Protocol
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el Cuidado de Animales institucional y el empleo directrices del Comité (IACUC). ratones Thy1-YFP, PLP-EGFP y PV-tdTomato se utilizaron para estos experimentos, pero cualquier ratones que expresan las proteínas fluorescentes se pueden borrar y la imagen con éxito.
1. Preparación del tejido
Precaución: El paraformaldehído (PFA) y acrilamida son tóxicos e irritantes. Realizar experimentos que utilizan estos reactivos en una campana de humos y con equipo de protección personal (bata de laboratorio, guantes y protección para los ojos).
- Sacrificar al animal en la cámara de eutanasia con ~ 1 ml de isoflurano hasta que la respiración cesa (~ 2 - 3 min).
- Utilice una bomba peristáltica ajustado a ~ 5 ml / min para perfundir intracardially el ratón con solución de perfusión (Tabla 1) a 4 ° C hasta que la sangre se elimina de los tejidos (5-10 min).
- Cambiar el líquido de perfusión a la solución de fijación (Tabla 1)a 4 ° C hasta que el cuello y la cola han endurecido significativamente (5-10 min).
- Poner fin a la perfusión y decapitar al animal. Diseccionar con cuidado el cerebro del cráneo mediante la eliminación de primero el tejido conectivo que rodea el cráneo y luego la eliminación de hueso de la superficie ventral del cráneo y levantando el cerebro fuera (Figura 1a), como se describe en 20.
Nota: Prestar especial atención a la eliminación de hueso que rodea los lóbulos floculonodular del cerebelo y los bulbos olfativos.- Diseccionar la médula espinal de la columna vertebral, insertando suavemente la punta de una multa afilada tijera, entre la médula espinal y la columna vertebral y el corte de los segmentos de la columna vertebral de distancia individuales, tal como se describe en el 21.
- Hemisect el cerebro mediante la colocación en una matriz de cerebro de ratón de plástico y corte a lo largo de la línea media con una cuchilla de matriz.
- Añadir cada hemisferio y la médula espinal para separar 50 ml bañera de centrífugaes con ~ 40 ml de solución de hidrogel (Tabla 1). A partir de este punto hacia adelante la cubierta de los tubos con papel de aluminio para proteger los fluoróforos durante todas las etapas subsiguientes.
- Incubar el tubo que contiene la muestra en hidrogel a 4 ° C con agitación suave (~ 30 rpm) durante 7 días.
2. La polimerización
- Desechar ~ 25 ml de hidrogel, la preservación de la muestra y ~ 25 ml de hidrogel en el tubo de centrífuga.
- Desoxigenar la muestra mediante la eliminación de la tapa y colocar el tubo de centrífuga en el vaso de desecador y conectar el frasco a un vacío. Aplicar el vacío durante al menos 10 minutos para permitir que los gases disueltos a salir de las burbujas de la solución y la forma. agitar suavemente para desalojar las burbujas.
- Reemplazar el vacío en el frasco desecador con gas de nitrógeno 100% durante 2 - 3 min. Una vez que la presión se iguala (una vez se puede abrir la parte superior del frasco desecador), la tapa rápidamente el tubo para evitar la reintroducción de oxígeno.
- Polímeroize el hidrogel colocando el tubo con la muestra en un baño de agua a 37 ° durante 3 horas hasta que la polimerización es completa. Hidrogel polimerizado se enfrentará a una consistencia (Figura 1b) similar a un gel. Nota: Una pequeña cantidad de hidrogel polimerizado en la parte superior es aceptable.
- Use una espátula para eliminar la muestra polimerizado del tubo de centrífuga, y luego cortar el exceso de hidrogel de la muestra.
- Retire el hidrogel restante colocando la muestra en un trapo sin pelusa y frotar suavemente y rodando el tejido en él, dejando sólo una fina capa de hidrogel polimerizado en la muestra.
3. La eliminación de los lípidos
Nota: el tejido de lípido-limpiado es frágil, manejar con cuidado. Use un filtro de células durante el drenaje del tubo para evitar la pérdida de muestra. Además, la muestra se hinchará a lo largo del proceso de limpieza, sin embargo, la hinchazón puede ser invertida durante el proceso de adaptación de índice de refracción.
Precaución: Sodium dodecil sulfato (SDS) y el ácido bórico son irritantes. Realizar experimentos utilizando en una campana de humos y con equipo de protección personal (bata de laboratorio, guantes y protección para los ojos).
- Transferencia de la muestra polimerizado a un tubo de centrífuga limpio de 50 ml y añadir 45 ml de la limpieza de tampón (Tabla 1). Incubar a 45 ° C con agitación suave (~ 30 rpm). Cambiar el tampón al día durante un período inicial de 7 días mediante el vertido de la memoria intermedia de compensación utilizada en los desechos químicos y la adición de ~ 45 ml de tampón de compensación fresco. Mantener los tubos de centrífuga que contienen las muestras cubiertas de papel de aluminio para proteger los fluoróforos.
- Después de los primeros 7 días, se incuba la muestra a 40 ° C y el intercambio de tampón de compensación cada 2 - 3 días. Continuar compensación hasta que todos los lípidos se solubilizan y el tejido alcanza la transparencia (Figura 1c). Esto será de 4 - 6 semanas para un hemisferio de cerebro de ratón y 2 - 4 semanas para una médula espinal.
- Una vez que se elimina el tejido, transferirmuestra a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml y lavar 4 veces en PBST (Tabla 1) a 40 ° C con agitación suave (~ 30 rpm) durante 24 hr para eliminar residual SDS.
4. La tinción Molecular
Precaución: 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI) es un irritante y cualquier experimentos que utilizan que se debe realizar en una campana de humos y con equipo de protección personal (bata de laboratorio, guantes y protección para los ojos).
- Transferir la muestra a un tubo de centrífuga limpio de 15 ml y se llenan de 1 g / ml DAPI en 1 x PBST, pH 7,5. Se incuba a temperatura ambiente (RT) durante 24 hr. Mantener los tubos de centrífuga que contienen las muestras cubiertas de papel de aluminio para proteger los fluoróforos.
- Lavar 3 veces en PBST a TA durante al menos 6 hr / lavado.
5. Índice de Refracción Matching
Precaución: 2,2 'tiodietanol (TDE) es un irritante y cualquier experimento que utiliza shOuld llevar a cabo en una campana de humos y con equipo de protección personal (bata de laboratorio, guantes y protección para los ojos).
- Transferir la muestra a un tubo de centrífuga limpio de 15 ml y llenarlo con un 30% (v / v) TDE en 1 x PBS, pH 7,5. Incubar a 40 ° C con agitación suave (~ 30 rpm) durante 24 hr.
- Cambio de TDE 30% al 63% (v / v) de TDE en 1 x PBS, pH 7,5. Incubar a 40 ° C con agitación suave durante 24 hr.
Nota: La muestra se contraerá a su tamaño original, aproximadamente. - En una superficie plana, limpia rodar un trozo de adhesivo reutilizable en un cilindro con diámetro uniforme ligeramente mayor que el espesor de la muestra.
- Coloque el cilindro adhesiva reutilizable en un círculo abierto (~ 25 mm de diámetro interior con una pequeña abertura en la parte superior) en un plato de cristal inferior a 40 mm. Si correcciones deben hacerse, retire el cilindro del vidrio y cortar con una cuchilla de afeitar.
- Utilice una punta de pipeta P1000 para crear un sello entre el adhesivo reutilizable y vidrio porrodar alrededor del borde exterior del cilindro.
- Place ~ 100 l 63% TDE en el plato de vidrio y se extendió alrededor para cubrir la superficie del vidrio dentro del círculo de adhesivo reutilizable.
- Usando una espátula, se coloca cuidadosamente la muestra en el centro del círculo, teniendo cuidado de no formar burbujas.
- Pipetear otros 100 l de 63% de TDE directamente sobre la muestra, a continuación, colocar inmediatamente una cubierta de vidrio circular de 40 mm sobre el adhesivo reutilizable.
- Utilizando el índice, medio y anular de ambas manos, presione con cuidado alrededor del perímetro del círculo hasta que la cubierta de vidrio ha puesto en contacto con la muestra.
- Lentamente el plato de fondo de cristal a una posición vertical descansando contra una superficie, a continuación, añadir 63% TDE con una pipeta hasta que la solución llega a la pequeña abertura en la parte superior. Use un trapo sin pelusa para secar la punta de la pipeta para que la solución no gotee sobre el cristal. Para evitar las burbujas en la cámara, no vaciar la pipeta hasta el final.
- Ala pequeña abertura, añadir elastómero de silicio para encerrar el círculo y crear una cámara cerrada. Espere 5 minutos para que se seque antes de exponer.
6. Microscopía
Precaución: Los láseres utilizados en confocal, solo plano de iluminación y microscopía de lámina de luz son muy potente y puede causar ceguera. Cualquier experimento que utilizan láseres deben realizarse después de una amplia formación y con gran precaución y protección ocular adecuada.
- Coloque la cámara de imágenes con la muestra dentro de la etapa de un microscopio láser confocal de barrido.
- Abra el software de imagen (véase la Tabla de Materiales). Para encender el láser de argón de excitación, haga clic en la pestaña de configuración en la parte superior del programa y luego el icono de láser. Marque la casilla junto al argón para alimentar el láser y mover la escala deslizante a 30%. Observe el puntero calentar lentamente hasta la posición seleccionada.
- Volver a la ficha adquirir en la parte superior. En la caja grande "Configuración trayectoria del haz y# 34; ir al cargar / guardar cuadro de ajuste y seleccione el menú desplegable para seleccionar un canal de longitud de onda apropiada a la imagen YFP (527 nm).
- Seleccionar los objetivos adecuados para la formación de imágenes mediante la localización de un hipervínculo de color rojo con la etiqueta "Objetivo: objeto actual" en el cuadro de configuración de canal. Al hacer clic en la pestaña abre todos los objetivos disponibles y una selección rotará automáticamente la torreta.
- Use objetivos (por ejemplo., 10x) con una distancia grande de trabajo (mayor que el espesor del tejido para formar imágenes, por ejemplo, 11 mm) y una gran apertura numérica (por ejemplo., 0,3) para maximizar la resolución de la imagen en el plano y minimizar espesor de la sección óptica.
- En la columna izquierda de menús desplegables, abra el "XY: resolución" ventana para establecer la matriz de adquisición, llamado "formato", de 1.024 x 1.024 o un valor adecuado para el límite de resolución lateral del objetivo. Establecer el factor de zoom lo más bajo posible (por ejemplo., 10.7).
- En la misma ventana, set 8 y media de la línea 1 del marco parámetros medios dejando caer abajo en los menús marcados individualmente en consecuencia. Utilice valores grandes para una alta relación señal-ruido y los valores pequeños para la adquisición rápida.
Nota: 8 promedios de línea y 1 media de trama adquirirán imágenes de alta calidad de un hemisferio cerebral del ratón en aproximadamente 4 horas. - Busque la muestra usando los controles de la etapa. Una vez que un campo representativo es visible, establecer la ganancia y offset.
Nota: La ganancia y el desplazamiento puede variar sustancialmente en función del tipo de tejido, fluoróforos, y / o característica anatómica está formando la imagen. Para YFP, los valores de fijar de 760 a la 780: de la ganancia y de -1,0 a -1,5 para el desplazamiento. - Seleccione "exploración baldosas" y seleccione los límites de la región de interés. Establecer los límites superior e inferior de la pila Z a adquirir. Ajuste el espesor de la sección óptica basada en el límite de la sección de resolución óptica del objetivo.
Nota: Un objetivo delímite de la sección de resolución óptica se define principalmente por su apertura numérica. La mayoría del software de control de microscopio calculará automáticamente un valor apropiado para el objetivo que se utiliza. Para un objetivo de 10X con una apertura numérica de 0,3 que sería de aproximadamente 11 micras. - Iniciar la adquisición.
Nota: Este proceso puede tardar varias horas. - Recoge imágenes de mayor resolución usando objetivos de mayor aumento de las regiones específicas de interés.
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Representative Results
La visualización de la organización estructural del cerebro es fundamental para la comprensión de cómo la morfología y la conectividad afectan la función cerebral en la salud y la enfermedad. técnicas de compensación ópticas hacen posible poblaciones celulares imagen en 3D en los tejidos intactos, que nos permite estudiar la morfología y la conectividad de manera cohesiva.
Los ratones que expresan proteínas fluorescentes impulsado por promotores específicos de subpoblaciones de células permiten que uno de separar el complejo patrón de conectividad neuronal en el cerebro. Ratones transgénicos Thy1-YFP se han utilizado ampliamente en la literatura de compensación óptica debido a que estos ratones expresan YFP en un subconjunto de neuronas de proyección que residen en la corteza cerebral y el hipocampo, así como otras estructuras en el cerebro (figura 2a y b). Por otra parte, YFP + corticales neuronas de la capa V proyectan a través del tracto corticoespinal en los sespinal pinal (Figura 2c + D + i), que los hace muy útiles para evaluar el efecto de insulto y / o lesión axonal en la médula espinal en neuronas corticales 15. A través del uso de la microscopía confocal y seccionamiento óptico de tejidos ópticamente despejados se puede evaluar fácilmente las diferencias en la densidad neuronal a través de grandes estructuras anatómicas.
Además de ratones transgénicos Thy1-YFP, cualquier número de ratones transgénicos se pueden obtener imágenes. Ratones transgénicos PLP-EGFP expresan proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) en oligodendrocitos maduros que expresan la proteína proteolipídica (PLP) en todo el cerebro y la médula espinal (Figura 3a). Ratones transgénicos que expresan PV-tdTomato tdTomato en un subconjunto de parvalbúmina (PV) que expresa las interneuronas en el cerebelo, cuerpo estriado y el hipocampo (Figura 3b). Incluso en ratones que no expresan transgenes fluorescentes, colorantes fluorescentes de pequeño peso molecular, tales como DAPI, puede difundirse fácilmente en los tejidos de hidrogel incorporado y permitir la evaluación de núcleos celulares en el cerebro (Figura 4).
Figura 1:. Las diferentes etapas del cerebro de Compensación Fotografía del cerebro thy1-YFP + ratón que ha sido extraído del cráneo (a). Fotografía del hemisferio cerebral thy1-YFP + ratón hidrogel incorporado (b). Fotografía de thy1-YFP + ratón hemisferio cerebral después de la eliminación de lípidos (c). Las barras de escala son de 5 mm en cada panel. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: thy1-YFP expresión en el cerebro de unaThy1-YFP + neuronas en la corteza cerebral y de la médula espinal. nd hipocampales, fotografiado con un aumento de 5X y reconstruido en 3D (a). Una proyección de intensidad máxima de una imagen de la pila 10 veces de la corteza cerebral que demuestra la arborización dendrítica de las neuronas piramidales corticales capa V (B). expresión Thy1-YFP en una médula espinal cervical y torácica intacta fotografiada con un aumento de 5X y reconstruido en 3D (c). Una proyección de intensidad máxima de una imagen de la pila 10 veces de la médula espinal que demuestra los axones individuales (D). Las barras de escala son de 1 mm en (a), 100 micras en (b), de 2 mm en (c), y 100 micras en (d). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: PLP-EGFP y PV-tdTomato expresión en el cerebro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La tinción DAPI DAPI en la expresión cerebral en el cerebelo de un hemisferio cerebral intacta reflejado en un aumento de 5X.. La imagen es de aproximadamente 1 mm desde el plano sagital medio. El recuadro muestra el nivel de detalle visible en esta profundidad de imagen en un aumento de 10X. Escala de barras de unare 250 micras en el panel principal y 50 micras en el recuadro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Buffer | Químico | La concentración final |
| solución de perfusión | ||
| 10x de solución salina tamponada con fosfato | 1x | |
| Nitrato de sodio | 0.5% w / v | |
| La heparina | 10 U / ml | |
| solución fijadora | ||
| 10x de solución salina tamponada con fosfato | 1x | |
| ParaformaldehyDelaware | 4% v / v | |
| solución de hidrogel | ||
| 10x de solución salina tamponada con fosfato | 1x | |
| paraformaldehído | 4% v / v | |
| acrilamida | 4% v / v | |
| Bis-acrilamida | 0,05% v / v | |
| VA-044 Iniciador | 0,25% w / v | |
| búfer de compensación | ||
| Ácido bórico | 200 mM | |
| Dodecil sulfato de sodio | 4% w / v | |
| PBST | ||
| 10x de solución salina tamponada con fosfato | 1x | |
| Triton X-100 | 0,1% v / v | |
| La azida sódica | 0.1% w / v |
Tabla 1: Lista de los tampones y soluciones.
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Discussion
compensación pasiva de los tejidos de hidrogel incrustado (claridad pasiva) es un método sencillo y barato para la limpieza de piezas grandes de tejido. Este enfoque no requiere un equipo dedicado y se puede realizar fácilmente en un agitador de temperatura controlada. En el lapso de unas pocas semanas, los tejidos, incluso grandes, altamente mielinizados, como todo un cerebro o la médula espinal, llegarán a ser transparentes y adecuados para la microscopía. A pesar de que este informe se ha centrado en la limpieza de tejidos del SNC, CLARITY pasiva se puede aplicar a cualquier tejido.
Las fortalezas y debilidades relativas de las técnicas de compensación óptica se han discutido previamente en la literatura 13,17,22, pero la mayoría están claramente establecidos en el 23. CLARIDAD pasiva es muy adecuado para experimentos en los que un gran número de muestras se están limpiando simultáneamente y reproducibilidad es de gran importancia. El uso de un hidrogel para proporcionar apoyo adicional al tejido facilita multiple sondeo del tejido. En este informe, un pequeño tinte de peso molecular, DAPI, se demostró, sino múltiples rondas de anticuerpo de sondeo también son posibles con este enfoque.
El método descrito anteriormente se desvía de nuestro protocolo publicado previamente 15 en un par de maneras significativas. En primer lugar, en el actual enfoque, los especímenes fueron intracardially no perfundidos con hidrogel. Esto era debido al hecho de que el hidrogel puede polimerizar antes de tiempo en la tubería y agujas del aparato de perfusión, que conduce a perfusiones incompletas y de compensación inconsistente. La incubación de los tejidos paraformaldehído fijo en hidrogel durante 7 días es consistente con el protocolo original de CLARITY 14, aunque de una incubación de 1 día se utiliza para 1 - secciones de tejido de espesor 3 mm en la técnica de CLARITY pasiva (PACT) 17. En segundo lugar, este enfoque lleva a cabo la eliminación de lípidos a una temperatura ligeramente superior que se informó anteriormente 15-17. temperatur superiore acelera la eliminación de lípidos, pero debe equilibrarse con la posibilidad de una pérdida catastrófica de la integridad del tejido (de fusión). Al aumentar la temperatura de incubación en un 8 ° C (a 45 ° C) durante 7 días y luego por 3 ° C (a 40 ° C) durante el resto del proceso de eliminación de lípidos, la limpieza de tejidos se acelera, pero sin el riesgo concomitante de la pérdida de la integridad del tejido. Este aumento de temperatura es consistente con temperaturas notificadas durante electroforética Clearing Tissue (ETC) en el protocolo de CLARITY original (50 ° C) 14. Además, no se ha observado disminución en la intensidad de fluoróforos expresados transgénicamente ni disminución en la tinción DAPI.
Desoxigenación es un paso importante en la creación del hidrogel. El hidrogel puede polimerizar en la presencia de oxígeno disuelto en la solución de hidrogel, pero en nuestras manos la tasa y totalidad de polimerización era mucho más variable sin desoxigenación. Si el hydrogel no se polimeriza, la razón más común es la presencia de oxígeno en el hidrogel.
El proceso de compensación óptica es muy fácil de poner en práctica, sin embargo, la microscopía que sigue puede ser bastante complicado. De importancia crítica son los objetivos que se utilizan para la imagen del tejido. La distancia de trabajo de un objetivo define el que se pueden tomar imágenes de profundidad en una muestra de tejido. Un objetivo con una distancia de trabajo de 2 mm puede única imagen 2 mm en una muestra, por lo tanto, la distancia de trabajo de un objetivo debe ser mayor que el espesor de la muestra con el fin de la imagen por completo. Del mismo modo, la apertura numérica de un objetivo pone un límite al tamaño de características que puede resolver tanto en el plano y el espesor de las secciones ópticas que se puede adquirir de manera significativa. Plane selectivo Iluminación Microscopy (SPIM) y la hoja de Microscopía de luz (LSM) pueden superar la limitación del espesor de la sección óptica por la naturaleza de la iluminación, pero estos microscapas pluviales no están ampliamente disponibles. Alta apertura numérica, objetivos gran distancia de trabajo son raros y caros, pero son necesarias para obtener imágenes de alta calidad a partir de grandes secciones ópticamente despejadas.
Una vez que las imágenes han sido adquiridos, que a menudo son muy grandes, que van desde varios cientos de MB de resolución baja (tanto en el plano y la dirección z) Imagen a unos pocos TB una imagen de alta resolución recogida en un LSM. Los equipos que se utilizan para el análisis de imágenes no sólo requieren una gran cantidad de almacenamiento, pero grandes cantidades de memoria de acceso aleatorio (RAM) para el procesamiento de imágenes. Los paquetes de software adecuadas de los análisis de grandes volúmenes de imagen ópticamente despejadas incluyen Amira, Imaris, y ImageJ 14-16.
Entre las limitaciones de este enfoque, CLARIDAD pasiva requiere más tiempo para aclarar los tejidos que otros enfoques de compensación óptica. Disminuir el volumen del tejido a ser limpiado por el recorte o el corte en trozos más pequeños pueden Accellípidos eliminación eRate. Además, la disminución de la concentración de paraformaldehído en el hidrogel, a su vez disminución de reticulación y aumentar el tamaño de hidrogel de poro, lo que lleva a la más rápida de compensación 17, aunque esto puede conducir a una mayor expansión del tejido, los experimentadores individuales pueden encontrar que vale la pena la disminución de la compensación hora. Además, combinado con TDE como agente de eliminación, la cantidad de la expansión del tejido en general puede ser limitada.
Aunque este informe se describe el uso de tintes de bajo peso molecular, anticuerpos de palpación es un siguiente paso muy natural. La presencia del hidrogel no sólo proporciona soporte físico a los tejidos aclarados, sino que también sirve como un impedimento para la penetración de los anticuerpos profundamente en el tejido. La disminución de la concentración de acrilamida o la concentración de paraformaldehído aumentará el tamaño de los poros en el hidrogel, facilitando (y por lo tanto de aceleración) anticuerpo penetración 17, pero esto tiene un efecto perjudicial sobre tissue expansión. Sin embargo, el anticuerpo de sondeo de los bloques de tejido puede llevarse a cabo en cuestión de días y de todo el cerebro en un par de semanas utilizando las concentraciones de acrilamida y paraformaldehído descritas en el informe original 14.
técnicas de compensación ópticos permiten a uno mirar profundamente en el cerebro, profundizando en el conocimiento de su estructura y función. Estas nuevas herramientas permitirán a los investigadores visualizar el cerebro a resoluciones celulares y moleculares, aumentando nuestra comprensión de este más compleja de órganos.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado generosamente por los Institutos Nacionales de / Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NIH / NINDS) y la subvención 1R01NS086981 Conrad N. Hilton Foundation Salud. Agradecemos al Dr. Laurent Bentolila y el Dr. Mateo Schibler por su valiosa asistencia con microscopía confocal. Agradecemos a todos los que han contribuido al foro CLARITY (http://forum.claritytechniques.org). Agradecemos especialmente el Dr. Karl Deisseroth para la apertura de su laboratorio para enseñar esta técnica fascinante. Los autores están muy agradecidos por el generoso apoyo de la Organización de Investigación Médica Brain Mapping, Mapeo Cerebral Fundación textuales, Pierson-Lovelace Fundación, la Fundación Ahmanson, Fundación de Caridad Capital Group Companies, William M. y R. Linda Fondo Filantrópico Dietel, y el Fondo de Northstar . Las investigaciones realizadas en esta publicación también fue apoyado en parte por el Centro Nacional de Recursos para la Investigación y la Oficina del Director de la NaciónAl Institutos de Salud bajo los números de adjudicación C06RR012169, C06RR015431, y S10OD011939. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | buffers |
| 32% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusion and hydrogel |
| 2,2'-thiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | refractive index matching solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hydrogel |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | clearing buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | clearing buffer |
| Sodium hydroxide | Fisher | 55255-1 | buffers |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 52002-100G | preservative |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | buffers |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusion |
| Sodium nitrate | Fisher | BP360-500 | perfusion |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | nuclear stain |
| 99.9% isoflurane | Phoenix | 57319-559-06 | anesthetic |
| Hydrocholoric acid | Fisher | A1445-500 | buffers |
| Glass bottom dish | Willco | HBSB-5040 | Willco dishes |
| Reusable adhesive | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Silicon elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Lint-free wipe | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Mouse brain matrix | Roboz | SA-2175 | sectioning tissue |
| Matrix blades | Roboz | RS-9887 | sectioning tissue |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-24 | pefusion |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 | microscopy |
| Imaging software | Leica | LAS AF | microscopy |
References
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