Protocol
Tüm deneyler Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) kurallarına uygun olarak yapıldı. Thy1 YFP, PLP-EGFP PV-tdTomato farenin Bu deneyler için kullanılmıştır, ama floresan proteinleri eksprese bir farenin başarılı bir şekilde temizlenir ve görüntülenebilir.
1. Doku Hazırlanması
Dikkat: Paraformaldehyde (PFA) ve akrilamid toksik ve tahriş edicidir. Davlumbaz ve uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) bu reaktifleri kullanılarak deneyler.
- (- 3 dakika ~ 2) solunum sona erene kadar izofluran ~ 1 ml ötenazi odasında hayvan kurban.
- (- 10 dakika 5), kan dokulardan temizlenir kadar ~ 5 ml ayarlanmış bir peristaltik pompa kullanımı / dak intrakardiyak, 4 ° C de perfüzyon çözeltisi (Tablo 1) ile fare perfüze edilmesi için.
- Fiksatif çözüm için perfüzat değiştirin (Tablo 1)(- 10 dakika 5), 4 ° C'de, boyun ve kuyruk anlamlı katılaşana dek.
- perfüzyon End ve hayvan başını kesmek. Dikkatle ilk kafatası çevreleyen bağ dokusu çıkarılması ve sonra da kafatasının ventral yüzeyinden kemik kaldırılması ve 20 de açıklandığı gibi, (Şekil 1a) beynini kaldırarak kafatası beyin teşrih.
Not: beyincik flocculonodular lobları ve koku ampuller çevreleyen kemiğin çıkarılması için özel bakım verir.- Nazikçe omurilik ve vertebral kolon arasında ince bir keskin makas ucu sokarak ve 21 de açıklandığı gibi, uzak bireysel omurga segmentleri keserek vertebra sütundan omurilik parçalara ayır.
- plastik bir fare beyin matrisi içine yerleştirerek ve bir matris bıçak ile orta hat boyunca keserek beyin Hemisect.
- santrifüj küvet 50 ml ayırmak için her yarımkürede ve omurilik ekleES ~ hidrojel çözeltisi (Tablo 1) 40 ml. Bu noktada ileri kapaktan alüminyum folyo ile tüpler sonraki tüm adımları sırasında fluorophores korumak için.
- yumuşak 7 gün boyunca (~ 30 rpm) çalkalayarak 4 ° C'de hidrojel örneğini içeren tüp inkübe edin.
2. Polimerizasyon
- Santrifüj tüpü içinde ~ hidrojelin 25 ml numune ve koruyucu, ~ hidrojelin 25 mi atın.
- kapağı çıkarmadan ve kurutucu kavanoza santrifüj tüpü yerleştirilmesi ve bir vakum kavanozu bağlayarak örnek oksilenlendirilmesi. çözüm ve form kabarcıklar çıkmaya çözünmüş gazlar izin için en az 10 dakika süreyle vakum uygulamak. Yavaşça kabarcıklarını çıkarmak için sallayın.
- 3 dakika - 2 üzerinde% 100 azot gazı ile desiccator kavanoza vakum değiştirin. basıncı (kurutucu kavanozun üst açılabilir kez) eşitleyen sonra, hızlı bir şekilde oksijen reintroduction önlemek için tüp kap.
- PolimerPolimerizasyon işlemi tamamlanana kadar, 3 saat için 37 ° C su banyosu içinde örnek tüpü yerleştirerek hidrojel ize. Polimerize hidrojel jel benzeri bir kıvam (Şekil 1b) alacak. Not: üst polimerleşmemiş hidrojel az miktarda kabul edilebilir.
- Daha sonra, santrifüj tüpüne gelen polimerize örneği kaldırmak örnekten fazla hidrojel kesip bir spatula kullanın.
- silip bir tüy bırakmayan üzerinde örnek yerleştirerek ve yavaşça örnek üzerinde polimerize hidrojel, sadece ince bir tabaka geride bırakarak, sürtünme ve üzerinde doku yuvarlayarak kalan hidrojel çıkarın.
3. Lipit Kaldırma
Not: Lipid temizlenir doku kırılgan, dikkatli olun. tüp boşaltırken örnek kaybetmemek için bir hücre süzgeç kullanın. Ayrıca, örnek kırılma indisini uyumlu hale işlemi sırasında ters olabilir şişen, ancak, temizleme işlemi boyunca şişer.
Dikkat: Sodium dodesil sülfat (SDS) ve borik asit tahriş edicidir. Davlumbaz ve uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) ile onları kullanan deneyler.
- Temiz bir 50 ml santrifüj tüpüne polimerize örnek aktarın ve tampon (Tablo 1) temizleme 45 ilave edin. hafifçe çalkalanarak 45 ° C (~ 30 rpm) inkübe edilir. kimyasal atık içine kullanılan takas tampon dökülen ve taze takas tampon ~ 45 ml ekleyerek ilk 7 gün boyunca günde tampon değiştirin. florofor korumak için alüminyum folyo ile kaplanmış numunelerin içeren santrifüj tüplerini muhafaza edin.
- 3 gün - ilk 7 gün sonra, her 2 40 ° C ve döviz takas tamponu de örnek kuluçkaya yatmaktadır. Tüm lipidler çözünmüş ve doku şeffaflık (Şekil 1c) ulaşıncaya kadar takas devam edin. Bir fare beyin yarımkürede 6 hafta ve 2 - - Bir omurilik için 4 hafta Bu 4 olacak.
- Doku temizlendikten sonra, aktarmakYeni bir 50 ml santrifüj tüpüne numune ve kalıntı SDS kaldırmak için 24 saat boyunca hafif bir çalkalama (~ 30 rpm) 40 ° C'de PBST (Tablo 1) 4 kez yıkayın.
4. Moleküler Boyama
Dikkat: 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole dihidroklorür (DAPI) tahriş edici ve davlumbaz ve uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) ile yapılmalıdır kullanan herhangi deneyler olduğunu.
- Temiz bir 15 ml santrifüj tüpüne örnek transferi ve 1 x PBST içinde 1 ug / ml DAPI, pH 7.5 ile doldurun. 24 saat oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir. florofor korumak için alüminyum folyo ile kaplanmış numunelerin içeren santrifüj tüplerini muhafaza edin.
- en az 6 saat / yıkama için oda sıcaklığında PBST içinde 3 kez yıkanır.
5. Refraktif İndeks Eşleştirme
Dikkat: sh 2,2'-Thiodiethanol (TDE) tahriş edicidir ve herhangi deneyler onu kullananDavlumbaz ve uygun kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması) ile yapılabilir ould.
- Temiz bir 15 ml santrifüj tüpüne örnek aktarın ve% 30 1 x PBS içinde (hac / hac) TDE, pH 7.5 ile doldurun. 24 saat boyunca hafifçe çalkalanarak 40 ° C (~ 30 rpm) inkübe edilir.
- 1 x PBS, pH 7.5 içinde% 63 (h / h) TDE Exchange% 30 TDE. yumuşak, 24 saat boyunca çalkalanarak 40 ° C'de inkübe edin.
Not: Örnek, yaklaşık orijinal boyutuna geri çekilmek olacaktır. - düz ve temiz bir yüzey üzerine numunenin kalınlığından sadece biraz daha düzgün bir çapa sahip bir silindirin içine yeniden bir yapışkan parça döndürün.
- açık uçlu daire yeniden kullanılabilir yapışkan silindiri Lay (~ üst kısmında küçük bir açıklığı olan 25 mm iç çap) 40 mm cam alt çanak. düzeltmeler yapılması gerekiyorsa, cam silindir kaldırmak ve bir jilet ile kesti.
- ile yeniden yapıştırıcı ile cam arasında bir sızdırmazlık oluşturmak için bir P1000 pipet kullanınsilindirin dış kenarı etrafında yuvarlayarak.
- Yeri ~ 100 ul% 63 cam tabak üzerine TDE ve yeniden yapıştırıcı daire içinde cam yüzeyini kapsayacak şekilde yayıldı.
- Bir spatula ile dikkatlice kabarcıkları oluşturmak için özen çemberin ortasında numuneyi.
- hemen ardından tekrar kullanılabilir yapıştırıcı üzerinde 40 mm yuvarlak cam kapak yerleştirin, doğrudan numune üzerine% 63 TDE başka 100 ul pipetle.
- cam kapak örneği ile temas yapmış kadar indeksi, orta ve iki elin yüzük parmağı kullanarak, dikkatli dairenin çevresinde basın.
- Yavaş yavaş bir yüzeye karşı duran dik konuma cam alt yemek getirmek Çözelti en küçük açıklığı ulaşana kadar daha sonra bir pipet yardımıyla% 63 TDE ekleyin. ücretsiz bir çözüm camına damla kalmaması pipet kapalı kuru silin bir tüy bırakmayan kullanın. odasında kabarcıkları önlemek için, pipet tüm yol boş asla.
- içinküçük açma, daire içine ve kapalı bir odasını oluşturmak için silikon elastomer ekleyin. o görüntüleme önce kurumaları için 5 dakika bekleyin.
6. Mikroskopi
Dikkat: konfokal, tek düzlem aydınlatma ve ışık levha mikroskopi kullanılan lazerler çok güçlü ve körlüğe neden olabilir. lazerler kullanan herhangi deneyler geniş eğitimden sonra ve büyük bir dikkatle ve uygun göz koruması ile yapılmalıdır.
- Bir lazer tarama konfokal mikroskop sahnede iç numune ile görüntüleme odasına yerleştirin.
- görüntüleme yazılımı açın (Malzeme Tablo). Argon uyarma lazer açmak için, daha sonra programın lazer simgesinin üstündeki yapılandırma sekmesini tıklatın. lazer güç ve% 30 slayt ölçekli taşımak için argon yanındaki kutuyu işaretleyin. işaretçi yavaşça seçilen pozisyona ısınmak gözlemleyin.
- üstündeki acquire sekmesine dönün. Büyük kutusuna "Işın Yolu Ayarları &# 34; / Yük gitmek kutusu ayarı kaydetmek ve görüntü YFP (527 nm) için uygun bir dalga boyu kanalı seçmek için açılır menüyü seçin.
- kanal ayarları kutusunun altında: "Mevcut nesne objektif" etiketli kırmızı köprü bularak görüntüleme için uygun hedefleri seçin. sekmesini tıklayarak mevcut tüm hedefleri açılır ve bir seçim taret otomatik olarak dönecektir.
- Kullanım amaçları (örn., 10X), büyük bir çalışma mesafesi ile (doku kalınlığından daha büyük, yansıması için, örneğin 11 mm) ve geniş bir sayısal açıklık (örn., 0.3) düzlem resim çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak ve en aza indirmek için optik kesit kalınlığı.
- 1024 x 1,024 "biçim" denilen toplama matriks ayarlamak için pencereyi, ya da objektif lateral çözünürlük sınırı için uygun bir değer: "çözünürlük XY" açık, açılır menüler sol sütun üzerinde. (Mümkün olduğunca düşük yakınlaştırma faktörünü ayarlamak gibi., 10,7).
- Aynı pencerede, buna göre bireysel olarak etiketli menüleri aşağı bırakarak 8 hat ortalama ve 1 çerçeve ortalama parametreleri ayarlayın. hızlı elde edilmesi için yüksek bir sinyal-gürültü oranı ve küçük değerler için büyük değerler kullanın.
Not: 8 hat ortalamaları ve 1 kare ortalama yaklaşık 4 saat içinde bir fare beyin yarımkürede yüksek kaliteli görüntüler elde edecektir. - sahne kontrollerini kullanarak örnek bulun. temsili bir alan görünür sonra, kazanç ve ofset ayarlayın.
kazanç ve doku tipi, fluorophores dayalı ölçüde değişecektir ofset ve / veya anatomik özellik görüntülü Not:. YFP için kazanç için 780 760 den ve -1.0 ofset için -1.5 değerleri ayarlayın. - "Karo tarama" seçin ve ilgi bölgenin sınırlarını belirleyin. z-yığının Set alt ve üst sınırları elde edilecek. Amaç optik bölüm çözünürlük sınırına dayalı optik bölümün kalınlığı ayarlayın.
Not: Bir amaç enoptik bölüm çözünürlük sınırı öncelikle sayısal açıklık ile tanımlanır. otomatik olarak objektif bir değer uygun olan hesaplar en mikroskop kontrol yazılımı kullanılmaktadır. 0.3 sayısal diyafram ile 10X objektif için bu yaklaşık 11 mikron olacaktır. - edinimi başlatın.
Not: Bu, birden çok saat sürebilir. - özel ilgi bölgelerinden daha yüksek büyütme hedefleri kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntüler toplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beynin yapısal organizasyonu görselleştirme morfolojisi ve bağlantı sağlık ve hastalık beyin fonksiyonlarını nasıl etkilediğini anlamak için kritik öneme sahiptir. Optik takas teknikleri bize cohesively morfolojisi ve bağlantı incelemek için izin sağlam dokularda 3D görüntü hücre popülasyonu için mümkün kılar.
Hücreler beyindeki sinir bağlantı karmaşık bir desen ayrı kızdırmak için bir izin alt popülasyonlar için özel rehberleri tarafından yönlendirilen floresan proteinleri ifade Fareler. Bu fareler, beyin (Şekil 2a ve b) projeksiyon serebral korteks ve hipokampus bulunan nöronlar gibi diğer yapılar bir alt YFP ifade çünkü thy1 YFP transjenik farenin optik temizleme literatürde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, YFP + kortikal tabaka V nöronlar s kortikospinal yolu ile projekortikal nöronların 15 omurilik akson hakaret ve / veya yaralanma etkisini değerlendirmek için onları çok kullanışlı hale pinal kordon (Şekil 2c ve d). optik temizlenmiş dokuların konfokal mikroskopi ve optik kesit kullanımı sayesinde kolayca büyük anatomik yapıların arasında nöronal yoğunluk farklılıklarını değerlendirir.
Thy1 YFP transgenik farelerin yanı sıra, transgenik farelerin herhangi bir sayıda görüntülü olabilir. PLP-EGFP transgenik fareler, beyin ve omurilik (Şekil 3a) boyunca proteolipid protein (HUA) ifade olgun oligodendrositlere yeşil floresan protein (EGFP) geliştirilmiş express. PV-tdTomato transgenik olan farelerde beyincik, striatum ve hipokamp (Şekil 3b) 'de internöronlardan ifade parvalbumin (PV)' in bir alt-grup içinde tdTomato ifade eder. Hatta farelerde D gibi floresan transgenler, küçük molekül ağırlıklı floresan boyalar, ifade ettikleriniAPI kolaylıkla hidrojel gömülü dokulara nüfuz ve beyin (Şekil 4) hücre çekirdekleri değerlendirilmesini izin verir.
Şekil 1:. Kafatasından çıkarılmış thy1-YFP + fare beyninin Beyin Takas Fotoğraf Farklı Aşamaları (a). Hidrojel gömülü thy1-YFP + fare beyin yarımkürede (b) Fotoğraf. Lipid kaldırma (c) sonra thy1-YFP + fare beyin yarımkürede Fotoğraf. Ölçek çubukları her panelde 5 mm'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Beyin a'daki thy1-YFP İfadeserebral korteks nd Omurilik. thy1-YFP + nöronlar ve 5X büyütmede görüntülü ve 3D yeniden hippocampus (a). kortikal tabaka V piramidal nöronlar (b) dendritik arborization gösteren serebral korteksin 10X görüntü yığını maksimum yoğunluk projeksiyonu. sağlam bir servikal ve torakal omurilikteki thy1-YFP ifadesi 5X büyütmede görüntülü ve 3D (c) yeniden. Bireysel aksonlar (d) gösteren omurilik 10X görüntü yığını maksimum yoğunluk projeksiyonu. Ölçek çubukları 1 mm (a), 100 mikron (b), 2 (c) mm ve (d) 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Beyindeki PLP-EGFP ve PV-tdTomato ifadesi. bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. 5X büyütmede görüntülü bozulmamış serebral hemisfer beyinciğindeki beyin DAPI ifade DAPI boyama. Görüntü midsagital düzleminden yaklaşık olarak 1 mm kadardır. içerlek 10X büyütmede bu görüntüleme derinlikte görünür ayrıntı düzeyini gösterir. Ölçek bar biriçerlek 250 ana panelde um ve 50 um yeniden. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| tampon | Kimyasal | Nihai konsantrasyon |
| Perfüzyon çözeltisi | ||
| 10x fosfat tamponlu salin | 1x | |
| Sodyum nitrat | % 0.5 ağ / hac | |
| heparin | 10 U / ml | |
| fiksatif çözüm | ||
| 10x fosfat tamponlu salin | 1x | |
| Paraformaldehyde | % 4 h / h | |
| hidrojel çözümü | ||
| 10x fosfat tamponlu salin | 1x | |
| Paraformaldehyde | % 4 h / h | |
| akrilamid | % 4 h / h | |
| : Bis-akrilamid | % 0.05 h / h | |
| VA-044 Başlatıcı | % 0.25 ağ / hac | |
| Takas tampon | ||
| Borik asit | 200 mM | |
| Sodyum dodesil sülfat | % 4 a / h | |
| PBST | ||
| 10x fosfat tamponlu salin | 1x | |
| Triton X-100 | % 0.1 h / h | |
| Sodyum azid | % 0.1 ağ / hac |
Tablo 1: Tamponlar ve Çözümleri listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hidrojel gömülü dokularda (pasif CLARITY) pasif takas dokusunun büyük parçalar temizlenmesi için basit ve ucuz bir yöntemdir. Bu yaklaşım, özel ekipman gerektirmez ve kolay bir şekilde, sıcaklık kontrollü sallayıcı içinde gerçekleştirilebilir. Birkaç haftalık bir sürede içinde, örneğin bütün bir beyin ya da spinal kord bile büyük, çok miyelinli dokular, şeffaf ve mikroskopi için uygun olacaktır. Bu rapor, merkezi sinir sistemi doku temizleme odaklanmış olmasına rağmen, pasif AÇIKLIK herhangi bir dokuya uygulanabilir.
Optik takas tekniklerinin güçlü ve zayıf yönleri, literatürde 13,17,22 daha önce tartışılmıştır, ama en açık 23'te ortaya koydu. örneklerin çok sayıda eş zamanlı olarak temizlenir ve tekrar elde büyük önem taşımaktadır edilmektedir burada pasif AÇIKLIK deneyler için de uygundur. Doku m kolaylaştıran bir hidrojel kullanımının ek destek sağlamakultiple doku sondalama. Bu raporda, bir küçük molekül ağırlıklı boya DAPI göstermiştir, ancak tarama bir antikorun birden çok mermi Bu yaklaşım ile de mümkündür.
Yukarıda açıklanan yaklaşım önemli yollarından bir çift bizim daha önce yayınlanan protokolü 15 sapar. Birincisi, mevcut yaklaşımla, numuneler intrakardiyak hidrojel ile perfüze değildi. Bu hidrojel zamanından önce tam olmayan perfüzyonları ve tutarsız temizleme yol tüp ve perfüzyon aparatı iğnelerine polimerize gerçeği nedeniyle. PASİF AÇIKLIK Tekniği (Paktı) 17, 3 mm kalınlığında doku bölümleri - 1 gün inkübasyon 1 için kullanılan da 7 gün süre ile hidrojel paraformaldehid sabit dokuların inkübe orijinal AÇIKLIK protokolü 14 ile uyumludur. İkinci olarak, bu yaklaşım, daha önce 15-17 rapor biraz daha yüksek bir sıcaklıkta, yağ çıkarma gerçekleştirir. yüksek sıcaklıke lipit kaldırma hızlandırır, ancak doku bütünlüğü (erime) bir felaket kaybı ihtimaline karşı dengeli olmalıdır. Lipid kaldırma işleminin geri kalan kısmı için (40 ° C) 3 ° C daha sonra 7 gün boyunca (45 ° C) 8 ° C inkübasyon sıcaklığı artışı ve doku temizleme hızlanmış ancak eş zamanlı riski olmadan doku bütünlüğünün kaybı. Bu sıcaklık artışı, orijinal AÇIKLIK protokolünde elektroforetik doku temizleme (VB) (50 ° C) 14 bildirilmiştir sıcaklıklar ile tutarlıdır. Ayrıca, transgenik olarak eksprese floroforlar de DAPI boyama azalma yoğunluğundaki bir azalma gözlenmiştir.
Deoksijenasyon hidrojel yaratılmasında önemli bir adımdır. Hidrojel hidrojel çözelti içinde çözünmüş oksijen varlığında polimerize olabilir, ancak elimizdeki hızı ve polimerizasyonun tamlığı çok daha fazla değişken deoksijenasyon idi. h Eğerydrogel en yaygın nedeni, hidrojel oksijen varlığı, polimerize etmez.
optik temizleme işlemi uygulamak son derece kolaydır, ancak aşağıdaki mikroskopi oldukça karmaşık olabilir. kritik öneme sahip doku görüntü kullanılan hedeflerdir. Bir amacın çalışma mesafesi bir doku numunesi içine derinliği it can görüntü tanımlar. 2 mm çalışma mesafesi olan bir amacı, sadece görüntü örnek içine 2 mm kadar, bu nedenle amacı çalışma mesafesi görüntü için, tamamen örnek kalınlığından daha büyük olmalıdır olabilir. Benzer şekilde, bir amacın sayısal açıklık bir sınırı içeri-düzlemi ve anlamlı edinebilirler optik bölümlerinin kalınlığı hem çözebilirsiniz özellikleri boyutunu yerleştirir. Seçici Düzlem Aydınlatma Mikroskobu (SPIM) ve Hafif Sac Mikroskobu (EKK) aydınlatma doğası gereği optik kesit kalınlığı üzerinde sınırlama üstesinden, ancak bu microsCopes yaygın olarak kullanılabilir değildir. Yüksek sayısal diyafram, geniş çalışma mesafesi hedefleri nadir ve pahalı, ancak büyük optik temizlenmiş bölümlerde yüksek kaliteli görüntüleme için gereklidir.
görüntüleri elde edildikten sonra, bir düşük çözünürlük için birkaç yüz MB arasında değişen, genellikle çok büyük (hem de z-yönünde-düzleminde) bir LSM üzerinde toplanan bir yüksek çözünürlüklü görüntü için bir kaç TB için resmin. görüntü analizi için kullanılan bilgisayarlar depolama büyük, ama görüntü işleme için rasgele erişim belleği (RAM) büyük miktarlarda sadece gerektirir. Büyük optik temizlenir görüntü hacimlerinin analizi uygun yazılım paketleri Amira, Imaris ve ImageJ 14-16 arasındadır.
Bu yaklaşımın sınırlamaları arasında, pasif CLARITY diğer optik takas yaklaşımlara kıyasla dokuları temizlemek için daha fazla zaman gerektirir. doku hacmi azalan Accel küçük parçalara içine onu kırparak veya kesit ile silinebilirerate lipid kaldırma. Bu büyük bir doku genişlemesi neden olsa da, hidrojel paraformaldehid konsantrasyonunu azaltarak dönüş azalma çapraz bağlama ve daha hızlı açıklığa 17 giden, hidrojel gözenek boyutu artacak, bireysel deneyci bu açıklıkta azalma değer olduğunu görebilirsiniz zaman. Bundan başka, bir temizleme maddesi olarak TDE ile birlikte, genel olarak doku genişleme miktarı sınırlı olabilir.
Bu rapor, küçük molekül ağırlıklı boyaların kullanımını tarif rağmen, sondalama antikor çok doğal bir sonraki adımdır. hidrojel varlığı sadece temizlenir dokulara fiziksel destek sağlar, ancak, aynı zamanda, derin doku içine antikorların nüfuz etmesi için bir engel olarak görev yapar. Akrilamid konsantrasyonunun düşürülmesi ya da paraformaldehit konsantrasyonu antikoru 17 nüfuz kolaylaştırılması (ve böylece hızlandırılması), hidrojel gözenek boyutunu artırır, ancak bu Tiss üzerinde zararlı bir etkiye sahipue genişleme. Bununla birlikte, doku blokları tarama antikoru özgün rapora 14'te tarif edilen akrilamid ve paraformaldehit konsantrasyonları kullanılarak bir kaç hafta gün ve bütün beyin madde içinde gerçekleştirilebilir.
Optik temizleme teknikleri bir yapısı ve işlevi anlayışını sürdürmek, beynin içine derinlemesine bakmak için izin verir. Bu yeni araçlar organlarının bu en karmaşık bizim anlama artan hücresel ve moleküler çözünürlüklerde beyin görselleştirmek araştırmacılar sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma cömertçe Nörolojik Bozukluklar ve İnme (NIH / NINDS) hibe 1R01NS086981 ve Conrad N. Hilton Vakfı Sağlık / Ulusal Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Biz konfokal mikroskobu ile onların çok değerli yardım için Dr Laurent Bentolila ve Dr Matthew Schibler teşekkür ederim. Biz AÇIKLIK forumu (http://forum.claritytechniques.org) katkıda bulunmuş olanlar teşekkür ederim. Biz özellikle bu büyüleyici tekniğini öğretmek onun laboratuvarını açılması için Dr. Karl Deisseroth teşekkür ederim. Yazarlar Beyin Haritalama Tıbbi Araştırma Örgütü, Beyin Haritalama Destekleme Vakfı, Pierson-Lovelace Vakfı, Ahmanson Vakfı, Capital Group Şirketleri Hayırsever Vakfı, William M. ve Linda R. Dietel Hayırsever Fonu ve Northstar Fonundan cömert destek için minnettarız . Bu yayında bildirilen araştırma da kısmen Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi tarafından ve Ulusun Başkanlığınca desteklenenÖdül numaraları C06RR012169, C06RR015431 ve S10OD011939 altında Sağlık al Enstitüleri. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | buffers |
| 32% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusion and hydrogel |
| 2,2'-thiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | refractive index matching solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hydrogel |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | clearing buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | clearing buffer |
| Sodium hydroxide | Fisher | 55255-1 | buffers |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 52002-100G | preservative |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | buffers |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusion |
| Sodium nitrate | Fisher | BP360-500 | perfusion |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | nuclear stain |
| 99.9% isoflurane | Phoenix | 57319-559-06 | anesthetic |
| Hydrocholoric acid | Fisher | A1445-500 | buffers |
| Glass bottom dish | Willco | HBSB-5040 | Willco dishes |
| Reusable adhesive | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Silicon elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Lint-free wipe | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Mouse brain matrix | Roboz | SA-2175 | sectioning tissue |
| Matrix blades | Roboz | RS-9887 | sectioning tissue |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-24 | pefusion |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 | microscopy |
| Imaging software | Leica | LAS AF | microscopy |
References
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes. J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).
- MacKenzie-Graham, A., et al. A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain. J Anat. 204, 93-102 (2004).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. Neuroimage. 101, 625-632 (2014).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Sci Rep. 5, 9808 (2015).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
- Parra, S. G., et al. Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP. J Vis Exp. (67), e3848 (2012).
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. J Viz Exp. (96), e52580 (2015).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).
