Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de Institutional Animal Care en gebruik Committee (IACUC) richtlijnen. Thy1-YFP, PLP-EGFP en PV-TdTomato muizen werden gebruikt voor deze experimenten, maar alle muizen die fluorescerende eiwitten kunnen met succes worden gewist en afgebeeld.
1. Tissue Voorbereiding
Let op: paraformaldehyde (PFA) en acrylamide zijn giftig en irriterende stoffen. Voer experimenten gebruik te maken van deze reagentia in een zuurkast en met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, handschoenen en oogbescherming).
- Offer het dier euthanasie kamer met ~ 1 ml isofluraan totdat de ademhaling ophoudt (~ 2 - 3 min).
- Gebruik een peristaltische pomp ingesteld op ~ 5 ml / min intracardiaal perfuseren de muis met perfusievloeistof (tabel 1) bij 4 ° C totdat het bloed wordt geklaard uit de weefsels (5-10 min).
- Verander het perfusaat te fixatief (tabel 1)bij 4 ° C totdat de nek en de staart zijn aanzienlijk verstijfd (5-10 min).
- Beëindig de perfusie en onthoofden het dier. Ontleden voorzichtig uit de hersenen van de schedel door eerst het bindweefsel rond de schedel te verwijderen en vervolgens het verwijderen van bot uit het ventrale oppervlak van de schedel en het opheffen van de hersenen uit (figuur 1a), zoals beschreven in 20.
Let op: Geef speciale aandacht aan het verwijderen van het bot rond de flocculonodular lobben van het cerebellum en de olfactorische bollen.- Ontleden het ruggenmerg van de wervelkolom door voorzichtig de tip van een fijne, scherpe schaar tussen het ruggenmerg en de wervelkolom en het snijden van de afzonderlijke segmenten wervelkolom verwijderd, zoals beschreven in 21.
- Hemisect de hersenen door het in een plastic muizenhersenen matrix en snijden langs de middellijn met een matrix mes.
- Voeg elk halfrond en het ruggenmerg tot 50 ml scheiden centrifuge tubes met ~ 40 ml hydrogel oplossing (Tabel 1). Vanaf dit punt hebben betrekking op de buizen met aluminiumfolie om de fluoroforen beschermen tijdens alle verdere stappen.
- Incubeer de buis met het monster in hydrogel bij 4 ° C onder zacht schudden (~ 30 rpm) gedurende 7 dagen.
2. polymerisatie
- Gooi ~ 25 ml hydrogel behoud van de monster en ~ 25 ml hydrogel in de centrifugebuis.
- Deoxygenate het monster door het verwijderen van de kap en het plaatsen van de centrifugebuis in exsiccator pot en het verbinden van de pot om een vacuüm. Onder vacuüm gedurende ten minste 10 minuten om opgeloste gassen uit de oplossing toe en blaasvorming komen. Schud om de bubbels te verwijderen.
- Vervang het vacuüm in de exsiccator pot met 100% stikstof gas over 2-3 min. Wanneer de druk egaliseert (eenmaal boven de exsiccator pot kan worden geopend) snel dop op de buis naar de herinvoering van zuurstof te voorkomen.
- Polymeerize de hydrogel door het plaatsen van de buis met het monster in een 37 ° C waterbad gedurende 3 uur totdat de polymerisatie is voltooid. Gepolymeriseerde hydrogel zal een gelachtige consistentie (figuur 1b) nemen. Opmerking: Een kleine hoeveelheid gepolymeriseerde hydrogel boven aanvaardbaar.
- Gebruik een spatel om de gepolymeriseerde monster uit de centrifugebuis te verwijderen, dan weggesneden het overtollige hydrogel uit het monster.
- Verwijder het resterende hydrogel door het plaatsen van het monster op een pluisvrije wissen en zachtjes wrijven en slingeren van het weefsel op, met achterlating van slechts een dunne laag gepolymeriseerde hydrogel op het monster.
3. Lipid Removal
Opmerking:-Lipid ontruimd weefsel is breekbaar, voorzichtig behandelen. Gebruik een cel zeef bij het aftappen van de buis om te voorkomen dat monster. Ook zal de monster zwellen gedurende het zuiveringsproces echter zwelling kan worden omgekeerd tijdens de brekingsindex matching proces.
Let op: Sodium dodecylsulfaat (SDS) en boorzuur zijn irriterende stoffen. Experimenten uitvoeren met behulp van hen in een zuurkast en met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, handschoenen en oogbescherming).
- Transfer gepolymeriseerde monster een schone centrifugebuis van 50 ml en voeg 45 ml clearing buffer (Tabel 1). Incubeer bij 45 ° C onder zachtjes schudden (~ 30 rpm). Verander de buffer dagelijks voor een eerste 7 dagen door het gieten van de gebruikte clearing buffer in chemisch afval en het toevoegen van ~ 45 ml vers clearing buffer. Houd de centrifugebuizen die de betrokken in aluminiumfolie om de fluoroforen bescherming monsters.
- Na de eerste 7 dagen incuberen van het monster bij 40 ° C en uitwisseling clearing buffer per 2-3 dagen. Doorgaan clearing totdat alle vetten zijn oplosbaar en weefsel bereikt transparantie (figuur 1c). Dit zal 4-6 weken voor een muis hersenhelft en 2-4 weken voor een ruggenmerg.
- Zodra weefsel wordt gewist, de overdrachtmonster een nieuwe 50 ml centrifugebuis en was 4 keer in PBST (tabel 1) bij 40 ° C onder zacht schudden (~ 30 rpm) gedurende 24 uur om residueel SDS te verwijderen.
4. Moleculaire kleuring
Let op: 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride (DAPI) is een irriterend en geen experimenten met behulp van het moet worden uitgevoerd in een zuurkast en met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, handschoenen en oogbescherming).
- Breng het monster een schone 15 ml centrifugebuis en vul met 1 ug / ml DAPI in 1x PBST, pH 7,5. Incubeer bij kamertemperatuur (KT) gedurende 24 uur. Houd de centrifugebuizen die de betrokken in aluminiumfolie om de fluoroforen bescherming monsters.
- Was 3 keer in PBST bij KT gedurende tenminste 6 uur / was.
5. Refractive Index Matching
Let op: 2,2-thiodiethanol (TDE) is een irriterend en geen experimenten gebruik te maken van deze should worden uitgevoerd in een zuurkast en met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, handschoenen en oogbescherming).
- Breng het monster een schone 15 ml centrifugebuis en vul met 30% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. Incubeer bij 40 ° C onder zacht schudden (~ 30 rpm) gedurende 24 uur.
- Exchange 30% TDE met 63% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. Incubeer bij 40 ° C onder zacht schudden gedurende 24 uur.
Opmerking: De sample wordt weer krimpen tot ongeveer oorspronkelijke grootte. - Op een vlak, schoon oppervlak gooit stuk herbruikbare kleefstof in een cilinder met uniforme diameter net iets groter dan de dikte van het monster.
- Leg de herbruikbare kleeflaag cilinder in een open cirkel (~ 25 mm inwendige diameter met een kleine opening aan de bovenkant) op een 40 mm glazen bodem schaal. Als correcties moeten worden gemaakt, verwijdert u de cilinder van het glas en gesneden met een scheermesje.
- Gebruik een P1000 pipet tip om een afdichting tussen de herbruikbare lijm en glas te creëren doorrollen rond de buitenste rand van de cilinder.
- Plaats ~ 100 ul 63% TDE op de glazen schaal verspreid over het glasoppervlak in de cirkel van herbruikbare kleefstof omvatten.
- Met behulp van een spatel voorzichtig plaatst het monster in het midden van de cirkel, zorg niet om bellen te vormen.
- Pipet nog eens 100 ul van 63% TDE direct op het monster, dan meteen plaats een 40 mm ronde deksel glas over de herbruikbare kleeflaag.
- De index, midden en ringvinger van beide handen voorzichtig op rond de omtrek van de cirkel tot het dekglas contact met het monster gemaakt.
- Langzaam breng de glazen onderste schaal rechtop rusten tegen een oppervlak, voeg 63% TDE met een pipet totdat de oplossing de kleine opening aan de top bereikt. Gebruik een pluisvrije doekje om drogen van de pipetpunt zodat de oplossing druipt niet op het glas. Om te bellen in de kamer te vermijden, nooit leeg de pipet helemaal.
- naarde kleine opening, voeg silicium elastomeer om de cirkel omsluiten en een gesloten kamer. Wacht 5 minuten tot het droog is voor de beeldvorming.
6. Microscopie
Let op: De lasers gebruikt in confocale, enkel vlak verlichting en licht blad microscopie zijn zeer krachtig en kan blindheid veroorzaken. Elke experimenten met behulp van lasers moet worden uitgevoerd na uitgebreide training en met grote voorzichtigheid en passende oogbescherming.
- Plaats de beeldvorming kamer met het monster binnen op het stadium van een laser scanning confocale microscoop.
- Open de imaging software (zie tabel of Materials). Voor het inschakelen van de argon excitatie laser, klikt u op het tabblad configuratie aan de bovenkant van het programma op het pictogram laser. Vink het vakje aan naast argon aan het laservermogen en beweeg de schuif schaal tot 30%. Neem de aanwijzer langzaam opwarmen naar de geselecteerde positie.
- Terug naar het tabblad verwerven aan de top. In de grote doos "Beam Path Instellingen &# 34; ga naar het laden / opslaan instelling en selecteer het drop down menu om een geschikte golflengte kanaal om het YFP (527 nm) te selecteren.
- Kies passende doelstellingen voor de beeldvorming door het lokaliseren van de rode link met het label "doelstelling: huidige object" onder het vak kanaal instellingen. Door te klikken op de tab opent alle beschikbare doelstellingen en een selectie wordt automatisch roteren het torentje.
- Gebruik doelstellingen (bijv., 10X) met een grote werkafstand (groter dan de dikte van het weefsel af te beelden, bijvoorbeeld 11 mm) en een grote numerieke apertuur (bijv., 0,3) te maximaliseren in het vlak beeldresolutie minimaliseren optische sectie dikte.
- Op de linker kolom van de drop-down menu's, open de "XY: de resolutie" window acquisitie matrix ingesteld, genaamd "format", tot 1024 x 1024 of een waarde die geschikt is voor de laterale resolutie limiet van de doelstelling. Stel de zoomfactor zo laag mogelijk (bijv., 10,7).
- In hetzelfde venster, set 8 lijn gemiddelde en 1 beeld gemiddelde parameters die door de individueel gelabelde menu's dienovereenkomstig te laten vallen naar beneden. Met grote waarden voor een hoge signaal-ruisverhouding en lage waarden voor snelle acquisitie.
Opmerking: 8 lijn gemiddelden en 1 beeld gemiddelde zal afbeeldingen van hoge kwaliteit van een muis hersenhelft te verwerven in ongeveer 4 uur. - Zoek het monster met behulp van het podium controles. Zodra een vertegenwoordiger veld zichtbaar is, stellen de gain en offset.
Opmerking: De versterking en offset aanzienlijk variëren, afhankelijk van het weefseltype, fluoroforen en / of anatomische functie af te beelden. Voor YFP, ingestelde waarden 760-780 voor de winst en van -1,0 naar -1,5 voor de offset. - Selecteer "tegel scan" en selecteer de grenzen van de regio van belang. Stel de boven- en ondergrenzen van de z-stack te verwerven. Stel de dikte van de optische sectie op basis van optische gedeelte resolutie beperking van de doelstelling van.
Opmerking: Een objectieve'soptische gedeelte resolutie limiet wordt bepaald in de eerste plaats door zijn numerieke lensopening. De meeste microscoop control software berekent automatisch een waarde die geschikt is voor het doel wordt gebruikt. Een 10X objectief met een numerieke apertuur van 0,3 die ongeveer 11 urn zou zijn. - Start de overname.
Opmerking: Dit kan meerdere uren in beslag nemen. - Verzamel hogere resolutie beelden met behulp van een hogere vergroting doelstellingen van specifieke gebieden van belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Visualiseren van de structurele organisatie van de hersenen is van cruciaal belang om te begrijpen hoe de morfologie en connectiviteit beïnvloeden hersenfunctie in gezondheid en ziekte. Optische clearing technieken maken het mogelijk om de afbeelding celpopulaties in 3D in intacte weefsels, waardoor wij de morfologie en connectiviteit in samenhang te bestuderen.
Muizen die fluorescerende eiwitten tot expressie gedreven door promoters specifiek voor subpopulaties van cellen mogelijk een te plagen elkaar complexe patroon van neurale verbindingen in de hersenen. Thy1-YFP transgene muizen zijn uitgebreid gebruikt in de optische clearing literatuur omdat deze muizen brengen YFP in een subset van projectie neuronen die in de cerebrale cortex en hippocampus bevinden, en andere structuren in de hersenen (Figuur 2a en b). Bovendien YFP + corticale laag V neuronen projecteren door de corticospinal-darmkanaal in de spinal koord (figuur 2c en d), waardoor ze zeer nuttig zijn bij het evalueren van het effect van axonale belediging en / of letsel in het ruggenmerg op corticale neuronen 15. Door het gebruik van confocale microscopie en optische sectie optisch gewist weefsels kan men gemakkelijk verschillen in neuronale dichtheid over grote anatomische structuren te evalueren.
Naast Thy1-YFP transgene muizen, kan elk aantal transgene muizen worden afgebeeld. PLP-EGFP transgene muizen brengen versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) in rijpe oligodendrocyten expressie proteolipide proteïne (PLP) over de hersenen en ruggenmerg (figuur 3a). PV-TdTomato transgene muizen brengen TdTomato in een subset van parvalbumin (PV) expressie interneuronen in het cerebellum, hippocampus en striatum (Figuur 3b). Zelfs bij muizen die niet fluorescerend transgenen laag molecuulgewicht fluorescente kleurstoffen, zoals D expressAPI gemakkelijk diffunderen hydrogel ingebedde weefsels en toestaan dat de evaluatie van cellulaire kernen in de hersenen (figuur 4).
Figuur 1:. Verschillende stadia van Brain Clearing Foto van Thy1-YFP + muis hersenen die van de schedel is verwijderd (a). Foto van hydrogel ingebedde Thy1-YFP + muis hersenen halfrond (b). Foto van Thy1-YFP + muis hersenhelft na lipiden verwijdering (c). Schaal bars zijn 5 mm in elk paneel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Thy1-YFP expressie in de hersenen eennd Spinal Cord. Thy1-YFP + neuronen in de cerebrale cortex en hippocampus afgebeeld in 5x vergroting en gereconstrueerd in 3D (a). Een maximale intensiteit projectie van een 10X beeld De stapel van de cerebrale cortex het aantonen van de dendritische arborization van de corticale laag V piramidale neuronen (b). Thy1-YFP expressie in een intacte cervicale en thoracale ruggenmerg afgebeeld in 5x vergroting en gereconstrueerd in 3D (c). Een maximale intensiteit projectie van een 10X beeld De stapel van het ruggenmerg demonstreren individuele axonen (d). Schaal bars zijn 1 mm in (a), 100 urn in (b), 2 mm in (c), en 100 micrometer (d). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: PLP-EGFP en PV-TdTomato expressie in de hersenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: DAPI kleuring in de hersenen DAPI expressie in het cerebellum van een intacte hersenhelft afgebeeld bij 5x vergroting.. Het beeld is ongeveer 1 mm van het sagittale middenvlak. De inzet toont het niveau van detail zichtbaar op deze beeldvorming diepte 10x vergroting. Schaal bars opre 250 micrometer in het hoofdpaneel en 50 urn in de inzet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Buffer | Chemisch | eindconcentratie |
| perfusievloeistof | ||
| 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing | 1x | |
| Natriumnitraat | 0,5% w / v | |
| heparine | 10 U / ml | |
| fixatief oplossing | ||
| 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing | 1x | |
| Paraformaldehyde | 4% v / v | |
| hydrogel oplossing | ||
| 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing | 1x | |
| paraformaldehyde | 4% v / v | |
| acrylamide | 4% v / v | |
| Bis-acrylamide | 0,05% v / v | |
| VA-044 Initiator | 0,25% w / v | |
| clearing buffer | ||
| boorzuur | 200 mM | |
| Natriumdodecylsulfaat | 4% w / v | |
| PBST | ||
| 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing | 1x | |
| Triton X-100 | 0,1% v / v | |
| natriumazide | 0,1% w / v |
Tabel 1: Lijst van Buffers en oplossingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Passieve clearing hydrogel ingebedde weefsels (passief CLARITY) is een eenvoudige en goedkope werkwijze voor het opruimen van grote stukken weefsel. Deze benadering vereist geen speciale apparatuur en kan gemakkelijk worden uitgevoerd in een thermisch geïsoleerde shaker. Over de tijdspanne van een paar weken, zelfs grote, sterk gemyeliniseerde weefsel, zoals een gehele hersenen of het ruggenmerg, wordt transparant en geschikt voor microscopie worden. Hoewel dit verslag was gericht op het opruimen van CNS weefsels, kan passieve HELDERHEID worden toegepast op elk weefsel.
De relatieve sterktes en zwaktes van optische clearing technieken zijn eerder besproken in de literatuur 13,17,22, maar zijn het duidelijkst in 23. Passieve helderheid geschikt voor experimenten waarbij grote aantallen monsters tegelijk worden gewist en reproduceerbaarheid van groot belang. Het gebruik van een hydrogel voor extra ondersteuning aan het weefsel vergemakkelijkt multiple sonderen van het weefsel. In dit rapport een laag molecuulgewicht kleurstof, DAPI werd aangetoond, maar meerdere ronden van antilichaam sonderen zijn ook mogelijk met deze benadering.
De hierboven beschreven benadering wijkt af van onze eerder gepubliceerde protocol 15 in een paar belangrijke manieren. Enerzijds, in de huidige aanpak, de monsters werden niet intracardiaal geperfuseerd met hydrogel. Dit was te wijten aan het feit dat de hydrogel voortijdig kan polymeriseren in de slang en naalden van de perfusie inrichting leidt tot onvolledige perfusie en inconsistent clearing. Incuberen paraformaldehyde gefixeerde weefsels in hydrogel gedurende 7 dagen is met de originele CLARITY protocol 14, hoewel een 1 dag incubatie wordt 1 - 3 mm weefselsecties in de passieve CLARITY Technique (PACT) 17. Ten tweede treedt deze benadering lipide verwijderd bij een iets hogere temperatuur die eerder gerapporteerd 15-17. hogere temperatuure versnelt lipide verwijderd, maar moeten worden afgewogen tegen de mogelijkheid van een katastrofisch weefselverlies integriteit (smelten). Bij een hogere incubatietemperatuur van 8 ° C (tot 45 ° C) gedurende 7 dagen en vervolgens met 3 ° C (40 ° C) voor de rest van het lipide verwijderingsproces wordt weefsel clearing versneld, maar zonder gelijktijdige risico verlies van integriteit weefsel. Deze temperatuurverhoging is met temperaturen gerapporteerd tijdens elektroforetische Tissue Clearing (ETC) in de oorspronkelijke CLARITY protocol (50 ° C) 14. Bovendien is geen afname in de intensiteit van transgeen expressie fluoroforen of afname DAPI kleuring waargenomen.
Deoxygenation is een belangrijke stap in de verwezenlijking van de hydrogel. De hydrogel kan polymeriseren in aanwezigheid van opgeloste zuurstof in de hydrogel oplossing, maar in onze handen de snelheid en volledigheid van de polymerisatie was veel variabeler zonder deoxygenatie. Als de hydrogel niet polymeriseren, de meest voorkomende reden is de aanwezigheid van zuurstof in de hydrogel.
De optische zuiveringsproces opmerkelijk eenvoudig te implementeren, echter, de microscopie die volgt worden vrij ingewikkeld. Van cruciaal belang zijn de doelstellingen die het imago van de weefsel. De werkafstand van een objectief bepaalt dat het beeld kan de diepte in een weefselmonster. Een objectief met een werkafstand van 2 mm dienen beeld 2 mm in een monster, dus de werkafstand van een objectief moet groter zijn dan de dikte van het monster dat volledig om afbeeldingen. Ook de numerieke apertuur van een objectief plaatst een beperking van de omvang van kenmerken die het zowel in het vlak en de dikte van optische secties dat zinvol kan verwerven kan oplossen. Selectieve Plane Verlichting Microscopy (SPIM) en Light Sheet microscopie (LSM) kan de beperking van optische sectie dikte overwonnen door de aard van de verlichting, maar deze microCopes zijn niet op grote schaal beschikbaar. Hoge numerieke lensopening, grote werkafstand doelstellingen zijn zeldzaam en duur, maar noodzakelijk voor hoogwaardige beeldvorming zijn van groot optisch gewist secties.
Zodra de beelden zijn verkregen, zijn ze vaak erg groot, variërend van een paar honderd MB voor een lage resolutie (zowel in-vlak en de z-richting) de afbeelding voor een paar TB voor een hoge resolutie afbeelding verzameld op een LSM. De computers voor beeldanalyse vereist niet alleen veel opslagruimte, maar grote hoeveelheden random access memory (RAM) voor beeldverwerking. Softwarepakketten geschikt zijn van de analyse van grote optisch ontruimd image volumes omvatten Amira, Imaris en ImageJ 14-16.
Onder de beperkingen van deze aanpak, passieve DUIDELIJKHEID vergt meer tijd om weefsels dan andere optische clearing benaderingen te wissen. Het verminderen van de omvang van het weefsel worden verwijderd door bijsnijden of snijden in kleinere stukken kan accelerate lipide-verwijdering. Ook het verminderen van de concentratie van paraformaldehyde in de hydrogel zal op zijn beurt afname verknoping en verhoging van de hydrogel poriegrootte, wat leidt tot snellere clearing 17, maar dit kan leiden tot meer weefselexpansie kunnen individuele onderzoekers vinden dat het de afname clearing waard tijd. Verder combinatie met TDE als klaringsmiddel, de hoeveelheid totale weefselexpansie kunnen beperkt zijn.
Hoewel dit rapport beschrijft het gebruik van kleine gewicht kleurstoffen moleculair, antilichaam indringende is een heel natuurlijke volgende stap. De aanwezigheid van de hydrogel zorgt niet alleen fysieke ondersteuning aan de weefsels opgeruimd, maar dient ook als een belemmering voor de penetratie van antilichamen diep in het weefsel. Het verminderen van de concentratie acrylamide of paraformaldehyde concentratie de poriegrootte van de hydrogel te verhogen, vergemakkelijkt (en dus versnelling) antilichaam penetratie 17, maar dit heeft een nadelig effect op tissUE expansie. Niettemin kan antilichaam sonderen blokken weefsel worden bereikt in een paar dagen en gehele hersenen binnen enkele weken met de acrylamide en paraformaldehyde concentraties in het oorspronkelijke rapport 14 beschreven.
Optische clearing technieken mogelijk maken om diep in de hersenen, het bevorderen van het begrip van de structuur en functie. Deze nieuwe instrumenten zullen de onderzoekers in staat stellen om de hersenen op cellulair en moleculair resoluties te visualiseren, het vergroten van ons begrip van deze meest complexe organen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd mede mogelijk gemaakt door de National Institutes of Health / Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (NIH / NINDS) subsidie 1R01NS086981 en de Conrad N. Hilton Foundation. Wij danken Dr. Laurent Bentolila en Dr. Matthew Schibler voor hun waardevolle hulp bij confocale microscopie. Wij danken degenen die hebben bijgedragen aan de DUIDELIJKHEID forum (http://forum.claritytechniques.org). We hebben vooral danken dr Karl Deisseroth voor het openen van zijn lab om deze fascinerende techniek te leren. De auteurs zijn dankbaar voor de genereuze steun van de Brain Mapping Medical Research Organization, Brain Mapping Ondersteuning Foundation, Pierson-Lovelace Foundation, The Ahmanson Foundation Capital Group Companies Charitable Foundation, William M. en Linda R. Dietel Mecenaatsfonds, en Northstar Fund . Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ook gedeeltelijk ondersteund door het National Center for Research Resources en door het Bureau van de directeur van de Natieal Institutes of Health onder award nummers C06RR012169, C06RR015431 en S10OD011939. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | buffers |
| 32% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusion and hydrogel |
| 2,2'-thiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | refractive index matching solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hydrogel |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | clearing buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | clearing buffer |
| Sodium hydroxide | Fisher | 55255-1 | buffers |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 52002-100G | preservative |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | buffers |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusion |
| Sodium nitrate | Fisher | BP360-500 | perfusion |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | nuclear stain |
| 99.9% isoflurane | Phoenix | 57319-559-06 | anesthetic |
| Hydrocholoric acid | Fisher | A1445-500 | buffers |
| Glass bottom dish | Willco | HBSB-5040 | Willco dishes |
| Reusable adhesive | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Silicon elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Lint-free wipe | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Mouse brain matrix | Roboz | SA-2175 | sectioning tissue |
| Matrix blades | Roboz | RS-9887 | sectioning tissue |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-24 | pefusion |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 | microscopy |
| Imaging software | Leica | LAS AF | microscopy |
References
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes. J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).
- MacKenzie-Graham, A., et al. A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain. J Anat. 204, 93-102 (2004).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. Neuroimage. 101, 625-632 (2014).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Sci Rep. 5, 9808 (2015).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
- Parra, S. G., et al. Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP. J Vis Exp. (67), e3848 (2012).
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. J Viz Exp. (96), e52580 (2015).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).
