Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Richtlinien durchgeführt. THY1-YFP, PLP-EGFP und PV-tdTomato Mäuse wurden für diese Experimente verwendet, aber alle Mäuse fluoreszierende Proteine exprimieren erfolgreich gelöscht werden kann und abgebildet.
1. Gewebepräparation
Achtung: Paraformaldehyd (PFA) und Acrylamid sind giftig und Reizstoffe. Führen Sie Experimente diese Reagenzien in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung verwendet (Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille).
- Sacrifice das Tier in Euthanasie Kammer mit ~ 1 ml Isofluran, bis die Atmung aufhört (~ 2 - 3 min).
- Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe auf ~ 5 ml / min bis intrakardial perfuse die Maus mit Perfusionslösung (Tabelle 1) bei 4 ° C , bis das Blut aus den Geweben gelöscht (5 - 10 min).
- Ändern Sie den Perfusat zu Fixierungslösung (Tabelle 1)bei 4 ° C bis zur Ausschöpfung der Hals und Schwanz deutlich versteift (5 - 10 min).
- Beenden Sie die Perfusion und köpfen das Tier. Sezieren vorsichtig heraus das Gehirn aus dem Schädel , indem zuerst das Bindegewebe Entfernen des Schädels umgibt und dann Knochen von der ventralen Oberfläche des Schädels zu entfernen und das Gehirn heraus (Abbildung 1a) anheben, wie in 20 beschrieben.
Hinweis: Geben Sie die Entfernung von Knochen besondere Sorgfalt flocculonodularis Lappen des Kleinhirns umgibt und die Riechkolben.- Präparieren Sie das Rückenmark aus der Wirbelsäule durch sanft mit der Spitze eines feinen, scharfen Schere zwischen dem Rückenmark und der Wirbelsäule einsetzen und die einzelnen Wirbelsäulensegmenten weg schneiden, wie in 21 beschrieben.
- Hemisect das Gehirn, indem es in einer Kunststoffmatrix Mausgehirn Plazieren und mit einer Matrix Klinge entlang der Mittellinie schneiden.
- Fügen Sie jede Hemisphäre und Rückenmark zu trennen 50 ml Zentrifugen Wannees mit ~ 40 ml Hydrogel - Lösung (Tabelle 1). Von diesem Punkt an Abdeckung die Rohre mit einer Aluminiumfolie, die Fluorophore bei allen nachfolgenden Schritten zu schützen.
- Inkubiere das Rohr die Probe in Hydrogel bei 4 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 rpm) für 7 Tage enthält.
2. Polymerisation
- Verwerfen ~ 25 ml Hydrogel, Konservieren der Probe und ~ 25 ml Hydrogel in dem Zentrifugenröhrchen.
- Desoxygenieren die Probe durch Entfernen der Kappe und das Zentrifugenröhrchen in Exsikkator Glas platzieren und das Glas auf ein Vakuum zu verbinden. Gelten das Vakuum für mindestens 10 min gelösten Gasen zu ermöglichen, aus der Lösung und Blasen bilden zu kommen. Schütteln Sie die Luftblasen zu entfernen.
- Ersetzen Sie das Vakuum im Exsikkator Glas mit 100% Stickstoffgas über 2 - 3 min. Sobald der Druck ausgleicht (einmal die Spitze des Exsikkator Glas geöffnet werden kann), die Kappe schnell das Rohr die Wiedereinführung von Sauerstoff zu verhindern.
- Polymerize das Hydrogel durch das Rohr mit Probenabgabe in einem 37 ° C Wasserbad für 3 Stunden, bis die Polymerisation abgeschlossen ist. Polymerisierte Hydrogel nimmt auf einer gelartigen Konsistenz (Abbildung 1b). Hinweis: Eine geringe Menge an nicht-polymerisierten Hydrogels am oberen akzeptabel ist.
- Verwenden Sie einen Spachtel, um den polymerisierten Probe aus dem Zentrifugenröhrchen zu entfernen, dann schneiden Sie das überschüssige Hydrogel aus der Probe entfernt.
- Entfernen Sie die verbleibenden Hydrogel, das durch die Probe auf einem fusselfreien platzieren frei wischen und sanftes Reiben und Rollen des Gewebes auf sie, nur hinter einer dünnen Schicht aus polymerisiertem Hydrogel auf die Probe zu verlassen.
3. Lipidentfernung
Hinweis: Lipid-frei Gewebe zerbrechlich ist, mit Vorsicht handhaben. Verwenden Sie eine Zelle Sieb, wenn das Rohr Ablassen verlieren Probe zu vermeiden. Außerdem quellen die Probe während des gesamten Löschvorgang jedoch Quellung während der Brechungsindex-Anpassungsprozeß umgekehrt werden.
Achtung: Sodium Dodecylsulfat (SDS) und Borsäure sind reizend. Führen Sie Experimente, um diese in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Kittel, Handschuhe und Schutzbrille) verwendet wird.
- Übertragen polymerisierten Probe in ein sauberes 50 - ml - Zentrifugenröhrchen eingewogen und 45 ml Clearing - Puffer (Tabelle 1). Inkubieren bei 45 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 rpm). Ändern Sie den Puffer täglich für zunächst 7 Tage um die verbrauchte Clearing-Puffer in chemische Abfälle Abgießen und Zugabe von ~ 45 ml frischem Clearing-Puffer. Halten Sie die Zentrifugenröhrchen, die die in Aluminiumfolie abgedeckt Proben, um die Fluorophore zu schützen.
- Nach den ersten 7 Tagen Inkubation der Probe bei 40 ° C und Austausch Clearing Puffer alle 2 - 3 Tage. Weiter Lichtung , bis alle Lipide löslich gemacht sind und Gewebe erreicht Transparenz (Abbildung 1c). Dies wird 4 - 6 Wochen für eine Maus Gehirnhemisphäre und 2 - 4 Wochen für eine Rückenmark.
- Sobald Gewebe gelöscht ist, übertragenProbe auf eine neue 50 ml - Zentrifugenröhrchen und wasche 4 Mal in PBST (Tabelle 1) bei 40 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 min) über 24 h Rest SDS zu entfernen.
4. Molekulare Färbung
Achtung: 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI) ist ein Reizmittel und alle Experimente unter Verwendung sollte es in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Kittel, Handschuhe und Augenschutz) durchgeführt werden.
- Übertragen Sie die Probe in einen sauberen 15 ml Zentrifugenröhrchen geben und mit 1 ug / ml DAPI in 1x PBST, pH-Wert 7,5. Inkubieren bei Raumtemperatur (RT) für 24 Std. Halten Sie die Zentrifugenröhrchen, die die in Aluminiumfolie abgedeckt Proben, um die Fluorophore zu schützen.
- 3 x waschen in PBST bei RT für mindestens 6 h / Wäsche.
5. Anpassung des Brechungsindex
Achtung: 2,2'-Thiodiethanols (TDE) ist ein Reizmittel und alle Experimente verwendet es shOuld in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Kittel, Handschuhe und Augenschutz) durchgeführt werden.
- Übertragen, um die Probe in einen sauberen 15 ml-Zentrifugenröhrchen geben und mit 30% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. Inkubieren bei 40 ° C unter leichtem Schütteln (~ 30 Upm) für 24 Std.
- Austausch von 30% TDE mit 63% (v / v) TDE in 1x PBS, pH 7,5. bei 40 ° C inkubieren unter leichtem Schütteln 24 Stunden.
Hinweis: Die Probe wird schrumpfen zurück auf etwa Originalgröße. - Auf einem flachen, saubere Oberfläche ein Stück wiederverwendbarer Klebstoff in einen Zylinder mit einheitlichem Durchmesser rollen nur geringfügig größer als die Dicke der Probe.
- Legen Sie den wieder verwendbaren Klebstoffzylinder in einem offenen Kreis (~ 25 mm Innendurchmesser mit einer kleinen Öffnung an der Spitze) auf einem 40 mm Glasbodenschale. Wenn Korrekturen vorgenommen werden müssen, entfernen Sie den Zylinder aus dem Glas und schnitt mit einer Rasierklinge.
- Verwenden Sie Spitze eine p1000 Pipette eine Dichtung zwischen dem wieder verwendbaren Klebstoff und Glas zu schaffen, indemes um den äußeren Rand des Zylinders rollen.
- Platz ~ 100 & mgr; l 63% TDE auf die Glasschale und verteilen um die Glasoberfläche innerhalb des Kreises von wieder verwendbaren Klebstoff zu bedecken.
- Mit einem Spatel, legen Sie sorgfältig die Probe in der Mitte des Kreises, kümmert sich nicht um Blasen zu bilden.
- Pipettieren weitere 100 & mgr; l von 63% TDE direkt auf die Probe, dann sofort legen Sie eine 40 mm Kreisdeckglas über den wieder verwendbaren Klebstoff.
- Mit dem Zeige-, Mittel- und Ringfinger beider Hände, drücken Sie vorsichtig um den Umfang des Kreises, bis das Deckglas Kontakt mit der Probe gemacht hat.
- Langsam bringen die Glasbodenschale in eine aufrechte Position gegen eine Fläche ruht, dann fügen Sie 63% TDE mit einer Pipette, bis die Lösung die kleine Öffnung am oberen Ende erreicht. Mit einem fusselfreien wischen Sie die Pipettenspitze zu trocknen, so dass die Lösung nicht auf das Glas tropft. Zur Vermeidung von Blasen in der Kammer, leeren Sie nie die Pipette den ganzen Weg.
- Nachdie kleine Öffnung, fügen Silikonelastomer den Kreis und schaffen eine geschlossene Kammer zu umschließen. Warten Sie 5 Minuten für sie vor der Abbildung, um zu trocknen.
6. Mikroskopie
Achtung: Die Laser in der konfokalen, Ebene Beleuchtung und Lichtbogen-Mikroskopie verwendet werden, sind sehr leistungsfähig und kann zur Erblindung führen. Alle Experimente Laser verwendet wird, sollten nach einer umfangreichen Ausbildung und mit großer Vorsicht und entsprechenden Augenschutz durchgeführt werden.
- Setzen Sie die Druckkammer mit der Probe im Inneren auf der Bühne eines Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop.
- Öffnen Sie die Imaging-Software (siehe Tabelle der Materialien). So schalten Sie die Argon Anregungslaser, klicken Sie auf die Registerkarte Konfiguration an der Spitze des Programms dann den Laser-Symbol. Markieren Sie das Kästchen neben Argon, den Laser einzuschalten und die Folie Skala bis 30% bewegen. Beachten Sie die Zeiger langsam erwärmen zu der gewählten Position.
- Zurück zur acquire Reiter an der Spitze. In dem großen Feld "Beam Path Settings &# 34; gehen Sie zum Laden / Speichern-Box Einstellung und das Dropdown-Menü wählen Sie einen entsprechenden Wellenlängenkanal Bild YFP (527 nm) zu wählen.
- Wählen Sie die entsprechende Ziele für die Bildgebung durch den roten Hyperlink Auffinden der Aufschrift "Ziel: aktuelle Objekt" unter dem Kanaleinstellungen Feld. Ein Klick auf die Registerkarte öffnet alle verfügbaren Ziele und eine Auswahl automatisch den Turm drehen.
- Verwendung Ziele (z. B. 10X) mit einem großen Arbeitsabstand (größer als die Dicke des Gewebes abgebildet, beispielsweise 11 mm ist) und eine große numerische Apertur (z. B. 0,3) in der Ebene der Bildauflösung zu maximieren und zu minimieren optische Schnittdicke.
- Auf der linken Spalte der Dropdown-Menüs, öffnen Sie die "XY: Auflösung" Fenster Erfassungsmatrix zu setzen, die so genannte "Format", auf 1.024 x 1.024 oder ein angemessener Wert für die laterale Auflösungsgrenze des Objektivs. Stellen Sie den Zoomfaktor so gering wie möglich (z. B. 10,7).
- Im gleichen Fenster stellen 8 Linie Durchschnitt und 1 Frame durchschnittliche Parameter durch Eintropfen entsprechend die individuell beschriftet Menüs nach unten. Verwenden, um große Werte für ein hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis und kleine Werte für eine schnelle Akquisition.
Hinweis: 8-Zeilen-Mittelwerte und 1 Frame Durchschnitt erwirbt qualitativ hochwertige Bilder einer Maus Gehirnhälfte in etwa 4 Stunden. - Suchen Sie die Probe mit Hilfe der Bühne steuert. Sobald eine repräsentative Feld sichtbar ist, stellen Sie die Verstärkung und Offset.
Hinweis: Die Verstärkung und Offset werden im Wesentlichen basierend auf dem Gewebetyp variieren, Fluorophore und / oder anatomischen Merkmal abgebildet wird. Für YFP, stellen Werte von 760 bis 780 für die Verstärkung und von -1,0 bis -1,5 für den Offset. - Wählen Sie "Kachel-Scan" und wählen Sie die Grenzen der Region von Interesse. Den oberen und unteren Grenzen des z-Stapel zu erwerb. Stellen Sie die Dicke des optischen Abschnitt auf der Basis der optischen Schnittauflösungsgrenze des Ziels.
Hinweis: Ein Ziel deroptische Abschnitt Auflösungsgrenze wird in erster Linie durch seine numerische Apertur definiert. Die meisten Mikroskop Steuerungssoftware wird automatisch ein angemessener Wert für die objektive Berechnung verwendet wird. Für einen 10X-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0,3 das wäre etwa 11 um betragen. - Starten Sie die Aufnahme.
Hinweis: Dies kann mehrere Stunden dauern. - Sammeln Sie Bilder mit höherer Auflösung höherer Vergrößerung Ziele aus bestimmten Regionen von Interesse verwendet wird.
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Representative Results
die strukturelle Organisation des Gehirns sichtbar machen ist entscheidend für das Verständnis, wie die Morphologie und Konnektivität Gehirnfunktion in Gesundheit und Krankheit beeinflussen. Optische Clearing-Techniken machen es möglich, Bildzellpopulationen in 3D in intakten Geweben, so dass wir kohäsiv Morphologie und Konnektivität zu studieren.
Mäuse, die fluoreszierende Proteine exprimieren, angetrieben durch spezifische Promotoren Subpopulationen von Zellen ein ermöglichen, die komplexen Muster der neuronalen Verbindungen im Gehirn zu necken auseinander. THY1-YFP transgene Mäuse wurden ausführlich in der optischen Clearing- Literatur verwendet , da diese Mäuse in einer Untergruppe von Projektionsneuronen YFP exprimieren, die in der Großhirnrinde und des Hippocampus befinden, sowie andere Strukturen im Gehirn (2a & b). Darüber hinaus YFP + Rindenschicht V Neuronen projizieren durch den corticospinal - Darm - Trakt in den spinal Kabel (Abbildung 2c und d), so dass sie sehr nützlich bei der Beurteilung der Wirkung der axonalen Beleidigung und / oder Verletzungen im Rückenmark auf die kortikale Neuronen 15 zu machen. Durch die Verwendung der konfokalen Mikroskopie und optische Schnitte von optisch gelöscht Geweben kann man leicht Unterschiede in neuronal Dichte über große anatomische Strukturen zu bewerten.
Zusätzlich zu THY1-YFP-transgenen Mäusen kann eine beliebige Anzahl von transgenen Mäusen, abgebildet werden. PLP-EGFP transgenen Mäuse exprimieren im gesamten Gehirn und Rückenmark (Abbildung 3a) grün fluoreszierende Protein (EGFP) in reifen Oligodendrozyten exprimieren Proteo Protein (PLP) verbessert. PV-tdTomato transgenen Mäuse exprimieren tdTomato in einer Untergruppe von Parvalbumin (PV) Exprimieren Inter im Cerebellum, Striatum und Hippocampus (Abbildung 3b). Auch in Mäusen, die nicht exprimieren fluoreszierendes Transgenen, niedermolekulare fluoreszierende Farbstoffe, wie zum Beispiel DAPI kann leicht diffundieren in Hydrogel eingebetteten Geweben und erlauben die Bewertung der Zellkerne im Gehirn (Abbildung 4).
Abb . 1: Verschiedene Phasen der Gehirn Clearing Fotografie von THY1-YFP + Gehirn der Maus , die aus dem Schädel (a) entfernt wurde. Fotografie von Hydrogel eingebettet THY1-YFP + Maus Gehirnhemisphäre (b). Fotografie von THY1-YFP + Maus Gehirnhemisphäre nach Lipidentfernung (c). Maßstabsbalken sind 5 mm in jeder Platte. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: THY1-YFP - Expression im Gehirn einnd Spinal Cord. THY1-YFP + Neuronen in der Großhirnrinde und des Hippocampus bei 5fache Vergrößerung abgebildet und rekonstruiert in 3D (a). Ein maximaler Intensitätsprojektion eines 10fach-Bildstapel der Hirnrinde die dendritische arborization der Rindenschicht V Pyramidenneuronen (b) zeigt. THY1-YFP-Expression in einer intakten Hals- und Brustrückenmark bei 5fache Vergrößerung abgebildet und rekonstruiert in 3D (c). Ein maximaler Intensitätsprojektion eines 10fach-Bildstapel des Rückenmarks zeigen einzelne Axone (d). Maßstabsbalken sind 1 mm in (a), 100 & mgr; m in (b), 2 mm (c), und 100 & mgr; m in (d). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: PLP-EGFP und PV-tdTomato Expression im Gehirn. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: DAPI - Färbung im Gehirn DAPI Ausdruck im Cerebellum einer intakten Hirnhemisphäre bei 5fache Vergrößerung abgebildet.. Das Bild ist in etwa 1 mm von der Medianebene. Der Einschub zeigt die Detailebene sichtbar bei diesem Abbildungstiefe bei 10-facher Vergrößerung. Maßstabsbalken einre 250 & mgr; m in der Hauptkonsole und 50 & mgr; m im Einsatz. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Puffer | Chemisch | Die Endkonzentration |
| Perfusions - Lösung | ||
| 10x phosphatgepufferte Salzlösung | 1x | |
| Natriumnitrat | 0,5% w / v | |
| Heparin | 10 U / ml | |
| Fixierlösung | ||
| 10x phosphatgepufferte Salzlösung | 1x | |
| Paraformaldehyde | 4% v / v | |
| Hydrogellösung | ||
| 10x phosphatgepufferte Salzlösung | 1x | |
| Paraformaldehyd | 4% v / v | |
| Acrylamide | 4% v / v | |
| Bis-Acrylamid | 0,05% v / v | |
| VA-044-Initiator | 0,25% w / v | |
| Clearing - Puffer | ||
| Borsäure | 200 mM | |
| Natriumdodecylsulfat | 4% w / v | |
| PBST | ||
| 10x phosphatgepufferte Salzlösung | 1x | |
| Triton X-100 | 0,1% v / v | |
| Natriumazid | 0,1% w / v |
Tabelle 1: Liste der Puffer und Lösungen.
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Discussion
Passive Clearing von Hydrogel eingebettet Gewebe (passive CLARITY) ist eine einfache und kostengünstige Methode für große Gewebestücke zu löschen. Dieser Ansatz erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann leicht in einem temperaturgesteuerten Schüttler durchgeführt werden. Über den Zeitraum von einigen Wochen, auch große, hoch myelinisierten Gewebe, wie eine gesamte Gehirn oder Rückenmark, werden für die Mikroskopie transparent und geeignet sind. Auch wenn dieser Bericht über das Clearing von ZNS-Gewebe konzentriert hat, können passive CLARITY zu jedem Gewebe aufgebracht werden.
Die relativen Stärken und Schwächen der optischen Clearing- Techniken 13,17,22, zuvor in der Literatur diskutiert worden, aber sind am deutlichsten in 23 angelegt. Passive CLARITY ist gut geeignet für Experimente, bei denen eine große Anzahl von Proben gelöscht werden gleichzeitig und Reproduzierbarkeit ist von großer Bedeutung. Die Verwendung eines Hydrogels, zusätzlich zu unterstützen, um das Gewebe erleichtert multiple Sondieren des Gewebes. In diesem Bericht wird ein kleines Molekulargewicht Farbstoff, DAPI, wurde gezeigt, aber mehrere Runden von Antikörper-Sondierung sind auch möglich mit diesem Ansatz.
Der beschriebene Ansatz weicht die oben von unserem bisher veröffentlichten Protokoll 15 in ein paar wichtigen Punkten. Zum einen in dem aktuellen Ansatz wurden die Proben nicht intrakardial mit Hydrogel perfundiert. Dies war aufgrund der Tatsache, daß das Hydrogel vorzeitig in den Schlauch und Nadeln der Perfusionsapparatur polymerisieren kann, unvollständiger Perfusionen und inkonsistente Clearing führt. Paraformaldehyd fixierten Gewebe in Hydrogel Inkubieren für 7 Tage ist konsistent mit der ursprünglichen Klarheit Protokoll 14, obwohl ein 1 Tag Inkubation für 1 verwendet wird - 3 mm dicke Gewebeschnitte in dem passiven CLARITY Technique (PACT) 17. Zweitens führt dieser Ansatz Lipidentfernung bei einer etwas höheren Temperatur , die zuvor 15-17 berichtet. Höhere Temperature beschleunigt Lipidentfernung, sondern muss gegen die Möglichkeit eines katastrophalen Verlust der Gewebeintegrität (Schmelzen) ausgeglichen werden. Durch die Erhöhung der Inkubationstemperatur von 8 ° C (bis 45 ° C) für 7 Tage und dann mit 3 ° C (bis 40 ° C) für den Rest des Lipidentfernungsprozesses ist Gewebe Clearing- beschleunigt, aber ohne die gleichzeitige Risiko von der Verlust der Gewebeintegrität. Dieser Temperaturanstieg ist mit Temperaturen während der elektrophoretischen Tissue Clearing (ETC) in der ursprünglichen CLARITY Protokoll gemeldet (50 ° C) 14 konsistent. Weiterhin wurde keine Abnahme in der Intensität der transgen exprimierten Fluorophore oder Abnahme der DAPI-Färbung beobachtet.
Desoxygenierung ist ein wichtiger Schritt bei der Schaffung des Hydrogels. Das Hydrogel kann in Gegenwart von Sauerstoff in dem Hydrogel-Lösung gelöst polymerisieren, aber in unseren Händen die Geschwindigkeit und Vollständigkeit der Polymerisation war viel variabler ohne deoxygenation. Wenn die hydrogel nicht polymerisieren nicht der häufigste Grund ist die Anwesenheit von Sauerstoff in dem Hydrogel.
Die optische Clearing-Prozess bemerkenswert einfach ist, jedoch zu implementieren, dass die Mikroskopie folgt kann ziemlich kompliziert sein. Von entscheidender Bedeutung sind die das Gewebe abzubilden Ziele. Der Arbeitsabstand eines Objektivs definiert die Tiefe, dass es Bild in einer Gewebeprobe. Ein Objektiv mit einem Arbeitsabstand von 2 mm kann nur Bild 2 mm in eine Probe, muss daher der Arbeitsabstand einer Objektiv größer sein als die Dicke der Probe, um sie vollständig zu Bild. In ähnlicher Weise stellt die numerische Apertur einer Objektiv eine Begrenzung der Größe von Funktionen, die es lösen können sowohl in der Ebene als auch die Dicke der optischen Abschnitte, die es sinnvoll zu erwerben. Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) und Lichtblatt-Mikroskopie (LSM) kann durch die Art der Beleuchtung, die Beschränkung auf optische Schnittdicke zu überwinden, aber diese Mikrosmeistert sind nicht überall verfügbar. Hohe numerische Apertur, großen Arbeitsabstand Ziele sind selten und teuer, aber notwendig sind, um für hohe Bildqualität von großen optisch gelöscht Abschnitte.
Sobald die Bilder erfasst wurden, sind sie oft sehr groß ist, für eine niedrige Auflösung von mehreren hundert MB Bereich (sowohl in der Ebene als auch der z-Richtung) Bild zu einigen TB für ein hochauflösendes Bild auf einem LSM gesammelt. Die Computer für die Bildanalyse verwendet werden, erfordern nicht nur viel Stauraum, aber große Mengen an Direktzugriffsspeicher (RAM) für die Bildverarbeitung. Software - Pakete geeignet für die Analyse von großen optisch gelöscht Bild Bände umfassen Amira, Imaris und ImageJ 14-16.
Unter den Grenzen dieses Ansatzes erfordert passive CLARITY mehr Zeit Gewebe als andere optische Clearing Ansätze zu löschen. das Volumen des Gewebes abnimmt, indem es Trimmen gelöscht werden oder in kleinere Stücke können sectioning ACCELerate Lipid-Entfernung. Auch wird wiederum Abnahme Vernetzung der Konzentration von Paraformaldehyd in dem Hydrogel verringert und die Hydrogel Porengröße zu erhöhen, zu einer schnelleren Clearing führenden 17, obwohl dies zu einer größeren Gewebeexpansion führen kann, können einzelne Experimentatoren feststellen , dass es sich lohnt, die Abnahme der Lichtung Zeit. Weiterhin mit TDE als Klärungsmittel kombiniert, kann die Menge des gesamten Gewebeexpansion begrenzt werden.
Obwohl dieser Bericht die Verwendung von kleinen Molekulargewicht Farbstoffe beschreibt, Sondieren Antikörper ist eine sehr natürliche nächste Schritt. Die Anwesenheit des Hydrogels bietet nicht nur körperliche Unterstützung für die gelöscht Gewebe, sondern dient auch als ein Hindernis für das Eindringen von Antikörpern tief in das Gewebe. Eine Verringerung der Acrylamidkonzentration oder die Paraformaldehydkonzentration wird die Porengröße in dem Hydrogel zu erhöhen, zu erleichtern (und damit die Beschleunigung) Antikörper 17 Penetration, aber dies hat eine schädliche Wirkung auf tissue Expansion. Dennoch können Antikörper Sondieren von Blöcken von Gewebe in wenigen Tagen erreicht werden und ganze Gehirn in ein paar Wochen das Acrylamid und Paraformaldehyd Konzentrationen in dem ursprünglichen Bericht 14 beschrieben ist .
Optische Clearing- Techniken ermöglichen einen tief in das Gehirn zu sehen, Förderung des Verständnisses der Struktur und Funktion. Diese neuen Werkzeuge ermöglichen es den Forschern, das Gehirn auf zellulärer und molekularer Auflösung sichtbar zu machen, unser Verständnis dieser komplexen Organen zu erhöhen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health / National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NIH / NINDS) Zuschuss 1R01NS086981 und der Conrad N. Hilton Foundation unterstützt. Wir danken Dr. Laurent Bentolila und Dr. Matthew Schibler für ihre unschätzbare Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie. Wir danken, die an der CLARITY-Forum beigetragen haben (http://forum.claritytechniques.org). Wir danken vor allem Dr. Karl Deisseroth für eröffnet sein Labor diese faszinierende Technik zu lehren. Die Autoren sind dankbar für die großzügige Unterstützung von der Brain Mapping Medical Research Organization, Brain Mapping Support Foundation, Pierson-Lovelace-Stiftung, Ahmanson Stiftung, Capital Group Companies Charitable Foundation, William M. und Linda R. Dietel Philanthropische Fund, und Northstar Fund . Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet wurde, auch teilweise von der National Center for Research Resources und vom Amt des Direktors der Nation unterstütztal Institutes of Health unter preis Zahlen C06RR012169, C06RR015431 und S10OD011939. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position der National Institutes of Health vertreten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | buffers |
| 32% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusion and hydrogel |
| 2,2'-thiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | refractive index matching solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hydrogel |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | clearing buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | clearing buffer |
| Sodium hydroxide | Fisher | 55255-1 | buffers |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 52002-100G | preservative |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | buffers |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusion |
| Sodium nitrate | Fisher | BP360-500 | perfusion |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | nuclear stain |
| 99.9% isoflurane | Phoenix | 57319-559-06 | anesthetic |
| Hydrocholoric acid | Fisher | A1445-500 | buffers |
| Glass bottom dish | Willco | HBSB-5040 | Willco dishes |
| Reusable adhesive | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Silicon elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Lint-free wipe | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Mouse brain matrix | Roboz | SA-2175 | sectioning tissue |
| Matrix blades | Roboz | RS-9887 | sectioning tissue |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-24 | pefusion |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 | microscopy |
| Imaging software | Leica | LAS AF | microscopy |
References
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