Protocol
Alle forsøkene ble utført i samsvar med Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) retningslinjer. THY1-YFP, PLP-EGFP og PV-TdTomato mus ble anvendt for disse forsøk, men noen mus som uttrykker fluorescerende proteiner kan med hell fjernet og avbildes.
1. Tissue Forberedelse
Forsiktig: Paraformaldehyde (PFA) og akrylamid er giftige og irriterende. Utfør eksperimenter utnytte disse reagensene i en avtrekkshette og med egnet personlig verneutstyr (laboratoriefrakk, hansker og vernebriller).
- Ofre dyr i eutanasi kammer med ~ 1 ml isofluran til å puste opphører (~ 2-3 min).
- Bruk av en peristaltisk pumpe satt til ~ 5 ml / min for å intracardially perfuse musen med perfusjon oppløsning (tabell 1) ved 4 ° C inntil blodet fjernes fra vevene (5 - 10 min).
- Endre perfusate å fiksativ løsning (tabell 1)ved 4 ° C inntil halsen og hale er betydelig stivere (5 - 10 min).
- Avslutt perfusjon og halshogge dyret. Nøye dissekere ut hjernen fra skallen ved først å fjerne bindevevet som omgir skallen og deretter fjerning av ben fra baksiden av hodeskallen og løfte den ut hjernen (figur 1a), som beskrevet i 20.
Merk: Gi ekstra hensyn til fjerning av bein som omgir flocculonodular fliker av lillehjernen og olfactory pærer.- Dissekere ryggmargen fra ryggsøylen ved forsiktig å stikke spissen av en fin, skarp saks mellom ryggmargen og ryggsøylen og kutte de enkelte virvelsøylen segmenter bort, slik det er beskrevet i 21.
- Hemisect hjernen ved å plassere den i en plastisk mus hjerne matrix og kutte langs midtlinjen med en matrise blad.
- Legg hver halvkule og ryggmargen for å skille 50 ml sentrifuge badekares med ~ 40 ml hydrogel oppløsning (tabell 1). Fra dette tidspunktet dekke rørene med aluminiumsfolie for å beskytte fluorophores under alle påfølgende trinn.
- Inkuber røret inneholdende prøven i hydrogelen ved 4 ° C med forsiktig risting (~ 30 rpm) i 7 dager.
2. Polymerisasjon
- Kast ~ 25 ml hydrogel, bevare prøven og ~ 25 ml hydrogel i sentrifugerøret.
- Oksygen fra prøven ved å fjerne lokket og plassere sentrifugerøret i eksikator krukke og tilkobling av glasset til et vakuum. Påfør vakuum i minst 10 min for å tillate at oppløste gasser å komme ut av oppløsning og danner bobler. Rist for å fjerne boblene.
- Erstatte vakuumet i eksikator krukke med 100% av nitrogengass i løpet av 2 - 3 min. Så snart trykket utjevner (når toppen av eksikatoren glasset kan åpnes), raskt hetten røret for å hindre gjeninnføring av oksygen.
- polymerize hydrogelen ved å plassere røret med prøven i et 37 ° C vannbad i 3 timer inntil polymeriseringen er fullført. Polymerisert hydrogel vil ta på seg en gel-lignende konsistens (Figur 1b). Merk: En liten mengde upolymerisert hydrogel på toppen er akseptabelt.
- Bruke en spatel for å fjerne den polymeriserte prøven fra sentrifugerøret, og deretter skjære bort overflødig hydrogel fra prøven.
- Fjerne gjenværende hydrogel ved å plassere prøven på en lofri tørke og gni forsiktig og rullende vevet på den, etterlater bare et tynt lag av polymerisert hydrogel på prøven.
3. Lipoidfjerning
Merk: Lipid-ryddet vev er skjør, må behandles med forsiktighet. Bruk en celle sil ved tømming av røret for å unngå å miste prøven. Dessuten vil prøven svelle i hele clearing prosessen er imidlertid svelling kan bli reversert i løpet av brytningsindekstilpasningsprosessen.
Forsiktig: Sodium (SDS) og borsyre er irritanter. Utføre eksperimenter utnytte dem i en avtrekkshette og med egnet personlig verneutstyr (laboratoriefrakk, hansker og vernebriller).
- Overfør polymerisert prøve til et rent 50 ml sentrifugerør og tilsett 45 ml av rengjøring buffer (tabell 1). Inkuber ved 45 ° C med forsiktig risting (~ 30 rpm). Endre buffer daglig i en innledende 7 dager ved å helle av brukt clearing buffer i kjemisk avfall og legge ~ 45 ml fersk clearing buffer. Hold sentrifugerør som inneholdt prøvene dekket i aluminiumsfolie for å beskytte fluorophores.
- Etter de første 7 dager, inkubere prøven ved 40 ° C og utveksling clearing buffer hver 2 - 3 dager. Fortsett clearing til alle lipider er oppløst og vev når gjennomsiktighet (Figur 1c). Dette vil være 4 - 6 uker for en mus hjernen halvkule og 2 - 4 uker for en ryggmargen.
- Når vev er fjernet, overføreprøven til en ny 50 ml sentrifugerør og vaskes 4 ganger i PBST (tabell 1) ved 40 ° C med forsiktig risting (~ 30 opm) i løpet av 24 timer for å fjerne gjenværende SDS.
4. Molecular Farging
Forsiktig: 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) er irriterende og noen eksperimenter utnytte det bør utføres i et avtrekksskap og med egnet personlig verneutstyr (laboratoriefrakk, hansker og vernebriller).
- Overføre prøven til et rent 15 ml sentrifugerør og fylle med 1 ug / ml DAPI i 1x PBST, pH 7,5. Inkuber ved romtemperatur (RT) i 24 timer. Hold sentrifugerør som inneholdt prøvene dekket i aluminiumsfolie for å beskytte fluorophores.
- Vask 3 ganger i PBST ved romtemperatur i minst 6 timer / vask.
5. brytningsindeks Matching
Forsiktig: 2,2'-Thiodiethanol (TDE) er irriterende og noen eksperimenter utnytte det shOuld bli utført i en avtrekkshette og med egnet personlig verneutstyr (laboratoriefrakk, hansker og vernebriller).
- Overføre prøven til et rent 15 ml sentrifugerør og fyll med 30% (v / v) TDE i 1 x PBS, pH 7,5. Inkuber ved 40 ° C med forsiktig risting (~ 30 rpm) i 24 timer.
- Utveksling 30% TDE med 63% (v / v) TDE i 1 x PBS, pH 7,5. Inkuber ved 40 ° C med forsiktig risting i 24 timer.
Merk: Prøven vil krympe tilbake til omtrent opprinnelig størrelse. - På en flat, ren overflate rulle en del av gjenbrukbare klebemiddel inn i en sylinder med ensartet diameter bare litt større enn tykkelsen av prøven.
- Legg den gjenbrukbare limet sylinder i en åpen sirkel (~ 25 mm indre diameter med en liten åpning på toppen) på en 40 mm glassbunn fatet. Dersom rettelser må gjøres, fjerne sylinderen fra glass og kuttet med et barberblad.
- Bruke en P1000-pipette for å skape en tetning mellom den gjenbrukbare klebemiddel og glass avå rulle den rundt den ytre kanten av sylinderen.
- Place ~ 100 mL 63% TDE på glassfat og spredt rundt for å dekke glassflaten innenfor sirkelen av gjenbrukbare lim.
- Ved hjelp av en slikkepott, forsiktig plasser prøven i midten av sirkelen, tar seg ikke å danne bobler.
- Pipetter ytterligere 100 mL 63% TDE direkte på prøven, og deretter umiddelbart plassere en 40 mm rund dekkglass over gjenbruk limet.
- Ved hjelp av indeksen, midtre og ringfingeren på begge hendene, forsiktig trykk rundt omkretsen av sirkelen til dekselet glass har tatt kontakt med prøven.
- Sakte bringe glassbunn parabolen til oppreist stilling hviler mot en overflate, og deretter legge 63% TDE med en pipette til løsningen når den lille åpningen på toppen. Bruk en lofri tørke å tørke av pipettespissen slik at løsningen ikke drypper på glasset. For å unngå bobler i kammeret, aldri tømmes pipetten helt.
- Tilden lille åpningen, legge silikon elastomer å omslutte sirkelen og skape et lukket kammer. Vent fem minutter for den tørke før bildebehandling.
6. Mikroskopi
Forsiktig: lasere som brukes i konfokal, enkelt plan belysning og lys ark mikroskopi er svært kraftige og kan føre til blindhet. Eventuelle forsøk utnytte lasere bør utføres etter omfattende opplæring og med stor forsiktighet og egnet øyebeskyttelse.
- Plasser bilde kammer med prøven inne på scenen av en laser scanning confocal mikroskop.
- Åpne bildebehandlingsprogrammer (se tabell for material). Slik slår du på argon eksitasjon laser, klikk på fanen konfigurasjonen på toppen av programmet da laseren ikonet. Merk av i boksen ved siden av argon å drive laser og flytt glideskala til 30%. Observer peker sakte varme opp til den valgte posisjonen.
- Gå tilbake til fanen erverve på toppen. I den store boksen "strålebanen Innstillinger &# 34; gå til belastning / lagre innstillingen boksen og velg rullegardinmenyen for å velge en passende bølgelengde kanal til bilde YFP (527 nm).
- Velg riktige målene for bildebehandling ved å finne den røde hyperkobling merket "objektiv: nåværende objekt" under kanalinnstillinger boksen. Ved å klikke på fanen åpner alle tilgjengelige mål og et utvalg vil automatisk rotere turret.
- Bruk mål (f.eks., 10x) med en stor arbeidsavstand (større enn tykkelsen av det vev som skal avbildes, for eksempel 11 mm) og en stor numerisk apertur (f.eks., 0,3) for å maksimere i-plan oppløsning og minimalisere optiske delen tykkelse.
- På venstre kolonne på drop down menyer, åpne "XY: oppløsning" vinduet for å sette oppkjøpet matrise, kalt "format", til 1024 x 1024 eller en verdi som passer for lateral oppløsning grensen for målet. Sett zoomfaktoren så lavt som mulig (f.eks., En0,7).
- I det samme vinduet, satt åtte linje gjennomsnitt og en ramme gjennomsnittlig parametere ved å slippe ned individuelt merket menyer tilsvarende. Bruke store verdier for et høyt signal-til-støy-forhold og små verdier for hurtig anskaffelse.
Merk: 8 linjer gjennomsnitt og en ramme gjennomsnitt vil få høy kvalitet bilder av en mus hjernen halvkule i ca 4 timer. - Finn prøven ved hjelp av scene kontroller. Når en representant feltet er synlig, setter gain og offset.
Merk: forsterkning og offset vil variere alt vesentlig basert på den vevstype, fluoroforer, og / eller anatomiske trekk som avbildes. For YFP, sette verdier 760-780 for gevinst og fra -1,0 til -1,5 for offset. - Velg "tile scan» og markerer grensene for regionen av interesse. Still inn øvre og nedre grenser på z-stack å bli kjøpt opp. Angi tykkelsen av den optiske delen basert på målet optiske delen oppløsningsgrensen.
Merk: En objektiv soptisk seksjon oppløsning Grensen er definert hovedsakelig ved sin numerisk apertur. Mest mikroskop styreprogramvare vil automatisk beregne en verdi som er passende for formålet som brukes. For en 10X objektiv med en numerisk apertur på 0,3 som ville være omtrent 11 mikrometer. - Start oppkjøpet.
Merk: Det kan ta flere timer. - Samle bilder med høyere oppløsning ved hjelp av høyere forstørring fra bestemte områder av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Visualisering den strukturelle organiseringen av hjernen er avgjørende for å forstå hvordan morfologi og tilkobling påvirke hjernens funksjon i helse og sykdom. Optiske clearing teknikker gjør det mulig å avbilde cellepopulasjoner i 3D i intakte vev, slik at vi kan studere morfologi og tilkobling cohesively.
Mus som uttrykker fluorescerende proteiner drevet av promotorer som er spesifikke for sub-populasjoner av celler tillater en å skille fra hverandre den komplekst mønster av nevral tilkobling i hjernen. THY1-YFP transgene mus som har blitt brukt i stor utstrekning i den optiske clearing litteratur fordi disse mus uttrykker YFP i en undergruppe av projeksjons nevroner som befinner seg i den cerebrale cortex og hippocampus, så vel som andre strukturer i hjernen (figur 2a og b). Videre YFP + kortikale lag V nevroner projisere gjennom corticospinal kanalen i sPinal ledningen (Figur 2c og d), noe som gjør dem svært nyttig for å vurdere effekten av aksonal fornærmelse og / eller skade i ryggmargen på kortikale nevroner 15. Gjennom bruk av konfokal mikroskopi og optisk seksjonering av optisk ryddet vev kan man lett evaluere forskjellene i neuronal tetthet over store anatomiske strukturer.
I tillegg til THY1-YFP transgene mus, kan hvilket som helst antall av transgene mus som skal avbildes. PLP-EGFP transgene mus som uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) i modne oligodendrocytter som uttrykker proteolipid protein (PLP) i hele hjernen og ryggmargen (figur 3a). PV-TdTomato transgene mus som uttrykker TdTomato i en undergruppe av parvalbumin (PV) som uttrykker interneuroner i lillehjernen, striatum og hippocampus (figur 3b). Selv i mus som ikke uttrykker fluorescerende transgener, små molekylvekt fluorescerende fargestoffer, som for eksempel DAPI, lett kan diffundere inn i hydrogel innleiret vev og tillater evaluering av cellekjerner i hjernen (figur 4).
Figur 1:. Ulike stadier av Brain Clearing Fotografi av THY1-YFP + mus hjernen som har blitt fjernet fra kraniet (a). Fotografi av hydrogel-embedded THY1-YFP + mus hjernen halvkule (b). Fotografi av THY1-YFP + mus hjernen halvkule etter lipid fjerning (c). Skala barer er 5 mm i hvert panel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: THY1-YFP Expression in the Brain ennd ryggmargen. THY1-YFP + nevroner i hjernebarken og hippocampus avbildes på 5x forstørrelse og rekonstruert i 3D (a). En maksimal intensitet projeksjon av en 10X bilde stabel av hjernebarken demonstrere dendrittiske arborization av kortikale lag V pyramidale nevroner (b). THY1-YFP uttrykk i et intakt cervical og thorax ryggmargen avbildes på 5x forstørrelse og rekonstruert i 3D (c). En maksimal intensitet projeksjon av en 10X bildestakk i ryggmargen som viser individuelle axoner (d). Skala barer er 1 mm i (a), 100 mikrometer i (b), 2 mm i (c), og 100 mikrometer i (d). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: PLP-EGFP og PV-TdTomato Expression i hjernen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: DAPI Farging i Brain DAPI uttrykk i lillehjernen av en intakt cerebral halvkule avbildes på 5x forstørrelse.. Bildet er ca 1 mm fra midsagittal planet. Det innfelte viser detaljnivået synlig på dette avbildningsdybden på 10X forstørrelse. Scale barer enre 250 mikrometer i hovedpanelet og 50 mikrometer i innfelt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Buffer | Kjemisk | Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP |
| perfusjon løsning | ||
| 10x fosfatbufret saltvann | 1x | |
| natriumnitrat | 0,5% w / v | |
| heparin | 10 U / ml | |
| fiksativ løsning | ||
| 10x fosfatbufret saltvann | 1x | |
| Paraformaldehyde | 4% vol / vol | |
| hydrogel løsning | ||
| 10x fosfatbufret saltvann | 1x | |
| paraformaldehyde | 4% vol / vol | |
| akrylamid | 4% vol / vol | |
| Bis-akrylamid | 0,05% v / v | |
| VA-044 Initiativtaker | 0,25% w / v | |
| Clearing buffer | ||
| Borsyre | 200 mm | |
| Natriumdodecylsulfat | 4% w / v | |
| PBST | ||
| 10x fosfatbufret saltvann | 1x | |
| Triton X-100 | 0,1% volum / volum | |
| natriumazid | 0,1% w / vol |
Tabell 1: Liste over buffere og løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Passiv clearing av hydrogel innebygd vev (passiv CLARITY) er en enkel og billig metode for å fjerne store deler av vev. Denne tilnærmingen krever dedikert utstyr og kan lett utføres i et temperaturkontrollert shaker. Over span av noen uker, selv store, svært myelinerte vev, for eksempel en hel hjernen eller ryggmargen, vil bli gjennomsiktig og egnet for mikroskopi. Selv om denne rapporten har fokusert på clearing av CNS vev, kan passiv CLARITY brukes på alle vev.
De relative styrker og svakheter ved optiske clearing teknikker har vært diskutert tidligere i litteraturen 13,17,22, men er mest tydelig lagt ut i 23. Passiv klarhet er godt egnet for forsøk hvor et stort antall prøver blir fjernet samtidig og reproduserbarhet er av stor betydning. Bruken av en hydrogel for å gi ekstra støtte til vevet letter multiple sondering av vevet. I denne rapporten en liten molekylvekt fargestoff, DAPI ble påvist, men flere runder med antistoff sondering er også mulig med denne tilnærmingen.
Den tilnærmingen som er beskrevet ovenfor avviker fra vår tidligere utgitt protokoll 15 i et par vesentlige måter. For det første, i dagens tilnærming, prøvene ble ikke intracardially dynket med hydrogel. Dette skyldes det faktum at hydrogelen kan polymerisere for tidlig i produksjonsrøret og nåler av perfusjon apparat, som fører til ufullstendig perfusjoner og inkonsekvent å fjerne. Inkubering av paraformaldehyd fast vev i hydrogelen i 7 dager er i overensstemmelse med den opprinnelige CLARITY protokollen 14, skjønt en 1 dags inkubering blir brukt til 1 - 3 mm tykke vevssnitt i den passive KLARHET Teknikk (PACT) 17. For det andre utfører denne tilnærmingen lipid fjernes ved en litt høyere temperatur som tidligere er rapportert 15-17. høyere temperature akselererer fettfjerning, men må balanseres mot muligheten for et katastrofalt tap av vev integritet (smelting). Ved økning av inkubasjonstemperaturen ved 8 ° C (45 ° C) i 7 dager og deretter ved 3 ° C (40 ° C) i resten av fettfjerningsprosessen blir vev lysning akselerert, men uten den samtidige risiko for tap av vev integritet. Denne økningen i temperatur er konsistent med temperaturer rapportert under Elektro Tissue Clearing (ETC) i den opprinnelige CLARITY protokollen (50 ° C) 14. Videre har ingen minskning i intensiteten av transgent uttrykt fluoroforer og heller ikke reduksjon i DAPI farging observert.
Deoxygenation er et viktig skritt i etableringen av hydrogel. Hydrogelen kan polymerisere, i nærvær av oksygen oppløst i hydrogelen oppløsning, men i våre hender hastigheten og fullstendigheten av polymeriseringen var mye mer variabel uten deoksygenering. Dersom hydrogel ikke polymerisere, den vanligste årsaken er tilstedeværelsen av oksygen i hydrogel.
Den optiske clearing Prosessen er bemerkelsesverdig lett å implementere, imidlertid, den mikroskopi som følger kan bli ganske komplisert. Av avgjørende betydning er målene som brukes til å avbilde vev. Arbeidsavstanden for en objektiv definerer dybde at det kan bildet inn i en vevsprøve. Et objektiv med en arbeidsavstand på 2 mm kan bare bilde 2 mm inn i en prøve, og derfor arbeidsavstanden til et mål må være større enn tykkelsen av prøven for å avbilde den helt. Tilsvarende den numeriske apertur på en objektiv setter en grense på størrelse med funksjoner som det kan løse både i planet og tykkelsen av optiske deler som det kan menings tilegne seg. Selektiv Plane Illumination Mikroskopi (SPAM) og Lys Sheet Mikroskopi (LSM) kan overvinne begrensninger på optiske delen tykkelse av natur belysning, men disse mikroerCopes er ikke allment tilgjengelig. Høy numerisk apertur, store arbeidsavstand målene er sjeldne og dyre, men er nødvendig for høy bildekvalitet fra store optisk ryddet seksjoner.
Når bildene er kjøpt, de er ofte veldig store, alt fra flere hundre MB for en lav oppløsning (både i planet og z-retning) bilde til noen TB for et bilde med høy oppløsning samlet på en LSM. Datamaskiner som brukes for bildeanalyse krever ikke bare mye lagringsplass, men store mengder random access memory (RAM) for bildebehandling. Programvarepakker som er egnet for analyse av store optisk ryddet bildevolumer inkluderer Amira, Imaris, og ImageJ 14-16.
Blant de begrensningene i denne tilnærmingen, krever passiv CLARITY mer tid til å fjerne vev enn andre optiske clearing tilnærminger. Redusere volumet av vevet som skal klarert av trimming det eller seksjonering den i mindre biter kan Accelrere lipid-fjerning. Også redusere konsentrasjonen av paraformaldehyde i hydrogel vil i sin tur redusere kryssbinding og øke hydrogel pore størrelse, noe som fører til raskere clearing 17, selv om dette kan føre til større ekspansjon vev, kan enkelte forskere finner ut at det er verdt nedgang i clearing tid. Videre, kombinert med TDE som en clearingmiddel, kan mengden av samlet vev utvidelse være begrenset.
Selv om denne rapporten beskriver bruken av små molekylvekt fargestoffer, antistoff sonder er en meget naturlig neste trinn. Tilstedeværelsen av hydrogelen ikke bare gir fysisk støtte til de tømte vev, men tjener også som en hindring for inntrengning av antistoffer dypt inn i vevet. Reduksjon av akrylamid-konsentrasjon eller paraformaldehyd konsentrasjon vil øke porestørrelsen i hydrogelen, tilrettelegging (og således akselererer) antistoff penetrasjon 17, men dette har en skadelig effekt på tissue ekspansjon. Likevel kan antistoffet sondering av blokker av vev oppnås i løpet av noen dager og hele hjernen i et par uker ved hjelp av akrylamid og paraformaldehydkonsentrasjoner som er beskrevet i det opprinnelige rapporten 14.
Optiske clearing teknikker tillater en å se dypt inn i hjernen, å fremme forståelsen av dens struktur og funksjon. Disse nye verktøyene vil gjøre forskerne til å visualisere hjernen på cellulære og molekylære oppløsninger, øke vår forståelse av denne mest komplekse organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble sjenerøst støttet av National Institutes of Health / National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag (NIH / ninds) stipend 1R01NS086981 og Conrad N. Hilton Foundation. Vi takker Dr. Laurent Bentolila og Dr. Matthew Schibler for deres uvurderlige hjelp med konfokalmikroskopi. Vi takker de som har bidratt til CLARITY forumet (http://forum.claritytechniques.org). Vi vil spesielt takke Dr. Karl Deisseroth for å åpne opp sin lab for å lære denne fascinerende teknikk. Forfatterne er takknemlige for sjenerøs støtte fra Brain Mapping Medical Research Organization, Brain Mapping Support Foundation, Pierson-Lovelace Foundation, The Ahmanson Foundation, Capital Group Companies Charitable Foundation, William M. og Linda R. Dietel filantropiske fond og Northstar Fund . Forskning rapportert i denne publikasjonen ble også delvis støttet av Nasjonalt Senter for Forskningsressurser og ved kontoret til direktør for National Institutes of Health i henhold til tildelings tall C06RR012169, C06RR015431, og S10OD011939. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | buffers |
| 32% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusion and hydrogel |
| 2,2'-thiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | refractive index matching solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hydrogel |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | clearing buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | clearing buffer |
| Sodium hydroxide | Fisher | 55255-1 | buffers |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 52002-100G | preservative |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | buffers |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusion |
| Sodium nitrate | Fisher | BP360-500 | perfusion |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | nuclear stain |
| 99.9% isoflurane | Phoenix | 57319-559-06 | anesthetic |
| Hydrocholoric acid | Fisher | A1445-500 | buffers |
| Glass bottom dish | Willco | HBSB-5040 | Willco dishes |
| Reusable adhesive | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Silicon elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Lint-free wipe | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Mouse brain matrix | Roboz | SA-2175 | sectioning tissue |
| Matrix blades | Roboz | RS-9887 | sectioning tissue |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-24 | pefusion |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 | microscopy |
| Imaging software | Leica | LAS AF | microscopy |
References
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes. J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).
- MacKenzie-Graham, A., et al. A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain. J Anat. 204, 93-102 (2004).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. Neuroimage. 101, 625-632 (2014).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Sci Rep. 5, 9808 (2015).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
- Parra, S. G., et al. Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP. J Vis Exp. (67), e3848 (2012).
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. J Viz Exp. (96), e52580 (2015).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).
