Protocol
すべての実験は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）のガイドラインに従って行われました。 THY1-YFP、PLP-EGFPおよびPV-TdTomatoマウスをこれらの実験に使用したが、蛍光タンパク質を発現している任意のマウスは正常にクリアして画像化することができます。
1.組織標本
注意：パラホルムアルデヒド（PFA）とアクリルアミドが毒性と刺激物です。ドラフト内で、適切な個人用保護具（白衣、手袋、目の保護）で、これらの試薬を利用する実験を行います。
- （ - 3分〜2）呼吸が停止するまでのイソフルラン〜1ミリリットルで安楽死室で動物を生け贄に捧げます。
- （ - 10分5）血液が組織からクリアされるまで、心臓内に4℃で灌流液（ 表1）でマウスを灌流するために〜5ミリリットル/分に設定し、蠕動ポンプを使用してください。
- 固定液を灌流液を変更します（ 表1）4℃で首と尾が大幅に補強されるまで（5から10分）。
- 灌流を終了し、動物を刎ねます。慎重に最初の頭蓋骨を周囲の結合組織を除去した後、頭蓋骨の腹面から骨を除去し、20で説明したように、（ 図1a）は、脳を持ち上げて、頭蓋骨から脳を解剖します。
注：小脳の片葉小節のローブと嗅球を周囲の骨の除去に特別な注意を与えます。- 優しく脊髄と脊柱の間の微妙な、鋭いハサミの先端を挿入し、21で説明したように、離れて個々の脊柱セグメントを切断することにより脊柱から脊髄を解剖。
- プラスチックマウス脳マトリックス中に配置し、マトリクスの刃で正中線に沿って切断することにより脳を二等分します。
- 50ミリリットルの遠心分離槽を分離する各半球および脊髄を追加ヒドロゲル溶液（ 表1）~40 mlのエス。この点から前方のすべての後続のステップ中に蛍光団を保護するためにアルミホイルでチューブをカバーしています。
- 穏やかに7日間（〜30 rpm）で振とうしながら4℃でヒドロゲル中にサンプルを含むチューブをインキュベートします。
2.重合
- 遠心管にサンプルと〜ヒドロゲルの25ミリリットルを維持し、ヒドロゲルの〜25ミリリットルを廃棄します。
- キャップを外し、デシケータージャーに遠心管を配置し、真空に瓶を接続することにより、試料を脱酸素。溶液およびフォームの泡の出てくるために溶存ガスを可能にするために、少なくとも10分間真空を適用します。静かに気泡を取り除くために振ります。
- 3分 - 2を超える100％の窒素ガスでデシケータージャー内に真空を交換してください。圧力が（デシケータージャーのトップを開くことができたら）等化したら、すぐに酸素の再導入を防止するためのチューブをキャップ。
- ポリマー重合が完了するまで、3時間37℃の水浴中で試料と管を配置することによってヒドロゲルをIZE。重合ヒドロゲルは、ゲル状のコンシステンシー（ 図1b）にかかります。注意：上部の未重合ヒドロゲルの少量が許容されます。
- サンプルから過剰なヒドロゲルを切り取った後、遠心分離管から重合サンプルを除去するために、へらを使用します。
- 無料のワイプリントにサンプルを置き、静かにサンプル上の重合ヒドロゲルの薄層だけを残し、擦れ、その上に組織を圧延することにより、残りのヒドロゲルを削除します。
3.脂質除去
注：脂質クリア組織は壊れやすいので、取り扱いに注意して。チューブを排出する際にサンプルが失われないようにセルストレーナーを使用してください。また、試料は、屈折率整合プロセス中に逆転させることができる膨張が、クリア処理を通じて膨潤します。
注意：SODIUMドデシル硫酸ナトリウム（SDS）およびホウ酸が刺激されています。ドラフト内で、適切な個人用保護具（白衣、手袋、目の保護）とそれらを利用した実験を行います。
- きれいな50ミリリットルの遠心分離管に重合したサンプルを移し、緩衝液（ 表1）をクリアする45ミリリットルを追加します。穏やかに振とうしながら45℃（〜30 rpm）でインキュベートします。化学廃棄物への使用クリアリングバッファをオフに注ぐ、新鮮なクリアリングバッファの〜45ミリリットルを添加することにより、最初の7日間毎日バッファを変更します。蛍光団を保護するためにアルミホイルで覆われたサンプルを含む遠心管を保管してください。
- 3日 - 最初の7日後、すべての2〜40°Cと交換決済バッファーでサンプルをインキュベートします。すべての脂質が可溶化され、組織は透明（ 図1c）に達するまでクリアし続けます。マウス脳半球のための6週間と2 - - 脊髄のための4週間これは4になります。
- 組織がクリアされると、転送新しい50mlの遠心管に試料及び残留SDSを除去するために、24時間にわたって穏やかに振盪（約30 rpm）しながら40℃でPBST（ 表1）で4回洗浄します。
4.分子染色
注意：4 '、6-ジアミジノ-2-フェニル二塩酸塩（DAPI）は、刺激性であり、それを利用した任意の実験はドラフト内で、適切な個人用保護具（白衣、手袋、目の保護）を用いて行われるべきです。
- きれいな15mlの遠心チューブにサンプルを移し、1×PBST、pH7.5中に1μg/ mlのDAPIで埋めます。 24時間室温（RT）でインキュベートします。蛍光団を保護するためにアルミホイルで覆われたサンプルを含む遠心管を保管してください。
- 少なくとも6時間/洗浄を室温でPBSTで3回洗浄します。
5.屈折率整合
注意：SH 2,2'-チオジエタノール（TDE）は、刺激性であり、任意の実験は、それを利用しますドラフト内で、適切な個人用保護具（白衣、手袋、目の保護）を行うことがウルド。
- きれいな15ミリリットルの遠心分離管にサンプルを移し、1×PBS、pH7.5中30％（v / v）のTDEで満たします。 24時間穏やかに振とうしながら40℃（〜30 rpm）でインキュベートします。
- 1×PBS、pH7.5中63％（v / v）のTDEとの交流30％TDE。穏やかに24時間振盪しながら40℃でインキュベートします。
注：サンプルは、ほぼ元の大きさに戻って縮小します。 - 平らな、きれいな表面上のサンプルの厚さよりもわずかに大きい均一な直径を持つシリンダーに再利用可能な接着剤の一部をロールバックします。
- 40ミリメートルのガラスボトムディッシュにオープンエンド円（上部に小さな開口部を持つ〜25ミリメートル、内径）で再利用可能な接着剤シリンダーを置きます。訂正がなされる必要がある場合は、ガラスからシリンダーを取り外し、カミソリの刃で切断しました。
- によって、再利用可能な接着剤とガラスとの間にシールを作成するために、P1000のピペットチップを使用してシリンダーの外側リムの周りにそれを転がします。
- 場所〜100μlの63％のガラス皿の上にTDEと再利用可能な接着剤の円内のガラス表面を覆うように周りに広がります。
- へらを使用して、慎重に気泡を形成しないように注意しながら、円の真ん中にサンプルを配置します。
- サンプル上に直接63％TDEの別の100μLをピペットで、その後すぐに再利用可能な接着剤の上に40ミリメートルの円形のカバーガラスを配置します。
- カバーガラスが試料と接触したまでインデックス、中央、及び両手の薬指を使って、慎重に円形の周囲を押します。
- ゆっくりと、表面に支え直立位置にガラスボトムディッシュをもたらすソリューションは、上部に小さな開口部に到達するまで、ピペットを用いて63％のTDEを追加します。無料のソリューションは、ガラス上に滴下しないようにピペットチップをオフに乾燥するためにワイプ糸くずを使用してください。チャンバー内の気泡を回避するために、ピペットのすべての方法を空にすることはありません。
- に小さな開口部は、円を囲み、閉鎖チャンバーを作成するために、シリコンエラストマーを追加します。それは撮影前に乾燥するのを5分待ってください。
6.顕微鏡
注意：共焦点、単一平面照明と光シート顕微鏡で使用されるレーザーは非常に強力であり、失明を引き起こす可能性があります。レーザーを利用した任意の実験は、広範囲の訓練の後、大きな注意し、適切な眼の保護を行うべきです。
- レーザー走査共焦点顕微鏡のステージ上の内部サンプルとイメージング室を配置します。
- イメージングソフトウェアを開きます（材料の表を参照してください）。アルゴン励起レーザーをオンにするには、その後、プログラムのレーザアイコンの上部にある[設定]タブをクリックします。レーザーの電源を入れて、30％にスライドスケールを移動させるために、アルゴンの横にあるボックスをチェックします。選択された位置まで温め、ゆっくりとポインタを守ってください。
- 上部の取得]タブに戻ります。大きなボックスに「ビーム経路の設定＆＃34; /負荷に行くボックスを設定保存し、画像YFP（527 nm）のに適した波長チャネルを選択するドロップダウンメニューを選択します。
- チャネルの設定]ボックスの下：「現在のオブジェクトの目的」というラベルの付いた赤いハイパーリンクを配置することにより、イメージングのために適切な目標を選択します。タブをクリックすると、すべての利用可能な目標を開き、選択がタレットを自動的に回転します。
- 使用目的（ 例えば 、10倍）大きい作動距離（組織の厚さよりも大きいが、画像化される、 例えば11 mm）とし、大きな開口数（ 例えば 、0.3）を有する面内画像の解像度を最大にし、最小限にします光学部の厚さ。
- 1,024×1024または目的の横方向の解像度の限界に適した値に、「フォーマット」と呼ばれる、取得行列を設定するには：「解像度XY」ウィンドウのドロップダウンメニューの左の欄には、開きます。 （可能な限り低いズーム倍率を設定し、例えば 、1。7）。
- 同じウィンドウでは、それに応じて個別に標識されたメニューをドロップダウンすることにより、8ラインの平均値と1フレーム平均パラメータを設定します。高い信号対雑音比と迅速な取得のための小さな値の大きい値を使用してください。
注：8ラインの平均値と1フレームの平均は約4時間で、マウスの脳半球の高品質な画像を取得します。 - ステージコントロールを使用してサンプルを探します。代表的なフィールドが表示されたら、ゲインとオフセットを設定します。
フルオロフォア、ゲインとオフセットは、組織の種類に基づいて、実質的に変化し、および/または画像化される解剖学的特徴：注意してください。 YFPの場合、オフセット用のゲインおよび-1.0から-1.5まで、760から780に値を設定します。 - 「タイルスキャン」を選択し、関心領域の境界を選択します。 zスタックの設定上限値と下限値を取得します。目的の光学部の解像限界に基づいて、光学部の厚さを設定します。
注：目的の光学部の解像限界は、主に、その開口数によって定義されます。ほとんどの顕微鏡制御ソフトウェアが自動的に使用されている目的のために適切な値を計算します。約11ミクロンとなる0.3の開口数の10倍の対物レンズのため。 - 取得を開始します。
注：これは、複数の時間がかかることがあります。 - 関心の特定の領域から高倍率の対物レンズを使用して、より高い解像度の画像を収集します。
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Representative Results
脳の構造組織の可視化形態との接続が健康と病気で脳機能にどのような影響を与えるかを理解するために重要です。光学決済技術は、私たちが凝集的形態との接続性を研究することができ、無傷の組織における3次元の画像細胞集団にことを可能にします。
細胞の亜集団のための特異的プロモーターによって駆動される蛍光タンパク質を発現するマウスは、脳内の神経接続の複雑なパターンを離れていじめるために1つを可能にします。これらのマウスは、脳（ 図2aおよびb）は、投影大脳皮質と海馬に存在する神経細胞、ならびに他の構造体のサブセットにおいてYFPを発現するので、THY1-YFPトランスジェニックマウスは、光学的透明文献において広く使用されてきました。さらに、YFP +皮質層Vのニューロンは、s内の皮質脊髄路を通って突出しますpinalコード（ 図2c＆D）、皮質ニューロン15上の脊髄における軸索損傷および/ または損傷の影響を評価する上で、それらは非常に有用となります。共焦点顕微鏡と光学的にクリアされた組織の光学切片を使用することによって一つは簡単に大規模な解剖学的構造全体の神経細胞密度の違いを評価することができます。
THY1-YFPトランスジェニックマウスに加えて、トランスジェニックマウスの任意の数を画像化することができます。 PLP-EGFPトランスジェニックマウスは、脳および脊髄（ 図3a）全体プロテオリピドタンパク質（PLP）を発現する成熟したオリゴデンドロサイトに増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現します。 PV-TdTomatoトランスジェニックマウスは、小脳、線条体および海馬（ 図3b）における介在ニューロンを表現するパルブアルブミン（PV）のサブセットでTdTomatoを発現します。偶数例えばDなどの蛍光導入遺伝子、低分子量の蛍光色素を発現しないマウスにおけるAPIは、容易にヒドロゲル包埋組織中に拡散し、脳（ 図4）における細胞核の評価を可能にすることができます。
図1：頭蓋骨から削除されましたTHY1-YFP +マウスの脳の脳クリア写真の異なる段階 （a）です。ハイドロゲル包埋THY1-YFP +マウスの脳半球（B）の写真。脂質除去（c）の後THY1-YFP +マウス脳半球の写真。スケールバーは、各パネルの5ミリメートルである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 脳aのTHY1-YFP発現ND脊髄。大脳皮質や海馬におけるTHY1-YFP +ニューロンは、5倍の倍率で撮像し、3Dの（a）に再建。皮質層V錐体ニューロン（B）の樹状突起樹枝状分岐を示す大脳皮質の10X画像スタックの最大値投影。無傷の子宮頸部および胸部脊髄におけるTHY1-YFPの発現は5倍の倍率で撮像し、3D（c）に再構成されました。個々の軸索を示す脊髄（D）の10倍の画像スタックの最大値投影。スケールバーは1mmである（a）は、100μmの（b）は、図2（c）でミリメートル、及び（d）で100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 脳におけるPLP-EGFPおよびPV-TdTomato発現。 、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：5X倍率で撮像された無傷の大脳半球の小脳における脳 DAPI発現におけるDAPI染色 。画像は正中矢状面から約1ミリメートルです。挿入図は、10倍の倍率で、この撮像深度で見える詳細のレベルを示しています。スケールはバーメインパネルと挿入図では50μmで250μmの再。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| バッファ | 化学物質 | 最終濃度 |
| かん流液 | ||
| 10×リン酸緩衝生理食塩水 | 1倍 | |
| 硝酸ナトリウム | 0.5％w / vで | |
| ヘパリン | 10 U / mlの | |
| 固定液 | ||
| 10×リン酸緩衝生理食塩水 | 1倍 | |
| Paraformaldehyデ | 4％v / vの | |
| ヒドロゲル溶液 | ||
| 10×リン酸緩衝生理食塩水 | 1倍 | |
| パラホルムアルデヒド | 4％v / vの | |
| アクリルアミド | 4％v / vの | |
| ビス - アクリルアミド | 0.05％v / vの | |
| VA-044イニシエータ | 0.25％w / vで | |
| バッファのクリア | ||
| ホウ酸 | 200 mMの | |
| ドデシル硫酸ナトリウム | 4％w / vで | |
| PBST | ||
| 10×リン酸緩衝生理食塩水 | 1倍 | |
| トリトンX-100 | 0.1％v / vの | |
| アジ化ナトリウム | w / vの0.1％ |
表1： 緩衝液およびソリューションの一覧。
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Discussion
ハイドロゲル包埋組織（パッシブCLARITY）の受動クリアは組織の大部分をクリアするための簡単で安価な方法です。このアプローチは、専用の設備を必要とせず、容易に温度制御シェーカー中で行うことができます。数週間のスパンで、このような脳全体または脊髄などであっても大規模な、非常に有髄組織は、顕微鏡検査のために透明性と適切ななります。このレポートは、CNS組織の清算に焦点を当てているにもかかわらず、受動CLARITYは、任意の組織に適用することができます。
光学決済技術の相対的な長所と短所は、文献13,17,22で、以前に議論されてきたが、ほとんど明らかに23にレイアウトされています。受動CLARITYは、多数のサンプルが同時にクリアされ、再現性が非常に重要である実験のために適しています。組織に追加の支持を提供するために、ヒドロゲルを使用することは、Mを容易に組織のプロービングultiple。この報告書では、小分子量染料、DAPIは、実証されたが、抗体検査の複数のラウンドは、このアプローチでも可能です。
上記のアプローチは、重要ないくつかの方法で私たちの以前に発表されたプロトコル15から外れます。まず、現在のアプローチでは、試料は、心臓内ヒドロゲルで灌流しませんでした。これは、ヒドロゲルが途中で不完全な灌流と一貫性のないクリアにつながる、チューブと灌流装置の針で重合することができるという事実によるものでした。パッシブCLARITY技術（PACT）17で厚さ3mmの組織切片- 1日のインキュベーションを1に使用されているが、7日間ヒドロゲル中のパラホルムアルデヒド固定組織をインキュベートすると、元のCLARITYプロトコル14と一致しています。第二に、このアプローチは、以前15-17報告わずかに高い温度での脂質の除去を行います。高いtemperatureは、脂質の除去を加速するが、組織の完全性（融点）の壊滅的な損失の可能性に対してバランスをとらなければなりません。 3°Cで（40℃）、脂質除去プロセスの残りのために、組織のクリアを加速するが、の同時リスクなしに、次に7日間、8°C（45°Cまで）でインキュベーション温度を増加させることによって組織の完全性の喪失。この温度上昇は、元CLARITYプロトコル（50℃）14で電気泳動ティッシュクリア（ETC）の間に報告された温度と一致しています。さらに、トランスジェニック的に発現フルオロフォアもDAPI染色の減少の強度の低下が観察されませんでした。
脱酸素化は、ヒドロゲルの作成における重要なステップです。ヒドロゲルは、ヒドロゲル溶液中の溶存酸素の存在下で重合することが、私たちの手の中に重合速度および完全性は、脱酸素することなく、はるかに変動しました。時間の場合ydrogelは、最も一般的な理由は、ヒドロゲル中の酸素の存在下で、重合されません。
光クリア処理を実装する非常に簡単であるが、以下の顕微鏡検査は、非常に複雑にすることができます。非常に重要で組織を画像化するために用いられる目標です。対物レンズの作動距離は、組織サンプルに画像をすることができる深さを規定します。 2mmの作動距離対物のみ画像が試料に2mmで、したがって、対物レンズの作動距離を画像化するためにそれを完全にサンプルの厚さよりも大きくなければならないことができます。同様に、対物レンズの開口数は制限それは、面内の両方解決できるフィーチャのサイズとそれが意味深長に取得することができる光学切片の厚さを配置します。選択的平面照明顕微鏡（SPIM）と光シート顕微鏡（LSM）は、照明の性質により、光学部の厚さに制限を克服することができますが、これらのマイクロ対処は、広く利用できません。高い開口数、大きな作動距離目標は希少かつ高価であるが、大きな光学クリアセクションからの高品質の画像化のために必要です。
画像が取得された後、彼らは、LSM上に集め、高解像度画像の数TBの低解像度（面内およびz方向の両方）の画像のために数百MBに至るまで、多くの場合、非常に大きいです。画像解析のために使用されるコンピュータは、ストレージ大量のが、画像処理のためのランダムアクセスメモリ（RAM）の大量だけでなく、必要とします。大きな光学的にクリアされた画像ボリュームの分析の適切なソフトウェアパッケージはアミラ、IMARIS、およびImageJの14-16を含みます。
このアプローチの限界の中では、受動CLARITYは、他の光清算アプローチよりも組織をクリアするために多くの時間を必要とします。組織の容積を小さくすると、アクセルができ小片にそれを、それをトリミングまたはセクショニングによってクリアされますERATE脂質除去。また、ヒドロゲル中にパラホルムアルデヒドの濃度を減少させると、今度は架橋を減少し、これは大きな組織の拡大につながるかもしれませんが、個々の実験者は、それがクリアに減少する価値があることがあり、より迅速なクリアリング17につながる、ヒドロゲル細孔サイズを増やします時間。さらに、クリアリング剤としてTDEと合わせ、全体の組織の膨張量が制限されます。
この報告書は、小分子量染料の使用を記載しているが、抗体検査は非常に自然な次のステップです。ヒドロゲルの存在だけでなく、クリア組織に物理的なサポートを提供するだけでなく、深部組織への抗体の浸透のための障害となっています。アクリルアミドの濃度を減少させるか、パラホルムアルデヒドの濃度は、抗体が17を浸透促進する（したがって、加速）、ハイドロゲルの孔サイズを増加させるが、これはTISSに有害な影響を与えUE展開。それにもかかわらず、組織のブロックのプロービング抗体は、元のレポート14に記載のアクリルアミド及びパラホルムアルデヒドの濃度を使用して、数週間で日と脳全体の問題で実現することができます。
光学清算技術は1つが、その構造と機能の理解を促進、脳に深く見ることができます。これらの新しいツールは、器官のこの最も複雑なの私達の理解を増加させ、細胞および分子分解能で脳を視覚化する研究を可能にします。
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Acknowledgments
この作品は、寛大に神経疾患・脳卒中（NIH / NINDS）助成金1R01NS086981とコンラッドN.ヒルトン財団の健康/国立研究所の国立研究所によってサポートされていました。我々は、共焦点顕微鏡との貴重な援助のために博士ローランBentolila博士マシューSchiblerに感謝します。私たちは、CLARITYフォーラム（http://forum.claritytechniques.org）に寄与しているものに感謝します。我々は、特にこの魅力的な技術を教えるために、彼の研究室を開放するための博士カールDeisserothに感謝します。著者らは、脳マッピング医学研究機構、脳マッピング支援財団、ピアソン・ラブレス財団、アーマンソン財団、キャピタル・グループ会社慈善財団、ウィリアムM.とリンダR. Dietel慈善基金、およびノーススター基金からの寛大な支援に感謝してい。この刊行物で報告された研究はまた、部分的に研究資源のための国立センターと国家のディレクターのオフィスでサポートされていました受賞番号C06RR012169、C06RR015431、およびS10OD011939下の健康のアル研究所。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | buffers |
| 32% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusion and hydrogel |
| 2,2'-thiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | refractive index matching solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hydrogel |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | clearing buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | clearing buffer |
| Sodium hydroxide | Fisher | 55255-1 | buffers |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 52002-100G | preservative |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | buffers |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusion |
| Sodium nitrate | Fisher | BP360-500 | perfusion |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | nuclear stain |
| 99.9% isoflurane | Phoenix | 57319-559-06 | anesthetic |
| Hydrocholoric acid | Fisher | A1445-500 | buffers |
| Glass bottom dish | Willco | HBSB-5040 | Willco dishes |
| Reusable adhesive | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Silicon elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Lint-free wipe | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Mouse brain matrix | Roboz | SA-2175 | sectioning tissue |
| Matrix blades | Roboz | RS-9887 | sectioning tissue |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-24 | pefusion |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 | microscopy |
| Imaging software | Leica | LAS AF | microscopy |
References
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