Summary
Her er en protokol til at høste, vedligeholde og behandle mus små tarm organoids med patogen forbundet molekylære mønstre (PAMPs) og Listeria monocytogenes beskrevet, samt fokus på genekspression og ordentlig normalisering teknikker til protein.
Abstract
Primære intestinale organoids er et værdifuldt modelsystem, der har potentiale til at signifikant indvirkning inden for mucosal immunologi. Men kompleksiteten af de organoide vækstkarakteristika bære betydelige forbehold for investigator. Specifikt er vækstmønstre enkelte organoide er meget varierende og skabe en heterogen population af epitelceller i kultur. Med sådanne forbehold, fælles vævskultur praksis kan ikke blot anvendes på organoide system på grund af kompleksiteten af den cellulære struktur. Tælle og plating udelukkende baseret på celle nummer, som er fælles for individuelt adskilte celler, såsom cellelinjer, er ikke en pålidelig metode til organoids medmindre nogle normalisering teknik anvendes. Normalisering af det samlede proteinindhold er lavet kompleks på grund af beboeren protein matrix. bør tages Disse egenskaber med hensyn til celle nummer, form og celletype i betragtning, når de evaluerer udskilt contelte fra organoide masse. Denne protokol er blevet genereret at skitsere en enkel procedure til kultur og behandle små tarm organoids med mikrobielle patogener og patogen forbundet molekylære mønstre (PAMPs). Det understreger også normaliseringsreglerne teknikker, der skal anvendes, når protein analyse udføres efter sådan en udfordring.
Introduction
Evnen til at høste og kultur primære organoids er blevet beskrevet til tyndtarmen, colon, pancreas, lever og hjerne og er spændende forskud germane at forstå en flere fysiologisk repræsentativt fænomener for vævs biologi 1-5. De første fremgangsmåder beskriver kulturen og vedligeholdelse af små intestinale organoids blev rapporteret af Sato et al. Ud af laboratoriet af Hans Clevers 1. Forud for denne fremgangsmåde, høst og kultur af primære intestinale epitelceller viste sig at være begrænsede og ineffektive i at opretholde epitelcellevækst. Fremgangsmåder inkluderet dissociation af vævet via inkubering med enzymer, såsom collagenase og dispase, som i sidste ende vil føre til udvæksten af sammenblandede primære fibroblastceller 6. Disse betingelser vil også blive tid begrænset til at opretholde den epithelcellekultur. Minimal til ingen epitelcelle niche ville danne, som epitelcellerne ville træde apoptose grundmanglen på egnede vækstfaktorer eller tab af kontakt integritet, betegnes anokis 7. Fremkomsten af 3D-organoide dyrkningssystem har tilvejebragt en fremgangsmåde til kultur primære intestinale celler indeholdende et spektrum af intestinale celletyper i vedvarende kultur 1. Disse epiteliale organoids har fordele i forhold cellelinier er, at de er sammensat af flere differentierede celler, og bedre efterligner organ, de er afledt af in vivo 8. Processen til i sidste ende "vokse en mini gut i et fad" har vist sig at være et værdifuldt redskab til at vurdere svaret fra tarmepitel under forskellige stimuli. Undersøgelse af samspillet af primære tarmceller med mikrobielle patogen forbundet molekylære mønstre (PAMPs) er relevant for området for immunologi, da disse molekylære mønstre kan regulere forskellige reaktioner fra både vært og mikrobe 9. Ikke alene kan efterforskerne nu udforske disse interaktioner med mus organoids, men dekan dyrkes fra mennesker samt to. Denne teknologi har potentiale til dramatisk ændre personlig medicin og det er fristende at spekulere over fremskridt, at denne teknik vil gøre det muligt i den nærmeste fremtid.
Det overordnede mål med denne metode er at give en protokol for kulturen, ekspansion, og behandling af intestinale organoids med en række forskellige stimuli. Sådanne stimuli kan i sidste ende spænder fra vacciner, bakterielle PAMPs, levende patogener, gastrointestinale (GI) og kræftmedicin. Den isolering og dyrkning af mus tarm organoids er blevet tilpasset fra Sato et al. Selv om der er mindre afvigelser fra den oprindelige metode, slutproduktet bliver organoide kultur stadig opnås, når følger denne protokol. Denne metode er fokuseret på at beskrive en passende teknik til ordentlig normalisering, når der arbejdes med ikke-homogene cellestrukturer, som skal tages i betragtning, når der udføres en analyse baseret på celle numbra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al forskning blev godkendt og gennemført under Virginia Tech IACUC retningslinjer
1. Klargør R-Spondin1 konditionerede medier fra HEK293T-Rspo1 cellelinje
- Generering af HEK293T-Rspondin1 celler er tidligere blevet beskrevet 10. Seed HEK293T-Rspondin1 secernerende celler ved 5-10% konfluens, ca. 8 x 10 5 -1.7 x 10 6 celler, i en T-175 kolbe med 40 ml 1x Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% kalvefosterserum ( FBS) som vækstmedierne, og inkuberes ved 37 ° C + 5% CO2.
BEMÆRK: vækstmedier for HEK293T-Rspondin1 udskiller celler vil tjene som R-spondin1 konditioneret medie. R-spondin1 kan alternativt købes som et rekombinant vækstfaktor anvendt ved en slutkoncentration på 500 ng / ml. - Grow de HEK293T-Rspondin1 celler i syv dage eller indtil den når 95% sammenflydning bestemt af lyse-field mikroskopi. Høst de 40 ml konditioneret medium og overførsel til en 50ml konisk rør. Kassér T-175 kolbe af HEK293T-Rspondin1 udskiller celler.
- Centrifuger røret med konditionerede medier ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C for at pelletere celledebris. Opsaml supernatanten, betegnet R-spondin1 konditionerede medier, og alikvot i 15 ml rør. Opbevar portioner ved -20 ° C til kortvarig eller -80 ° C til langtidsopbevaring.
BEMÆRK: media Når optøet, R-Spondin1 konditionerede kan opbevares op til 1 uge 4 ° C.
2. Udarbejdelse af organoide Growth Media og reagenser til Høst tyndtarmens Cryptocoryner
- One-dag før høst, placere den frosne protein matrix på is og tø natten over ved 4 ° C. Autoklave dissekere saks, pincet og objektglas, der vil blive anvendt til krypt høst.
- Den følgende dag begynder ved at fremstille 40 ml organoide vækstmedium indeholdende kosttilskud og vækstfaktorer ved tilsætning stamkoncentrationer til 40 ml 1x DMEM / F-12. Medier kosttilskud indeholder: 10 mM 2- [4- (2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethansulfonsyre (HEPES) - 400 pi, 1x glutamin supplement - 400 pi, 1x B27 uden vitamin A - 400 pi, 1x N2 - 200 pi, 1 mM N-acetyl-cystein - 40 pi, 100 ng / ml m-Noggin - 40 pi, 50 ng / ml m-EGF - 4 pi og sted i et 37 ° C vandbad, indtil brug. Varm en 15 ml prøve af R-spondin1 til 37 ° C i et vandbad.
- Varm tre sterile 24 brønds plader til 37 ° C i mindst 30 minutter ved at placere i en inkubator. Forbered 50 ml per mus 1x phosphatpufret saltvand (PBS) + 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og afkøles til 4 ° C. Fremstilling af 100 ml per mus 1x PBS indeholdende 10% FBS og afkøles til 4 ° C.
3. Høst Mus musculus tyndtarmens Crypts for organoide Kultur 1
- Sacrifice en mandlig C57B6 / J mus alder 6-12 ugers alderen rejst på standard gnaverfoder og vand til rådighedad libitum efter institutionelle retningslinier. Afliv via CO 2 kvælning efterfulgt af cervikal dislokation.
BEMÆRK: Hold slagtet på is indtil væv høst og udfører vævet høst i et biologisk sikkerhedsskab at minimere risikoen for forurening.
Bemærk: En mandlig eller kvindelig mus kan anvendes til at generere organoids. - (Valgfrit) Barber musen til at fjerne pelsen før nedsænke i 70% ethanol. Submerse musen i 70% ethanol i 2 min og pin lemmer til pinning bord med den dorsale side af musen rører brættet.
- Brug præ-steriliserede dissekere saks og pincet til at gøre en midterlinje snit på den ventrale del af musen. Gør snittet på genitalia skrider craniale til bunden af halsen. Åbn hudindskæring lateralt med en pincet og pin huden til pinning bord for at blotlægge peritoneum.
- Lav en mid-line snit i bughinden af maven med dissekere saks og fold the bughinden med pincet sideværts og pin til pinning bord for at eksponere de abdominale organer.
BEMÆRK: Sørg for at undgå at skære abdominale organer. - Fjern tyndtarmen fra bughulen med dissekere pincet og saks ved at skære den proximale krydset af tyndtarmen forbundet til maven og den distale junction tilsluttet blindtarmen. Placer tyndtarmen i en steril petriskål indeholdende 10 ml iskold 1x PBS.
- Skyl indholdet indeholdt i lumen af tyndtarmen med iskold 1x PBS ved anvendelse af en 1 ml pipette. Gentag dette trin, indtil resterne i lumenet af tyndtarmen fjernes.
- Skær tyndtarmen med dissekere saks i 3-4 omtrent lige lange strimler og læg strimlerne på langs på en ny steril petriskål. For hver strimmel, indsætte forkant af de dissekere saks inde i lumen af tyndtarmen til at lave et snit hele længden of strimlen. Pincet for sideværts åben klap snittet for at blotlægge lumen af tyndtarmen.
- Brug en steril objektglas til forsigtigt skrabe væk villi på den luminale overflade af tyndtarmen. Skær tyndtarmen i 1-2 cm længde strimler med dissekere saks og overføre disse strimler til en 50 ml konisk rør indeholdende 10 ml iskold 1x PBS.
- Blande indholdet forsigtigt ved at vende 50 ml konisk rør og tillade indholdet væv at sedimentere til bunden af 50 ml konisk rør. Aspirer 1x PBS og gentag dette tre gange ved vask af vævet med 10 ml iskold 1 x PBS. På den sidste vask forlade konisk rør på is i 10 minutter indeholdende 10 ml 1x PBS og tyndtarmen vævssegmenter.
- Aspirer 1x PBS, og der tilsættes 25 ml 1x PBS + 2 mM EDTA. Sted på en vippende platform ved 4 ° C eller i en ice bucket i 45 minutter. Mens vævet inkubere, mærke seks 15 ml koniske rør "fraktion # 1-6."
- Tillad indholdet væv at sedimentere til bunden af røret. Fjern og overføre supernatanten til røret 15 ml konisk mærket "fraktion 1". Gentag 1x PBS + 10% FBS omrystning trin (3.11) fem gange og Supernatanten overføres indholdet for at det korrekt mærkede-fraktion rør.
- Centrifuger ved 125 xg i 5 min. Aspirere supernatanten og resuspender pellets i 5 ml forvarmet 1x DMEM / F-12, uden vækstfaktorer tilsat.
- Centrifuger ved 78 x g i 2 min. Aspirer 4 ml af supernatanten og resuspender hver pellet i 1 ml resterende medier.
- Fjern 20 ml fra hver fraktion og tilføje til en glasplade. Visualiser krypter og vragdele under et lysmikroskop og bestemme, hvilke fraktioner til at kombinere og samle tilsvarende for at opnå den størst Percentage af krypter til debris-forhold.
BEMÆRK: Fraktioner 2-6 opnåelse af størst andel af krypter der skal pletteres. Fraktionerne til pool er oftest fraktion 3 med fraktion 4, og fraktion 5 med fraktion 6. - Centrifuge fraktioner der skal pletteres ved 125 xg i 5 min. Aspirer supernatanten forlader 50-100 pi resterende over pillen.
- Hold rør på is, og der tilsættes 1 ml af protein matrix til de samlede fraktioner. Pipetter op og ned langsomt for at forhindre tilsætning af luftbobler.
- Fjern forvarmet plader med 24 brønde fra 37 ° C inkubator, og der tilsættes 50 pi protein matrix / krypt suspension i midten af hver brønd. Overfør den podede-pladen til en 37 ° C inkubator i 10 minutter for at tillade proteinmatricen slip for at størkne.
- Tilføj 450 pi tidligere udarbejdede organoide vækstmedier + 50 pi R-spondin1 aircondition medier per brønd. Pladerne inkuberes ved 37 ° C + 5% CO2 natten over.
- Tilføj 50-100 pi af R-spondin1 aircondition media per brønd dagligt. Hver 3. dag erstatte hele organoide vækstmedier med frisk fremstillet organoide vækstmedier 450 pl / brønd beskrevet i trin 2.2. Derudover tilsættes 50-100 pi af R-spondin1 konditioneret medium per brønd.
BEMÆRK: protein matrix dråbe opretholder sin integritet i en uge, men efter 7 dage fortsætte til passage organoids.
4. Passage Organoids Hver 7. dag
- Optø proteinmatricen på is natten over ved 4 ° C dagen før passage. Varm plade med en steril 24 til 37 ° C i mindst 30 min. Forbered organoide vækstmedier beskrevet i trin 2.2 og holde ved 37 ° C indtil brug.
- Fjern organoide plade fra inkubatoren og påbegynde passage af pladen på is. Aspirer vækstmedier med en 10 ml pipette fra 3-4 brønde til start.
BEMÆRK: Opbevar aspirerede medier i 10 ml pipette, da dette vil blive brugt til at løsne proteinmatricen fald i det næste trin. - I såpiratkopierede-brønde, pipette op og ned for at løsne det protein matrix drop fra pladen. Forsigtig skrabning med spidsen af en 10 ml pipette er nyttigt til at løsne proteinmatricen dråbe. Overfør indholdet til en 15 ml konisk rør.
- Inkubér 15 ml koniske rør på is i 10 minutter og centrifugeres ved 125 xg i 5 min ved 4 ° C. Observere en hvid pellet i bunden af den koniske rør. Forsigtigt aspireres og kassere størstedelen af supernatanten / gamle organoide vækstmedier over organoide pellet forlader 100-200 ml over pelleten.
- Bryde op organoide krypter ved anvendelse af en 23 gauge nål fastgjort til en 1 ml sprøjte. Aspirer og skubbe 10-15 gange for at adskille de krypter. Minimere luft bobledannelse på grund af overdreven pipettering.
- Resuspendere organoids i 500 pi protein matrix og tilsættes 50 pi per brønd i en ny plade med forvarmet 24. Tilføj 450 pi af tidligere udarbejdede organoide vækstmedier + 50 pi R-spondin1konditionerede medier per brønd. Pladerne inkuberes ved 37 ° C natten over.
5. Plating Organoids på dag 14 for Pattern Recognition Receptor Stimulering med PAMPs og Listeria monocytogenes for Gene Expression Analysis
- To dage før provokation, streak ud L. monocytogenes på en BHI-agar plade.
- Den følgende dag vælge en L. monocytogenes koloni og vokse i 10 ml BHI-bouillon ved 37 ° C natten over under omrystning ved 200 rpm.
- Optø proteinmatricen på is natten over ved 4 ° C dagen før organoide udfordring. Varm plade med en steril 24 til 37 ° C i mindst 30 min. Forbered organoide vækstmedier beskrevet i trin 2.2 og holde ved 37 ° C indtil brug.
- Fjern organoide kultur fra inkubatoren og påbegynde passage af organoids.
- Aspirer medier fra 3-4 brønde og holde det aspirerede medier i 10 ml pipete da dette vil blive brugt til at løsne proteinmatricen dråbe. Pipette op ogned for at løsne proteinmatricen dråbe fra pladen. Forsigtig skrabning med spidsen af en 10 ml pipette er nyttigt til at løsne proteinmatricen dråbe. Overfør indholdet til en 15 ml konisk rør.
- Inkubér 15 ml koniske rør på is i 10 min. Centrifuger ved 125 xg i 10 min ved 4 ° C. Observere en hvid pellet i bunden af den koniske rør. aspireres forsigtigt supernatanten forlader ca. 100 pi af resterende supernatant bag.
- Resuspender organoide pellet i 5 ml iskold 1x PBS og fjerne en 10 pi alikvot til tælling. Tilsæt 10 pi portion til midten af et hæmocytometer uden dækglas. overlay forsigtigt dækglas på toppen af dråben.
BEMÆRK: hæmocytometer vil tilstoppe med organoids hvis objektglasset ikke fjernes først. - Tæl det samlede antal organoids via et lysmikroskop i hvert gitter / hele kammer hæmocytometeret og bestemme den organoide koncentration: number af de samlede organoids tælles per 10 pi.
- Fjern et passende volumen fra 15 ml konisk rør, der vil give tilstrækkeligt antal organoids der skal podes til assayet og centrifugeres denne suspension ved 125 xg i 10 min.
BEMÆRK: Intervallet mellem 40-100 organoids pr brønd af en 24-brønds plade er tilstrækkelig til RNA-analyse. Den typiske organoide størrelse kan variere fra 300 um til 1000 um i diameter. - Aspirere supernatanten og resuspender pellet i 500 ml protein matrix uden at generere luftbobler. Der tilsættes 50 ml organoide / protein matrix suspension per brønd i en plade med 24.
BEMÆRK: Mængden af protein matrix bruges til at resuspendere organoids vil variere for den række betingelser behandlingsmuligheder og tekniske gentagelser. - Der tilsættes 500 pi organoide vækstmedium (uden N-acetyl-cystein) til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C + 5% CO2 i 1 time.
- Forbered 2x koncentrationer af PAMPs (dvs. flagellin,lipopolysaccharid) og leve L. monocytogenes. Mål OD af levende L. monocytogenes og bøf på en BHI plade til tælling. Behandl organoids ved 1 x 10 6 kolonidannende enheder (CFU) / ml.
BEMÆRK: OD til CFU bestemmelse vil variere af bakterier skrive og bør vurderes før organoide stimulation. For eksempel, en OD på 0,6 ≈ 1 x 10 9 CFU / ml for L. monocytogenes, men bør også vurderes selvstændigt inden forsøget. - Streak ud en seriel fortynding fra behandling bestand af L. monocytogenes til nøjagtigt at bestemme behandlingen CFU / ml. Forfatterne finder, at en 1 x 10 8 fortynding af 100 pi på en BHI-agar plade er tilstrækkelig til at tælle kolonier for at bestemme en nøjagtig CFU / ml.
- Forbered en varme dræbt løsning af L. monocytogenes ved at tage en 1 ml prøve af levende L. monocytogenes opløsning og centrifugeres ved 5000 xg i 10 min. Aspirere supernatanten og vaskden bakterielle pellet med 1 ml 1x PBS.
- Centrifugeres L. monocytogenes på 5.000 xg i 10 min, og pellet resuspenderes i 1 ml 1x PBS. Varm dræbe L. monocytogenes i en 1,7 ml polypropylenrør ved opvarmning ved 80-90 ° C i 1 time. Kultur en 100 pi portion af varmedræbt L. monocytogenes på en BHI agarplade at bekræfte levende bakterier tilbage.
- Der tilsættes 500 pi af den passende 2x PAMP og / eller mikrobe behandling til 500 pi hjemmehørende medier i udpegede brønde bestemmes af brugeren. Inkuber ved 37 ° C + 5% CO2 i 24 timer.
BEMÆRK: Tilføjelse af en 500 pi portion af en 2x PAMP / mikrobe behandling til 500 pi residente medier vil bringe koncentrationen behandling til 1x i et samlet volumen på 1 ml.
- Den følgende dag manuelt tælle L. monocytogenes kolonier for en nøjagtig bestemmelse af behandling CFU / ml. Aspirer medier fra pladen af behandlede organoids og vask brønde tEfter tre gange med 1x PBS.
- Fortsæt til RNA-ekstraktion via phenol / chloroform 11 eller et RNA-ekstraktion kit ifølge producentens instruktioner. Evaluere genekspression ved anvendelse af standard QRT-PCR 12.
6. Plating Organoids på dag 14 for PAMP og L. monocytogenes Challenge for Protein Analyse i Supernatant
- To dage før provokation, starte en cellekultur af Caco-2-celler, podningsdensitet ≈1 x 10 6 celler i en T-75 kolbe med 1x DMEM + 20% FBS og inkuberes Caco-2-celler ved 37 ° C + 5 % CO2. Begynd en bakteriekultur af L. monocytogenes på BHI plade og inkuber pladen i en bakteriel inkubator ved 37 ° C.
- Den følgende dag vælge en L. monocytogenes koloni og vokse i 10 ml BHI-bouillon ved 37 ° C natten over. Optø proteinmatricen på is natten over ved 4 ° C dagen før organoide udfordring.
- Den følgende dag varm en steril 96 godt sort-walledplade til 37 ° C i mindst 30 min. Forbered organoide vækstmedier uden N-acetyl-cystein beskrevet i trin 2.2 og holde ved 37 ° C indtil brug. Fjern organoide kultur fra inkubatoren og påbegynde passage af organoids.
BEMÆRK: Den typiske organoide størrelse kan variere fra 300 um til 1000 um i diameter. - Aspirer medier fra 3-4 brønde og holde det aspirerede medier i 10 ml pipete da dette vil blive brugt til at løsne proteinmatricen dråbe. Resuspender med en pipette for at løsne proteinmatricen slip fra pladen. Forsigtig skrabning med en 10 ml pipette er nyttigt til at løsne proteinmatricen dråbe. Overfør indholdet til en 15 ml konisk rør.
- Inkubér 15 ml koniske rør på is i 10 min. Centrifuger ved 125 xg i 10 min ved 4 ° C. Observere en hvid pellet i bunden af den koniske rør. aspireres forsigtigt supernatanten forlader 100 ul resterende supernatant bag.
- Resuspender organoide pellet i 5 ml iskold1x PBS og fjerne en 10 pi alikvot til tælling. Tilsæt 10 pi alikvot til midten af et hæmocytometer og forsigtigt overlejre dækglas.
BEMÆRK: hæmocytometer vil tilstoppe med organoids hvis objektglasset ikke fjernes først. - Tæl det samlede antal organoids via et lysmikroskop i hvert gitter af hæmocytometeret / hele kammeret og bestemme den organoide koncentration: samlede antal organoids tælles per 10 ml.
- Fjern et passende volumen fra 15 ml konisk rør, der vil give tilstrækkeligt antal organoids der skal podes til assayet og centrifugeres denne suspension ved 125 xg i 10 min.
BEMÆRK: Mængden af protein matrix bruges til at resuspendere organoids vil variere for mængden af betingelser behandlingsmuligheder og tekniske gentagelser. Forfatterne finder, at 40-100 organoids er tilstrækkelig for secerneret protein analyse. - Aspirere supernatanten og resuspender pellet i 500 pi protein matrix / brønd uden at generereluftbobler.
BEMÆRK: Mængden af protein matrix bruges til at resuspendere organoids vil variere for mængden af betingelser behandlingsmuligheder og tekniske gentagelser. - Efterlad mindst to kolonner tom på 96 godt sort-walled vævskulturplade da disse vil tjene som brønde podet med Caco-2-celler til generering af en standardkurve. Der tilsættes 50 pi protein matrix + organoide suspension per brønd til en forud opvarmet 96 brønd sort-walled vævskulturplade. Opbevar pladen ved 37 ° C i 10 minutter for at tillade protein matrix at størkne.
- Tilsæt 100 pi organoide vækstmedium (uden N-acetyl-cystein) til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C + 5% CO2 i 1 time.
- Forbered 2x koncentrationer af PAMPs og leve L. monocytogenes. Tilsæt 100 ml af hver given behandlingsbetingelse per brønd og inkuberes i 24 timer.
- Den følgende dag plade Caco-2 celler i standardkurven brønde. Begynd med opvarmning sterilt 1x PBS, 0,25% trypsin og 1x DMEM + 20% FBS to 37 ° C.
- Fjern de T-75-kolbe indeholdende Caco-2-celler og udsuge cellekulturmediet. Vask cellerne med 10 ml 1x PBS. Aspirer 1x PBS, tilsættes 2 ml 0,25% trypsin og sted T-75 kolbe i 37 ° C inkubator i 15 min.
- Visualisere kolbe under et lysmikroskop for at sikre cellerne er fritliggende derefter tilsættes 8 ml 1x DMEM + 20% FBS til de frigjorte Caco-2-celler og overføres til et 15 ml konisk rør. Fjern en 10 pi alikvot og tælle cellerne ved lysmikroskopi under anvendelse af et hæmocytometer.
BEMÆRK: Et øvre celleantal på 60.000 celler / brønd fungerer godt og fortyndinger kan udføres til generering af standardkurven ned til 2.500 celler / brønd. - Resuspendere Caco-2-celler i proteinmatrix og tilsættes 50 pi per brønd til passende brønde. Tillad proteinmatricen at størkne ved 37 ° C i Caco-2-celler.
BEMÆRK: Vækstmedier til Caco-2-celler behøver ikke at blive tilføjet efter størkning af proteinet matrix. - Følgende24 hr behandlingstid for organoide assay, aspireres og gemme organoide cellulære supernatant medier og holde på is. Brøndene vaskes tre gange med 1x PBS. Tilsæt 100 pi 100% methanol til hver brønd herunder Caco-2 standard curve brønde og inkuberes ved 4 ° C eller på is i 20-30 min at fastsætte organoids.
BEMÆRK: Det kræves ikke, at de Caco-2 standard curve brønde vaskes med 1 x PBS, da de kan have methanol tilsat direkte. - Efter methanol inkubation vaskes brøndene tre gange med iskold 1x PBS. Opbevar pladen ved 4 ° C i op til 1-2 uger.
- Tilføj kernefarvning farvestof i en koncentration på 1 ug / ml per brønd, dække pladen med aluminiumsfolie og inkuberes ved 4 ° C natten over.
- Brug en 96 brønds plade-læser for at måle farvning farvestof nuklear excitation / emission (350 nm / 461nm henholdsvis) og normalisere hver organoide godt med standardkurven af Caco-2-celler.
- Fortsæt til downstream assays, såsom ELISA
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når du følger denne protokol til at dyrke tarm organoids vil karakteristiske sfære formede organoids være til stede efter høst. Tilføjelsen af R-spondin1 konditionerede medier dagligt vil indlede vækst og spirende af organoids. Væksten af organoids er vist i figur 1A - F, og repræsenterer intestinale organoids på dag 1, 2, 4, 5, 6 og dag 14. Figur 1F repræsenterer de ikke-homogene vækstkarakteristika af organoids på dag 14.
Når organoids dyrkes til et passende antal, kan de genudpladet og udfordret med forskellige PAMPs og / eller mikrober. Expression analyse kan udføres via standardteknikker. Dette er repræsenteret i figur 2A-C, som viser mRNA-ekspression af inflammatoriske cytokiner IL-18, IL-6, og TNFa som blev analyseret efter en24 timers udfordring organoids med varme dræbt L. monocytogenes og pAMP flagellin. Rationalet for evaluering af mRNA-ekspression cytokiner IL-18, IL-6, og TNFa var, at disse var gode kandidater til at blive moduleret af epitelceller i respons på patogene udfordring, og modulering af disse inflammatoriske cytokiner ville vise effektiviteten af teknikken.
Figur 3A - C viser den relative nuklear farvning af intestinale organoids med nukleare farvning farvestof efter fiksering med minimal baggrund farvning af vragrester i beboeren protein matrix. Denne metode til fiksering og farvning kan anvendes til at normalisere assays, som vil udgøre forskellige celleantal i hver brønd. Dette er tydeligt i figur 4, når generering af en standardkurve for seriefortyndinger af Caco-2 celler udpladet i protein matrix, derefter fikseret og farvet med nuklearefarvning farvestof. R2 værdi på 0,89 indikerer et lineært forhold mellem celleantal og betyder fluorescensintensitet, og den lineære ligning kan anvendes til at normalisere organoids til celleantal. Standardkurven er vist i figur 4 begynder at nå mætning grænse, ud over 30.000 celler per brønd. En titrering af celler over 30.000 celler per brønd er vist i figur 4 til at omfatte mætning række nuklear farvning farvestof. Forøget nøjagtighed af normalisering vil blive opnået med et celletal, der afspejler den lineære område af kernefarvning farvestof før mætning er nået.
Figur 1:. Tyndtarmens organoide Vækst Tidsforløb for vækst for murine tyndtarm afledte organoids efter isolering. (A) Dag 1. (B) Dag 2. (C) Dag 4. (D) Dag 5. (E) Dag 6. (F) Dag 14. Billederne er repræsentative for organoide vækst for hver given dag. Scale barer lig 200 um i venstre billede for A, B, C, D og E. Scale barer lig med 100 um i det rigtige billede for A, B, C, D og E. Scale barer lig 1000 um og 200 um for venstre og højre billeder til F, hhv. klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: mRNA-ekspression af inflammatoriske cytokiner efter 24 timers PAMP Challenge Relativ mRNA-ekspression af vildtype-intestinale organoids udfordret i 24 timer med PAMPs og varmedræbte Listeria monocytogenes (A - C) repræsenterer gange ændring i i.. nflammatory cytokiner IL-18, IL-6 og TNFa hhv. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse (SD) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Relativ Fluorescerende Farvning af Organoids for normalisering Nuklear farvning af organoids med følgende fiksering.. (A) Bright felt af organoids. (B) Fluorescensfarvninq af organoids med nuklear farvning farvestof. (C) sammenflettede billede af lyse felt og fluorescerende farvning. Scale barer lig 400 um i alle billeder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Standard Curve genereret fra Caco-2-celler Standard kurve frembragt fra tredobbelte brønde.. Cell såning havde en række starter ved 60.000 celler pr med fortyndinger ned til 2.500 celler pr. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Oversigt over protokollen Diagram 1-Top panel i figuren illustrerer høst af R-spondin1 konditionerede medier. 2-midterste panel af figur illustrerer aspekter af protokollen til at høste og kultur mus små tarm organoids. 3-Bottom panel af figur illustrerer: (A) plating af 14 dages dyrkede organoids. (B) Challenge med PAMPs / L.monocytogenes, og forlader ubesatte brønde for at danne en standardkurve. (C) Efter PAMP udfordring, klædningen af Caco-2-celler i de tidligere ubesatte brønde for at danne en standardkurve. (D) Efter fiksering og tilsætning af en nuklear farvning farvestof, måle excitation / emission af brøndene og normalisering mod en standardkurve. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kulturen og vedligeholdelse af intestinale organoids er en procedure, der kan beherskes af enhver person med tilstrækkelig vævskultur teknik. Der er finesser i passage sammenlignet med voksende celler i en mere konventionel monolag, men disse finesser er ikke vanskelige at overvinde. De kritiske trin i denne fremgangsmåde involverer at kunne dyrke organoids til en høj nok densitet for optimal såning. Eksperimenter skal skaleres ned med organoids som store seeding tætheder, der kan ofte opnås med cellelinjer er ikke praktisk. Dette bliver især tydeligt, når der er flere behandlingsgrupper.
Denne protokol er beregnet til at give en trin-for-trin metode til at studere værtspatogene interaktioner af tarmepitelet med en række forskellige bakterielle, virale og fungale patogener, samt adresse vanskeligheder ved hjælp af dette system med hensyn til normalisering. Rapporter er til rådighed, der describe interaktionerne mellem tarm organoids med bakterielt patogen salmonella, endnu ikke fat normalisering metoder ved måling udskilles cytokiner 13.
Der er flere problemer, der opstår, når normalisere organoide kulturer ved forskellige metoder. Normalisere secerneret protein via bicinchoninsyre-assay (BCA) er en mulighed; imidlertid vækstkomponenter kræves til organoide kultur (N2 og / eller vitamin B27) interfererer med BCA assay (data ikke vist) Normalisering via cellulær levedygtighed, såsom en modificeret MTT assay er blevet beskrevet 14.; dog en behandling, der vil ændre den mitokondrielle metaboliske aktivitet af organoids vil indføre en unøjagtig metode til normalisering via denne teknik som MTT baseret på reduktion af virkningen af mitokondrie dehydrogenaser 15. Det er også nødvendigt at fjerne N-acetyl-cystein (NAC) fra medierne, ikke påly hvis der ønskes normalisering via MTT teknik, men hvis behandling med et bakterielt patogen som NAC kan hæmme bakterievækst 16.
Fordelene ved denne teknik er, at udskilte cytokiner og proteinprodukter fra organoids nu kan normaliseres mod en standardkurve for Caco-2-celler. Begrænsninger af denne teknik er, at normaliseringen er korrelative fordi nuklear farvning af ikke-transformerede primære epiteliale organoids normaliseres mod nukleare farvning af en coloncancer cellelinie. Forfatterne finder, at fastsættelse med methanol og farvning kerner med nukleare farvning farvestof er en effektiv normalisering teknik mod en standardkurve for Caco-2-celler. Selv om væksten karakteristika coloncancercellelinie ikke nøjagtigt efterligner vækstkarakteristika intestinale organoids, ved anvendelse af en nuklear pletten og måling gennemsnitlige fluorescensintensitet er en god strategi til at normalisere mod samlede celleantal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Section 1,3,6) Or equivalent brand |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Section 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells |
| HEK293T-Rspondin1 secreting cell line | (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. | ||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | (Section 1) Or equivalent brand |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (Section 1) Or equivalent brand |
| Protein Matrix | Corning | 356231 | (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Section 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Section 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 Well TC Plates | Corning | 3524 | (Section 2) |
| N2 Supplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Section 2) |
| B27 without vitamin A 50x | Life Technologies | 12587-010 | (Section 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| 10ml Serological Pipet | Falcon | 357551 | (Section 2) Or equivalent brand |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Section 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (Section 2) Stock = 1M |
| Recombinant Mouse EGF | Biolegend | 585608 | (Section 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Section 3) | |
| dissecting scissors | (Section 3) | ||
| forceps | (Section 3) | ||
| glass slides | (Section 3) | ||
| dissecting tweezers | (Section 3) | ||
| 25 ml Serological Pipet | Falcon | (Section 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher | FB0875712 | (Section 3) Or equal sized TC dish |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| Flagellin from Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Section 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Section 5,6) (Murray et al.) |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Section 5,6)Or equivalent brand |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Section 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (section 6) |
| Methanol | Fisher | A412-4 | (Section 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Section 6) | |
| 96 Well Assay Plate | Corning | 3603 | (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated |
| Nuclear Staining Dye | Life Technologies | H1399 | (section 6) Hoechst 33342 |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | (Section 6) Or equivalent brand |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | (Section1,3) Or equivalent brand |
| 1.7 ml polypropylene tube | Bioexpress | C-3262-1 | Or equivalent brand |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Or equivalent brand |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman gene expression assay kit |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Freshney, R. I., Freshney, M. G. Culture of epithelial cells. 2nd edn. , Wiley-Liss. (2002).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).
- Allen, I. C., et al. NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways. Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).
- Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiol Rep. 2 (9), (2014).
- Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5, 1228 (2014).
- Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts. Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).
- Parry, M. F., Neu, H. C. Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro. J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).
