Summary
Här är ett protokoll för att skörda, underhålla och behandla mus tunntarmens organoids med patogen associerade molekylära mönster (PAMPs) och Listeria monocytogenes beskrivs, liksom betoning på genuttryck och lämpliga normaliseringsmetoder för protein.
Abstract
Primära tarm organoids är ett värdefullt modellsystem som har potential att avsevärt påverka området mucosal immunologi. Men komplexiteten i de organoid tillväxtegenskaper bära betydande förbehåll för utredaren. Specifikt, tillväxtmönster hos varje individuell organoid är mycket variabla och skapa en heterogen population av epitelceller i odling. Med sådana förbehåll, kan vanliga vävnadsodlingsmetoder inte tillämpas enbart på organoid systemet på grund av komplexiteten i cellstrukturen. Räkna och plätering enbart baserad på cellantal, vilket är vanligt för individuellt separerade celler, såsom cellinjer, är inte en tillförlitlig metod för organoids om inte någon normalisering teknik används. Normalisering till totalt proteininnehåll görs komplex på grund av att den inhemska proteinmatrisen. Dessa egenskaper i form av antalet celler, form och celltyp bör beaktas vid bedömningen av utsöndrat contält från organoid massan. Detta protokoll har tagits fram för att beskriva en enkel procedur till kultur och behandla små tarm organoids med mikrobiella patogener och patogen associerade molekylära mönster (PAMPs). Det understryker också normaliseringsmetoder som ska användas när proteinanalys utförs efter en sådan utmaning.
Introduction
Förmågan att skörda och kultur primära organoids har beskrivits för tunntarmen, kolon, pankreas, lever och hjärna och är spännande framsteg relevant för att förstå en flera fysiologiskt representativt fenomen för vävnadsbiologi 1-5. De första metoderna beskriver kulturen och underhåll av små tarm organoids rapporterades av Sato et al. Ur labbet Hans Clevers en. Före denna metod, skörd och odling av primära intestinala epitelceller visade sig vara begränsade och ineffektiva för att upprätthålla epitelial celltillväxt. Metoder ingår dissociation av vävnad via inkubation med enzymer, såsom kollagenas och dispas, vilket i slutändan skulle leda till utväxt av blandade primära fibroblastceller 6. Dessa villkor skulle också vara tidsbegränsat för att upprätthålla den epiteliala cellkulturen. Minimal eller ingen epitelcell nisch skulle bilda, såsom epitelceller skulle träda apoptos på grund avbristen på lämpliga tillväxtfaktorer eller förlust av kontakt integritet, benämnd anokis 7. Tillkomsten av 3D-organoid odlingssystem har gett en metod att odla primära tarmceller som innehåller ett spektrum av tarmcelltyper i ihållande kultur 1. Dessa epiteliala organoids har fördelar jämfört med cellinjer är att de är sammansatta av flera differentierade celler, och bättre efterlikna det organ de är härledda från in vivo 8. Processen för att slutligen "växa en mini tarmen i en skål" har visat sig vara ett värdefullt verktyg för att utvärdera effekten av tarmepitelet under olika stimuli. Undersöker samspelet mellan primära tarmceller med mikrobiella patogener associerade molekylära mönster (PAMPs) är relevant för området immunologi eftersom dessa molekylära mönster kan reglera olika svar från både värd och mikrob 9. Inte bara kan utredarna nu utforska dessa interaktioner med musen organoids, men dekan odlas från människor såväl 2. Denna teknik har potential att dramatiskt ändra personlig medicin och det är frestande att spekulera om framsteg som denna teknik kommer att göra det möjligt inom en snar framtid.
Det övergripande målet med denna metod är att tillhandahålla ett protokoll för den kultur, expansion, och behandling av tarm organoids med en mängd olika stimuli. Sådana stimulanser kan i slutändan allt från vacciner, bakterie PAMPs, levande patogener, gastrointestinala (GI) och cancerterapi. Den isolering och odling av mus tarm organoids har anpassats från Sato et al. Även om det finns små avvikelser från den ursprungliga metoden, slutprodukten är organoida kulturen fortfarande uppnås vid tillämpningen av detta protokoll. Denna metod är inriktad på att beskriva en lämplig teknik för korrekt normalisering när man arbetar med icke-homogena cellstrukturer, som måste beaktas vid genomförandet av en analys baserad på cell numbra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All forskning godkändes och genomförs under Virginia Tech IACUC riktlinjer
1. Bered R-Spondin1 Conditioned Media Från HEK293T-Rspo1 cellinje
- Generation av HEK293T-Rspondin1 celler har tidigare beskrivits 10. Frö HEK293T-Rspondin1 utsöndrande celler vid 5-10% konfluens, approximativt 8 x 10 5 -1.7 x 10 6 celler, i en T-175-kolv med 40 ml 1x Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% fetalt bovint serum ( FBS) som tillväxtmediet, och inkubera vid 37 ° C + 5% CO2.
OBS: Tillväxtmediet för HEK293T-Rspondin1 utsöndrar celler kommer att fungera som rade R-spondin1 media. R-spondin1 kan alternativt köpas som en rekombinant tillväxtfaktor användes vid en slutlig koncentration av 500 ng / ml. - Odla HEK293T-Rspondin1 celler i sju dagar eller tills den når 95% konfluens bestäms av ljusfältsmikroskop. Skörda 40 ml konditionerat medium och överför till en 50ml koniskt rör. Kasta T-175-kolv av HEK293T-Rspondin1 utsöndrar celler.
- Centrifugera röret innehållande konditionerade media vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C för att pelletera cellrester. Samla supernatanten, benämnd R-spondin1 konditionerat medium, och delprov i 15 ml rör. Lagra alikvoter vid -20 ° C under kort sikt eller -80 ° C för långtidsförvaring.
OBS: När tinade, konditionerade R-Spondin1 media kan lagras upp till en vecka vid 4 ° C.
2. Beredning av organoida Growth Media och reagenser för skörd tunntarmen Crypts
- Endags före skörd, placera den frysta proteinmatrisen på is och tina över natten vid 4 ° C. Autoklav dissekera sax, pincett och glasskivor som kommer att användas för crypt skörd.
- Följande dag, börja med att förbereda 40 ml organoid tillväxtmedia innehållande kosttillskott och tillväxtfaktorer genom att lägga lager koncentrationer 40 ml 1x DMEM / F-12. Medie kosttillskott innehåller: 10 mM 2- [4- (2-hydroxietyl) piperazin-1-yl] etansulfonsyra (HEPES) - 400 | j, l, 1x glutamin tillägg - 400 | j, l, 1x B27 utan vitamin A - 400 | j, l, 1x N2 - 200 | il, 1 mM N-acetyl-cystein - 40 | il, 100 ng / ml m-Noggin - 40 | il, 50 ng / ml m-EGF - 4 | j, l och placera i ett 37 ° C vattenbad tills användning. Värm en 15 ml alikvot av R-spondin1 till 37 ° C i ett vattenbad.
- Varm tre sterila 24-brunnsplattor till 37 ° C under minst 30 minuter genom att placera i en inkubator. Förbered 50 ml per mus 1x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och kyl till 4 ° C. Bereda 100 ml per mus 1x PBS innehållande 10% FBS och kyl till 4 ° C.
3. Skörd Mus musculus tunntarms Crypts för organoid kultur en
- Offra en manlig C57B6 / J mus ålder 6-12 veckors ålder upp på standard gnagare chow och vatten som är tillgängligtad libitum enligt institutionens riktlinjer. Avliva via CO 2 kvävning följt av cervikal dislokation.
OBS: Håll kadaver på is tills vävnad skörd och utföra vävnads skörden i ett biologiskt säkerhetsskåp för att minimera risken för kontaminering.
Obs: En manlig eller kvinnlig mus kan användas för att generera organoids. - (Tillval) Raka musen för att ta bort pälsen innan nedsänkning i 70% etanol. Doppa musen i 70% etanol i 2 min och stift lemmar att klämma fast ombord med ryggsidan av musen röra kortet.
- Använder försteriliserade dissekera sax och pincett för att göra en mid-line incision på den ventrala delen av musen. Göra snitt vid genitalierna fortskrider kraniala till basen av halsen. Öppna snittet huden sidled med pincett och stift huden till sätter styrelsen att exponera bukhinnan.
- Göra en mid-line incision i bukhinnan i buken med dissekera sax och vik the bukhinnan med pincett i sidled och stift till fastlåsning kortet för att exponera bukorganen.
OBS: Var noga med att undvika att skära bukorganen. - Avlägsna tunntarmen från bukhålan med dissekera pincett och sax genom att skära den proximala föreningspunkten av tunntarmen ansluten till magen och den distala korsningen ansluten till caecum. Placera tunntarmen i en steril petriskål innehållande 10 ml iskall 1 x PBS.
- Spola innehållet som finns i lumen i tunntarmen med iskall 1 x PBS med användning av en 1 ml pipett. Upprepa detta steg tills skräpet i lumen i tunntarmen avlägsnas.
- Klipp tunntarmen med dissekera sax i 3-4 ungefär lika långa remsor och lägg remsorna i längdriktningen på en ny steril petriskål. För varje remsa, infoga framkant av dissekera sax inne i lumen i tunntarmen för att göra ett snitt hela längden of remsan. Använd pincett för att i sidled fäll snittet för att exponera lumen i tunntarmen.
- Använda en steril glasskiva för att försiktigt skrapa bort villi på den luminala ytan av tunntarmen. Klipp tunntarmen i 1-2 cm längd remsor med dissekera sax och överföra dessa band till en 50 ml koniskt rör innehållande 10 ml iskall 1 x PBS.
- Blanda innehållet försiktigt genom att vända 50 ml koniskt rör och tillåta innehållet vävnads sedimentera till botten av 50 ml koniska rör. Aspirera 1 x PBS och upprepa detta tre gånger genom tvättning av vävnaden med 10 ml iskall 1 x PBS. På den slutliga tvättningen lämnar det koniska röret på is under 10 min, innehållande 10 ml 1 x PBS och tunntarmen vävnadssegmenten.
- Aspirera 1x PBS och tillsätt 25 ml 1x PBS + 2 mM EDTA. Placera på en gungande plattform vid 4 ° C eller i en ishink under 45 min. Medan vävnaden ruvar, märka sex 15 ml koniska rör "fraktion # 1-6."
- Tillåt innehållet vävnads att sedimentera till botten av röret. Ta bort och överför supernatanten till röret 15 ml koniskt märkt "fraktion 1". Upprepa 1x PBS + 10% FBS skaka steg (3.11) fem gånger och överför supernatanten innehåll för att den på lämpligt sätt märkt-fraktionen rör.
- Centrifugera vid 125 x g under 5 min. Aspirera supernatanten och återsuspendera pellets i 5 ml förvärmda 1x DMEM / F-12, med inga tillväxtfaktorer tillsättes.
- Centrifugera vid 78 xg under 2 min. Sug 4 ml av supernatanten och suspendera varje pellet i en ml återstående media.
- Ta 20 ml från varje fraktion och lägg till en glasskiva. Visualisera kryptor och skräp under ett ljusmikroskop och bestämma vilka fraktioner som att kombinera och sammanföra i enlighet därmed för att uppnå största percentage av kryptor till skräp förhållande.
OBS: Fraktionerna 2-6 ger den största andelen kryptor som skall pläteras. Fraktionerna till poolen är oftast fraktion 3 med fraktion 4, och fraktion 5 med fraktion 6. - Centrifug fraktioner som skall pläteras vid 125 xg under 5 min. Aspirera supernatanten lämnar 50-100 pl kvar ovanför pelleten.
- Håll rören på is och tillsätt 1 ml av proteinmatris för de sammanslagna fraktionerna. Pipettera upp och ned långsamt för att förhindra addition av luftbubblor.
- Avlägsna förvärmda plattor med 24 brunnar från 37 ° C inkubator och tillsätt 50 | il av proteinmatris / krypta suspension i mitten av varje brunn. Överföra den ympade-plattan till en 37 ° C inkubator i 10 min för att tillåta att proteinmatrisen droppe att stelna.
- Tillsätt 450 pl av tidigare framställda organoid tillväxtmedia + 50 | il R-spondin1 rade media per brunn. Inkubera plattorna vid 37 ° C + 5% CO2 över natten.
- Lägga 50-100 | il av rade R-spondin1 medien per brunn dagligen. Varje 3: e dag ersätta hela organoid odlingsmedier med nygjord organoid tillväxtmedier 450 ul / brunn beskrivs i steg 2,2. Dessutom till 50-100 pl rade R-spondin1 media per brunn.
OBS: proteinmatris droppe bibehåller sin integritet under en vecka, men efter 7 dagar gå vidare till passaging organoids.
4. Passaging Organoids Varje 7: e dag
- Tina proteinmatrisen på is över natten vid 4 ° C dagen innan passaging. Varm en steril 24-brunnars platta till 37 ° C under minst 30 min. Förbered organoid tillväxtmedier som beskrivs i steg 2,2 och hålla vid 37 ° C tills användning.
- Ta organoid plattan från inkubatorn och börja passage av plattan på is. Aspirera odlingsmedium med en 10 ml pipett från 3-4 brunnar för att starta.
OBS: Håll det insugna media i 10 ml pipett, eftersom detta kommer att användas för att driva bort den proteinmatrisen droppe i nästa steg. - I såpirat-brunnar, pipett upp och ner för att rubba proteinmatrisen droppe från plattan. Försiktig skrapning med spetsen på en 10 ml pipett är till hjälp för att rubba proteinmatrisen droppe. Överför innehållet till en 15 ml koniska rör.
- Inkubera 15 ml koniska rör på is under 10 minuter och centrifugera vid 125 xg under 5 min vid 4 ° C. Observera en vit pellet vid botten av det koniska röret. Försiktigt aspirera och kasta majoriteten av supernatanten / gamla organoid odlingsmedier över organoid pelleten lämnar 100-200 mikroliter över pelleten.
- Bryt upp organoid kryptor med hjälp av en 23 gauge nål fäst till en 1 ml spruta. Aspirera och mata 10-15 gånger för att dissociera kryptor. Minimera luftbubbelbildning på grund av alltför pipettering.
- Resuspendera organoids i 500 | il av proteinmatris och tillsätt 50 | il per brunn i en ny förvärmd 24 brunnar. Tillsätt 450 mikroliter av tidigare framställda organoid tillväxtmedia + 50 pl R-spondin1konditionerat medium per brunn. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten.
5. Plating Organoids på dag 14 för mönsterigenkänning receptorstimulering med PAMPs och Listeria monocytogenes för Gene Expression Analysis
- Två dagar före utmaning, strimma ut L. monocytogenes på en BHI-agarplatta.
- Följande dag välja en L. monocytogenes koloni och växa i 10 ml BHI-buljong vid 37 ° C över natten under skakning vid 200 rpm.
- Tina proteinmatrisen på is över natten vid 4 ° C dagen innan organoid utmaning. Varm en steril 24-brunnars platta till 37 ° C under minst 30 min. Förbered organoid tillväxtmedier som beskrivs i steg 2,2 och hålla vid 37 ° C tills användning.
- Ta organoid kultur från inkubatorn och börja passage av organoids.
- Aspirera media från 3-4 brunnar och hålla aspire media i 10 ml pipete som kommer att användas för att rubba proteinmatrisen droppe. Pipett upp ochned för att lösgöra proteinet matrisdroppe från plattan. Försiktig skrapning med spetsen på en 10 ml pipett är till hjälp för att rubba proteinmatrisen droppe. Överför innehållet till en 15 ml koniska rör.
- Inkubera 15 ml koniska rör på is under 10 min. Centrifugera vid 125 xg under 10 min vid 4 ° C. Observera en vit pellet vid botten av det koniska röret. aspirera försiktigt supernatanten lämnar cirka 100 pl återstående supernatant bakom.
- Suspendera organoid pelleten i 5 ml iskall 1 x PBS och ta bort en 10 pl alikvot för räkning. Tillsätt 10 | il alikvot till mitten av en hemocytometer utan glastäckglas. overlay försiktigt glaset täck ovanpå droppen.
OBS! Hemocytometer kommer att täppa med organoids om glasskiva inte avlägsnas först. - Räkna det totala antalet organoids via ett ljusmikroskop i varje galler / hela kammaren i hemocytometer och bestämma den organoid koncentration: numlet totala organoids räknat per 10 pl.
- Ta en lämplig volym från 15 ml koniska rör som gör att tillräckligt många organoids att seedas för analysen och centrifugera denna suspension vid 125 xg under 10 minuter.
OBS: Området mellan 40-100 organoids per brunn i en 24 brunnars platta är tillräcklig för RNA-analys. Den typiska organoid storlek kan variera från 300 um till 1000 um i diameter. - Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 500 ml proteinmatrisen utan att generera luftbubblor. Tillsätt 50 ml organoid / proteinmatris suspension per brunn i en 24 brunnars platta.
OBS: Mängden protein matris som används för att återsuspendera organoids kommer att variera för antalet behandlingsvillkor och tekniska replikat. - Tillsätt 500 pl av organoid tillväxtmedia (utan N-acetyl-cystein) till varje brunn och inkubera vid 37 ° C + 5% CO2 under 1 timme.
- Förbereda 2x koncentrationer av PAMPs (dvs. flagellin,lipopolysackarid) och leva L. monocytogenes. Mät OD av levande L. monocytogenes och stek på en BHI platta för räkning. Behandla organoids vid 1 x 10 6 kolonibildande enheter (CFU) / ml.
OBS: OD till CFU beslutsamhet kommer att variera av bakterier typ och bör bedömas före organoida stimulering. Till exempel, en OD på 0,6 ≈ 1 x 10 9 CFU / ml för L. monocytogenes, men bör också bedömas oberoende före experimentet. - Streak ut en serieutspädning från behandlings lager av L. monocytogenes att exakt bestämma behandlings CFU / ml. Författarna finner att en 1 x 10 8-spädning av 100 | j, l på en BHI-agarplatta är tillräcklig för att räkna kolonier för att bestämma en korrekt CFU / ml.
- Förbered en värmedödad lösning av L. monocytogenes genom att ta en 1 ml portion av den levande L. monocytogenes lösning och centrifugera vid 5000 xg under 10 min. Aspirera supernatanten och tvättaden bakteriella pelleten med 1 ml 1 x PBS.
- Centrifugera L. monocytogenes vid 5000 xg under 10 minuter och suspendera pelleten i 1 ml 1 x PBS. Värm döda L. monocytogenes i ett 1,7 ml polypropylenrör genom upphettning vid 80-90 ° C under 1 timme. Kultur en 100 ul alikvot av värmen dödade L. monocytogenes på en BHI-agarplatta för att bekräfta inga levande bakterier kvar.
- Tillsätt 500 pl av den lämpliga 2x PAMP och / eller mikrob behandling till 500 | j, l bosatta medier i utsedda brunnarna bestäms av användaren. Inkubera vid 37 ° C + 5% CO2 under 24 timmar.
OBS: Lägga till en 500 | il alikvot av en 2x PAMP / mikrob behandling till 500 | j, l av inhemska medier kommer att föra behandlingskoncentrationen till 1x i en total volym av 1 ml.
- Följande dag, manuellt räkna L. monocytogenes kolonier för en noggrann bestämning av behandling CFU / ml. Aspirera media från plattan behandlade organoids och tvätta brunnar three gånger med 1 x PBS.
- Fortsätt till RNA-extraktion via fenol / kloroform 11 eller ett RNA-extraktion kit enligt tillverkarens instruktioner. Utvärdera genuttryck med standard QRT-PCR 12.
6. Plating Organoids på dag 14 för PAMP och L. monocytogenes Challenge för proteinanalys i supernatant
- Två dagar före smitta, starta en cellkultur av Caco-2-celler, såddtäthet ≈1 x 10 6 celler i en T-75 kolv med 1x DMEM + 20% FBS och inkubera de Caco-2-celler vid 37 ° C + 5 % CO2. Börja en bakteriekultur av L. monocytogenes på BHI plattan och inkubera plattan i en bakteriell inkubator vid 37 ° C.
- Följande dag välja en L. monocytogenes koloni och växa i 10 ml BHI-buljong vid 37 ° C över natten. Tina proteinmatrisen på is över natten vid 4 ° C dagen innan organoid utmaning.
- Följande dag varm steril 96 väl svart väggarplattan till 37 ° C under minst 30 min. Förbered organoid tillväxtmedier utan N-acetylcystein som beskrivs i steg 2,2 och hålla vid 37 ° C tills användning. Ta organoid kultur från inkubatorn och börja passage av organoids.
OBS: Den typiska organoid storlek kan sträcka sig från 300 | im till 1000 | j, m i diameter. - Aspirera media från 3-4 brunnar och hålla aspire media i 10 ml pipete som kommer att användas för att rubba proteinmatrisen droppe. Resuspendera med en pipett för att rubba proteinmatrisen droppe från plattan. Försiktig skrapning med en 10 ml pipett är till hjälp för att rubba proteinmatrisen droppe. Överför innehållet till en 15 ml koniska rör.
- Inkubera 15 ml koniska rör på is under 10 min. Centrifugera vid 125 xg under 10 min vid 4 ° C. Observera en vit pellet vid botten av det koniska röret. aspirera försiktigt supernatanten lämnar 100 pl återstående supernatant bakom.
- Suspendera organoid pelleten i 5 ml iskall1x PBS och ta bort en 10 pl alikvot för räkning. Tillsätt 10 pl alikvot till mitten av en hemocytometer och försiktigt överlagra glastäck.
OBS! Hemocytometer kommer att täppa med organoids om glasskiva inte avlägsnas först. - Räkna det totala antalet organoids via ett ljusmikroskop i varje rutnät av hemocytometer / hela kammaren och bestämma den organoid koncentration: antal totala organoids räknade per 10 ml.
- Ta en lämplig volym från 15 ml koniska rör som gör att tillräckligt många organoids att seedas för analysen och centrifugera denna suspension vid 125 xg under 10 minuter.
OBS: Mängden protein matris som används för att återsuspendera organoids kommer att variera för den mängd behandlingsbetingelser och tekniska replikat. Författarna finner att 40-100 organoids är tillräcklig för utsöndrat proteinanalys. - Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 500 | il av proteinmatris / brunn utan att genereraluftbubblor.
OBS: Mängden protein matris som används för att återsuspendera organoids kommer att variera för den mängd behandlingsbetingelser och tekniska replikat. - Lämna minst två kolumner tomma på 96 väl svarta väggar vävnadsodlingsplatta eftersom dessa kommer att fungera som brunnar ympades med Caco-2-celler för generering av en standardkurva. Tillsätt 50 pl av proteinmatris + organoid suspension per brunn till en förvärmd 96 väl black-walled vävnadskulturplatta. Lagra plattan vid 37 ° C under 10 min för att medge proteinmatris stelna.
- Tillsätt 100 pl av organoid tillväxtmedia (utan N-acetyl-cystein) till varje brunn och inkubera vid 37 ° C + 5% CO2 under 1 timme.
- Förbered 2x koncentrationer av PAMPs och leva L. monocytogenes. Tillsätt 100 ml av varje givet behandlingsbeting per brunn och inkubera i 24 h.
- Följande dag platt Caco-2-celler i standardkurvan brunnarna. Börja med att värma steril 1x PBS, 0,25% trypsin och 1 x DMEM + 20% FBS to 37 ° C.
- Avlägsna de T-75-kolv innehållande Caco-2-celler och aspirera cellodlingsmediet. Tvätta cellerna med 10 ml 1 x PBS. Aspirera 1x PBS, tillsätt 2 ml 0,25% trypsin och placera T-75-kolv i 37 ° C inkubator i 15 min.
- Visualisera kolven under ett ljusmikroskop för att säkerställa att cellerna har lossnat sätt sedan 8 ml 1x DMEM + 20% FBS till de lösgjorda Caco-2-celler och överför till ett 15 ml koniskt rör. Ta en 10 pl alikvot och räkna cellerna genom ljusmikroskop med hjälp av en hemocytometer.
ANMÄRKNING: En övre cellantal på 60.000 celler / brunn fungerar bra och spädningar kan utföras för generering av standardkurvan ner till 2500 celler / brunn. - Resuspendera Caco-2-celler i proteinmatris och tillsätt 50 | il per brunn till lämpliga brunnar. Tillåta proteinmatrisen stelna vid 37 ° C under Caco-2-celler.
OBS: Tillväxtmedier för de Caco-2-celler inte behöver tillsättas efter stelning av proteinmatrisen. - Följande24 hr behandlingstiden för organoid analysen aspirera och spara organoid cellulära supernatanten medier och hålla på is. Tvätta brunnarna tre gånger med 1 x PBS. Tillsätt 100 pl av 100% metanol till varje brunn inkluderande de Caco-2 standard curve brunnar och inkubera vid 4 ° C eller på is under 20-30 min för att fixera organoids.
OBS: Det är inte nödvändigt att de Caco-2 standard kurva brunnar tvättas med 1 x PBS, eftersom de kan ha metanol tillsattes direkt. - Efter metanol inkubation, tvätta brunnarna tre gånger med iskall 1 x PBS. Lagra plattan vid 4 ° C under upp till 1-2 veckor.
- Lägga nukleär färgning färgämnet vid en koncentration av 1 pg / ml per brunn, täck plattan med aluminiumfolie och inkubera vid 4 ° C över natten.
- Använd en platta med 96 brunnar läsaren att mäta nukleär färgning färgämne excitation / emission (350 nm / 461nm respektive) och normalisera varje organoid väl till standardkurvan för Caco-2-celler.
- Fortsätt till nedströms analyser såsom ELISA
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När du följer detta protokoll för att odla tarm organoids kommer karakteristiska sphere formad organoids vara närvarande efter skörd. Tillsatsen av R-spondin1 rade media dagligen kommer att initiera tillväxt och knoppning av de organoids. Tillväxten av organoids visas i fig 1A - F, och är representativ för intestinala organoids på dag 1, 2, 4, 5, 6 och dag 14. Figur 1F representerar de icke-homogena egenskaper för tillväxt organoids på dag 14.
När väl organoids odlas till ett tillräckligt antal, kan de replated och utmanades med olika PAMPs och / eller mikrober. Expressionsanalys kan utföras via standardtekniker. Detta representeras i fig 2A-C som visar mRNA-expression av inflammatoriska cytokiner IL-18, IL-6, och TNFa som analyserades efter en24 tim utmaning organoids med värme dödade L. monocytogenes och PAMP flagellin. Den logiska grunden för att utvärdera mRNA-expression cytokinerna IL-18, IL-6, och TNFa var att dessa var goda kandidater för att moduleras med epitelceller som svar på patogena utmaning, och modulering av dessa inflammatoriska cytokiner skulle visa effektiviteten av tekniken.
Figur 3A - C visar den relativa nukleär färgning av tarm organoids med nukleär färgning färgämne efter fixering med minimal bakgrundsfärgning av skräp i den inhemska proteinmatrisen. Denna metod för fixering och infärgning kan appliceras för att normalisera analyser, vilka kommer att stå för olika cellantal i varje brunn. Detta framgår i figur 4 vid generering av en standardkurva av seriespädningar av Caco-2-celler utstrukna i proteinmatrisen, fixerades därefter och färgades med nukleärfärgning färgämne. Den 2 värde på 0,89 R anger ett linjärt förhållande mellan cellantal och betyder fluorescensintensiteten, och den linjära ekvationen kan användas för att normalisera organoids till cellantalet. Standardkurvan som visas i figur 4 börjar att nå mättningsgränsen bortom 30.000 celler per brunn. En titrering av celler över 30.000 celler per brunn har visats i figur 4 för att inkludera mättnads utbud av nukleär färgning färgämne. Ökad noggrannhet av normalisering uppnås med ett mobilnummer som återspeglar det linjära området för nukleär färgning färgämne innan mättnadsgränsen är nådd.
Figur 1:. Tunntarms organoid Tillväxt Tidsförloppet för tillväxt för murina tunntarm härledda organoids efter isolering. (A) Dag 1. (B) Dag 2. (C) Dag 4. (D) Dag 5. (E) Dag 6. (F) Dag 14. Bilder är representativa för organoid tillväxt för varje given dag. Skalstrecken lika 200 | j, m i den vänstra bilder för A, B, C, D, och E. Skalstrecken lika med 100 | j, m i den högra bilden för A, B, C, D, och E. Skalstrecken lika 1000 ^ m och 200 | j, m för vänster och höger bild för F, respektive. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: mRNA-uttryck av inflammatoriska cytokiner Efter 24 timmar PAMP Challenge Relativ mRNA-expression av vildtyp intestinala organoids utmanade under 24 timmar med PAMPs och värme dödades Listeria monocytogenes (A - C) representerar faldig förändring av i.. nflammatory cytokinerna IL-18, IL-6 och TNFa respektive. Felstaplar representerar Standardavvikelse (SD) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Relativt fluorescerande färgning av Organoids för normalisering nukleär färgning av organoids med efter fixering.. (A) Bright området organoids. (B) Fluorescerande färgning av organoids med nukleär färgning färgämne. (C) Sammanslagen bild av ljusa fält och fluorescerande färgning. Skalstrecken lika 400 mikrometer i alla bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: standardkurva som genereras från Caco-2-celler standardkurva som genereras från tredubbla brunnar.. Cellsådd hade en rad börjar vid 60.000 celler per brunn med utspädningar ner till 2500 celler per brunn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Översikt av protokollet Diagram 1-Top panel figuren illustrerar skörda R-spondin1 konditionerade media. 2-mellersta panel av figuren illustrerar aspekter av protokollet för att skörda och kultur mus tunntarmens organoids. 3-bottenpanel figuren visar: (A) plätering av 14 dagars odlade organoids. (B) Utmaning med PAMPs / L.monocytogenes, och lämnar lediga brunnar för att generera en standardkurva. (C) Efter PAMP utmaningen, bordläggning av Caco-2-celler i de tidigare obebodda brunnarna för att generera en standardkurva. (D) Efter fixering och tillägg av en nukleär färgning färgämne, mäta excitation / emission av brunnarna och normalisering mot en standardkurva. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kulturen och underhåll av tarm organoids är ett förfarande som kan behärskas av någon person med tillräcklig vävnadsodlingsteknik. Det finns nyanser i passaging i jämförelse med odling av celler på ett mer konventionellt monoskikt, men dessa nyanser är inte svåra att övervinna. De kritiska stegen i denna metod involverar att kunna växa de organoids till en tillräckligt hög densitet för optimal ympning. Experiment måste skalas ned med organoids som stora sådd tätheter som ofta kan uppnås med cellinjer är inte praktiskt. Detta blir särskilt tydligt när det finns flera behandlingsgrupper.
Detta protokoll är avsedd att ge en steg-för-steg-metod för att studera värd-patogen interaktioner av tarmepitelet med en mängd olika bakteriella, virala och svamppatogener samt adress svårigheter att använda detta system med avseende på normaliseringen. Rapporter finns att describe samspelet mellan tarm organoids med bakteriell patogen Salmonella, men ändå inte ta itu med normaliseringsmetoder vid mätning utsöndrade cytokiner 13.
Det finns flera svårigheter som påträffas vid normalisering organoid kulturer med olika metoder. Normalisera utsöndrat protein via bicinkoninsyra assay (BCA) är ett alternativ; emellertid tillväxtkomponenter som erfordras för organoid kultur (N2 och / eller vitamin B27) interferera med BCA-analys (data visas ej) Normalisering via cellulär viabilitet, såsom en modifierad MTT-analys har beskrivits. 14; emellertid en behandling som kommer att förändra den mitokondriella metaboliska aktiviteten hos organoids kommer att införa en felaktig metod för normalisering via denna teknik som MTT baserat på minskning av verkan av mitokondriella dehydrogenaser 15. Det är också nödvändigt att ta bort N-acetyl-cystein (NAC) från media, inte påly om normalisering via MTT teknik önskas, men om behandling med en bakteriell patogen som NAC kan hämma bakterietillväxt 16.
Fördelarna med denna teknik är att utsöndrade cytokiner och proteinprodukter från organoids nu kan normaliseras mot en standardkurva av Caco-2-celler. Begränsningar med denna teknik är att normaliseringen är korrelat eftersom nukleär färgning av icke-transformerade primära epiteliala organoids justerats mot den nukleär färgning av en koloncancer-cellinje. Författarna finner att fastställa med metanol och färgning kärnor med kärn färgning färgämne är en effektiv normaliseringsteknik mot en standardkurva av Caco-2-celler. Även om tillväxtegenskaperna hos denna koloncancer-cellinjen inte exakt efterlikna tillväxtegenskaperna hos intestinala organoids, med användning av en nukleär färgning och mätning av medelfluorescensintensiteten är en bra strategi för att normalisera mot totala cellantalet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Section 1,3,6) Or equivalent brand |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Section 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells |
| HEK293T-Rspondin1 secreting cell line | (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. | ||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | (Section 1) Or equivalent brand |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (Section 1) Or equivalent brand |
| Protein Matrix | Corning | 356231 | (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Section 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Section 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 Well TC Plates | Corning | 3524 | (Section 2) |
| N2 Supplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Section 2) |
| B27 without vitamin A 50x | Life Technologies | 12587-010 | (Section 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| 10ml Serological Pipet | Falcon | 357551 | (Section 2) Or equivalent brand |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Section 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (Section 2) Stock = 1M |
| Recombinant Mouse EGF | Biolegend | 585608 | (Section 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Section 3) | |
| dissecting scissors | (Section 3) | ||
| forceps | (Section 3) | ||
| glass slides | (Section 3) | ||
| dissecting tweezers | (Section 3) | ||
| 25 ml Serological Pipet | Falcon | (Section 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher | FB0875712 | (Section 3) Or equal sized TC dish |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| Flagellin from Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Section 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Section 5,6) (Murray et al.) |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Section 5,6)Or equivalent brand |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Section 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (section 6) |
| Methanol | Fisher | A412-4 | (Section 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Section 6) | |
| 96 Well Assay Plate | Corning | 3603 | (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated |
| Nuclear Staining Dye | Life Technologies | H1399 | (section 6) Hoechst 33342 |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | (Section 6) Or equivalent brand |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | (Section1,3) Or equivalent brand |
| 1.7 ml polypropylene tube | Bioexpress | C-3262-1 | Or equivalent brand |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Or equivalent brand |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman gene expression assay kit |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Freshney, R. I., Freshney, M. G. Culture of epithelial cells. 2nd edn. , Wiley-Liss. (2002).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).
- Allen, I. C., et al. NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways. Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).
- Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiol Rep. 2 (9), (2014).
- Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5, 1228 (2014).
- Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts. Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).
- Parry, M. F., Neu, H. C. Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro. J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).
