Summary
Kendini yenileme ve erişkin fare pankreas izole progenitör hücrelerin farklılaşmasını tespit etmek için in vitro koloni deneylerde icat edilir. Bu analizlerde, pankreas ataları metilselüloz içeren yan-katı bir ortam içinde 3-boyutlu bir uzayda hücre kolonileri yol açar. tek hücreler ve bireysel koloniler karakterizasyonu taşıma protokolleri açıklanmıştır.
Abstract
Kök ve yetişkin pankreas progenitör hücreler tip 1 şeker hastalığı olan hastaları tedavi etmek için terapötik bir beta-benzeri hücrelerin potansiyel bir kaynak olabilir. kök ve progenitör hücrelerin yetişkin pankreas mevcut olup olmadığını Bununla birlikte, hala bilinmemektedir. Yetişkin farelerde soy-tracing CRE-lox kullanarak araştırma stratejileri desteği ya da iki beta hücreleri kanalları, yetişkin pankreas atalarıdır bulunabilir tahmin yerden oluşturulabilir fikrini çürütmek olduğunu sonuçlar vermiştir. Bunlar, in vivo CRE-lox soy-izleme yöntemleri, ancak, kendini yenileme ve bir kök hücre tanımlamak için gerekli olan multi-soy farklılaşma iki kriter sorulara cevap veremez. Bu teknik boşluğu ele başlamak için, biz pankreas atalarıdır için 3 boyutlu koloni deneyleri tasarladı. Yakında bizim ilk yayınlanmasından sonra, diğer laboratuarlar bağımsız organoid tahlil denilen benzer, fakat özdeş değildir, yöntemi geliştirdi. organoid tahlil ile karşılaştırıldığında, bizim yöntem kullanırdüşük konsantrasyonlarda hücre dışı matris proteinlerinin dahil edilmesine izin yapışkan solüsyonlar oluşturur metilselüloz,. birçok yetişkin organı kök hücreleri için olduğu gibi metilselüloz içeren deneyler, daha kolay tespit ve progenitorlar küçük bir alt-nüfusu meydana getirdiğinde kritik olan tek hücre düzeyinde projenitör hücrelerinin analizleri izin verir. Birlikte, birkaç laboratuar sonuçları farelerden pankreatik progenitör benzeri hücrelerin in vitro kendini yenileme ve çok nesilli farklılaşmasında göstermektedir. Geçerli protokoller fare pankreas atalarıdır karakterize etmek iki metilselüloz tabanlı koloni analizler açıklanmaktadır; biri laminin hidrojel olarak bilinen murin hücre dışı matris proteinlerinin bir ticari preparatıdır ve diğer yapay hücre dışı matris protein içerir. Burada gösterilen teknikler 1) pankreas ayrışma ve CD133 + SOX9 / EGFP sıralama erişkin farelerin + duktal hücreler, s 2) tek bir hücre manipülasyon vardırorted hücreler, 3) tek bir koloni kendini yenileme veya farklılaşmasını değerlendirmek için ikincil koloni deneyleri içine mikroakışkan QRT-PCR ve tüm montaj immün ve tek hücre süspansiyonları ve yeniden kaplama içine birincil kolonilerin 4) ayrışmayı kullanarak analiz eder.
Introduction
Pankreas üç ana hücre soylarının oluşmaktadır; asiner hücreler sindirim enzimleri, kanallar patojenleri savuşturmak ve bağırsak sindirim enzimleri taşımak için müsin salgılayan salgıladıkları ve endokrin hücreleri glikoz homeostazını korumak insülin ve glukagon da dahil olmak üzere hormonlar, salgılar. Pankreasın embriyonik gelişim sırasında, erken duktal hücreler yetişkin hayvanların 1,2 pancreata üç soy sebebiyet veren yeteneğine sahip tri-güçlü progenitör hücrelerin kaynağıdır. Kemik iliği kök hücreleri olarak yetişkin kök ve progenitör hücreler, zaten başarıyla çeşitli hastalıkların 3 tedavi etmek için kullanılır, çünkü yetişkin pankreas kök ve progenitör hücreler bulmakta yoğun ilgi var. yalıtım ve yetişkin pankreas kök ve projenitör hücrelerin manipülasyonu mümkün olsaydı, bu hücrelerin insülin salgılayan hücreleri otoimmün tahrip edildiği tip 1 diyabet gibi hastalıkları tedavi etmek için kullanılabilir.
in vivo CRE-lox soy-izleme teknikleri, inada ve arkadaşları bir belirteç, karbonik anhidraz II ile etiketlenmiş erişkin fare duktal hücreler, her üç pankreas soy 4 yol olabileceğini gösterdi. Bununla birlikte, bu HNF1b 5 ve SOX9 2 gibi diğer duktal belirteçleri kullanarak, bu kanal sayısı, yetişkin farelerde p hücrelerinin önemli bir yöntem değildir sonucuna varılmıştır.
Birkaç yıl önce, biz yukarıda belirtilen tartışmanın nedeni gerekli kendini yenileme ve çok soy farklılaşma-iki kriter ölçmek için kullanılabilecek uygun analitik araçlar, bu alanda 6,7, eksikliği nedeniyle olabilir önerdi bir kök hücre tanımlamak. Söz in vivo CRE-lox soy-tracing tekniğiYukarıdaki nüfus düzeyinde progenitör-döl ilişki için kanıt sağlayabilir. Ancak, bu soy izleme tekniği tek progenitör hücrelerin kendini yenilemesi ve birden fazla soy içine ayırt edip edemeyeceğini ayırt elinden sınırlıdır. Birkaç mono-güçlü ataları, farklı bir soy potansiyeline sahip her birlikte analiz edildi, onlar topluca çok soyundan farklılaşma yeteneklerine sahip görünebilir, çünkü Tek hücre analizi önemlidir. Buna ek olarak, kök hücreler, genellikle yetişkin bir organın küçük bir gruptur. küçük bir hücre popülasyonu faaliyetleri büyük nüfus tarafından maskeli olabilir. Bu nedenle, nüfus çalışmanın bir negatif sonuç mutlaka kök hücrelerin yokluğunu göstermez. Son olarak, CRE-lox soy izleme şu anda kendini yenileme ölçümünü izin vermez.
Pankreatik progenitör hücre biyolojisi, koloninin alanında teknik boşluğu ele başlamak için 7-11 veya organoid 12-15 (Yöntemler ve Ekipmanları Tabloya bakınız) ticari bir hazırlık içerir ve diğer laminin hidrojel, tanımlanmış bir yapay ECM protein 7-11 içerir. Progenitör hücreler, yan-katı ortam içeren metilselüloz karıştırılır. Metilselüloz ağaç liflerinden hazırlanan biyolojik olarak eylemsiz ve yapışkan bir malzemedir ve rutin olarak hematopoietik koloni deneylerinde 16 kullanılmıştır. bunlar yeniden toplanamamış- böylece metilselüloz içeren yan-katı ortam bir progenitör hücrelerin hareketi kısıtlar. Bununla birlikte, ortam bir progenitör hücre büyümesi ve 3D uzayda bir hücre kolonisi ayırt izin verecek kadar yumuşaktır. hematolog geleneğini izleyerek, hücrelerin bir koloni sebebiyet veren yapabileceğini bir pankreatik progenitör hücre n olduamed pankreas koloni oluşturan birimi (PCFU). Fare ECM içeren koloni tahlilinde yetiştirilen PCFUs, "Halka" koloniler 7 adlandırılır kistik koloniler meydana getirirler. Wnt agonistinin eklenmesi üzerine, R spondin1, kemirgen ECM içeren kültürü bazı halkası koloniler "yoğun" koloniler 7 çevrilir. Bu makalede, fare ECM kültüründe yetişen koloniler bu iki tür toplu olarak "Halka / Yoğun" koloniler olarak adlandırılır. Yüzük / Yoğun koloniler tek bir hücre süspansiyonu içine ayrışmış ve laminin hidrojel ihtiva kültürlere yeniden kaplama zaman, "Endokrin / Asiner" koloniler 7 oluşturulmaktadır.
Tek bir koloni analizleri kullanarak, 9 sıçan pankreas, ya yetişkin dan (2-4 aylık) 7,11 ya da genç (1 haftalık) Yüzük / Yoğun ve Endokrin / Asiner kolonilerinin çoğunluğu, üçünü ifade olduğu tespit edilmiştir soy belirteçleri. Bu menşe PCFUs en tri-güçlü olduğunu göstermektedir. Fare ECM içeren koloni deneyde, yetişkin fare PCFUs sağlam kendini yenilemek ve kültür 7 11 hafta boyunca yaklaşık 500.000 kez genişletin. Laminin hidrojel mevcudiyetinde, sıçangil PCFUs endokrin ve asinar hücreleri içine, tercihen ayırt etmek için teşvik duktal soy 7,9,11 çok az oysa sıçangil ECM tercihan, endokrin ve asinar soyları duktal hücrelerin farklılaşmasını destekler. Önemli olarak, insülin + Glukagon - mono- hormon hücreleri laminin hidrojel kültürde üretilir ve fonksiyonel olgunlaşmasına gösteren in vitro 7,9 bölgesindeki Glükoz uyarısına karşı tepki olarak insülin salgılar edilir. 7,9 olası üç dizi farklılaşma ve bireysel PCFUs kendini yenileme 11 koloni oluşumu için oyuk başına bir hücrenin kültürlenmesini, tek hücreli mikromanipülasyon örneğin tarafından teyit edilir. Birlikte, bu sonuçlar kendini yenileyen, tri-Poten olduğunu kanıtlar sunmaktadırt, 3D kültür faaliyetleri göstermek doğum sonrası fare pankreas progenitör benzeri hücreler.
Bu makalede açıklanan sıçangil PCFU tahlilleri fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) 17 ile ayırt progenitör hücreler için tasarlanmış önceki koloni deneyi türetilir. Bu protokol başka vallahi yayında 18'de detaylı olarak belgelenmiştir. Kültür bileşenleri ve yetişkin PCFUs için, sıçan ECM içeren koloni deneyi gerçekleştirmek için gereken teknikler Mesc türetilmiş progenitörleri 17,18 ile aynıdır. Bu nedenle, testin bu yönleri burada tekrar edilmeyecektir; yerine aşağıdaki prosedürler ele alınacaktır: 1) yetişkin pankreas ayrışma ve yetişkin farelerin 7, 2) sıralanmış hücrelerin tek hücreli manipülasyon, 3) Tek koloni gelen PCFUs zenginleştirmek CD133 + SOX9 / EGFP + duktal hücreleri, sıralama mikroakışkan Mah-PCR ve tüm montaj immün ve Colonie 4) ayrışmasını kullanarak analizlertek hücre süspansiyonu ve içine s fare ECM veya laminin hidrojel koloni deneyleri içine yeniden kaplama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Açıklama: Biz kalite ve sonuçların bütünlüğünü sağlamak için araştırma yaygın olarak kabul gören etik standartlara uygun. Hayvan deneyleri Umut City Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış protokollere göre yapılır.
1. Yetişkin Fare pancreata gelen Tek hücreli Süspansiyon Hazırlamak
NOT: Önceki yayınlarda 7,11, CD-1 veya B6 arka plan fareler kullanıldı; Her iki arka benzer sonuçlar vermiştir. SOX9 loci 19,20 tarafından tahrik edilen gelişmiş yeşil floresan proteini (SOX9 / EGFP belirlenmiş) bir transjenik fare soyu, CD-1 arka oluşturuldu.
- 1-2 dakika veya solunum duruncaya kadar gaz CO 2 kullanılarak 3 ila 5 yetişkin fareler Euthanize. Sonra, her bir fare üzerinde servikal dislokasyon gerçekleştirin.
- Incelemek ve pancreata hazırlayın.
NOT: Ötenazi sonra en kısa sürede fareler parçalara ayır. Bu, pankreas otomatik sindirimi önlemek için önemlidirOtopsi değişiklikler.- makas kullanarak farenin karın duvarının orta hat üzerinde dikey bir kesi yapmak ve karın boşluğu açın. dalak bulun ve hafifçe kaldırmak için forseps kullanabilir. dalak ve makasla pankreasın dalak lob arasındaki bağ dokusu kesti.
- Pankreasın duodenum ve mide lob için bu uygulamayı tekrarlayın. (PBS / BSA olarak adlandırılan tam bir çözüm, P / S), soğuk Dulbecco tadil edilmiş fosfat tampon çözeltisi (DPBS),% 0.1 sığır serum albümini (BSA) ve penisilin ve streptomisin içeren buz üzerinde, bir Petri kutusu pankreas dokuları yerleştirin.
- ince uçlu forseps kullanarak bir diseksiyon mikroskop altında pankreastan yağ dokuları çıkarın.
Not: Bu, aşağıdaki adımları ayrışmış pankreas hücrelerinin sağlık için çok önemlidir.- (İsteğe bağlı) sağlamak için 488-509 nm uyarma kullanarak floresan stereomikroskop altında yeşil floresan için pancreata edinEGFP ifade.
- Bir doku kültürü kaputu, doku, soğuk PBS / BSA, 10 ml su ihtiva eden üç adet 100 mm Petri tabaklarda üç kez arka arkaya yıkayın.
- makas kullanarak farenin karın duvarının orta hat üzerinde dikey bir kesi yapmak ve karın boşluğu açın. dalak bulun ve hafifçe kaldırmak için forseps kullanabilir. dalak ve makasla pankreasın dalak lob arasındaki bağ dokusu kesti.
- Dokuların Küçük Adet oluşturun.
- mümkün olduğunca, PBS / BSA kaldırmak için kuru steril Petri kabı parçalara pancreata aktarın ve buz üzerinde bir kuru Petri kabı aktarın.
- 2 ul DNaz I stok solüsyonu (1.000.000 adet [MU] / ml), 1 ml PBS / BSA başına eklenerek DNase I içeren PBS / BSA hazırlayın.
Not: Bu çözüm PBS / BSA / DNaz I. biri sıralama deneyi kapsayacak olan, bir kerede bu çözümün ~ 200 ml yapın belirlenmiştir. - 2-3 dakika veya doku ince parçalar halinde olana kadar yaylı makas kullanılarak pancreata kıyma. Soğuk PBS / BSA / DNaz I 2-3 ml onları askıya Petri kabındaki doku parçaları ekleyin.
- 10 ml'lik bir pipet ile buz üzerinde bir 50 ml konik tüp doku parçaları aktarın. PBS / BS 10 ml toplam hacmi getirmekMümkün olduğunca fazla doku kurtardıktan sonra A / DNaz l.
- Çoğunlukla Tek Hücre içine Pankreas Adet sindiremez.
- Doku parçalara / 350-450 ul 10 ml kolajenaz B (100 mg / ml stok) ilave edilir ve her 3-4 dakikada dönen, 8 dakika boyunca bir su banyosu içinde 37 ° C 'de doku inkübe edin. hazırlamak ve daha sonra oda sıcaklığında 50 ml tüp duvarına aşağı doku çözümü sprey 16 ½ G iğne ile 10 ml şırınga kullanın. Bu yedi kez tekrarlayın.
NOT: hücre kümeleri break up ama hücrelerini öldürebilir üreten kabarcıkları önlemek için yeterli kuvvet kullanın. - 37 ° C'de su banyosunda tüp dönmek 8 dakika boyunca C ° ve her 3-4 dakikada döndürülerek karıştırılır. Yukarıda da belirtildiği gibi, yukarı ve yedi kez doku enjektör, ve kuru Petri tabağına doku çözeltisine bir numunesi (10 ul) yerleştirin. 10X objektif lens ile doku ters faz kontrast altında çözüm, ışık mikroskobu gözlemleyin. tek hücreler ve bazı küçük ölçekli c bekliyoruzell kümeleri mevcut olması.
- yavaşlatabilir veya kollajenaz aktivitesini durdurmak için bu noktadan buz üzerinde hücreleri tutun. Bir P1000 pipet kullanarak, soğuk PBS / BSA / DNase 5 ml, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de, soğuk PBS / BSA / DNaz I Santrifüj hücreleri kullanılarak 50 ml hacim ve tekrar süspansiyon ayarlayın.
- Doku parçalara / 350-450 ul 10 ml kolajenaz B (100 mg / ml stok) ilave edilir ve her 3-4 dakikada dönen, 8 dakika boyunca bir su banyosu içinde 37 ° C 'de doku inkübe edin. hazırlamak ve daha sonra oda sıcaklığında 50 ml tüp duvarına aşağı doku çözümü sprey 16 ½ G iğne ile 10 ml şırınga kullanın. Bu yedi kez tekrarlayın.
- Tek Hücre Cezalı ve Yıkama Verim için Filtre.
- 70 mikron naylon örgü filtre kap aracılığıyla ve daha sonra 40 mikron naylon örgü filtre fincan ile hücrelerin filtre.
- Soğuk PBS / BSA / DNaz I 5 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve hücreleri saymak.
Not: 2-4 aylık B6 ya da CD-1 fareler, her pankreas sırasıyla ~ 5 veya 10.000.000 hücre elde edilebilir. Bu numaralar farklı deneyselciler arasında değişebilir. Aşırı hücre birikme sayımı olarak bulunursa, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de 50 gibi soğuk PBS / BSA / DNaz I ml santrifüj hücreleri hacim getirmek. - 2 x 10 'lik bir konsantrasyon, hücre süspansiyonu hacmi ayarlamaGibi soğuk PBS / BSA / DNase ile 7 hücre / ml
2. Pankreas Koloni oluşturan atalarıdır zenginleştirin için Hücreleri sıralama
NOT: B6 fareler, CD133 + fakat CD133 Gönderen - hücreleri PCFUs 7,9,11 için zenginleştirilmiştir. CD133 + hücreleri tüm yolluk parametreleri 11 uygulandıktan sonra toplam ~ 13% pankreas hücreleri ayrışmış temsil etmektedir. CD-1 farelerinden, CD133 + SOX9 EGFP + hücreleri, tipik olarak, toplam pankreas hücrelerinin ~% 4 temsil eder ve bu hücre popülasyonu PCFUs 7 zenginleştirilmiştir. CD133 + SOX9 / EGFP + hücrelerin sıralama burada tarif edilir.
- Disosiye Pankreas Hücreleri Leke.
- Buz üzerinde 5 dakika boyunca 10 ug / ml nihai konsantrasyonda anti-fare CD16 / 32 ile birlikte tek bir hücre süspansiyonu inkübe edilerek spesifik olmayan azaltmak için tüm pankreas tek hücre süspansiyonu engeller.
- (50 1 x 10 6 hücre bir numuneyi çıkarın181. l), her 5-7 dakikada dönen, buz üzerinde 20 dakika süre ile, 5 ug / ml nihai konsantrasyon, izotip kontrol antikor, biyotinle konjuge edilmiş sıçan IgG1 ile leke.
- 1 x 10 6 hücre (50 ul) bir kısım çıkarın ve bir boyanmamış kontrol olarak buz üzerinde tutmak.
- Her 5-7 dakika dönen, buz üzerinde 20 dakika süre ile, 5 ug / ml nihai konsantrasyonda, bir biyotin-konjuge edilmiş anti-fare CD133 primer antikor ile hücrelerin kalan leke.
- Yıkama Hücreleri.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de PBS / BSA / Dnaz I ile 1 ml hacim ve santrifüj getirerek izotip kontrol ve primer antikor lekeli örnekleri yıkayın. Bu yıkama işlemi tekrarlayın.
- Nihai konsantrasyon 2 x 10 7 hücre / ml olacak şekilde, PBS / BSA / DNaz I izotip kontrol ve primer antikor lekeli örnekleri yeniden süspanse edin.
- 2 & # de streptavidin ile izotip kontrol ve birincil antikor lekeli örnekleri (STV) -etiketli allofikosiyanin (APC) Leke181 g / ml son konsantrasyon. Her 5-7 dakika dönen, buz üzerinde 15 dakika süreyle inkübe edin.
- hücreler ve 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama yıkama.
- Aşama 2.2 olarak, PBS / BSA / Dnaz I ile iki kez izotip kontrol ve primer antikor lekeli örnekleri yıkayın. DAPI (0.2 ug / ml nihai konsantrasyon) ile, PBS / BSA / DNaz I tekrar süspansiyon hücreleri. izotip kontrol numunesinin son hacmi 0.5 ml olmalıdır.
NOT: sıralayıcı kullanılmak üzere birincil antikor ile boyanmış numunede nihai yoğunluğu uygun olduğundan emin olun. 5 x 10 6 hücre / mL'lik bir konsantrasyonda rutin sıralamak için kullanılmaktadır. - sıralamadan önce 20 mikron örgü ile tüm hücreleri Filtre PBS / BSA / PS / DNaz I ile 0.5 ml lekesiz hücrelerin ses seviyesini ayarlama ve karanlıkta buz üzerinde hücreleri tutun.
- Aşama 2.2 olarak, PBS / BSA / Dnaz I ile iki kez izotip kontrol ve primer antikor lekeli örnekleri yıkayın. DAPI (0.2 ug / ml nihai konsantrasyon) ile, PBS / BSA / DNaz I tekrar süspansiyon hücreleri. izotip kontrol numunesinin son hacmi 0.5 ml olmalıdır.
- Hücrelerinin sıralama.
- sıralama için 80 mikron veya daha büyük meme kullanın.
NOT: Fare pankreatik endokrin hücreleri fiziksel strese yatkındır. HoWever, kemirgen PCFUs tasnifçi 7 geçerek yol açtığı stres etkilenecek görünmüyor. - sıralayıcı hücre olayları ve analiz parametrelerini elde edin. Ileri ve yan dağılım alanları için Kapısı hücreleri hücre artıkları 7 dışlamak için. ileri ve yan dağılım genişlikleri için Kapısı hücre ikilileri dışlamak için. Kapı DAPI + ölü hücreleri 7 dışlamak için. Izotop kontrol hücrelerinden değerlerine dayalı EGFP ve CD133-APC sinyaller (Şekil 1) için parametreleri yolluk seçin.
- % 5 fetal sığır serumu (FCS) ile desteklenmiş DMEM / F12 ortamında 1.5 mL içeren 5 ml polistiren tüpler içine kriteri hücreler toplanır. Santrifüj DMEM / F12 veya PBS / BSA / DNase ya küçük bir hacim içinde 5 dakika tekrar süspansiyon (yaklaşık 200 ul) boyunca 400 x g'de sıralanmış popülasyonları I% 5 FCS ile takviye edilmiştir. Buz üzerinde kullanıma kadar hücreleri tutun.
- sıralama için 80 mikron veya daha büyük meme kullanın.
- Sıralayıcı elde edilen CD133 + SOX9 EGFP + hücrelerin sayısını. al bir10 ul hücre numunesi, hücre yoğunluğu belirlemek için bir hemasitometre ile hücre sayımı ve.
NOT: sıralayıcı gelen makine sayıları genellikle güvenilmez çünkü hemasitometre kullanılması tavsiye edilir.
3. Plaka Fare ECM Proteinler İçeren Colony Testi içine kriteri Hücreler
NOT: Başka vallahi yayında 18 fare ECM içeren koloni tahlil içine hücrelerin kaplama için ayrıntılı protokoller bakınız.
- Kültür Ortamı hazırlayın.
- DMEM / F12 ortamı,% 1 (ağ / hac) metilselüloz,% 5 (h / h), murin ECM proteinleri,% 50 ihtiva eden bir kültür ortamı hazırlanır (h / h) Mesc türetilen pankreas benzeri hücrelerden şartlı ortam,% 5 (h / h) FCS, 10 mmol / L nikotinamid, 10 ng / ml insan rekombinant aktivin B 0.1 nmol / L olarak eksendin-4 ve 1 ng / ml, vasküler endotelyal büyüme faktörü-için uygun değildir. Klimalı ortam oluşturmak için Yöntemler başka bir yerde 18 detaylandırılmıştır.
- ortama RSPO'nun-1 750 ng / ml ilave edilireğer yoğun koloni oluşumu arzu edilir.
- 3 hafta boyunca CO2 37 ° C'de sıçangil ECM proteini kültür inkübe ve% 5.
1 Hücre Başına Well 4. Kültür sıralama Hücreler
NOT: Aşağıdaki prosedürler, el ve ağız pipet kullanarak tek hücre manipüle uygulanır. Alternatif bir yaklaşım, bir micromanipulator satın almaktır. Tipik bir mikromanipülatör bir joystick-işletilen motorize platformdan bir ters mikroskop içerir.
- Cam Pasteur Pipetler hazırlayın.
- Bir Bunsen beki kullanarak, ince bir noktada (açılış ~ 30 mikron) bir cam Pasteur pipet ucu dışarı çizin. cam Pasteur pipetler operatörden hava akışına karşı bir bariyer oluşturmak için bir pamuk tıpa olmalıdır.
- Sterilizasyon, 20 dakika boyunca 121 ° C 'de alevli cam Pasteur pipet Otoklav.
- Kültür, 96 oyuklu plakalar hazırlamak.
- Soğuk yarı katı kültür ortamı anlaşmasını hazırlayınDaha önce tarif edilen protokole 18 ing.
- de bir 1 ml şırınga ile / 100 ul, düşük bağlayıcı düz tabanlı 96 oyuklu plakanın iç kuyu içine orta koyun. Nem elde etmek için steril su ile dış kuyu doldurun.
- kullanılana kadar buz üzerinde kültür çanak yerleştirin.
- Sıralama Hücreleri hazırlayın.
- ~ 5 ml polistiren tüp içinde,% 10 FCS ve% 1 metilselüloz içeren DMEM / F12 / PS 2.5 ml nihai hacme, bir sıralayıcı toplanan 6000 hücreleri ekleyin. bileşenleri karıştırmak için şiddetle çalkalanır. 5 dakika boyunca veya kabarcıklar tüpün üstüne yüzen kadar bekleyin. Bu adım, buz üzerinde yapılması gerekli değildir.
- 18 ½ G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanılarak 1 mL / tabak olarak iki adet 35 mm'lik kaplara hücre çözeltisi koyun.
- nazikçe elle çanak sallanan tarafından çanak hücre çözümü yayıldı. yarı-katı ortam kuyu Cann marjı da tek hücre olarak, 35 mm çanak marjını ulaşmasına izin vermeyinot açıkça ters ışık mikroskobu kullanılarak görülebilir.
- Bir Mikroskop Çevresi Çalışma Alanı hazırlayın.
- Herhangi bir hücre içermeyen DMEM / F-12 ortamı ve% 1 metilselüloz içeren bir çözelti (no-cell ortamı) olun ve (tabak başına 1 mi), iki adet 35 mm Petri kutularına (4.3.2'de tarif edildiği gibi) çözüm dağıtmak .
- Temiz ve% 70 alkol solüsyonu ile ters faz-kontrast mikroskop etrafında çalışma alanını silin.
- Ağız Piece ile Pipet birleştirin.
- Adım 4.1 hazırlanan steril cam Pasteur pipeti seçin. cam Pasteur pipeti üstüne 1 ml plastik pipet büyük ucunu takın. Bir ince duvarlı lastik bir borusunun ucuna, ve borunun diğer ucuna ağızlığa 1 mi plastik pipet ucu küçük bir ucunu. Aynı grubun birden fazla hücre toplamak için aynı cam pipet kullanın.
- ağız emme, küçük bir hacim (~ 10 ul 50) ile hazırlayın"No-hücre" yarı-katı çözüm cam Pasteur pipeti ile adım 4.4.1 yaptı.
Not: cam Pasteur pipet dar açıklığı yarı-katı bir çözelti, akış direncine sahiptir ve hücrelerin kontaminasyon çekilecek önlemek üzere bir bariyer oluşturmaktadır.
- Tek Hücre seçin.
- Mikroskop sahnede sıralanmış hücreleri içeren 35 mm çanak yerleştirin ve kapağı çıkarın.
- Uygun bir hücre üzerinde bir 10X objektif lens ve odak kullanarak hücreleri bulmak çekilecek.
- Bul ve bir sonraki faiz hücreye pipet açılmasını yerleştirin. ağız yoluyla emme uygulanır.
NOT: Daha sonra işlemi sırasında hücre kaybetme riski yoktur, böylece hücrenin hareketi, oldukça yavaş olmalıdır. pipet açıklığı giren hücre hareketi görünür olmalıdır. debisi çok hızlı hareket ediyorsa, dar bir açıklığı olan bir pipet değiştirin.
- Bir Kültür Well içine Tek Hücre yatırın.
- Hücre pipet sonra, ağız parçasının açılmasını engelleyerek akışını durdurmak için dil kullanın. yarı-katı ortam akışı durdu emin olmak için yarı-katı ortamdan ucu çekilerek kısa bir süre önce Pause.
- Aşama 4.2'de elde 96 gözlü plaka içinde bir kuyuya pipet ucu yerleştirin. yavaşça ağız parçası haline üfleme yavaş yavaş hücre dışarı itin. Mark iyi hücre yatırılır sonra, bir kuyuya iki hücre kaplama önlemek için.
- Bir Tek Hücre Kültürü Well Yerleştirilen olduğundan emin olun.
- 'No-hücreye' orta aşama 4.4.1 hazırlanan pipet ucu yerleştirin. mikroskop altında uç açılmasını gözlemleyerek, kalan yarı katı bir çözüm dışarı itmek. hiçbir hücre pipet ucu dışarı akmasına bekliyoruz.
- çift kontrol etmek için, tek bir hücre implante edildi kültür kuyudaki yerini bulmak.
- Kadar Kültür,% 5, 37 ° C'de, tek hücreler, 23 hafta.
5. mikroakışkan QRT-PCR Analizi için yarı katı Kültür Bireysel kolonileri seçin
NOT: kaplama fare ECM içeren koloni tahlil içine CD133 + SOX9 / EGFP + hücreler sıralanmış üç hafta sonra, Halka veya yoğun koloniler 7 (Şekil 2) oluşur. Yüzük / Yoğun koloniler tek bir hücre süspansiyonu içine ayrışmış ve laminin hidrojel kültürü içine yeniden kaplama zaman, Endokrin / Asiner kolonileri yaklaşık bir hafta sonra 7 (Şekil 2) oluşturulur. Her koloninin soy bileşimini belirlemek üzere, mikro-akışkan QRT-PCR analizi soy belirteçleri 7 ekspresyonunu tespit etmek için kullanılır. Ön amplifikasyon, bir koloni TaqMan prob karışımı, reaksiyon tamponu ve SuperScript III 21 ihtiva eden bir ana karışımı içinde karıştırılır. 48.48 dizi çip sonradan mikroakışkan PCR reaksiyonları 21 kullanılır.
- Ön amplifikasyon, PCR hazırlanması48 probları içeren karıştırın.
- Pipet 1.5 ml tüp içinde her TaqMan probu (20x stok) 1.5 ul. 150 ul ses seviyesini ayarlamak için TE tamponu 78 ul ekleyin.
- Üretici 21 dan protokolleri takip ederek master karışımı hazırlayın.
- PCR için ince duvarlı reaksiyon tüpü uygun her 0.2 ml ana karışımı 9 ul yerleştirin ve en fazla 48 tüpler için bu adımı tekrarlayın.
- yarı-katı kültür tek koloniler seçin.
Not: Halka / yoğun kolonileri 50 ° ile 400 um 9,11 arasında değişen çaplara sahip, endokrin / Asiner kolonileri daha büyüktür. Bu nedenle, tek bir halka / yoğun kolonileri bir eğimli şekil içinde bir bükülmüş bir 10 ul pipet ucu ile donatılmış bir P10 pipet kullanarak toplanır. Küçük Endokrin / Asiner kolonileri (Şekil 2) toplamak için, adım 4'e bakın.- , Yüksek büyütmede (örneğin, 20X objektif lens) kapsamında ilgi bir koloni bulun büyütme azaltmak ve aspiratkoloni e. (İsteğe bağlı) koloninin görünür özelliklerini belgelemek için bu aşamada koloninin bir faz-kontrast görüntü çekin.
- ana karışımı 9 ul içeren PCR tüpüne koloni aktarın.
- Bir sonraki koloni seçin. Toplamda en fazla 45 koloni kontrolleri için 3 noktalar bırakarak, PCR çalışması başına analiz edilebilir.
- Ön amplifikasyon ile RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezi.
- kuvvetli bir şekilde termal reaksiyon gerçekleştirilmeden önce örnekleri vorteksleyin.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak 21 termal döngü reaksiyonları gerçekleştirmek. Halka / Yoğun koloniler Endokrin / Asiner kolonileri 16-20 döngüleri gerektirir ve tek hücreler 22 döngüleri gerektirir, 14 döngüleri gerektirir.
Not: Ön amplifikasyon cDNA'lar mikroakışkan PCR analizi öncesinde -20 ° C'de depolanabilir.
- Imalatçının talimatlarına 21'e göre bir mikroakışkan çip kullanan, daha sonra PCR reaksiyonları.
- Hasat kolonileri saptamak ve.
- adım 4 veya 5.4 gibi mikroskop altında koloniler Pick up ve% 4 paraformaldehid çözüm ekleyebilirsiniz. hafifçe çalkalanarak 4 ^ 'de O / N inkübe edin.
- Oda sıcaklığında 10-30 dakika boyunca iki kez 1X PBS ile koloniler yıkayın. parafin ile sızdırmaz hale 1.5 ml tüpler 4 ° C'de sabit koloniler saklayın.
- Antikorlar ile Koloni Leke.
- Bloke edici tamponun 200 ul (% 5 eşek ve / veya keçi serumu, 1 x PBS içinde% 0.1 Triton X-100) ihtiva eden açık bir tabana sahip, 96 oyuklu siyah plakanın bir oyuk transfer kolonileri. hafifçe çalkalanarak 4 ^ 'de O / N inkübe edin.
- Bloke edici tampon ile (hamster için 500, anti-Müsin 1 antikoru, örneğin, 1) önceden belirlenmiş bir konsantrasyonda birincil bir antikor ile seyreltilir. de birincil antikor 200 ul temiz koloniler aktarın ve hafifçe çalkalanarak 4 ^ 'de O / N inkübe edin. WPBS% 0.1 Tween her bir yıkama için oda sıcaklığında 10 dakika süre ile 1 x 200 ul PBS /% 0.1 Tween 20 ile yeni bir kuyuya 20 aktarma kolonileri ihtiva eden koloniler 3 kez kül.
- Bloke edici tamponu kullanılarak: önceden belirlenmiş bir konsantrasyonda (keçi anti-Ermeni hamsteri antikoru için 2,000, örneğin 1) sekonder antikoru ile seyreltilir. Karanlıkta çözüm tutun. İkincil antikor, 200 ul içeren kuyu temizleme, ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübasyona koloniler aktarın. PBS ile koloniler 3 kez yıkama /% 0.1 Tween 20, Aşama 6.2.2 gibi.
- DAPI ile karşıt-leke koloniler ve konfokal mikroskobu ile görselleştirmek.
- PBS 300 nM DAPI içeren kuyu içine koloniler transferi ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
- görselleştirme için bir 35 mm cam alt Petri kabı DAPI lekeli koloniler aktarın. Buharlaşmayı önlemek için koloniler üzerine bir kapak kayma yerleştirin.
- görüntü yakalamak için bir konfokal mikroskop kullanın. DAPI lekelenme görselleştirmek içing, 730-950 nm iki foton dalgaboyu kullanın. 519 ve 561 nm emisyon dalga boyları olan fluorochromes uyarmak için 458 nm'lik bir dalga boyuna sahip bir argon lazer kullanır. 665 nm emisyon dalga boyları olan fluorochromes uyarmak için 633 nm'lik bir dalga boyuna sahip bir helyum-neon lazer kullanır.
7. ayırmak ve yeniden plaka İkincil Colony Tahliller içine İlköğretim Yüzük / Yoğun Kolonileri
Not: tüm işlemler, steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Bu gibi soğuk PBS / BSA ile buz veya yıkama hücrelerindeki hücrelerin koyarak mümkün olduğu kadar, bu prosedürde hücreler, soğuk çarpması kaçının. Bu tür uygulamalar yeniden kaplama hücrelerin canlılığını azaltır.
- Çözümler hazırlayın.
- Ön sıcak yıkama tampon maddesi (DMEM / F12, P / S,% 0.1 BSA), bir 37 ° C su banyosu içinde.
- Ön sıcak 96 oyuklu bir plaka (düz tabanlı, düşük bağlanma), bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde. Bir ikinci bir plaka oyuk ve 100 ul% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi 100 ul% 100 FCS eklemeiyi.
- Koloni toplayın.
- Aşama 5.4 de tarif edildiği gibi, çekme ve 10 ul pipet uçları kullanılarak primer kültürlerinde 20 veya daha fazla halka / yoğun kolonileri bir toplam havuz.
- 5 dakika boyunca 400 xg'de 1.5 ml tüp ve spin sıcak (en azından RT), yıkama tamponu (~ 1,000 ul) koloniler yerleştirin. süpernatantı.
- Tripsin kullanarak tek hücre süspansiyonları içine Koloni ayırmak.
- (7.1 hazırlandı) sıcak bir tripsin solüsyonu içeren kuyuya, koloniler içeren geri kalan hacmi (20 ul ya da daha az), aktarın.
- 1.5 dakika boyunca 37 ° C inkübatör (bir su banyosu) plaka inkübe edin. plaka çıkarın ve koloniler birkaç kez pipetle. Başka bir 1.5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Plaka ve pipet yukarı kaldırın ve birkaç kez aşağı koloniler break up. koloniler tek hücre süspansiyonu içine ağırlıklı dağılmış olup olmadığını görmek için mikroskop altında kontrol edin.kolonilerin aşırı sindirimi kaçının.
- FCS Ekleyerek Tripsin Reaksiyonu durdurun.
- hücreleri içeren kuyuya sıcak FCS 100 ul aktarın. Pipet yukarı ve aşağı birkaç kez. 1000 mcL sıcak yıkama tampon içeren bir 1.5 ml tüp içine hücreleri aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
- Sıcak tamponu ile iki kez yıkanır.
- hücreler tampon veya kültür ortamının 200 ° de ul yeniden askıya.
- Bir hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını. Oda sıcaklığında hücre süspansiyonu tutun.
- Plaka tekrar murin ECM proteinlerini (% 5 hacim / hacim) veya laminin hidrojel (100 ug / ml) ya da ihtiva eden sekonder koloni deneyleri içine hücreleri ayrıştırılmış ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de hücreler inkübe edin.
Not: murin ECM proteinleri içine hücreleri yeniden kaplama için, 2-3 hafta içinde oyuk ve kültür başına 2,500-5,000 hücreleri kullanır. laminin hidrojel kültürü yeniden mesi için, 7-12 gün boyunca kuyu ve kültür başına 10,000-25,000 hücreleri kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yetişkin pankreatik progenitör hücreler, floresan aktive hücre sınıflandırma (Şekil 1) ile zenginleştirilmiş olabilir. ~ SOX9 20 75 kb yukan ve ~ 150 kb aşağı sekansları burada kullanılan SOX9 / EGFP transgenik fare hattı ilk GENSAT Beyin Atlas Proje 19 bir sonucu olarak oluşturulan ve EGFP raportör ihtiva eden bir bakteriyel yapay kromozom kontrolü altındadır . Bu farelerde, EGFP verimli ve özellikle 22 pankreas kanalları etiketler. Pankreas tedarik ve tek bir hücre süspansiyonu içine ayrıldı ve STV- APC ile konjüge edilmiş sekonder antikor ile boyanarak, ardından biotin ile konjuge edilmiş anti-CD133 antikorları ile boyanmıştır. Elde edilen hücreler, uygun bir kapılama parametreler (Şekil 1) ile akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Farklı yolluk parametreleri kullanılarak elde edilen hücreler sıralanır ve için metilselüloz içeren koloni deneyleri içine kaplama olabilirkoloni oluşumu. Daha önceki çalışmalarda, bu koloni oluşturan özelliği sadece sıralı CD133 + SOX9 / EGFP + duktal hücreler 7 bulunduğunu tespit edildi.
Ters faz-kontrast, ışık mikroskobu (Şekil 2) kullanılarak görüldüğü gibi metilselüloz içeren koloni deneyleri oluşan koloniler, kendi morfolojileri göre sınıflandırıldı. Daha sonra, bireysel koloniler gen ifadesi için mikroakışkan Mah-PCR analizi (Şekil 3) veya tarafından özenle seçilmiş ve analiz edildi protein ekspresyonu (Şekil 4) için immün tüm montaj. Yayınlanan çalışmalarda 7,9,11, pek çok tek tek koloniler bu koloniler için başlatma PCFUs çoğunluğu gösteren kanala (müsin 1), asinar (amilaz) ve endokrin (insülin) hücreleri için soy belirteçleri ifade ettikleri, tri-güçlü. Her kolonide üç hücre soylarının oranı Bununla birlikte, türleri ve metilselüloz içeren koloni deneyleri 7,9 mevcut ECM proteinleri konsantrasyonları etkilenmiştir. Murin ECM proteinleri tercihen endokrin ve asiner hücre soylarının 7,9,11 farklılaşmasını desteklenen laminin hidrojel ise PCFUs kendini yenileme ve duktal hücre farklılaşması uyarılır.
Şekil 1. Akış iki duktal hücre belirteçleri, SOX9 loci odaklı EGFP muhabiri kullanıldı içeren CD133 ve SOX9. SOX9 / EGFP transgenik farelerde göre boyama desenleri gösteren erişkin farelerin ayrışmış pankreas hücrelerinin sitometri analizi. Pankreas CD133 + SOX9 / EGFP + hücreler için bir temsilci sıralama kapısı (kırmızı kutu) gösterilir. CD133 + SOX9 / EGFP + hücreleri PCFUs 7 zenginleştirilmiştir.les / ftp_upload / 54016 / 54016fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Farklı morfolojileri ile Şekil 2. Koloniler metilselüloz içeren koloni tahlillerinde üretildi. Yüzük Temsilcisi fotomikrografı, görünür ışık ile aydınlatılmış bir faz-kontrast mikroskop Yoğun ve Endokrin / Asiner kolonileri gösterilir. Taze kriteri PCFUs 3 hafta 7 murin ECM proteinlerini kültürlenmiştir ihtiva eden kültür ortamına ekilir, zil ve yoğun kolonileri oluşturulur. Endokrin / Asiner kolonileri ~ 1 hafta 7 için bir laminin hidrojel içeren kültür ortamına ayrışmış Halkası veya Yoğun koloni hücrelerin yeniden kaplama ve kültürlü sonra oluşur. Yüzük ve yoğun koloniler için Ölçek çubukları 100 mikron =. Endo / Asiner kolonileri = 25 μ için ölçek çubuğu;. m bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Duktal, asiner ve endokrin hücreleri için belirteçleri ifade fare ECM proteinleri yetiştirilen Şekil 3. Bireysel koloniler. Bireysel Halka kolonilerin mikroakışkan QRT-PCR analizi Temsilcisi sonuçları. Her sütun tek bir koloni temsil eder. genlerin ekspresyon seviyeleri daha yüksek ifade ve düşük ifade gösterge soğuk renk göstergesi sıcak renk burada, bir ısı-haritası olarak ifade edilmiştir. tek koloniler birçok kanalı, endokrin veya asinar hücre soyunun gösterge işaretleri için her panelin genlerin en az birini ifade eder. Bu veriler, bireysel kolonilerin birçok tri-soy işaretleri ifade ve önermek olduğunu göstermektedir çoğu bumenşeli PCFUs tri-kuvvetlidirler. Bu rakam daha önce yayınlanmış şekil 7 modifiye edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. İki Halka koloniler duktal işaretleyici Musin 1 (yeşil renk) protein ifadesini gösteren bir Musin 1. Temsilcisi sonuçları Halka kolonilerin immün tüm montaj bir duktal protein işaretleyici ifade etti. çekirdekler karşı lekeli DAPI (mavi renk) ile vardır. Bu Yüzük kolonilerde birçok hücre Musin 1 proteini ifade eder. Bu murin ECM proteinlerinde yetiştirilen halka kolonileri mucin1 ve duktal hücre belirteçleri yüksek seviyelerde (Şekil 3'te daha sıcak renkler) ifade gösteren mikro-akışkan QRT-PCR sonuçları ile tutarlıdır. Ölçek çubuğu temsil50 mikron s. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil kendini yenileme ve kültür bireysel progenitör hücrelerin çok soyundan farklılaşma ölçümü için 5. Pankreas koloni deneyleri. Temsili iş akışı sunulmaktadır. Kültür ortamı, yarı katı hale geldi, bu sayede de pankreas koloni deneyleri, viskoz malzeme metilselüloz içerir. Yarı-katı ortam hareketini kısıtlar ve (kırmızı ile gösterilmiştir) bir progenitör hücrelerin toplanmasını önler. Ancak, orta tek bir progenitör hücre kendini yenilemek ve / veya farklılaştırmak ve (birden kırmızı çevreler tarafından temsil edilen) bir hücre kolonisi haline büyümeye izin verecek kadar yumuşak. Bunun tersine, tek hücreler o <, koloni-oluşturucu niteliklere sahip olmayanem> yani (mavi belirtilen) non-progenitör hücreler, tek hücre olarak kalması ya da kültürde zamanla ölür. Metilselüloz ayrıca düşük konsantrasyonlarda ECM proteinleri,% 5 gibi kemirgen ECM proteinleri ya da 100 ug / ml laminin hidrojel içermesini mümkün kılar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pankreas koloni deneyleri ve tek bir koloni burada açıklanan analizleri geçmiş yıllarda 23 hematopoetik progenitör hücrelerin biyolojisi çözmekte önemli roller oynamışlardır metilselüloz içeren hematopoetik koloni deneyleri ilham edildi. Bu analizlerde (Şekil 5), pankreas hücreleri içinde plakalanır ayrışmış metil-içeren halka, yoğun ya da endokrin / Asiner koloniler 7 oluşumunu destekleyen uygun büyüme faktörleri ve ECM proteinleri ile yarı-katı ortamı. bir hücre kolonisi ortaya verme kapasitesine sahip tek bir progenitör hücresi PCFU olarak adlandırılır. Mikroakışkan Mah-PCR ve tüm montaj immün kullanarak tek tek koloniler karakterize ederek, menşeli PCFUs soy potansiyelleri çıkarılabilir. Erişkin sıçangil PCFUs büyük bir çoğunluğu üç güçlü in vitro 7,9 duktal, asiner ve endokrin soy hücrelerinin yol verme yeteneğine sahip olduğu bulunmuştur. mur ikenine ECM proteinleri kanal soy doğru tri-güçlü PCFU farklılaşmasını teşvik laminin hidrojel sağlam endokrin ve asiner hücre soyu farklılaşması 7,9 sağlar. Tek hücre süspansiyonu ve ayrışmış edilebilir PCFUs, halka ya da bir birincil fare ECM koloni tahlil yetiştirilen yoğun koloniler in vitro kendini yenileme kapasitesini değerlendirmek için ikincil bir fare ECM koloni tahlil 7 içine yeniden kaplama. Bu PCFUs 11 hafta 7 üzerinde ~ fare ECM proteinleri 500.000 kez genişletilmiş olduğu tespit edilmiştir. kritik adımlar aşırı sindirim Kolajenazla pankreas hücrelerinin önlenmesi ve yeniden kaplama öncesi ayrışmış halkası / yoğun koloni hücrelere soğuk şok minimize parçalara pankreatasmdan yağ dokularının çıkarılmasını içerir. tek hücre mikromanipülasyon Mastering biraz zaman alabilir; sabır ve uygulama gereklidir.
2B kültür 24, s dahil olmak üzere diğer pankreatik progenitör hücre deneyleri ile karşılaştırıldığındaaşağıdaki gibi Askı "pancreasphere" 25 ve organoid deneyler 12-15, burada açıklanan metilselüloz içeren koloni testlerin önemli avantajlarıdır. İlk olarak, bir konsantrasyon yelpazesi mevcuttur ve ECM proteinlerinin ayarlama kolayca elde edilebilir. metilselüloz, yarı katı ortam içinde 3D yapısını veren bir madde olmasıdır. Bunun aksine, organoid kültür yöntemleri% 33 h / h veya daha yüksek mevcut murin ECM proteinleri, katılaşması bağlıdır. Şekilde az% 1 sıçangil ECM proteininde progenitör hücre tahlilinde ECM protein konsantrasyonu öneminin altını çizerek, endokrin hücreleri 9 farklılaşmasını inhibe olabileceği hususu not edilmelidir. İkinci olarak, koloniler eşit iyi kültür dağılmış olan ve doğru sayılabilir. Üçüncü olarak, tek koloniler kolay bir sonraki analiz için seçilmiş olabilir. Dördüncü olarak, metilselüloz-içeren yan-katı ortam, bakımı kolay olan ve herhangi bir ortaDeğişim kültür sırasında gereklidir. Son olarak hücreler, çok sayıda (24 oyuklu plaka başına 25.000 hücre) kaplanabilir ve kaplama hücreler arasında küçük bir popülasyon bile progenitör hücre faaliyetlerinin tespit edilmesi için bunları verimli hale bu koloni deneylerinde incelenmiştir.
Burada anlatılan pankreas progenitör hücre deneyleri fonksiyonel dayalı, ancak işaretini tabanlı değil, pankreatik progenitör hücrelerin analizleri. Bu pankreatik progenitör hücreleri neyi ifade belirteçleri bilmeden okudu anlamına gelir. yetişkin pankreas progenitör hücrelerin ifade edebilir ne özel belirteçler hakkında çok az bilgi olduğundan, bu önemlidir. Buna ek olarak, oluşum safhasındaki pankreatik progenitör hücreleri için markerler yetişkin progenitor hücreleri incelemek için yeterli olmayabilir. İşlevsel analizler kullanılarak, bir birinci örneğin CD133 gibi PCFU aktiviteye sahip alt popülasyonu belirlemek belirli progenitör hücre işaretçilerini tespit başlayabilir + </ sup> SOX9 / EGFP + hücreler Burada gösterilen. Bu, diferansiyel PCFU içeren nüfus tarafından ifade edilen genlerin RNA SEQ kullanılarak tanımlanması ile takip edilebilir. Aday belirteçler daha sonra test ve in vitro olarak ve projenitör hücrelerinin farklılaşma özellikler takip in vivo nesilli izleme teknikleri deneyleri ile doğrulanabilir.
In vitro olarak metilselüloz içeren koloni deneylerinin sınırlamalar üçe ayrılır. Deneyler, kültürdeki 3D uzayda pankreatik progenitör hücreleri ECM proteinlerini ve büyüme faktörlerini sağlayarak pankreas in vivo mikro-taklit da, birinci, koşullar aynı değildir. Buna ek olarak, in vivo olarak epitel hücre yapıları önemli sonuçlara yol açabilir tek hücreler içine ayrışma ile parçalanmıştır. Nedenle, in vivo olarak kullanılarak takip çalışmalarında projenitör hücreleri kontrol etmek için önemli olacaktır 18 tanımsız reaktifler içerir. Bu tanımsız bileşenler dolaylı olarak progenitör hücreleri üzerinde spesifik büyüme faktörlerinin fonksiyonlarını etkileyebilir ve daha fazla çalışma kültürü koşulları tam olarak tanımlanmış bir set oluşturmak için gereklidir. Son olarak, soy izleme deneyler, yetişkin farelerde in vivo olarak 26,27 ya da alfa hücreleri için beta hücreleri asinar-to-beta hücreleri 28 dönüşüm gösterdi. Burada açıklanan metilselüloz kültür koşulları duktus-beta hücre dönüşüm yalnızca spesifik olabilir. olmayan kanal hücreleri kültür içinde beta hücreleri dönüştürmek için, bilinmeyen başka kültür koşulları gerekli olabilir.
Sorun giderme gerekli olabilir birkaç örnekleri vardır. Çözülen hücreler kümeleştiler Örneğin, Çözeltilerin DNase daha yüksek dozlarda kullanımı. DNaz I DNA mo neden ayrışmış pankreas hücrelerinin dolaşmasını önlemek için önemlidirÖlü hücreleri tarafından yayımlanan lecules (adım 1.3.2 bakınız).
kıyılmış dokular 10 ml pipet sopa Alternatif olarak, eğer küçük parçalar halinde doku kıyma. 10 mi pipet açıklığı yeterince geniş doku parçaları kolajenaz sindirimi sonra geçmesi için olmalıdır. adet 10 ml pipet ucu takılıp alırsanız, bu yaylı makas ile doku kıyma (adım 1.3.4 bakınız) yeterli olmadığını gösterir.
Ortaya çıkabilecek bir başka sorun, ayrışmış pankreas hücrelerinin (yani, sıralanmamış hücreleri) sıçangil ECM proteinleri hiçbir koloni büyüme. Bu durumda bu Overdigestion ve hücre ölümüne neden olabileceğinden, pankreas ayrışma aşaması esnasında tek hücre içine kümelerin tüm kırmaya çalışmayın. büyük parça varsa, bir kaç (4) Kısa ve şırınga 37 ° C'de 7 kez ya da daha az bir tüp döndürür. mikroskop altında hücrelerin tekrar kontrol edin. kolajenaz B tedavisi için en uzun süre 30 dakikadır. Dkullanılan kollajenaz üzerinde epending, sindirim için en uygun zaman farklı (adım 1.4.2 bakınız) olabilir.
Buna ek olarak, kültür havuzlarına kemirgen hücre dışı matris proteinlerinin kümeleri kuluçkadan sonra gözlenebilir. Bunu önlemek için, sıçangil hücre dışı matris proteinleri ile temas kültür bileşenlerinin 37 ° C (adım 3) 'de inkübasyondan önce vaktinden önce katılaşmasını önlemek için buz üzerinde soğuk tutulur emin olun.
Buna ek olarak, bir cam Pasteur pipet içine aynı anda bir hücre çekme zor olabilir. Buna bir çözeltisi, bir hücre, diğer hücrelerden yeterli mesafeye sahip olduğundan emin olmak için, yarı-katı bir ortam içinde kaplama taze kriteri hücre yoğunluğunun azaltılmasıdır. Bu, aynı anda birden fazla hücre toplayıp önlemek olacaktır. Buna ek olarak, bu uçağa yakın elle tek hücreler almak için daha kolay bir mikro olmadan olduğu gibi, yarı-katı ortamın altına yakın mikroskop odağı yerleştirmek için iyidirmanipülatör (adım 4.6.2 bakınız).
Buna ek olarak, tek bir hücre manipülasyonu başarılı olup olmadığı açık olabilir. Bir çözüm, gerçek deneyden önce tek hücre mikromanipülasyon uygulamaktır. Hücre cam Pasteur pipet aldı sonra, hücre içermeyen,% 1 metilselüloz çözeltisi 1 ml ihtiva eden bir 35 mm Petri kabı (no-hücresi "orta aşama 4.4.1 hazırlandı) için bir hücre transfer edin. Görselleştirmek ve mikroskop altında odak Pasteur pipet ucu açılmasını yerleştirin ve yavaşça hücreyi dışarı itmek. Tek hücre yavaş yavaş pipet ucu etrafında görünür ve ardından 'no-hücreli' orta (adım 4.8.2 bakınız) içine hareket etmesini bekliyoruz.
Son olarak, hiçbir koloni üremesi ayrışmış primer halka / yoğun kolonileri ikincil kültürlerde oluşabilir. Sorun giderme için, ayrışmış birincil koloniler hücreler ikincil kültürlere kaplama önce RT tutulur emin olun. fare ECM proteinleri kültür için, eklemekböylece birincil kolonilerden elde edilen ayrışmış hücreleri öldürebilir soğuk sıcaklık hücrelerin maruziyetini en aza indirerek, 18 karıştırmadan önce soğuk kültür ortamı içeren tüp son hücreleri. Bununla birlikte, laminin hidrojel içine hücrelerinin yeniden kaplama 37 ° C inkübasyon (adım 7) önce buz üzerinde yapılması gerekli değildir.
Özetle, iki metilselüloz içeren koloni deneyleri yanı sıra genç farelerde 10 karaciğerlerinden, 7,11 yetişkin ve genç postnatal fare 9,10 pankreatasmdan progenitör benzeri hücreleri karakterize etmek için kullanılmaktadır. Gelecekteki uygulamalar kadavra pankreas organlarının insan koloni oluşturan projenitör hücrelerin tanımlanması ve karakterizasyonu de yönlendirilecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz sıralama yardım için Umut City Analitik Sitometri Çekirdek Lucy Brown ve Alexander spalla teşekkür ederiz. Bu çalışma Sağlık (NIH) National Institutes DAT Destekler için Rejeneratif Tıp hibe RB5-07398 için Ulusal Bilim Vakfı Hibe NSF-DMR-1206121 ve California Institute tarafından R01DK081587 ve R01DK099734 HTK için, ve ADR U01DK089533 ve hibe kısmen desteklenen HTK Oxnard Vakfı ve Ella Fitzgerald Vakfı Joseph J. Jacobs DAT Caltech'te Tıp Moleküler Mühendislik Enstitüsü, ve olanlardan minnetle kabul de bulunmaktadır.
Finansman: Bu çalışma Sağlık (NIH) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenen HTK için R01DK081587 ve R01DK099734 verir ve ADR U01DK089533, ve Rejeneratif Tıp hibe RB5-07398 için Ulusal Bilim Vakfı Hibe NSF-DMR-1206121 ve California Institute tarafından DAT Joseph J. Jacobs desteklerDAT Caltech'te Tıp Moleküler Mühendisliği Enstitüsü ve Oxnard'ın Vakfı ve HTK için Ella Fitzgerald Vakfı olanlar da şükranla kabul edilmektedir. Bu yayında bildirilen araştırma ödülü numarası P30CA33572 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen Analitik Sitometri Çekirdek ve Işık Mikroskopi Dijital Görüntüleme Core yapılan çalışmaları yer alıyor.
Çalışma sponsoru: Sponsor verilerinin çalışma tasarımı, toplama, analiz, ya da yorumlanması katılmadı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20 °C |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20 °C | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1,500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15 g/cm/sec) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50 ml Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100 mm x 20 mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20 °C |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40 μm Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 μm filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20 °C |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80 °C |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80 °C |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20 °C |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80 °C |
| Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18 G x1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16 G x 1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | ||
| PBS/BSA | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) |
||
| PBS/BSA/Dnase1 | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) Dnase 1 (2,400 Units/ml per pancreas) |
References
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).
- Inada, A., et al. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Fu, X., et al. MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).
- Ghazalli, N., et al. Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jin, L., et al. Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures. Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).
- Jin, L., et al. In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. 32, 2708-2721 (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Lee, J., et al. Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells. Elife. 2, e00940 (2013).
- Dorrell, C., et al. The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar. Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).
- Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice. Blood. 87, 4544-4551 (1996).
- Ku, H. T., et al. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Winkler, M., et al. A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors. J Vis Exp. , e3148 (2011).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Formeister, E. J., et al. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).
- Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide (PN) 68000088 K1. , Available from: http://www.fluidigm.com/documents (2015).
- Seymour, P. A., et al. A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation. Dev Biol. 323, 19-30 (2008).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455, 627-632 (2008).
- Baeyens, L., et al. Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice. Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).
- Thorel, F., et al. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature. 464, 1149-1154 (2010).
