortierten Zellen, die in der Kolonie-Assay mit einem Gehalt Murine ECM Proteine
HINWEIS: Bitte beachten Sie die ausführlichen Protokolle für die Beschichtung von Zellen in die Mäuse - ECM-enthaltenden Kolonie - Assay in einer anderen JoVE Veröffentlichung 18.
- Bereiten Kulturmedien.
- Vorbereiten eines Kulturmedium, das DMEM / F12-Medium, 1% (wt / v) Methylcellulose, 5% (v / v) murine ECM Proteine, 50% (v / v) konditioniertes Medium von MESC abgeleiteten Pankreas-ähnliche Zellen, 5% (v / v) FCS, 10 mmol / L Nicotinamid, 10 ng / ml humanem rekombinantem Activin B, 0,1 nmol / L Exendin-4 und 1 ng / ml vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor-A. Verfahren zur Herstellung des konditionierten Mediums zu erzeugen sind an anderer Stelle 18 beschrieben.
- Hinzufügen, 750 ng / ml RSPO-1 zu dem Mediumwenn Dense Koloniebildung erwünscht ist.
- Inkubieren der murinen ECM - Protein Kultur bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3 Wochen.
4. Kultur die sortierten Zellen bei 1 Zelle pro Well
HINWEIS: Die folgenden Verfahren gelten einzelne Zellen mit Hand und Mund Pipetten zu manipulieren. Ein alternativer Ansatz ist es, einen Mikromanipulator zu erwerben. Ein typischer Mikromanipulator umfasst ein inverses Mikroskop mit einem Joystick betriebenen motorisierten Plattform.
- Bereiten Glas Pasteur Pipetten.
- Mit Hilfe eines Bunsenbrenners, ziehen die Spitze einer Pasteur-Glaspipette zu einer feinen Spitze (~ 30 & mgr; m bei der Öffnung). Die Glaspasteurpipetten sollte einen Wattestopfen haben eine Barriere für den Luftstrom von dem Bediener zu erstellen.
- Autoklave mit geflammten Glas Pasteur Pipetten bei 121 ° C für 20 Minuten zur Sterilisation.
- Bereiten Sie 96-Well-Platten für Kultur.
- Bereiten Sie kalt halbfeste Kulturmedium according dem zuvor beschriebenen Protokoll 18.
- Dispense das Medium in die inneren Vertiefungen einer Low-Bindung mit flachem Boden 96-Well-Platte mit 100 ul / Vertiefung einer 1 ml-Spritze. Füllen Sie die äußeren Vertiefungen mit sterilem Wasser auf Feuchtigkeit halten.
- Legen Sie die Kulturschale auf Eis bis zum Gebrauch.
- Bereiten Sie die sortierten Zellen.
- Hinzufügen ~ 6,000 gesammelten Zellen von einem Sortierer zu 2,5 ml Endvolumen von DMEM / F12 / PS, das 10% FCS und 1% Methylcellulose in einer 5 ml Polystyrolröhrchen. Kräftig schütteln die Komponenten zu mischen. Warten für 5 min oder bis die Blasen zu dem oberen Ende des Rohres schweben. Dieser Schritt braucht nicht auf Eis durchgeführt werden.
- Dispense die Zell-Lösung auf zwei 35-mm-Schalen mit 1 ml / Schale mit einer 1-ml-Spritze mit einer 18 ½ G-Nadel.
- Verbreiten Sie die Zell-Lösung in die Schale vorsichtig die Schale mit der Hand zu schaukeln. Nicht in den halbfesten Medium den Rand des 35-mm-Schale, wie die einzelnen Zellen am Rand des Brunnens Cann zu erreichenot unter Verwendung eines invertierten Lichtmikroskop beobachtet deutlich werden.
- Bereiten Sie den Arbeitsbereich Rund ein Mikroskop.
- Machen Sie eine Lösung DMEM / F-12-Medium und 1% Methylcellulose ohne Zellen ( "No-cell" Medium) enthält, und verzichten die Lösung (wie in 4.3.2 beschrieben) in zwei 35-mm-Petrischalen (1 ml pro Schale) .
- Reinigen und wischen Sie den Arbeitsbereich um ein umgekehrtes Phasenkontrastmikroskop mit einer 70% igen Alkohollösung.
- Bauen Sie die Pipette mit dem Mundstück.
- Wählen Sie eine sterile Glaspasteurpipette, die in Schritt 4.1 hergestellt. Bringen Sie das große Ende einer 1-ml-Plastikpipettenspitze an die Spitze der Glaspasteurpipette. Bringen Sie das kleine Ende des 1-ml-Plastikpipettenspitze an einem Ende eines dünnwandigen Gummischlauch, und das Mundstück an das andere Ende des Rohres. Verwenden Sie die gleiche Glaspipette für mehrere Zellen der gleichen Gruppe aufnimmt.
- Aufzustellen, durch den Mund Saug-, ein kleines Volumen (~ 10 bis 50 & mgr; l) des"No-cell" halbfeste Lösung in Schritt 4.4.1 mit dem Glas Pasteur Pipette gemacht.
HINWEIS: Die semi-festen Lösung an der schmalen Öffnung des Glaspasteurpipette erzeugt Strömungswiderstand und liefert eine Barriere Kontamination der Zellen zu verhindern, abgeholt werden.
- Wählen Sie eine einzelne Zelle.
- Legen Sie die 35-mm-Schale die sortierten Zellen auf dem Mikroskoptisch enthält, und den Deckel entfernen.
- Finden Sie die Zellen, die eine 10fach Objektiv und Fokus auf einer geeigneten Zelle mit aufgenommen werden.
- Finden und die Öffnung der Pipettenspitze legen neben der Zelle von Interesse. Bewerben Sog durch den Mund.
HINWEIS: Die Bewegung der Zelle sollte sehr langsam sein, so dass es während des Prozesses später kein Risiko des Verlustes der Zelle ist. Die Bewegung der Zelle, die die Öffnung der Pipette eingeben sollte sichtbar sein. Wenn der Fluss zu schnell bewegt, mit einer engeren Öffnung zu einer Pipette ändern.
- Anzahlung, um die Single Cell in eine Kultur Well.
- Sobald die Zelle in der Pipette ist, verwenden Sie die Zunge den Fluss zu stoppen, indem die Öffnung des Mundstücks zu blockieren. Pause kurz vor der Spitze aus dem halbfesten Medium zurückzuziehen, um sicherzustellen, dass das halbfeste Medium fließt, wurde beendet.
- Setzen Sie die Spitze der Pipette in einen Brunnen in der 96-Well-Platte, hergestellt in Schritt 4.2. Schieben Sie die Zelle langsam aus, indem Sie vorsichtig in das Mundstück bläst. Markieren Sie das gut, nachdem die Zelle abgeschieden wird, zu vermeiden, zwei Zellen in eine gut Plattierung.
- Stellen Sie sicher, dass eine einzelne Zelle in einer Kultur gut aufgestellt ist.
- Die Pipettenspitze in der "no-cell" Medium in Schritt 4.4.1 vorbereitet. Während die Öffnung der Spitze unter dem Mikroskop zu beobachten, drücken Sie die restlichen halbfeste Lösung aus. Erwarten Sie keine Zelle, die die Spitze der Pipette herausfließen.
- Um überprüfen, finden Sie die Lage in der Kultur gut, wo die einzelne Zelle implantiert wurde.
- Kultur die einzelnen Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 fürbis 3 Wochen.
5. Wählen Sie Einzelne Kolonien, die aus Halbfeste Kultur für Mikrofluidik-qRT-PCR-Analyse
HINWEIS: Drei Wochen nach dem Ausplattieren sortiert CD133 + Sox9 / EGFP + Zellen in das murine ECM-enthaltenden Kolonie - Assay, Ring oder dichte Kolonien werden 7 gebildet (Figur 2). Wenn Ring / Dense Kolonien in einzelne Zellsuspension und neu plattiert in Laminin Hydrogel Kultur gelöst sind, werden endokrine / acinar Kolonien nach etwa einer Woche 7 (Abbildung 2) erzeugt. Zur Bestimmung der Abstammung Zusammensetzung jeder Kolonie, mikrofluidischen qRT-PCR - Analyse verwendet , um die Expression von Lineage Marker 7 zu erkennen. Für Vorverstärkung, ist eine Kolonie gemischt in einem Master - Mix 21 eine TaqMan Sondenmischung, Reaktionspuffer und Superscript III enthält. Die 48,48 - Array - Chip ist für mikrofluidische PCR - Reaktionen 21 anschließend verwendet.
- Bereiten Sie die Vorverstärkung PCRmischen 48 Sonden enthalten.
- Pipette 1,5 ul jeder TaqMan-Sonde (20x Lager) in einem 1,5-ml-Röhrchen. Hinzuzufügen 78 ul TE-Puffer um das Volumen auf 150 ul einzustellen.
- Bereiten Sie den Master - Mix durch Protokolle vom Hersteller 21 folgen.
- Legen 9 ul Master Mix in 0,2 ml dünnwandigen Reaktionsrohr geeignet für die PCR, und wiederholen Sie diesen Schritt für bis zu 48 Röhren.
- Wählen Sie einzelne Kolonien aus dem halbfesten Kultur.
HINWEIS: Ring / Dense Kolonien sind größer als Endokrine / acinar Kolonien, mit Durchmessern im Bereich von ~ 50 bis 400 & mgr; m 9,11. Daher werden einzelne Ring / Dense Kolonien nahm ein P10 Pipette mit einer Pipettenspitze 10 ul ausgestattet, die in eine gekrümmte Form gebogen ist. Zur Aufnahme des kleinen Endocrine / acinar Kolonien (Abbildung 2), siehe Schritt 4 fort.- Suchen Sie eine Kolonie von Interesse unter hoher Vergrößerung (zB 20X Objektivlinse), verringern Sie die Vergrößerung und aspirate die Kolonie. (Optional) Nehmen Sie ein Phasenkontrastbild der Kolonie in diesem Schritt die sichtbaren Eigenschaften der Kolonie zu dokumentieren.
- Übertragen Sie die Kolonie in die PCR-Röhrchen mit 9 ul Master-Mix.
- Suchen Sie sich die nächste Kolonie. Bis zu 45 Kolonien insgesamt können pro PCR-Lauf analysiert werden, 3 Spots für die Kontrollen zu verlassen.
- RNA-Extraktion und cDNA-Synthese mit Vorverstärkung.
- Vortex die Proben kräftig vor der thermischen Reaktion durchgeführt wird.
- Führen die thermischen Wechselreaktionen gemäß den Anweisungen des Herstellers 21. Ring / Dense Kolonien erfordern 14 Zyklen, Endocrine / acinar Kolonien erfordern 16-20 Zyklen, und einzelne Zellen benötigen 22 Zyklen.
HINWEIS: Vorverstärkung cDNAs können bei -20 ° C vor der mikrofluidischen PCR-Analyse gespeichert werden.
- Führen anschließenden PCR - Reaktionen, einen mikrofluidischen Chip, entsprechend den Anweisungen des Herstellers 21 verwendet wird .
- Ernte und Fix Kolonien.
- Pick-up die Kolonien unter dem Mikroskop, wie in den Schritten 4 oder 5.4, und fügen Sie sie zu einer 4% Paraformaldehydlösung. Inkubieren O / N bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
- Waschen Sie die Kolonien mit 1X PBS zweimal für 10-30 min bei RT. Speichern der festen Kolonien bei 4 ° C in 1,5 ml-Röhrchen mit Paraffin verschlossen.
- Stain die Kolonien mit Antikörpern.
- Transfer Kolonien auf eine Vertiefung einer 96-Well-schwarze Platte mit einem klaren Boden, die 200 & mgr; l Blockierungspuffer (5% Esel und / oder Ziegenserum, 0,1% Triton X-100 in 1x PBS). Inkubieren O / N bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
- Verdünne den primären Antikörper zu einer vorbestimmten Konzentration (beispielsweise 1: 500 für Hamster anti-Mucin 1 - Antikörper) unter Verwendung von Puffer blockiert. Übertragen Sie die Kolonien zu einem sauberen und mit 200 ul primärer Antikörper, und Inkubation O / N bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. WAsche, die Kolonien 3-mal mit PBS die Kolonien in eine neue und mit 200 ul 1x PBS / 0,1% Tween 20 für 10 min bei RT für jeden Wasch 0,1% Tween 20. Übertragung enthält.
- Verdünne die sekundären Antikörpers zu einer vorbestimmten Konzentration (beispielsweise 1: 2.000 für Ziegen - anti-armenischen Hamster - Antikörper) unter Verwendung von Blockierungspuffer. Halten Sie die Lösung im Dunkeln. Transfer der Kolonien Vertiefungen zu reinigen, der 200 & mgr; l sekundärem Antikörper und Inkubation für 2 h bei RT. Waschen Die Kolonien 3-mal mit PBS / 0,1% Tween 20, wie in Schritt 6.2.2.
- Counter-Fleck Kolonien mit DAPI und zu visualisieren, mit der konfokalen Mikroskopie.
- Übertragen Sie die Kolonien in die Vertiefungen mit PBS, das 300 nM DAPI und Inkubation für 5 min bei RT.
- Übertragen Sie die DAPI-gefärbte Kolonien auf eine 35 mm Glasboden-Petrischale für die Visualisierung. Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite der Kolonien Verdunstung zu verhindern.
- Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop die Bilder zu erfassen. Zur Visualisierung DAPI staining, verwenden Zwei-Photonen-Anregungswellenlänge von 730 bis 950 nm. Verwenden eines Argonlasers mit einer Wellenlänge von 458 nm Fluorochrome mit Emissionswellenlängen von 519 und 561 nm zu erregen. Verwenden eines Helium-Neon-Laser mit einer Wellenlänge von 633 nm Fluorochrome mit Emissionswellenlängen von 665 nm zu erregen.
7. Dissociate und Re-Platte Primärring / Dense Kolonien in Secondary Colony Assays
HINWEIS: Alle Verfahren sollte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Vermeiden Kälteschock zu den Zellen in diesem Verfahren so weit wie möglich, wie Zellen auf Eis oder Wasch Zellen mit kaltem PBS / BSA setzen. Solche Praktiken reduzieren die Lebensfähigkeit der wieder plattierten Zellen.
- Bereiten Sie Lösungen.
- Pre-warmen Waschpuffer (DMEM / F12; P / S; 0,1% BSA) in einem 37 ° C Wasserbad.
- Vorwärmen eine 96-Well-Platte (Flachboden, geringe Bindung) in einem 37 ° C Inkubator. Füge 100 & mgr; l 100% FCS zu einer Vertiefung der Platte, und 100 ul 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung zu einer zweitenGut.
- Sammeln Kolonien.
- Pick-and-Pool insgesamt 20 oder mehr Ring / Dense Kolonien in Primärkulturen unter Verwendung von 10 & mgr; l-Pipettenspitzen, wie in Schritt 5.4 beschrieben.
- Platzieren Sie die Kolonien in warm (mindestens RT) Waschpuffer (~ 1,000 & mgr; l) in einem 1,5-ml-Röhrchen und Schleudern bei 400 xg für 5 min. Entfernen Sie den Überstand.
- Distanzieren die Kolonien in Einzelzellsuspensionen unter Verwendung von Trypsin.
- Übertragen das verbleibende Volumen (20 & mgr; l oder weniger), die die Kolonien enthält, in das Bohrloch, das warm Trypsin-Lösung enthält (hergestellt in 7.1).
- Die Platte in einem 37 ° C-Inkubator (kein Wasserbad) für 1,5 min. Entfernen Sie die Platte und Pipette, um die Kolonien ein paar Mal. für weitere 1,5 min bei 37 ° C inkubieren.
- Entfernen Sie die Platte und Pipette nach oben und unten ein paar Mal um die Kolonien zu brechen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop zu sehen, ob die Kolonien überwiegend in Einzelzellsuspension verteilt wurden.Vermeiden Sie zu Verdauung der Kolonien.
- Stoppen Sie die Trypsin Reaktion von FCS Hinzufügen.
- Übertragen Sie 100 ul warmen FCS in den Brunnen, die die Zellen enthält. Pipette nach oben und unten ein paar Mal. Übertragen Sie die Zellen in ein 1,5-ml-Tube 1000 ul warmen Waschpuffer enthält. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min bei RT.
- Wasche zweimal mit warmem Puffer.
- Wieder die Zellen in ~ 200 ul Puffer oder dem Kulturmedium.
- Zählen der Anzahl von Zellen eines Hämacytometers verwenden. Halten Sie die Zellsuspension bei RT.
- Re-Platte dissoziierten Zellen in sekundäre Kolonie - Assays entweder murine ECM - Proteine (5% v / v) oder Laminin Hydrogel (100 ug / ml) und Inkubieren der Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 enthält.
HINWEIS: Für Zellen in Maus-ECM-Proteine wieder Plattierung, verwenden 2.500-5.000 Zellen pro Vertiefung und Kultur für 2-3 Wochen. Für neu mende in Laminin Hydrogel Kultur, verwenden 10.000-25.000 Zellen pro Vertiefung und Kultur für 7-12 Tage.
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Representative Results
Adult Pankreas - Vorläuferzellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (Abbildung 1) angereichert werden. Die Sox9 / EGFP transgenen Mauslinie hier verwendet wurde zum ersten Mal als Ergebnis des Projekts GENSAT Gehirn - Atlas 19 erzeugt, und die EGFP Reporter unter der Kontrolle eines bakteriellen künstlichen Chromosom enthält ~ 75 kb stromaufwärts und ~ 150 kb Downstream - Sequenzen von Sox9 20 . In diesen Mäusen markiert EGFP Pankreasgänge effizient und spezifisch 22. Pancreas wurde beschafft und dissoziiert in eine Einzelzellsuspension, und gefärbt mit anti-CD133 Antikörper mit Biotin konjugiert ist, gefolgt von mit sekundären Antikörpern, konjugiert mit STV-APC Anfärbung. Die resultierenden Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie mit entsprechenden Gating - Parameter (Abbildung 1) analysiert. Zellen mit unterschiedlichen Gating-Parameter erhalten kann in die Methyl enthaltenden Kolonie-Assays sortiert und plattiert werdenKoloniebildung. In früheren Studien wurde festgestellt , dass koloniebildende Fähigkeit nur in der sortierten CD133 + Sox9 / EGFP + duktalen Zellen 7 zu finden ist.
Die Kolonien , in der Methylcellulose-enthaltende Kolonie - Assays gebildet wurden entsprechend ihrer Morphologien klassifiziert, als invertiertes beobachtet unter Verwendung von Phasenkontrast - Lichtmikroskop (Abbildung 2). Anschließend wurden einzelne Kolonien von Hand gepflückt und analysiert durch mikrofluidische qRT-PCR - Analyse für die Genexpression (Abbildung 3) oder durch ganzHalterung für immunostaining Proteinexpression (Abbildung 4). In veröffentlichten Studien 7,9,11 wurde festgestellt , dass viele einzelne Kolonien exprimierten lineage Marker für Kanal (Mucin-1), acinar (Amylase) und endokrine (Insulin - Zellen), die anzeigt , dass die Mehrzahl der initiierende PCFUs für diese Kolonien tri-potent. Der Anteil der drei Zelllinien in jeder Kolonie Wurde durch die Arten und Konzentrationen von ECM - Proteinen , die in der Methylcellulose-enthaltende Kolonie - Assays 7,9 jedoch beeinflusst. Murine ECM - Proteine Selbsterneuerung von PCFUs und duktale Zelldifferenzierung während Laminin Hydrogel bevorzugt die Differenzierung von endokrinen und acinar unterstützt Zelllinien 7,9,11 stimuliert.
Abbildung 1. Durchflusszytometrie Analyse von dissoziierten Zellen der Bauchspeicheldrüse von erwachsenen Mäusen Färbemustern gemäß zwei duktale Zellmarker, CD133 und Sox9. Sox9 / EGFP transgenen Mäusen , die Sox9 Loci-driven enthielt EGFP Reporter verwendet wurden. Eine repräsentative Sortiergatter (roter Kasten) für Pankreas - CD133 + Sox9 / EGFP + Zellen gezeigt. CD133 + Sox9 / EGFP + Zellen werden für PCFUs 7 angereichert.les / ftp_upload / 54016 / 54016fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Kolonien mit unterschiedlichen Morphologien wurden erzeugt in Methylcellulose-Kolonie - Assays enthält. Repräsentative Mikrofotografien von Ring, dicht und Endocrine / Azinuszellen Kolonien aus einem Phasenkontrastmikroskop mit sichtbarem Licht beleuchtet werden gezeigt. Ring und Dense Kolonien werden erzeugt , wenn frisch sortiert PCFUs in das Kulturmedium plattiert , enthaltend murine ECM - Proteine und kultiviert für 3 Wochen 7. Endocrine / acinar Kolonien werden nach erneuter Plattierung der distanzierte Ring oder Dense Kolonie Zellen in Kulturmedium gebildet 7 ein Laminin - Hydrogel und kultiviert für ~ 1 Woche enthält. Maßstabsbalken für Ring und Dense Kolonien = 100 & mgr; m. Maßstabsbalken für Endo / acinar Kolonien = 25 μ;. m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Einzelne Kolonien in murine ECM Proteine exprimiert Marker für duktale, acinar und endokrinen Zellen. Repräsentative Ergebnisse von mikrofluidischen qRT-PCR - Analyse der einzelnen Ring Kolonien gewachsen. Jede Spalte steht für eine einzelne Kolonie. Die Expression von Genen werden als Wärme Karte hier zum Ausdruck gebracht, mit wärmeren Farben anzeigt, höhere Expression und kälteren Farben anzeigt geringere Expression. Viele der einzelnen Kolonien exprimieren mindestens eines der Gene in jeder Platte für die Marker indikativ für Kanal, endokrine oder acinar Zelllinie. Diese Daten zeigen, daß viele der einzelnen Kolonien tri-lineage Marker exprimieren, und legen nahe, dass die meisten derUrsprung PCFUs sind Tri-potent. Diese Zahl kann von einem zuvor veröffentlichten Abbildung modifiziert 7. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Zwei ausgedrückt Ring Kolonien eine duktale Proteinmarker Mucin 1. Repräsentative Ergebnisse der ganze-mount Immunfärbung von Ring Kolonien, Proteinexpression eines duktalen Marker Mucin 1 (grüne Farbe) zeigt. Die Kerne sind gegengefärbt mit DAPI (blaue Farbe). Viele Zellen in diesen Ring Kolonien exprimieren Mucin 1-Protein. Dies steht im Einklang mit den mikrofluidischen qRT-PCR - Ergebnisse zeigen , dass Ring Kolonien in murine ECM - Proteine exprimieren gewachsen hohen Niveaus (wärmere Farben in Abbildung 3) von mucin1 und andere duktale Zellmarker. Der Maßstab darstellens 50 um. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Pancreatic Kolonie - Assays zur Messung der Selbsterneuerung und multi-lineage Differenzierung einzelner Vorläuferzellen in Kultur. Representative Workflow präsentiert wird. Unsere Bauchspeicheldrüsen Kolonie-Assays enthalten ein viskoses Material, Methylcellulose, so daß das Kulturmedium wird halbfest. Halbfeste Medium schränkt die Bewegung und verhindert die Aggregation von einzelnen Vorläuferzellen (rot markiert). Jedoch ist das Medium weich genug, um eine einzelne Vorläuferzelle zu ermöglichen, selbst zu erneuern und / oder differenzieren, und wachsen in einer Kolonie von Zellen (durch mehrere rote Kreise dargestellt). Im Gegensatz dazu haben einzelne Zellen, die keine koloniebildenden Fähigkeiten, <em> dh nicht-Vorläuferzellen (blau gekennzeichnet), bleiben als einzelne Zellen oder im Laufe der Zeit in Kultur sterben. Methylcellulose ermöglicht auch die Aufnahme von ECM - Proteine bei niedrigen Konzentrationen, wie 5% murinen ECM - Proteine oder 100 ug / ml Laminin Hydrogel. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Pankreas - Kolonie - Assays und einzelne Kolonie Analysen der Methylhaltigen hämatopoetischen Kolonie - Assays beschrieben hier wurden inspiriert , die bei der Entschlüsselung der Biologie der hämatopoetischen Vorläuferzellen in den vergangenen Jahrzehnten 23 Hauptrollen gespielt haben. In diesen Assays (Abbildung 5), dissoziiert sind Pankreaszellen ausplattiert in Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medien mit geeigneten Wachstumsfaktoren und ECM - Proteinen, die die Bildung von Ring, Dense oder Endocrine / Azinuszellen Kolonien 7 unterstützen. Eine einzelne Vorläuferzellen, die aus, die zu einer Kolonie von Zellen in der Lage ist, eine PCFU bezeichnet. Durch die Charakterisierung von einzelnen Kolonien mit mikrofluidischen qRT-PCR und ganze-mount Immunfärbung können die Abstammungslinie Potentiale der Ursprung PCFUs abgeleitet werden. Es wurde festgestellt , dass eine Mehrheit der erwachsenen Mäuse - PCFUs sind Tri-potent, der fähig ist zu duktalen, acinar und endokrine Linie Zellen in vitro 7,9 führt. während murine ECM - Proteine , die Differenzierung von Tri-potenten PCFU in Richtung Kanal Linie zu fördern, ermöglicht es dem Laminin - Hydrogel robust endokrinen und Azinuszelltumoren lineage Differenzierung 7,9. Um die in vitro Selbsterneuerungskapazität des PCFUs, der Ring oder Dense Kolonien beurteilen in einem primären murinen ECM - Kolonie - Assay gezüchtet kann in Einzelzellsuspension und erneut ausplattiert in eine sekundäre murine ECM - Kolonie - Assay 7 dissoziiert werden. Es wurde festgestellt , dass PCFUs erweitert ~ 500.000 Mal in murine ECM - Proteine über 11 Wochen 7. Die kritischen Schritte beinhalten die Entfernung von Fettgewebe aus dem sezierten Bauchspeicheldrüsen, über-Verdau von Pankreaszellen durch Kollagenase zu vermeiden und Kälteschock zu den dissoziierten Ring / Dense Kolonie Zellen vor dem erneuten Plattierung minimieren. Die Beherrschung der Mikromanipulation von einzelnen Zellen kann einige Zeit in Anspruch nehmen; Geduld und Übung erforderlich.
Im Vergleich zu anderen Assays Pankreas - Vorläuferzellen, einschließlich 2D - Kultur 24, die sUSSETZUNG "pancreasphere" 25 und die organoiden Assays 12-15, die wesentlichen Vorteile der Methylcellulose enthaltenden Kolonie - Assays hier beschrieben sind , sind wie folgt. Zunächst werden, kann die Zugabe und Einstellung der ECM Proteine an einen weiten Bereich von Konzentrationen leicht erreicht. Dies liegt daran, Methylcellulose ist die Substanz, die die 3D Natur des halbfesten Medium verleiht. Im Gegensatz dazu hängen die organoiden Kulturverfahren auf der Erstarrung der murine ECM-Proteinen, die bei 33% v / v vorhanden sind oder höher. Es wird darauf hingewiesen , dass so wenig wie 1% murine Protein ECM 9 die Differenzierung von endokrinen Zellen hemmen können, die Bedeutung der ECM - Protein - Konzentration in der Vorläuferzelltest unterstreicht. Zweitens werden die Kolonien gleichmäßig über die Kultur gut verteilt und genau gezählt werden können. Drittens können einzelne Kolonien leicht für die nachfolgende Analyse Hand gepflückt werden. Viertens, die Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medium ist leicht zu warten, und kein MediumÄnderung im Verlauf der Kultur erforderlich. Schließlich eine große Anzahl von Zellen (bis zu 25.000 Zellen pro Platte mit 24 Vertiefungen) können in dieser Kolonie-Assays ausplattiert und untersucht werden, um sie effizienter zu machen zum Erfassen Zellvorläufer Aktivitäten, selbst wenn sie eine geringe Population unter den plattierten Zellen sind.
Die Pankreas-Vorläuferzellassays hier beschrieben sind auf funktionelle basiert, aber nicht Marker basiert, analysiert der Pankreas-Vorläuferzellen. Dies bedeutet, dass Pankreas-Vorläuferzellen untersucht werden können, ohne zu wissen, welche Marken sie zum Ausdruck bringen. Dies ist wichtig, weil es wenig Wissen darüber, welche spezifischen Markern die erwachsenen Pankreas-Vorläuferzellen exprimieren kann. Darüber hinaus Marker für die embryonalen Zellen Pankreas-Vorläufer kann für die Untersuchung der erwachsenen Vorläufern nicht ausreichend sein. Durch die Verwendung von Funktionsanalysen kann beginnen eine bestimmte Vorläuferzellmarker zu identifizieren , indem zuerst die Subpopulation zu bestimmen , die PCFU Aktivität, wie zB die CD133 hat + </ sup> Sox9 / EGFP + Zellen hier dargestellt. Dies kann durch die Identifizierung folgen, RNA-seq Verwendung von Genen, die durch die PCFU enthaltenden Population differentiell exprimiert werden. Die Kandidatenmarker kann dann durch Assays getestet und überprüft werden , wie zum Beispiel in vitro und in vivo - Linie Tracing - Techniken, die die Differenzierung Fähigkeiten der Vorläuferzellen zu verfolgen.
Die Grenzen der in vitro Methylcellulose enthaltenden Kolonie - Assays sind dreifach. Erstens : Obwohl die Assays , die die in vivo - Mikroumgebung des Pankreas durch die Bereitstellung ECM Proteine und Wachstumsfaktoren auf die Pankreas - Vorläuferzellen im 3D - Raum in Kultur nachahmen, sind die Bedingungen nicht identisch. Außerdem sind die Strukturen der Epithelzellen in vivo durch Dissoziation in einzelne Zellen aufgebrochen, die wichtige Folgen haben. Deshalb wird es wichtig sein , Progenitorzellen in Folgestudien unter Verwendung von in vivo zu überprüfen , 18. Diese undefinierten Komponenten können die Funktion von spezifischen Wachstumsfaktoren auf die Vorläuferzellen beeinflussen indirekt und mehr Arbeit erforderlich, um einen vollständig definierten Satz von Kulturbedingungen zu schaffen. Schließlich Linie Tracing - Experimente zeigten , acinar-to-Beta - Zellen 26,27 oder Alpha - Zellen-zu-Beta - Zellen 28 Umwandlungen in vivo in erwachsenen Mäusen. Die Methylkulturbedingungen hier beschriebenen Geräte dürfen nur für Kanal-to-Beta-Zell-Umwandlung spezifisch sein. Andere unbekannte Kulturbedingungen können erforderlich sein, für non-duct Zellen Betazellen in Kultur zu konvertieren.
Es gibt mehrere Fälle, in denen Fehlerbehebung notwendig sein kann. Zum Beispiel zusammen, wenn dissoziierten Zellen verklumpt sind, verwenden Sie höhere Dosen von DNase I in Lösungen. DNase I ist wichtig, ein Verheddern von dissoziierten Zellen der Bauchspeicheldrüse durch DNA-mo verursacht zu verhindernlen mit von den toten Zellen freigesetzt wird (siehe Schritt 1.3.2).
Alternativ kann, wenn gehackten Gewebe in der 10 ml Pipette kleben, Hackfleisch, das Gewebe in kleinere Stücke. Die Eröffnung der 10 ml Pipette sollte breit genug sein, um die Gewebestücke nach Collagenaseverdau zu passieren. Wenn Stücke an der Spitze der 10 ml Pipette stecken, zeigt dies, dass die Zerkleinerungs- des Gewebes durch die Feder Schere nicht ausreichend ist (siehe Schritt 1.3.4).
Ein weiteres Problem , das auftreten kann , ist keine Koloniewachstum in murine ECM Proteine aus dissoziierten Pankreaszellen (dh unsortierten Zellen). Falls dies geschieht, nicht versuchen, alle der Cluster in einzelne Zellen in der Bauchspeicheldrüse Dissoziationsschritt zu brechen, wie dies in overdigestion und Zelltod führen kann. Wenn es große Stücke sind, kehren das Rohr auf 37 ° C für ein paar (4) min und die Spritze 7 mal oder weniger. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Die maximale Zeit für Kollagenase B Behandlung beträgt 30 min. Depending auf der Kollagenase verwendet wird, kann die optimale Zeit für die Verdauung unterscheiden (siehe Schritt 1.4.2).
Zusätzlich Klumpen von murine extrazelluläre Matrixproteine in Kulturvertiefungen kann nach der Inkubation beobachtet werden. Um dies zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass alle der Kultur-Komponenten, die mit Maus-extrazellulären Matrixproteinen in Kontakt kommen, sind kalt auf Eis gehalten vor vorzeitiger Erstarrung in 37 ° C Inkubation zu vermeiden (siehe Schritt 3).
Darüber hinaus kann es in Aufnehmen einer Zelle zu einem Zeitpunkt in eine Glaspasteurpipette schwierig sein. Eine Lösung hierfür ist es, die Dichte der frisch sortierten Zellen in dem halbfesten Medium plattiert zu reduzieren, um sicherzustellen, dass eine Zelle in ausreichender Entfernung von den anderen Zellen aufweist. Dadurch wird vermieden, mehrere Zellen gleichzeitig aufnimmt. Darüber hinaus ist es besser, den Fokus des Mikroskops in der Nähe der Unterseite des halbfesten Medium zu platzieren, da es einfacher ist, einzelne Zellen mit der Hand in der Nähe dieser Ebene ohne Mikro zu holenManipulator (siehe Schritt 4.6.2).
Darüber hinaus kann es unklar sein, ob einzelne Zellmanipulation erfolgreich ist. Eine Lösung ist die einzige Zelle Mikromanipulations vor dem eigentlichen Experiment zu üben. Sobald die Zelle wird in der Glaspasteurpipette übertragen die Zelle auf eine 35 mm Petrischale mit 1 ml 1% Methylcellulose-Lösung ohne Zellen ( "no-cell 'Medium hergestellt in Schritt 4.4.1) aufgenommen. Visualisieren und legen Sie die Öffnung der Spitze des Pasteur-Pipette in Fokus unter dem Mikroskop, und langsam schieben die Zelle heraus. Erwarten Sie die einzelne Zelle langsam um die Spitze der Pipette erscheinen und dann bewegen in die "no-Zelle" Medium (siehe Schritt 4.8.2).
Schließlich kann kein Koloniewachstum in sekundären Kulturen von dissoziierten primären Ring / Dense Kolonien auftreten. Zur Fehlersuche, stellen Sie sicher, dass die Zellen aus dissoziierten primären Kolonien in RT gehalten werden, bevor sie in Sekundärkulturen Plattierung. Für die Kultivierung in murine ECM-Proteine, fügendie Zellen zuletzt auf das Rohr kalt Kulturmedium , das vor 18 Mischen, wodurch die Exposition der Zellen zu kalten Temperaturen zu minimieren, die die dissoziierten Zellen aus primären Kolonien erhalten töten kann. Jedoch braucht die Wieder Plattieren von Zellen in Laminin Hydrogels nicht vor 37 ° C Inkubation auf Eis durchgeführt werden (siehe Schritt 7).
Zusammenfassend zwei Methylcellulose enthaltende Kolonie - Assays verwendet wurden 10 Progenitor-ähnlichen Zellen aus der Bauchspeicheldrüsen von erwachsenen 7,11 und postnatale jungen Mäusen 9,10 sowie aus der Leber von jungen Mäusen zu charakterisieren. Zukünftige Anwendungen werden auf der Identifizierung und Charakterisierung der menschlichen koloniebildende Vorläuferzellen aus Pankreasorganen cadaveric gerichtet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Lucy Brown und Alexander Spalla aus der Analytical Cytometry Core beim City of Hope für die Unterstützung bei der Sortierung. Diese Arbeit wird teilweise durch National Institutes of Health (NIH) gewährt R01DK081587 und R01DK099734 zu HTK und U01DK089533 ADR, und von der National Science Foundation NSF Zuschuss-DMR-1206121 und California Institute for Regenerative Medicine Zuschuss RB5-07398 DAT Unterstützt unterstützt vom Joseph J. Jacobs-Institut für Molekulare Technik für Medizin an der Caltech zu DAT, und diejenigen, die aus Oxnard Foundation und Ella Fitzgerald Foundation HTK sind auch dankbar anerkannt.
Finanzierung: Diese Arbeit wird teilweise durch National Institutes of Health (NIH) unterstützt gewährt R01DK081587 und R01DK099734 zu HTK und U01DK089533 ADR, und von der National Science Foundation NSF Zuschuss-DMR-1206121 und California Institute für Regenerative Medizin an Zuschuss RB5-07398 DAT Unterstützt von der Joseph J. JacobsInstitut für Molekulare Technik für Medizin an der Caltech zu DAT, und diejenigen, die aus Oxnard Foundation und Ella Fitzgerald Foundation HTK sind auch dankbar anerkannt. Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet, die in der Analytical Cytometry Core-und Lichtmikroskopie Digital Imaging-Core unterstützt durch das National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Verleihungsnummer P30CA33572 geleistete Arbeit.
Studie Sponsor: Der Sponsor beteiligte sich nicht an der Studie Design, Sammlung, Analyse oder Interpretation der Daten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20 °C |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20 °C | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1,500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15 g/cm/sec) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50 ml Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100 mm x 20 mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20 °C |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40 μm Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 μm filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20 °C |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80 °C |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80 °C |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20 °C |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80 °C |
| Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18 G x1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16 G x 1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | ||
| PBS/BSA | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) |
||
| PBS/BSA/Dnase1 | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) Dnase 1 (2,400 Units/ml per pancreas) |
References
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