Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) הנחיות. Thy1-YFP, PLP-EGFP ו- PV-tdTomato עכברים ששימשו בניסויים אלה, אבל כל בעכברים המבטאים חלבוני ניאון ניתן לפנות בהצלחה צילמו.
1. רקמות הכנה
זהירות: Paraformaldehyde (PFA) ו acrylamide רעילים מגרים. בצע ניסויים ניצול ריאגנטים אלה במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות, ומשקפי מגן).
- להקריב את החיה בתא המתת חסד עם ~ 1 מ"ל של isoflurane עד הנשימה נפסקת (~ 2 - 3 דקות).
- השתמש משאבת peristaltic מוגדר ~ 5 מ"ל / דקה כדי intracardially perfuse את העכבר עם פתרון זלוף (טבלה 1) ב 4 ° C עד דם מנוקה מן הרקמות (5 - 10 דקות).
- שנה את perfusate לפתרון מקבע (טבלה 1)ב 4 מעלות צלזיוס עד צוואר וזנב החמירו משמעותית (5 - 10 דקות).
- לסיום זלוף לערוף את החיה. בזהירות לנתח את המוח מהגולגולת על ידי הסרה הראשונה רקמת החיבור המקיפה את הגולגולת ואז הסרת עצם מפני שטח הגחון של הגולגולת מרים את המוח (איור 1 א), כמתואר 20.
הערה: תן טיפול מיוחד להסרת עצם שמסביב אונות flocculonodular של המוח הקטן ואת נורות חוש הריח.- לנתח את חוט השדרה של עמוד השדרה על ידי הכנסת הקצה בעדינות של מספריים בסדר, חדו בין חוט השדרה ואת עמוד השדרה וחיתוך מגזרי עמוד השדרה הבודד משם, כמתואר 21.
- Hemisect המוח על ידי הצבתו במטריצה במוח העכבר פלסטיק חיתוך לאורך קו האמצע עם להב מטריקס.
- להוסיף כל חצי הכדור וחוט השדרה להפריד צנטריפוגה 50 מ"ל גיגיתes עם ~ 40 מ"ל של תמיסת הידרוג'ל (טבלה 1). מכריכה קדימה בשלב זה את הצינורות עם רדיד אלומיניום על מנת להגן על fluorophores במהלך כל הצעדים הבאים.
- דגירת הצינור המכיל את הדוגמא הידרוג'ל ב 4 ° C עם רעד עדין (~ 30 סל"ד) למשך 7 ימים.
2. פילמור
- בטל ~ 25 מ"ל של הידרוג'ל, שמירה על מדגם ו ~ 25 מ"ל של הידרוג'ל בצינור צנטריפוגות.
- Deoxygenate המדגם על ידי הסרת מכסה והצבת צינור צנטריפוגות בצנצנת ייבוש וחיבור צנצנת ואקום. החלת את הוואקום במשך 10 דקות לפחות להתיר גזים מומסים לצאת בועות פתרון וצורה. נער בעדינות כדי לסלק את הבועות.
- החזר את הוואקום בצנצנת הייבוש בגז חנקן 100% לעומת 2 - 3 דקות. לאחר לחץ המשווה (פעם בראש צנצנת הייבוש ניתן לפתוח), במהירות מכסה את הצינור כדי למנוע החידוש של חמצן.
- פּוֹלִימֵרize הידרוג על ידי הנחת צינור עם מדגם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות עד פילמור הושלמה. הידרוג'ל polymerized ייקח על (איור 1b) דמוי ג'ל עקבי. הערה: כמות קטנה של הידרוג'ל unpolymerized בראש מקובל.
- להשתמש במרית להסיר את מדגם polymerized מצינור צנטריפוגות, ואז לחתוך את הידרוג'ל העודף מן המדגם.
- הסר את הידרוג'ל הנותרים על ידי הצבת המדגם על מוך חינם לנגב ומשפשף בעדינות לגלגל את הרקמה על זה, והותיר אחריו רק שכבה דקה של הידרוג'ל polymerized על המדגם.
3. הסרת שומנים
הערה: רקמת פינה ליפידים הוא שברירי, להישמר מהם. השתמש מסננת תא כאשר רוקנה את הצינור כדי למנוע אובדן של מדגם. כמו כן, המדגם יתנפח לאורך כל תהליך הסליקה, לעומת זאת, נפיחות יכולה להיות הפוך במהלך תהליך ההתאמה מקדם השביר.
זהירות: Sodiאממ סולפט dodecyl (SDS) וחומצה בורה הם מגרים. בצע ניסויים ניצול אותם במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות ומשקפי מגן).
- העבר מדגם מפולמר צינור צנטריפוגות נקי 50 מ"ל ולהוסיף 45 מ"ל של סליקה חיץ (טבלה 1). לדגור על 45 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (~ 30 סל"ד). שינוי למאגר יומי 7 ימים ראשונים על ידי ניגר למאגר הסליקה בשימוש לתוך פסולת כימית והוספה ~ 45 מיליליטר של חיץ סליקה טרי. שמור את צינורות צנטריפוגה המכילים הדגימות המכוסות בנייר אלומיניום כדי להגן על fluorophores.
- לאחר 7 ימים הראשוניים, דגירת המדגם ב 40 מעלות צלזיוס ו חיץ חליפי סליקה כל 2 - 3 ימים. המשך סליקה עד שכל השומנים הם solubilized ורקמות מגיעות השקיפות (איור 1 ג '). זה יהיה 4 - 6 שבועות למשך חצי כדור במוח עכבר 2 - 4 שבועות עבור חוט שדרה.
- לאחר רקמות מנוקות, להעבירהמדגם לצינור צנטריפוגות חדשות 50 מ"ל ולשטוף 4 פעמים ב PBST (טבלה 1) ב 40 ° C עם רעד עדין (~ 30 סל"ד) מעל 24 שעות כדי להסיר SDS שיורית.
4. מולקולרי מכתים
זהירות: 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole dihydrochloride (DAPI) הוא חומר מגרה וכל ניסויים ניצול זה צריך להתבצע במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות, ומשקפי מגן).
- מעבירים את המדגם כדי צינור צנטריפוגות 15 מ"ל נקי ומלא עם 1 מיקרוגרם / מ"ל DAPI ב 1x PBST, pH 7.5. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 24 שעות. שמור את צינורות צנטריפוגה המכילים הדגימות המכוסות בנייר אלומיניום כדי להגן על fluorophores.
- לשטוף 3 פעמים ב PBST ב RT במשך 6 שעות / לשטוף לפחות.
5. התאמת מקדם השבירה
זהירות: 2,2'-Thiodiethanol (TDE) הוא חומר מגרה וכל ניסויים ניצול זה shולד להתבצע במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות, ומשקפי מגן).
- מעבירים את המדגם כדי צינור צנטריפוגות 15 מ"ל נקי ומלא עם 30% (v / v) TDE ב PBS 1x, pH 7.5. לדגור על 40 מעלות צלזיוס עם רעד עדין (~ סל"ד 30) למשך 24 שעות.
- המרת 30% TDE עם 63% (v / v) TDE ב 1x PBS, pH 7.5. לדגור על 40 מעלות צלזיוס עם רעד עדין למשך 24 שעות.
הערה: המדגם יתכווץ חזרה לגודל כ מקורי. - על משטח שטוח ונקי לגלגל חתיכת דבק לשימוש חוזר לגליל בקוטר אחיד רק מעט גדול יותר בעובי של המדגם.
- הנח את הגליל הדבק לשימוש החוזר במעגל פתוח (~ 25 מ"מ קוטר פנימי עם פתח קטן בחלק העליון) על צלחת תחתית זכוכית 40 מ"מ. אם תיקונים צריכים להיעשות, להסיר את הגליל מהכוס לחתוך עם סכין גילוח.
- השתמש טיפ p1000 פיפטה ליצור חותם בין דבק לשימוש חוזר וזכוכית ידימגלגל אותו סביב השפה החיצונית של הגליל.
- המקום ~ 100 μl 63% TDE על צלחת הזכוכית להפיץ מסביב כדי לכסות את משטח הזכוכית בתוך המעגל של דבק לשימוש חוזר.
- בעזרת מרית, מניח את המדגם בזהירות באמצע המעגל, נזהר שלא ליצור בועות.
- פיפטה עוד 100 μl של TDE 63% ישירות על גבי המדגם, ומייד למקם כוס כיסוי עגולה 40 מ"מ מעל הדבק לשימוש החוזר.
- באמצעות האינדקס, אמצע קמיצה של שתי הידיים, לחצו בזהירות מסביב למעגל עד הזכוכית המכסה יצר קשר עם המדגם.
- לאט לאט מביאים את התבשיל בתחתית הכוס בתנוחה זקופה נחה על פני השטח, ולאחר מכן להוסיף 63% TDE עם טפטפת עד שהתמיסה תגיע פתח קטן בראש. השתמש חינם מוך לנגב להתנגב קצה פיפטה כך שהפתרון לא לטפטף על זכוכית. כדי למנוע בועות בתא, לא לרוקן את פיפטה כל הדרך.
- להפתח הקטן, להוסיף אלסטומר סיליקון לצרף המעגל ליצור תא סגור. מתן 5 דקות עבור לו להתייבש לפני ההדמיה.
מיקרוסקופי 6.
זהירות: הלייזרים המשמשים confocal, תאורת מטוס בודדת במיקרוסקופ גיליון האור הם מאוד חזקה ויכולה לגרום לעיוורון. כל ניסויי ניצול לייזרים צריכים להתבצע לאחר אימונים רבים בזהירות רבה ומשקפי מגן מתאים.
- הנח את תא הדמיה עם המדגם בתוך על הבמה של מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר.
- פתח את תוכנת ההדמיה (ראה טבלה של חומרים). כדי להפעיל את הלייזר עירור ארגון, לחץ על הכרטיסייה תצורת בחלק העליון של התוכנית ולאחר מכן בסמל לייזר. סמן את התיבה לצד ארגון כוח לייזר ולעבור סולם שקופית 30%. שים את המצביע להתחמם לאט למצב שנבחר.
- חזור לכרטיסייה לרכוש בחלק העליון. בתיבת הדו הגדולה "הגדרות נתיב קרן &# 34; ללכת העומס / לשמור הגדרת תיבה ובחר את תפריט הנפתח כדי לבחור ערוץ גל מתאים לתמונת YFP (527 ננומטר).
- בחר יעדים מתאימים הדמיה ידי איתור הקישור האדום שכותרתו "מטרה: אובייקט נוכחי" תחת תיבת גדרות ערוץ. לחיצה על הכרטיסייה פותחת את כל המטרות הזמינות ומבחר באופן אוטומטי לסובב את הצריח.
- השתמש מטרות (למשל., 10X) עם מרחק עבודה גדולה (יותר מעובי של הרקמות להיות צלמו, למשל, 11 מ"מ) וכן מספרי צמצם גדול (למשל., 0.3) על מנת למקסם רזולוציית תמונת המטוס ולמזער עובי סעיף אופטי.
- על העמוד השמאלי של תפריטים נפתחים, לפתוח את "XY: רזולוציה" החלון להגדיר מטריצת רכישה, בשם "תבנית", 1,024 x 1,024 או ערך מתאים עבור מגבלת רזולוציה לרוחב של המטרה. הגדר את גורם זום נמוך ככל האפשר (למשל., 1.7).
- באותו החלון, להגדיר ממוצע 8 קו 1 פרמטרים ממוצעים מסגרת ידי הטלה למטה בתפריטים שכותרתו בנפרד בהתאם. השתמש בערכים גדולים עבור יחס אות לרעש גבוה וערכים קטנים לרכישה מהירה.
הערה: 8 ממוצעי קו ממוצע מסגרת 1 ירכשו תמונות באיכות גבוהה של אונה במוח עכבר בתוך כ -4 שעות. - אתר את המדגם באמצעות הפקדים הבמה. לאחר שדה נציג גלוי, להגדיר את הרווח לקזז.
הערה: הרווח לקזז ישתנה מבוסס במידה מהותית על סוג הרקמה, fluorophores, ו / או להיות הדמית תכונה אנטומית. עבור YFP, להגדיר ערכים מ 760 ל 780 טוב רווח ומתוך -1.0 ל -1.5 עבור לקזז. - בחר "סריקת אריח" ובחר את גבולות האזור של עניין. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של Z- מחסנית להירכש. הגדר את העובי של הסעיף האופטי המבוסס על מגבלת רזולוצית סעיף האופטית של המטרה.
הערה: המטרה שלמגבלת רזולוצית סעיף אופטית מוגדרת בראש ובראשונה על ידי הצמצם המספרי שלה. רוב תוכנות מיקרוסקופ שליטה תחשבנה מתאים ערך באופן אוטומטי עבור המטרה בשימוש. עבור מטרת 10X עם צמצם מספרי של 0.3 זה יהיה כ 11 מיקרומטר. - הפעל את הרכישה.
הערה: פעולה זו עשויה להימשך מספר שעות. - איסוף תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות מטרות בהגדלה גבוהה יותר מאזורים ספציפיים של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לדמיין את המבנה הארגוני של המוח הוא קריטי להבנת איך מורפולוגיה וקישוריות להשפיע על תפקוד המוח בריאות ומחלות. טכניקות סליקה אופטיות מאפשרות אוכלוסיות תאי תמונת 3D ברקמות ללא פגע, מה שמאפשר לנו ללמוד מורפולוגיה וקישוריות cohesively.
עכברים המבטאים חלבוני ניאון מונע על ידי יזמים ספציפיים עבור תת-אוכלוסיות של תאים להתיר אחת ניסו להפריד דפוס המורכב של קישוריות עצבית במוח. עכברים מהונדסים Thy1-YFP נעשה שימוש נרחב בספרות הסליקה האופטית כי עכברים אלה מבטאים YFP משנה של נוירונים הקרנה הנמצאים בקליפת המוח ואת ההיפוקמפוס, כמו גם מבנים אחרים במוח (איור 2 א & B). יתר על כן, YFP + נוירונים V שכבת קליפת המוח להקרין דרך מערכת corticospinal בשנות הכבל Pinal (איור 2 ג & D), מה שהופך אותם מאוד שימושי בהערכת ההשפעה של עלבון axonal ו / או פגיעה בחוט השדרה על נוירונים בקליפת המוח 15. באמצעות השימוש במיקרוסקופ confocal חתך אופטי של רקמות פינה אופטית אחד יכול להעריך הבדלים בקלות בצפיפות עצבית ברחבי מבנים אנטומיים גדולים.
בנוסף עכברים מהונדסים Thy1-YFP, כל מספר של עכברים מהונדסים ניתן הדמיה. עכברים מהונדסים PLP-EGFP מפורשות משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) ב oligodendrocytes הבוגרת לבטא חלבון proteolipid (PLP) בכל רחבי המוח וחוט שדרה (איור 3 א). עכברים מהונדס PV-tdTomato להביע tdTomato משנה של parvalbumin (PV) להביע interneurons במוח הקטן, הסטריאטום ובהיפוקמפוס (איור 3 ב). גם בעכברים כי אינו מבטא transgenes פלורסנט, צבעי ניאון משקל מולקולרי קטנים, כגון DAPI, יכול לנטרל בקלות לתוך רקמות מוטבעות הידרוג'ל ולהתיר בהערכה לגרעיני תא המוח (איור 4).
איור 1:. בשלבים שונים של מוח סליקת תצלום של Thy1-YFP + עכבר מוח שהוסר מהגולגולת (א). תצלום של האונה במוח הידרוג'ל-מוטבע Thy1-YFP + עכבר (ב). תצלום של אונה במוח Thy1-YFP + עכבר לאחר הסרת שומנים (ג). ברי סולם הם 5 מ"מ בפנל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: Thy1-YFP ביטוי המוחnd בחוט השדרה. Thy1-YFP + נוירונים בקליפת המוח ואת ההיפוקמפוס צילמו בהגדלה 5X ושיחזר ב 3D (א). היטל העוצמה המקסימלית של ערימה תמונה 10X של קליפת המוח הוכחת arborization הדנדריטים של נוירונים פירמידליים V שכבת קליפת המוח (ב). Thy1-YFP ביטוי בתוך חוט השדרה הצווארי החזי שלמים צילמו בהגדלה 5X ושיחזר ב -3 D (ג). היטל עצמה המקסימלית של ערימת תמונת 10X של חוט השדרה הוכחת אקסונים פרט (ד). ברי סולם הם 1 מ"מ (א), 100 מיקרומטר (ב), 2 מ"מ (ג), ו- 100 מיקרומטר (ד). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: PLP-EGFP ואת הביטוי PV-tdTomato במוח. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: DAPI מכתים בביטוי DAPI המוח במוח הקטן של חצי כדור ארץ מוחות שלם צלם בהגדלת 5X.. הדימוי הוא כ 1 מ"מ ממטוס midsagittal. הבלעה מראה את רמת הפירוט גלוי בעומק הדמיה זו בהגדלה 10X. סולם סורגיםמחדש 250 מיקרומטר הלוח הראשי ו -50 מיקרומטר הבלעה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| בַּלָם | כִּימִי | ריכוז סופי |
| פתרון זלוף | ||
| מלוח 10x שנאגר פוספט | 1x | |
| נתרן חנקתי | 0.5% w / v | |
| הפרין | 10 U / ml | |
| פתרון מקבע | ||
| מלוח 10x שנאגר פוספט | 1x | |
| Paraformaldehyדה | נ 4% / v | |
| פתרון הידרוג'ל | ||
| מלוח 10x שנאגר פוספט | 1x | |
| paraformaldehyde | נ 4% / v | |
| acrylamide | נ 4% / v | |
| Bis-acrylamide | 0.05% v / v | |
| יוזם VA-044 | 0.25% w / v | |
| חיץ סליקה | ||
| חומצה בורית | 200 מ"מ | |
| סולפט dodecyl נתרן | 4% w / v | |
| PBST | ||
| מלוח 10x שנאגר פוספט | 1x | |
| טריטון X-100 | 0.1% v / v | |
| אזיד הנתרן | 0.1% w / v |
טבלה 1: רשימת חוצצים ופתרונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סליקה פסיבית של רקמות מוטבעות הידרוג'ל (CLARITY הפסיבי) היא שיטה פשוטה וזולה לניקוי חתיכות גדולות של רקמה. גישה זו אינה דורשת ציוד ייעודי וניתן לבצעו בקלות שייקר בקרת טמפרטורה. במשך תקופה של כמה שבועות, אפילו גדולים, רקמות myelinated ביותר, כגון המוח כולו או בחוט השדרה, יהפוך שקוף ומתאים מיקרוסקופיה. למרות דוח זה התמקד סליקת רקמות CNS, ניתן ליישם CLARITY הפסיבית לכל רקמה.
את נקודות החוזק והחולשה היחסיות של טכניקות סליקה אופטיות נדונו בעבר בספרות 13,17,22,, אבל הם הכי ערוכים בצורה ברורה 23. CLARITY פסיבי הוא גם מתאים בניסויים שבהם מספר גדול של דגימות מנוקים בו זמנית שחזור היא בעלת חשיבות רבה. השימוש הידרוג לספק תמיכה נוספת לרקמה מקלה מרובי חיטוט של הרקמה. בדו"ח זה, לצבוע משקל מולקולרי קטן, DAPI, הודגם, אך סבבים רבים של נוגדן חיטוט גם הם אפשריים עם גישה זו.
הגישה המתוארת לעיל חורג מן הפרוטוקול שפורסם בעבר שלנו 15 בעוד כמה דרכים משמעותיות. ראשית, הגישה הנוכחית, הדגימות לא היו perfused intracardially עם הידרוג'ל. זה היה בשל העובדה כי הידרוג'ל יכול בטרם עת לפלמר בצינור ומחטים של מנגנון זלוף, שמוביל perfusions שלם וסליקה עקבי. דוגר רקמות קבועות paraformaldehyde ב הידרוג'ל למשך 7 ימים עולה בקנה אחד עם פרוטוקול CLARITY המקורי 14, אם כי דגירת יום 1 משמשת 1 - 3 מ"מ סעיפי רקמה עבים טכניקת CLARITY הפסיבית (PACT) 17. שנית, גישה זו מבצעת הסרת שומנים בטמפרטורה גבוהה במקצת כי שדווח בעבר 15-17. טמפרטורה גבוההדואר מאיצה הסרת שומנים, אבל חייבת להיות מאוזנת מול האפשרות של הפסד קטסטרופלי של שלמות רקמות (התכה). על ידי הגדלת טמפרטורת הדגירה ב -8 מעלות צלזיוס (45 מעלות צלזיוס) במשך 7 ימים ולאחר מכן על ידי 3 ° C (40 ° C) לשארית את תהליך הסרת השומנים, סליקת רקמות מואצת, אך ללא הסיכון בו הזמני של אובדן שלמות רקמות. זו עליית הטמפרטורה עולה בקנה אחד עם טמפרטורות דיווחו במהלך סליקת רקמות Electrophoretic (ETC) בפרוטוקול CLARITY המקורי (50 ° C) 14. יתר על כן, אין ירידה בעוצמת fluorophores הביע transgenically ולא ירידה מכתים DAPI נצפתה.
הרחקת חמצן הוא צעד חשוב ביצירה של הידרוג'ל. הידרוג יכול לפלמר בנוכחות חמצן מומס הפתרון הידרוג'ל, אך בידינו שיעור ושלמות פילמור היה הרבה יותר משתנה ללא הרחקת חמצן. אם hydrogel לא לפלמר, הסיבה הנפוצה ביותר היא בנוכחות חמצן הידרוג'ל.
תהליך הסליקה האופטי להפליא קל ליישם, אולם, מיקרוסקופיה העוקבת עלולה להיות מסובכת למדי. בעלת חשיבות מכרעת הם המטרות נהגו תמונת הרקמה. מרחק העבודה של אובייקטיבי מגדיר את העומק שזה יכול תמונה לתוך דגימת רקמה. אובייקטיבי עם מרחק עבודה של 2 מ"מ יכול רק תמונה 2 מ"מ לתוך מדגם, ולכן את מרחק העבודה של מטרה צריכה להיות גדולה יותר בעובי של המדגם כדי תצלם אותה לחלוטין. באופן דומה, הצמצם המספרי של אובייקטיבי מציב גבול לגודל של תכונות שהוא יכול לפתור הן-מטוס ואת העובי של חלקים אופטיים שזה יכול לרכוש באופן משמעותי. מטוס סלקטיבי מיקרוסקופי תאורה (SPIM) ואת גיליון האור המיקרוסקופי (LSM) יכולים להתגבר על המגבלה על עובי סעיף אופטי ידי הטבע של ההארה, אך מייקרו אלהמתמודדת אינה זמינה באופן נרחב. צמצם מספרי גבוה, מטרות מרחק עבודה גדולות הם נדירים ויקרים, אבל נחוצים הדמיה באיכות גבוהה ממקטעי פינה אופטית גדולים.
לאחר התמונות נרכשו, הם לעתים קרובות מאוד גדולים, החלו מכמה מאה MB עבור ברזולוציה נמוכה (הוא בתוך מטוס ואת z-הכיוון) תמונה כמה TB עבור תמונה ברזולוציה גבוהה שנאספה על LSM. המחשבים המשמשים לניתוח תמונה דורשים לא רק מידה רבה של אחסון, אבל בכמויות גדולות של זיכרון גישה אקראית (RAM) עבור עיבוד תמונה. חבילות תוכנה מתאימות של ניתוח כרכי תמונה נרחבים שנוקו אופטית כוללות עמירה, Imaris, ו ImageJ 14-16.
בין המגבלות של גישה זו, CLARITY הפסיבי דורש יותר זמן כדי לנקות רקמות מאשר גישות סליקה אופטית אחרות. הקטנת הנפח של הרקמה כדי להיות מסומן על ידי זמירה זה או חתך אותו לחתיכות קטנות יותר יכולות אקסלשומני הסרת erate. כמו כן, הפחתת הריכוז של paraformaldehyde הידרוג יהיה ב crosslinking ירידה בתור ולהגדיל את הגודל הנקבובי הידרוג'ל, שמובילות סליקה מהירה יותר 17, אם כי זה עלול להוביל להרחבת רקמות יותר, הנסיינים פרט עשויים לגלות כי זה שווה את ירידת סליקה זְמַן. יתר על כן, בשילוב עם TDE כסולקת, כמות להרחבת רקמות הכוללת עשויה להיות מוגבלת.
למרות דוח זה מתאר את השימוש בצבעים משקל מולקולרי קטן, נוגדן חיטוט הוא השלב הבא מאוד טבעי. הנוכחות של הידרוג'ל לא מספקת תמיכה פיזית רק לרקמות הפינה, אלא גם משמשת מכשול עבור חדירת הנוגדנים עמוקה לתוך הרקמה. הקטנת ריכוז acrylamide או ריכוז paraformaldehyde יגדיל את הגודל הנקבובי ב הידרוג'ל, להקל (ובכך מאיץ) נוגדן חדיר 17, אך יש לכך השפעה מזיקה על Tissהרחבת UE. אף על פי כן, נוגדן חיטוט של גושי רקמה ניתן להשיג ב עניין של ימים המוח כולו בעוד כמה שבועות באמצעות ריכוזים acrylamide ו paraformaldehyde המתוארים בדו"ח המקורי 14.
טכניקות סליקה אופטיות לאפשר אחד להסתכל עמוק לתוך המוח, לקדם את ההבנה של מבנה המוח ועל תפקודו. כלים החדשים אלה ייאפשרו לחוקרים לחזות המוח ברזולוציות תאיות ומולקולריות, הגדלת הבנתנו המורכבת ביותר על אברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על בנדיבות על ידי המכונים הלאומיים לבריאות / המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NIH / NINDS) מענק 1R01NS086981 וקרן הילטון קונרד נ. אנו מודים לד"ר לורן בן-טולילה וד"ר מתיו Schibler על עזרתם שלא יסולא בפז עם מיקרוסקופיה confocal. אנו מודים לאלה שתרמו בפורום CLARITY (http://forum.claritytechniques.org). אנחנו במיוחד להודות לד"ר קרל דייזרות עבור פתיחת המעבדה שלו ללמד טכניקה המרתק הזה. המחברים מודים על התמיכה הנדיבה של מינהל המחקר הרפואי למיפוי המוח, קרן תמיכה למיפוי המוח, פירסון-לאבלייס קרן, קרן Ahmanson, קרן הצדקה של חברות קפיטל גרופ, וויליאם מ ולינדה ר Dietel פילנתרופית קרן, קרן Northstar . מחקר מדווח בפרסום זה גם מומן בחלקו על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר על ידי משרד המנהל של האומההמכונים אל הבריאות תחת מספרי הפרס C06RR012169, C06RR015431, ו S10OD011939. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | buffers |
| 32% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusion and hydrogel |
| 2,2'-thiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | refractive index matching solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hydrogel |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | clearing buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | clearing buffer |
| Sodium hydroxide | Fisher | 55255-1 | buffers |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 52002-100G | preservative |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | buffers |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusion |
| Sodium nitrate | Fisher | BP360-500 | perfusion |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | nuclear stain |
| 99.9% isoflurane | Phoenix | 57319-559-06 | anesthetic |
| Hydrocholoric acid | Fisher | A1445-500 | buffers |
| Glass bottom dish | Willco | HBSB-5040 | Willco dishes |
| Reusable adhesive | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Silicon elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Lint-free wipe | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Mouse brain matrix | Roboz | SA-2175 | sectioning tissue |
| Matrix blades | Roboz | RS-9887 | sectioning tissue |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-24 | pefusion |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 | microscopy |
| Imaging software | Leica | LAS AF | microscopy |
References
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes. J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).
- MacKenzie-Graham, A., et al. A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain. J Anat. 204, 93-102 (2004).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. Neuroimage. 101, 625-632 (2014).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Sci Rep. 5, 9808 (2015).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
- Parra, S. G., et al. Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP. J Vis Exp. (67), e3848 (2012).
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. J Viz Exp. (96), e52580 (2015).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).
