Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с Уходу за животными и рекомендациями по использованию комитета (IACUC). Thy1-YFP, ПЛП-EGFP и PV-TdTomato мышей использовали для этих экспериментов, но любые мыши, экспрессирующие флуоресцентные белки могут быть успешно очищены и образ.
1. Подготовка ткани
Внимание: параформальдегид (PFA) и акриламид являются токсичными и раздражающими. Выполнение экспериментов с использованием этих реагентов в вытяжном шкафу и с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз).
- Жертвоприношение животное в эвтаназии камере с ~ 1 мл изофлуран, пока дыхание не прекратится (~ 2 - 3 мин).
- С помощью перистальтического насоса установлен в ~ 5 мл / мин до внутрисердечно обрызгивать мышь с перфузионной раствором (таблица 1) при 4 ° С до тех пор , пока кровь очищается от тканей (5 - 10 мин).
- Изменение перфузата к фиксирующим раствором (таблица 1)при 4 ° С до тех пор, шеи и хвоста не заметно напрягся (5 - 10 мин).
- Конец перфузию и обезглавить животное. Осторожно рассекают из мозга из черепа сначала удалением соединительной ткани вокруг черепа , а затем удаление кости с брюшной поверхности черепа и подъема мозг из (рис 1а), как описано в разделе 20.
Примечание: Дайте особое внимание удалению костей, окружающих flocculonodular мочки мозжечка и обонятельных луковиц.- Рассеките спинной мозг от позвоночного столба, аккуратно вставив кончик тонкой, острой ножничные между спинным мозгом и позвоночником и срезания отдельных позвоночных сегментов столбцов прочь, как описано в разделе 21.
- Hemisect мозг, поместив ее в пластиковую матрицу мозга мыши и резки вдоль средней линии с матрицей лезвием.
- Добавьте каждое полушарие и спинной мозг, чтобы отделить 50 мл центрифугу ваннаЕ. С. с ~ 40 мл раствора гидрогеля (таблица 1). С этой точки передней крышки трубы с алюминиевой фольгой для защиты флуорофоры во всех последующих шагов.
- Инкубируйте пробирку, содержащую образец в гидрогеле при температуре 4 ° С при осторожном встряхивании (~ 30 оборотов в минуту) в течение 7 дней.
2. Полимеризация
- Откажитесь ~ 25 мл гидрогеля, сохраняя образец и ~ 25 мл гидрогеля в центрифужную пробирку.
- Обескислороживание образца путем удаления колпачка и размещения центрифужной пробирки в эксикаторе банку и присоединительные банку в вакууме. Применение вакуума в течение по крайней мере 10 минут, чтобы позволить растворенные газы, чтобы выйти из раствора и образуют пузырьки. Осторожно встряхнуть, чтобы выбить пузыри.
- Заменить вакуум в эксикаторе банку со 100% -ным газообразным азотом в течение 2 - 3 мин. После того, как давление уравнивает (как только можно открыть верхнюю часть эксикаторе банку), быстро колпачок трубки, чтобы предотвратить повторное введение кислорода.
- полимерИзе гидрогель, помещая трубку с образцом в водяную баню C 37 ° в течение 3 ч до тех пор, полимеризация не будет завершена. Полимеризованных гидрогель будет брать на себя гелеобразной консистенции (рис 1b). Примечание: Небольшое количество неполимеризованных гидрогеля в верхней приемлемо.
- С помощью шпателя, чтобы удалить полимеризованного образца из трубки центрифуги, а затем отрезать излишки гидрогель от образца.
- Удалите остатки гидрогеля путем помещения образца на безворсовой вытереть и осторожно втирают и крученым ткани на ней, оставляя за собой лишь тонким слоем полимеризованного гидрогеля на образце.
3. липида Удаление
Примечание: липида-очищается ткань хрупкой, обращаться с осторожностью. Используйте клеточный фильтр при сливе трубки, чтобы избежать потери пробы. Кроме того, образец будет набухать в течение всего процесса клиринга, однако, опухоль может быть отменено в течение рефракционной процесса согласования индекса.
Внимание: Содагм додецилсульфат (SDS) и борной кислоты являются раздражителями. Выполнение экспериментов с использованием их в вытяжном шкафу и с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз).
- Передача полимеризованного образца в чистую 50 мл центрифужную пробирку и добавляют 45 мл Очистка буфера (таблица 1). Инкубируют при 45 ° С при осторожном встряхивании (~ 30 оборотов в минуту). Изменение буфера ежедневно в течение первоначального 7 дней, выливая от использованного клиринговую буфера в химических отходов и добавление 45 мл ~ свежего клирингового буфера. Держите центрифужные пробирки, содержащие образцы, покрытые алюминиевой фольгой для защиты флуорофоры.
- После первых 7 дней, инкубировать образец при температуре 40 ° C и обмен Очистка буфера через каждые 2 - 3 дней. Продолжайте очистку , пока все липиды не растворяются и ткани достигает прозрачности (рис 1c). Это будет 4 - 6 недель для полушария мозга мыши и 2 - 4 недели для спинного мозга.
- После того, как ткань очищается, переводобразец на новую 50 мл центрифужную пробирку и промойте 4 раза в PBST (таблица 1) при 40 ° С при осторожном встряхивании (~ 30 оборотов в минуту) в течение 24 часов для удаления остаточного SDS.
4. Молекулярный Окрашивание
Внимание: 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI) является раздражителем и любые эксперименты, использующие ее следует проводить в вытяжном шкафу и с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз).
- Перенести пробу в чистую 15 мл центрифужную пробирку и заправить 1 мкг / мл DAPI в 1X PBST, рН 7,5. Инкубируют при комнатной температуре (КТ) в течение 24 часов. Держите центрифужные пробирки, содержащие образцы, покрытые алюминиевой фольгой для защиты флуорофоры.
- Промыть 3 раза в PBST при комнатной температуре в течение по крайней мере 6 ч / промывочного раствора.
5. Индекс рефракционной Matching
Внимание: 2,2'-тиодиэтанол (TDE) является раздражителем и любые эксперименты с использованием его шульд быть выполнены в вытяжном шкафу и с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз).
- Перенести пробу в чистую 15 мл центрифужную пробирку и залить 30% (об / об) TDE в 1X PBS, рН 7,5. Инкубируют при 40 ° С при осторожном встряхивании (~ 30 оборотов в минуту) в течение 24 часов.
- Обмен 30% TDE с 63% (об / об) TDE в 1X PBS, рН 7,5. Инкубируют при 40 ° С при осторожном встряхивании в течение 24 часов.
Примечание: Образец будет сжиматься до приблизительно первоначального размера. - На ровную чистую поверхность рулон кусок многоразового клея в цилиндр с одинаковым диаметром чуть больше, чем толщина образца.
- Положите многоразовую клейкую цилиндр в открытый круг (~ 25 мм внутренний диаметр с небольшим отверстием в верхней части) на 40 мм блюдо со стеклянным дном. Если поправки должны быть сделаны, снимите цилиндр из стекла и разрезали лезвием бритвы.
- Используйте кончик P1000 пипетки, чтобы создать уплотнение между повторно используемого клея и стекла путемпрокатку вокруг внешнего обода цилиндра.
- Место ~ 100 мкл 63% TDE на стеклянную посуду и распространяется вокруг, чтобы покрыть поверхность стекла в круг многоразового клея.
- С помощью шпателя, тщательно поместить образец в центре круга, заботясь, чтобы не образовывать пузырьки.
- Пипетировать еще 100 мкл 63% TDE непосредственно на образец, а затем сразу же место 40 мм круглое защитное стекло с над многоразовой клеем.
- Используя индекс, середину и безымянного пальца обеих рук, осторожно нажмите по периметру круга, пока крышка из стекла не вступил в контакт с образцом.
- Медленно довести стеклянным дном блюдо в вертикальное положение упирающейся поверхности, а затем добавить 63% TDE с пипеткой до тех пор, пока раствор не достигнет через небольшое отверстие в верхней части. Используйте безворсовой протирать, чтобы высушить кончик пипетки так, чтобы раствор не капал на стекле. Для того, чтобы избежать пузырей в камере, никогда не опустошить пипетку весь путь.
- кнебольшое отверстие, добавить кремния эластомер вложить круг и создать закрытую камеру. Подождите 5 минут для того, чтобы высохнуть, прежде чем визуализации.
6. Микроскопия
Внимание: лазеры, используемые в конфокальной, одной плоскости освещения и световой микроскопии листа являются очень мощным и может привести к слепоте. Любые эксперименты, использующие лазеры должны быть выполнены после длительной подготовки и с большой осторожностью и надлежащей защиты глаз.
- Поместите камеру формирования изображения с образцом внутри на стадии лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
- Откройте программу обработки изображений (см таблицу материалов). Для включения лазера аргона возбуждения, перейдите на вкладку конфигурации в верхней части программы затем значок лазера. Установите флажок рядом с аргоном для питания лазера и переместить шкалу слайд до 30%. Обратите внимание указатель медленно нагреться до выбранной позиции.
- Вернитесь на вкладку приобретают в верхней части. В большом окне "Настройки пути луча &# 34; перейти на нагрузку / сохранить настройки окна и выберите из выпадающего меню, чтобы выбрать соответствующий канал длины волны для изображения YFP (527 нм).
- Выберите соответствующие задачи для визуализации путем размещения гиперссылки красной надписью "Цель: текущий объект" под окном настройки канала. При нажатии на вкладку открывает все доступные цели и выбор будет автоматически поворачивать башни.
- Используйте цели (например., 10x) с большим рабочим расстоянием (больше толщины ткани , чтобы быть отображены, например, 11 мм) и большой числовой апертурой (например., 0,3) , чтобы максимально увеличить плоскостную разрешение изображения и свести к минимуму оптическая толщина секции.
- На левой колонке выпадающие меню, откройте "XY: разрешение" окно для установки матрицы сбора данных, называемый "формат", 1,024 х 1,024 или значение соответствующего для бокового предела разрешения объектива. Установить коэффициент масштабирования как можно более низкой (например., 1+0,7).
- В том же окне, установите 8 средней линии и 1 кадр средние параметры, сбрасывая вниз по отдельности меченые меню соответствующим образом. Используйте большие значения для высокого отношения сигнал-шум и малых значений для быстрого приобретения.
Примечание: 8 строк средние и 1 кадр в среднем будет приобретать высококачественные изображения полушария мозга мыши примерно 4 часа. - Найдите образец, используя элементы управления стадии. После того, как представитель поле отображается, установите коэффициент усиления и смещения.
Примечание: Коэффициент усиления и смещение будет существенно меняться в зависимости от типа ткани, флуорофоров, и / или анатомической особенностью изображаемого. Для YFP, установите значения от 760 до 780 для усиления и от -1,0 до -1,5 для смещения. - Выберите "плитки сканирование" и выберите границы интересующей области. Установить верхний и нижний пределы Z-стека, чтобы быть приобретены. Установите толщину оптической части на основе оптического предела разрешения раздела объективной в.
Примечание: Цель-хоптический предел разрешения секции определяется прежде всего его числовой апертуры. Большая часть программного обеспечения управления микроскоп автоматически вычисляет значение, соответствующее для целей используется. Для объектива 10X с числовой апертурой 0,3, который будет составлять приблизительно 11 мкм. - Начать сбор данных.
Примечание: Это может занять несколько часов. - Собирать изображения с более высоким разрешением, используя более высокие цели увеличения от конкретных регионах, представляющих интерес.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Визуальное структурной организации мозга имеет решающее значение для понимания того, как морфология и соединения влияют на функцию мозга в норме и при патологии. Оптические методы клиринга позволяют популяции изображения клеток в 3D в неповрежденные ткани, что позволяет нам изучать морфологию и связность слаженно.
Мыши, которые экспрессируют флуоресцентные белки движимый промоторов, специфических для субпопуляций клеток позволяют одному дразнить друг от друга сложную структуру нейронной связи в головном мозге. Thy1-YFP трансгенных мышей широко используются в оптическом клирингового литературе , потому что эти мыши экспрессируют YFP в подгруппе проекционных нейронов , которые находятся в коре головного мозга и гиппокампе, а также других структур в головном мозге (рис 2а и б). Кроме того, + корковых нейронов V слоя YFP проекта через кортикоспинальных тракта в секPinal шнур (рис 2с & d), что делает их очень полезными при оценке влияния аксонов инсульта и / или травмы спинного мозга на корковых нейронов 15. Благодаря использованию конфокальной микроскопии и оптической секционирования оптически очищенных тканей можно легко оценить различия в плотности нейронов через большие анатомических структур.
В дополнение к Thy1-YFP трансгенных мышей, любое количество трансгенных мышей, могут быть отображены. ПЛП-EGFP трансгенные мыши экспрессируют усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) , в зрелых олигодендроцитов , экспрессирующих протеолипидный белок (PLP) в течение всего головного и спинного мозга (рис 3а). PV-TdTomato трансгенные мыши экспрессируют TdTomato в подгруппе парвальбумин (PV) , выражающая интернейронов в мозжечке, стриатуме и гиппокампе (рис 3b). Даже у мышей, которые не экспрессируют флуоресцентные трансгены, малые низкомолекулярные флуоресцентные красители, такие как DAPI, может легко диффундировать в гидрогелевых срезах тканей и позволяют оценить клеточных ядер в мозге (рисунок 4).
Рисунок 1:. Различные этапы мозга Клиринговый Фотография мозга Thy1-YFP + мышь , которая была удалена из черепа (а). Фотография гидрогеля встраиваемый Thy1-YFP + мышь полушарие мозга (б). Фотография Thy1-YFP + мыши полушария мозга после удаления липидного (с). Шкала баров 5 мм в каждой панели. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Thy1-YFP выражение в мозгего спинного мозга. Thy1-YFP + нейроны в коре головного мозга и гиппокампе при 5X изображается увеличением и реконструированы в 3D (а). Максимальная интенсивность проекции стека изображений 10X коры головного мозга, демонстрирующей ветвления дендритов корковых нейронов слоя V пирамидальных (б). Выражение Thy1-YFP в неповрежденной шейного и грудного отдела спинного мозга при 5X изображается увеличением и реконструированы в 3D (с). Максимальная интенсивность проекции стека изображения 10X спинного мозга, демонстрирующей отдельных аксонов (D). Шкала баров 1 мм (а), 100 мкм (б), 2 мм в (с) и 100 мкм (д). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: PLP-EGFP и PV-TdTomato в головном мозге. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: DAPI Окрашивание в выражении DAPI мозга в мозжечке интактного полушария головного мозга при изображаемого 5X увеличении.. Изображение составляет примерно 1 мм от среднесагиттальных плоскости. На вставке показан уровень детализации видимого на этой глубине изображения на 10-кратным увеличением. Шкала A Барыповторно 250 мкм в главной панели и 50 мкм в врезке. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| буфер | химическая | Конечная концентрация |
| Перфузия решение | ||
| 10x фосфатно-солевой буфер | 1x | |
| нитрат натрия | 0,5% вес / об | |
| гепарин | 10 ед / мл | |
| Фиксирующий раствор | ||
| 10x фосфатно-солевой буфер | 1x | |
| Paraformaldehyде | 4% об / об | |
| решение Гидрогель | ||
| 10x фосфатно-солевой буфер | 1x | |
| параформальдегид | 4% об / об | |
| акриламид | 4% об / об | |
| Бис-акриламид | 0,05% об / об | |
| VA-044 Инициатор | 0,25% вес / об | |
| Очистка буфера | ||
| Борная кислота | 200 мМ | |
| Натрия додецилсульфат | 4% вес / об | |
| PBST | ||
| 10x фосфатно-солевой буфер | 1x | |
| Тритон Х-100 | 0,1% об / об | |
| Азид натрия | 0,1% вес / об |
Таблица 1: Список буферов и решений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Пассивная очистка гидрогелевые срезах тканей (пассивный) CLARITY представляет собой простой и недорогой метод для очистки больших кусков ткани. Такой подход не требует специализированного оборудования и могут быть легко выполнены в контролируемой температурой шейкер. На протяжении нескольких недель, даже большие, высоко мякотных ткани, такие как целого головного или спинного мозга, станет прозрачной и пригодной для микроскопии. Хотя этот доклад сосредоточено на очистке тканей ЦНС, пассивный осветление может быть применен к любой ткани.
Относительные сильные и слабые стороны оптических методов клиринговых обсуждались ранее в литературе 13,17,22,, но наиболее четко изложены в 23. Пассивная ЯСНОСТЬ хорошо подходит для экспериментов, где большое количество образцов очищается одновременно и воспроизводимости имеет большое значение. Использование гидрогеля, чтобы обеспечить дополнительную поддержку ткани облегчает месколько зондирование ткани. В этом докладе, небольшой молекулярный вес красителя, DAPI, было продемонстрировано, но несколько раундов антитела зондирующего также возможны при таком подходе.
Описанный выше подход отличается от нашего ранее опубликованного протокола 15 в нескольких важных аспектах. Во-первых, в текущем подходе, образцы не внутрисердечно перфузировались гидрогеля. Это было связано с тем, что гидрогель может преждевременно полимеризоваться в трубке и хвои перфузионной аппарата, что приводит к неполной перфузии и непоследовательным очистки. Инкубация ПАРАФОРМАЛЬДЕГИДОМ фиксированных тканей в гидрогеля в течение 7 дней согласуется с первоначальным CLARITY протоколом 14, хотя 1 день инкубации используется для 1 - секций толщиной ткани 3 мм в пассивном CLARITY Техника (ПАКТ) 17. Во- вторых, этот подход выполняет удаление липидов при несколько более высокой температуре , что ранее сообщалось 15-17. Высшее Temperaturе ускоряет удаление липидов, но должны быть сбалансированы с возможностью катастрофической потери целостности тканей (плавление). За счет увеличения температуры инкубации на 8 ° C (до 45 ° С) в течение 7 дней, а затем на 3 ° C (40 ° C) в течение оставшейся части процесса удаления липидов, очистка ткани ускоряется, но без сопутствующего риска утрата целостности ткани. Это повышение температуры согласуется с температурами , зарегистрированных в течение электрофоретическим ткани Clearing (ETC) в первоначальном протоколе Ясности (50 ° C) 14. Кроме того, не наблюдалось никакого снижения интенсивности трансгенным выраженных флуорофоров, ни снижения DAPI окрашивания.
Деоксигенация является важным шагом в создании гидрогеля. Гидрогель может полимеризоваться в присутствии кислорода, растворенного в растворе гидрогеля, но в наших руках скорость и полнота полимеризации была намного более изменчивым без деоксигенирования. Если чydrogel не полимеризуется, наиболее распространенной причиной является наличие кислорода в гидрогеле.
Оптический процесс клиринг удивительно легко осуществить, однако, микроскопия, что следует, может быть довольно сложным. Чрезвычайно важное значение имеют задачи, используемые для изображения ткани. Рабочее расстояние объектива определяет глубину, что позволяет получать изображения в образце ткани. Объективный с рабочим расстоянием 2 мм может только изображение 2 мм в образце, поэтому рабочее расстояние объектива должно быть больше, чем толщина образца для того, чтобы изображение, оно полностью. Точно так же, числовая апертура объектива накладывает ограничение на размер функций, которые он может решить как в плоскость и толщину оптических секций, которые он может приобрести по значению. Селективный Плоскость Освещение Микроскопия (SPIM) и легкой листовой Микроскопия (МНК) может преодолеть ограничение на толщину оптической секции по характеру освещения, но эти MICROSризы не являются широко доступными. Высокая числовая апертура, большие задачи рабочего расстояния являются редкими и дорогими, но необходимы для изображений высокого качества из больших оптически расчищенных участков.
После того, как изображения были приобретены, они часто очень большой, начиная от нескольких сотен МБ для низкого разрешения (как в плоскости и направлении оси г) изображения до нескольких ТБ для изображений с высоким разрешением, собранной на МНК. Компьютеры, используемые для анализа изображений требуют не только большой хранения, но большие объемы оперативной памяти (RAM) для обработки изображения. Программные пакеты , пригодные для анализа больших объемов оптически расчищенных изображения включают Amira, Imaris и ImageJ 14-16.
Среди недостатков этого подхода, пассивное ЯСНОСТЬ требует больше времени, чтобы очистить ткани по сравнению с другими оптическим клиринговых подходов. Уменьшение объема ткани должен быть очищен путем обрезки его или секционирования его на более мелкие куски могут Accelкции липидов удаление. Кроме того , уменьшение концентрации параформальдегида в гидрогеле будет в снижении сшиванию оборота и увеличить размер гидрогель пор, что приводит к более быстрой очистки 17, хотя это может привести к большему расширению ткани, отдельные экспериментаторы могут обнаружить , что она стоит снижение очистки время. Кроме того, в сочетании с TDE в качестве посреднического агента, количество расширения общей ткани, может быть ограничено.
Хотя этот отчет описывает использование малых красителей молекулярного веса, антитела зондирования является очень естественным следующим шагом. Присутствие гидрогель не только обеспечивает физическую поддержку удаляемых тканей, но и служит препятствием для проникновения антител глубоко в ткани. При уменьшении концентрации акриламида или концентрации параформальдегида увеличит размер пор в гидрогеле, облегчая (и , таким образом , ускорение) антитела проникновения 17, но это оказывает пагубное воздействие на TISSуе расширение. Тем не менее, антитела зондировании блоков ткани может быть достигнуто в течение нескольких дней и весь мозг в течение нескольких недель с использованием концентрации акриламида и параформальдегидом , описанные в первоначальном докладе 14.
Оптические методы клиринга позволяют глубоко заглянуть в мозг, способствуя пониманию его структуры и функции. Эти новые инструменты позволят исследователям визуализировать мозга на клеточном и молекулярном разрешениях, увеличивая наше понимание этого самого комплекса органов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была щедро при поддержке Национального института здоровья / Национального института неврологических расстройств и инсульта (/ NINDS NIH) грант 1R01NS086981 и Hilton Foundation Conrad N.. Мы благодарим доктора Лорана Bentolila и д-р Мэтью Schibler за их неоценимую помощь с конфокальной микроскопии. Мы благодарим тех, которые внесли свой вклад в форуме Ясности (http://forum.claritytechniques.org). Мы особенно благодарим д-ра Карла Дейссерот за открытие свою лабораторию, чтобы научить эту увлекательную технику. Авторы выражают благодарность за щедрую поддержку от мозга Mapping медицинских исследований организации, Фонд поддержки Brain Mapping, Пирсона-ловеласа, Фонд Амансон фонд, капитал группы компаний благотворительного фонда, Уильям М. и Линда Р. Dietel Филантропического фонд и Фонд Northstar , Исследования сообщили в этой публикации, также при частичной поддержке Национального центра исследовательских ресурсов и Управлением Директора нацииаль институты здоровья под номерами премии C06RR012169, C06RR015431 и S10OD011939. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | buffers |
| 32% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusion and hydrogel |
| 2,2'-thiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | refractive index matching solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hydrogel |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | clearing buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | clearing buffer |
| Sodium hydroxide | Fisher | 55255-1 | buffers |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 52002-100G | preservative |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | buffers |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusion |
| Sodium nitrate | Fisher | BP360-500 | perfusion |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | nuclear stain |
| 99.9% isoflurane | Phoenix | 57319-559-06 | anesthetic |
| Hydrocholoric acid | Fisher | A1445-500 | buffers |
| Glass bottom dish | Willco | HBSB-5040 | Willco dishes |
| Reusable adhesive | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Silicon elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Lint-free wipe | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Mouse brain matrix | Roboz | SA-2175 | sectioning tissue |
| Matrix blades | Roboz | RS-9887 | sectioning tissue |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-24 | pefusion |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 | microscopy |
| Imaging software | Leica | LAS AF | microscopy |
References
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes. J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).
- MacKenzie-Graham, A., et al. A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain. J Anat. 204, 93-102 (2004).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. Neuroimage. 101, 625-632 (2014).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Sci Rep. 5, 9808 (2015).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
- Parra, S. G., et al. Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP. J Vis Exp. (67), e3848 (2012).
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. J Viz Exp. (96), e52580 (2015).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).
