Summary
Здесь, протокол для сбора, сохранения и лечения тонкого кишечника мыши органоиды патогена связаны молекулярных моделей (PAMPs) и листерий описывается, а также акцент на экспрессию генов и надлежащих методов нормализации для белка.
Abstract
Первичные кишечные органоиды являются ценным модель системы, которая имеет потенциал, чтобы существенно повлиять на поле через слизистую оболочку иммунология. Тем не менее, сложность в Органоид характеристики роста несут значительные предостережений для исследователя. В частности, закономерности роста каждого отдельного Органоид весьма разнообразны и создают гетерогенную популяцию эпителиальных клеток в культуре. С помощью таких предостережений, общие ткани практики культуры не могут быть просто применены к Органоид системе из-за сложности клеточной структуры. Подсчет и металлизированный исключительно на основе числа клеток, который является общим для индивидуально разделенных клеток, таких как клеточные линии, не является надежным методом органоидов, если не применяется какой-то метод нормализации. Нормализация к общему содержанию белка выполнен комплекс благодаря матрице резидентного белка. Эти характеристики с точки зрения количества клеток, формы и типа клеток следует принимать во внимание при оценке секретируемый CONпалатки от Органоид массы. Этот протокол был сформирован, чтобы наметить простую процедуру для культуры и лечения тонкого кишечника с органоиды микробных патогенов и патогенных микроорганизмов, связанные молекулярных моделей (PAMPs). В нем также подчеркивается методы нормализации, которые должны применяться при анализе белка проводится после такого вызова.
Introduction
Способность собирать и культуры первичных органоиды были описаны для тонкой кишки, толстой кишки, поджелудочной железы, печени и головного мозга и захватывающие достижения релевантно для понимания более физиологически представительный явления для тканевой биологии 1-5. Первые методы , характеризующие культуру и поддержания тонкого кишечника органоидами сообщает Сато и др. Из лаборатории Ганса Clevers 1. До этого метода, сбора и культуры первичных эпителиальных клеток кишечника оказалась ограниченной и неэффективной в поддержании эпителиальной роста клеток. Методы включали диссоциацию ткани с помощью инкубации с ферментами, такими как коллагеназы и диспазу, которые в конечном итоге привести к вырост перемешанных первичных клеток фибробластов 6. Эти условия также будут ограничены время в поддержании эпителиальной клеточной культуры. Минимальное чтобы не эпителиальной клетки ниши будет формироваться, как эпителиальные клетки вступит апоптоз из-заотсутствие соответствующих факторов роста или потери целостности контактов, называется anokis 7. Появление 3D-Органоид системы культуры предложен способ культивирования первичных клеток кишечника , содержащих спектр кишечных типов клеток в культуре устойчивой 1. Эти эпителиальные органоиды имеют преимущества по сравнению с клеточными линиями в том , что они состоят из нескольких дифференцированных клеток, и лучше имитировать орган они получены из 8 в естественных условиях. Процесс в конечном счете, "вырастить мини-кишка в блюде" оказалась ценным инструментом для оценки реакции кишечного эпителия при различных раздражителей. Исследуя взаимодействие первичных клеток кишечника с микробным патогенам связаны молекулярных моделей (PAMPs) имеет отношение к области иммунологии , как эти молекулярные структуры могут регулировать различные ответы от хозяина и микроба 9. Мало того, что исследователи в настоящее время исследовать эти взаимодействия с органоидами мыши, но онимогут быть выращены от людей , а также 2. Эта технология имеет потенциал, чтобы резко изменить персонализированной медицины и заманчиво порассуждать о достижениях, что этот метод даст возможность в ближайшем будущем.
Общая цель этого метода заключается в создании протокола для культуры, расширение и лечение кишечных органоидами с различными стимулами. Такие стимулы могут в конечном счете, в диапазоне от вакцин, бактериальных PAMPs, живых патогенных микроорганизмов, желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и терапии рака. Выделение и культура мыши кишечных органоидами была заимствована из Сато и др. Хотя есть небольшие отклонения от первоначального способа, конечный продукт является Органоид культура все еще достигается , когда после этого протокола. Этот метод ориентирован на описании адекватную методику для правильной нормализации при работе с неоднородных клеточных структур, которые должны быть приняты во внимание при проведении анализа на основе клеток пхариус.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования были утверждены и проведены в соответствии с руководящими принципами Virginia Tech IACUC
1. Подготовьте R-Spondin1 кондиционированной среды От HEK293T-RSPO1 клеточной линии
- Генерация клеток HEK293T-Rspondin1 было описано ранее 10. Семенной HEK293T-Rspondin1 секретирующих клеток на 5-10% сплошности, равной примерно 8 · 10 5 -1.7 х 10 6 клеток, в колбе Т-175 с 40 мл 1x Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) + 10% фетальной бычьей сыворотки ( FBS) , в качестве питательной среды, и инкубируют при 37 ° C ± 5% CO 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: питательная среда для клеток, секретирующих HEK293T-Rspondin1 будут служить в качестве R-spondin1 кондиционером СМИ. R-spondin1 можно альтернативно приобрести в качестве рекомбинантного фактора роста использовали при конечной концентрации 500 нг / мл. - Расти клетки HEK293T-Rspondin1 в течение семи дней или до достижения 95% слитности определяется ярко-полевой микроскопии. Урожай 40 мл кондиционированной среды и переноса в 50мл коническую трубку. Откажитесь от Т-175 колбу с HEK293T-Rspondin1 секретирующих клеток.
- Центрифуга трубки, содержащей кондиционированной среды при 300 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С, чтобы осадить клеточный дебрис. Соберите супернатант, называемый R-spondin1 кондиционированной среды и Алиготе в 15 мл пробирки. Храните аликвоты при -20 ° С в течение короткого срока или -80 ° С в течение длительного хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: После оттаивания R-Spondin1 кондиционированную среду можно хранить до 1 недели 4 ° C.
2. Подготовка Органоид роста сред и реактивов для уборки малых кишечных крипт
- Один день до сбора урожая, поместите замороженную белковой матрицы на льду и оттаивают в течение ночи при температуре 4 ° С. Автоклав рассекает ножницы, пинцет и стеклянные слайды, которые будут использоваться для сбора урожая крипт.
- На следующий день, начните с приготовления 40 мл Органоид питательной среды, содержащей добавки и факторы роста, добавляя концентрации запасов к 40 мл 1x DMEM / F-12. Медиа - добавки содержат: 10 мМ 2- [4- (2-гидроксиэтил) пиперазин-1-ил] этансульфоновой кислоты (HEPES) - 400 мкл, 1x глютамин добавка - 400 мкл, 1x В27 без витамина А - 400 мкл, 1 N 2 - 200 мкл, 1 мМ N-ацетил-цистеин - 40 мкл, 100 нг / мл м-Noggin - 40 мкл, 50 нг / мл м-EGF - 4 мкл и место в с водяной бане с 37 до использования O. Теплый 15 мл аликвоты R-spondin1 до 37 ° С в водяной бане.
- Теплые три стерильные 24-луночные планшеты до 37 ° С в течение по меньшей мере 30 мин путем размещения в инкубаторе. Приготовьте 50 мл на мышь 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), + 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и охлаждают до 4 ° С. Приготовьте 100 мл на мышь 1X PBS, содержащего 10% FBS и охлаждают до 4 & deg; С.
3. Уборка урожая Mus Musculus Малый Кишечные Склепы для Органоид культуры 1
- Жертвоприношение мужской C57B6 / J мыши возраст 6-12-недельного возраста подняли на стандартных грызунов и воды, доступнойвволю в соответствии с ведомственным руководящим принципам. Эвтаназии с помощью СО 2 удушья с последующим смещением шейных позвонков.
Примечание: Хранить туши на льду до сбора ткани и выполнить урожай ткани в кабинете биологической безопасности, чтобы свести к минимуму риск загрязнения.
Примечание: мужчина или женщина мыши могут быть использованы для создания органоиды. - (Необязательно) Бритье мышь, чтобы удалить мех перед тем погружением в 70% этаноле. Погружать мышь в 70% этаноле в течение 2 мин и пин-код конечности пиннинга доску с дорсальной стороне мыши касаясь доски.
- Используйте предварительно стерилизованные рассекает ножницы и пинцет, чтобы сделать разрез средней линии на вентральной части мыши. Сделайте надрез на гениталиях, протекающих черепно-мозговых к основанию шеи. Откройте разрез кожи по бокам с помощью пинцета и придавить кожу к пиннинга доску, чтобы выставить брюшины.
- Сделать надрез в середине строки в брюшину живота с рассечения ножницами и сложите йе брюшины с пинцетом в боковом направлении и пин-код к пиннинга плате, чтобы разоблачить органы брюшной полости.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы избежать сокращения органов брюшной полости. - Удалить тонкую кишку из брюшной полости с рассечения Щипцы и ножницы путем разрезания проксимальный стык тонкой кишки, соединенного с желудком и дистальном соединении, подключенного к слепой кишке. Поместите тонкий кишечник в стерильную чашку Петри, содержащую 10 мл охлажденного льдом 1x PBS.
- Промыть содержимое, содержащихся в просвете тонкой кишки, охлажденным льдом 1x PBS с использованием 1 мл пипетки. Повторите этот шаг, пока мусор в просвет тонкой кишки не удаляется.
- Отрежьте тонкий кишечник с рассечения ножницами на 3-4 приблизительно равные полоски длиной и положите полоски в продольном направлении на новую стерильную чашку Петри. Для каждой полосы, вставьте передний край рассекает ножницами внутри просвета тонкой кишки, чтобы сделать надрез по всей длине ое полосы. Используйте пинцет, чтобы в боковом направлении Откиньте надрез, чтобы разоблачить просвет тонкой кишки.
- Используйте стерильный предметное стекло, чтобы аккуратно соскрести ворсинки на полостной поверхности тонкой кишки. Отрежьте тонкую кишку в 1-2 см длины полоски с рассекающих ножницами и передать эти полоски в 50 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл ледяной холод 1x PBS.
- Смешайте содержимое осторожно переворачиванием коническую трубку 50 мл, и позволить содержание ткани оседают на дно 50 мл коническую трубку. Аспирируйте 1X PBS и повторить это три раза путем промывания ткани с 10 мл охлажденного льдом 1x PBS. На последней промывки оставить коническую пробирку на льду в течение 10 мин, содержащую 10 мл 1X PBS и небольшие сегменты ткани кишечника.
- Аспирируйте 1X PBS и добавляют 25 мл 1x PBS + 2 мМ ЭДТА. Место на качающейся платформе при 4 ° С или в ведерке со льдом в течение 45 мин. В то время как ткань инкубирования, маркировать шесть 15 мл конические пробирки "фракция № 1-6."
- Разрешить содержимое ткани оседают на дно пробирки. Удалить и перенести супернатант в мл коническую трубку 15 с надписью "фракция 1". Повторите 1x PBS + 10% FBS встряхивания стадии (3.11) в пять раз и передавать супернатант содержимое, чтобы соответствующим образом маркированы-фракции трубки.
- Центрифуга при 125 мкг в течение 5 мин. Аспирата супернатант и ресуспендируют гранул в 5 мл подогретого 1x DMEM / F-12, без каких-либо факторов роста добавлены.
- Центрифуга при 78 мкг в течение 2 мин. Отберите 4 мл супернатанта и ресуспендируют каждую гранулу в 1 мл остальных сред.
- Удалить 20 мл из каждой фракции и добавить к предметному стеклу. Визуализируйте крипты и мусора под световым микроскопом и определить, какие фракции объединить и объединить соответственно для достижения наибольшего Percentage крипт соотношение мусора.
Примечание: Фракции 2-6 дают самый большой процент крипт, чтобы быть покрыты. Фракции в пул наиболее часто фракция 3 с фракцией 4 и 5 фракции с фракцией 6. - Центрифуга фракции металлизируемые при 125 х г в течение 5 мин. Отберите супернатант оставляя 50-100 мкл оставшегося выше осадка.
- Хранить трубы на льду и прибавляют 1 мл белковой матрицы для объединенных фракций. Пипеткой вверх и вниз медленно, чтобы предотвратить добавление пузырьков воздуха.
- Удалить предварительно нагреты 24-луночные планшеты с 37 ° C инкубатора и добавить 50 мкл матрицы белка / крипты суспензии в середине каждой лунки. Перенести затравкой пластину к C-инкубаторе 37 ° в течение 10 мин, чтобы позволить падение белковый матрикс затвердеть.
- Добавить 450 мкл предварительно подготовленных Органоид питательной среды + 50 мкл R-spondin1 кондиционированной среды на лунку. Инкубируйте пластины при температуре 37 ° C + 5% CO 2 в течение ночи.
- Добавить 50-100 мкл R-spondin1 кондиционером лечебА на хорошо ежедневно. Каждый 3 - й день заменить весь Органоид питательной среды со свежеприготовленным Органоид питательная среда 450 мкл / лунку , описанной в пункте 2.2. Кроме того, добавляют 50-100 мкл R-spondin1 кондиционированной среды на лунку.
Примечание: Перепад матрица белок сохраняет свою целостность в течение одной недели, а через 7 дней приступить к пассирования органоидам.
4. Пассирование органоидами Каждый 7 - й день
- Разморозить белковой матрицы на льду в течение ночи при 4 ° С за день до пассажей. Теплый один стерильный 24-луночный планшет до 37 ° С в течение по меньшей мере 30 мин. Подготовка Органоид среды для выращивания, описанные на стадии 2.2, и держать при температуре 37 ° С до использования.
- Удалить Органоид пластины из инкубатора и начать пассажи пластины на льду. Отберите питательная среда с 10 мл пипеткой из 3-4 лунок, чтобы начать.
Примечание: Хранить Аспирированную носитель в 10 мл пипеткой, так как это будет использоваться, чтобы выбивать капли матричного белка в следующем шаге. - В качествепиратской-Скважина, пипеткой вверх и вниз для того, чтобы выбивать капли матричного белка из пластины. Легкий соскоб с кончиком 10 мл пипетки полезно в выбивании капли матричного белка. Перенести содержимое в коническую пробирку на 15 мл.
- Выдержите 15 мл конические пробирки на льду в течение 10 мин и центрифугируют при 125 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Отметим, белый осадок на дне конической трубки. Аккуратно аспирата и выбросить большую часть надосадочной / старый Органоид ростовой среде над Органоид окатышей, оставляя 100-200 мкл над таблеткой.
- Разбивают Органоид крипт с помощью иглы калибра 23, прикрепленную к 1 мл шприца. Отберите и выбросит в 10-15 раз для того, чтобы отделить крипты. Сведение к минимуму образования пузырьков воздуха из-за чрезмерного пипеткой.
- Ресуспендируют органоиды в 500 мкл белковой матрицы и добавляют 50 мкл на лунку в новый предварительно нагретый 24-луночного планшета. Добавить 450 мкл предварительно подготовленных Органоид питательной среды + 50 мкл R-spondin1кондиционированной среды на лунку. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение ночи.
5. Покрытие органоидами на 14 -й день для распознавания образов рецепторов стимуляции PAMPs и листерий для анализа экспрессии генов
- За два дня до заражения, полоса из L. моноцитогенес на BHI агаром.
- На следующий день забрать L. моноцитогенес колонию и расти в 10 мл BHI бульона при 37 ° С в течение ночи при встряхивании 200 оборотов в минуту.
- Разморозить белковой матрицы на льду в течение ночи при 4 ° С за день до Органоид вызов. Теплый один стерильный 24-луночный планшет до 37 ° С в течение по меньшей мере 30 мин. Подготовка Органоид среды для выращивания, описанные на стадии 2.2, и держать при температуре 37 ° С до использования.
- Удалить Органоид культуру из инкубатора и начать пассажи органоидов.
- Аспирируйте средств массовой информации из 3-4 лунок и держать всасываемого СМИ в pipete 10 мл, как это будет использоваться, чтобы выбивать капли матричного белка. Пипетировать ивниз для того, чтобы выбивать капли матричного белка из пластины. Легкий соскоб с кончиком 10 мл пипетки полезно в выбивании капли матричного белка. Перенести содержимое в коническую пробирку на 15 мл.
- Выдержите 15 мл конические пробирки на льду в течение 10 мин. Центрифуга при 125 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Отметим, белый осадок на дне конической трубки. Аккуратно аспирата супернатант оставляя приблизительно 100 мкл остаточного супернатанта позади.
- Ресуспендируют осадок в Органоид 5 мл охлажденного льдом 1x PBS и удалить 10 мкл аликвоты для подсчета. Добавляют 10 мкл аликвоты в середине гемоцитометра без проскальзывания покровного стекла. Аккуратно наложения покровного стекла на верхней части капли.
ПРИМЕЧАНИЕ: гемоцитометр забивают с органоидов, если предметное стекло не сначала удаляется. - Подсчитать общее количество органелл с помощью светового микроскопа в каждой сетке / всю палату гемоцитометра и определить концентрацию Органоид: Numбер от общего числа органоидов подсчитаны на 10 мкл.
- Удаление соответствующий объем из 15 мл коническую трубку, которая позволит Адекватное количество органелл, чтобы быть посеяны для анализа и центрифугировать эту суспензию при 125 мкг в течение 10 мин.
Примечание: Диапазон между 40-100 органоидам на лунку 24-луночного планшета достаточно для анализа РНК. Типичный Органоид размер может находиться в диапазоне от 300 мкм до 1000 мкм в диаметре. - Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок в 500 мл белковой матрицы без образования пузырьков воздуха. Добавьте 50 мл Органоид / белковой матрицы суспензии на лунку в 24-луночный планшет.
Примечание: Количество белковой матрицы используется для ресуспендирования органоиды будет отличаться от числа условий обработки и технических повторах. - Добавьте 500 мкл среды для выращивания Органоид (без N-ацетил-цистеин) в каждую лунку и инкубировали при 37 ° C ± 5% CO 2 в течение 1 часа.
- Приготовьте 2x концентрации PAMPs (т.е. флагеллином,липополисахарида) и жить L. моноцитогенес. Измерьте OD живого L. моноцитогенес и стейк на тарелку BHI для подсчета. Treat органоиды при 1 × 10 6 колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: OD для определения КОЕ будет варьироваться в зависимости от типа бактерий и должны быть оценены до Органоид стимуляции. Например, наружный диаметр 0,6 ≈ 1 · 10 9 КОЕ / мл для L. моноцитогенес, но также должны быть оценены независимо друг от друга до эксперимента. - Серия из серийного разведения от обработки запаса L. моноцитогенес точно определить лечение КОЕ / мл. Авторы обнаружили , что 1 х 10 8 разбавление 100 мкл на BHI агаром достаточна для подсчета колоний , чтобы определить точную КОЕ / мл.
- Приготовьте тепла убит раствор L. моноцитогенес, взяв 1 мл аликвоты живого L. моноцитогенес раствора и центрифуге при 5000 мкг в течение 10 мин. Аспирируйте супернатант и мытьбактериальный осадок с 1 мл 1x PBS.
- Центрифуга L. моноцитогенес при 5000 мкг в течение 10 мин и ресуспендируют осадок в 1 мл 1x PBS. Нагреть убить L. моноцитогенес в 1,7 мл полипропиленовую трубку нагреванием при температуре 80-90 ° С в течение 1 ч. Культура 100 мкл аликвоты тепла убит L. моноцитогенес на BHI агаром , чтобы подтвердить не живые бактерии остаются.
- Добавьте 500 мкл соответствующего 2x PAMP и / или лечения микробной до 500 мкл резидентной информации в обозначенных лунках, определяемым пользователем. Инкубировать при температуре 37 ° C + 5% СО 2 в течение 24 часов.
Примечание: Добавление 500 мкл аликвоты лечения / микроба 2x PAMP до 500 мкл-резидентов СМИ будет довести концентрацию лечения до 1 раза в общем объеме 1 мл.
- На следующий день, вручную рассчитывать L. моноцитогенес колонии для точного определения лечения КОЕ / мл. Аспирируйте средств массовой информации из пластины обработанных органоидов и мыть скважин три раза 1x PBS.
- Переходим к экстракции РНК с помощью смеси фенол / хлороформ 11 или набора для экстракции РНК в соответствии с инструкциями производителя. Оценка экспрессии генов с использованием стандартных QRT-PCR 12.
6. Покрытие органоидами на 14-й день для PAMP и L. моноцитогенес вызов для белка анализа в супернатанта
- За два дня до заражения, начать клеточную культуру клеток Сасо-2, плотность посева ≈1 х 10 6 клеток в Т-75 колбу с 1x DMEM + 20% FBS и инкубировать клетки Сасо-2 при температуре 37 ° С ± 5 % CO 2. Начинают бактериальной культуры L. моноцитогенес на BHI пластине и инкубировать пластину в бактериальном инкубаторе при температуре 37 ° С.
- На следующий день забрать L. моноцитогенес колонию и расти в 10 мл BHI бульона при 37 ° С в течение ночи. Разморозить белковой матрицы на льду в течение ночи при 4 ° С за день до Органоид вызов.
- На следующий день теплая один стерильный 96 хорошо черной стенойплиты до 37 ° С в течение по меньшей мере 30 мин. Подготовка Органоид питательной среды без N-ацетил-цистеин, описанной в шаге 2.2 и держать при температуре 37 ° С до использования. Удалить Органоид культуру из инкубатора и начать пассажи органоидов.
Примечание: Типичный Органоид размер может находиться в диапазоне от 300 мкм до 1000 мкм в диаметре. - Аспирируйте средств массовой информации из 3-4 лунок и держать всасываемого СМИ в pipete 10 мл, как это будет использоваться, чтобы выбивать капли матричного белка. Ресуспендируют с пипеткой для того, чтобы выбивать капли матричного белка из пластины. Нежный очищающий с 10 мл пипетки полезно в выбивании капли матричного белка. Перенести содержимое в коническую пробирку на 15 мл.
- Выдержите 15 мл конические пробирки на льду в течение 10 мин. Центрифуга при 125 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Отметим, белый осадок на дне конической трубки. Аккуратно аспирата супернатант оставляя 100 мкл остаточного супернатанта позади.
- Ресуспендируют Органоид осадок в 5 мл охлажденной льдом1x PBS и удалить 10 мкл аликвоты для подсчета. Добавляют 10 мкл аликвоты в середине гемоцитометра и аккуратно наложить покровного стекла.
ПРИМЕЧАНИЕ: гемоцитометр забивают с органоидов, если предметное стекло не сначала удаляется. - Подсчитать общее количество органелл с помощью светового микроскопа в каждой сетке гемоцитометра / всей камере и определяют концентрацию Органоид: общее количество органелл, подсчитанных на 10 мл.
- Удаление соответствующий объем из 15 мл коническую трубку, которая позволит Адекватное количество органелл, чтобы быть посеяны для анализа и центрифугировать эту суспензию при 125 мкг в течение 10 мин.
Примечание: Количество белковой матрицы используется для ресуспендирования органоиды будет отличаться от количества условий обработки и технических повторах. Авторы считают, что 40-100 органоиды достаточно для анализа секретируемого белка. - Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок в 500 мкл белковой матрицы / лунку без генерациивоздушные пузырьки.
Примечание: Количество белковой матрицы используется для ресуспендирования органоиды будет отличаться от количества условий обработки и технических повторах. - Оставьте по крайней мере, две колонки пусты на 96-луночного черного тонкостенные планшета для культуры ткани, поскольку они будут служить в качестве лунки засевают клетками Сасо-2 для генерации стандартной кривой. Добавьте 50 мкл белка матрицы + Органоид суспензии на лунку в предварительно нагретый 96-луночного культурального планшета черной стеной. Хранить планшет при 37 ° С в течение 10 мин, чтобы позволить белковый матрикс затвердеть.
- Добавьте 100 мкл среды для выращивания Органоид (без N-ацетил-цистеин) в каждую лунку и инкубировали при 37 ° C ± 5% CO 2 в течение 1 часа.
- Подготовить 2x концентрации PAMPs и жить L. моноцитогенес. Добавляют 100 мл каждого данного условия лечения на лунку и инкубировать в течение 24 часов.
- На следующий день пластинчатые Сасо-2 клеток в стандартной кривой лунки. Начните путем нагревания стерильную 1x PBS, 0,25% трипсина и 1x DMEM + 20% FBS тO 37 ° C.
- Удалите Т-75 колбу, содержащую клетки Сасо-2 и аспирация среды для культивирования клеток. Вымойте клеток с 10 мл 1x PBS. Аспирируйте 1X PBS, добавляют 2 мл 0,25% трипсина и место Т-75 колбу в 37 ° C инкубаторе в течение 15 мин.
- Визуализируйте колбу под световым микроскопом, чтобы убедиться, как клетки отдельностоящий затем добавляют 8 мл 1x DMEM + 20% FBS в отдельных клеток Сасо-2 и перенесите в 15 мл коническую пробирку. Удаление 10 мкл аликвоты и подсчета клеток с помощью световой микроскопии с использованием гемоцитометра.
Примечание: Верхний число клеток 60000 клеток / лунку работает хорошо и разведений могут проводиться для генерации стандартной кривой до 2500 клеток / лунку. - Ресуспендируют клетки Сасо-2 в белковой матрице и добавить 50 мкл на лунку в соответствующие лунки. Дайте белковый матрикс затвердевать при температуре 37 ° С для клеток Сасо-2.
Примечание: средства массовой информации роста для клеток Сасо-2 не должны быть добавлены следующие затвердеванию белковой матрицы. - Следующийвремя обработки 24 часа в сутки для Органоид анализа, аспирация и сохранить Органоид клеточных супернатантов носитель и держать на льду. Промыть лунки три раза 1x PBS. Добавьте 100 мкл 100% метанола в каждую лунку, включая СаСО-2 стандартная кривая скважины и инкубировать при температуре 4 ° С или на льду в течение 20-30 мин, чтобы зафиксировать органоидов.
Примечание: Не требуется, чтобы Сасо-2 стандартная кривая скважины промываться 1х PBS, так как они могут быть добавлены непосредственно метанол. - После инкубации метанола, промойте лунки три раза с ледяной 1x PBS. Храните планшет при 4 ° С в течение до 1-2 недель.
- Добавить краситель для окрашивания ядерной при концентрации 1 мкг / мл на лунку, покрывают пластину с алюминиевой фольгой и инкубируют при 4 ° С в течение ночи.
- Использование 96-луночного планшет-ридер для измерения окрашивания красителя ядерного возбуждения / излучения (350 нм / 461nm соответственно) и нормализовать каждый Органоид хорошо стандартной кривой клеток Сасо-2.
- Переходим к вниз по течению анализов, таких как ELISA
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При следовании этому протоколу культивировать кишечных органоиды, характерные сферы в форме органоиды будет присутствовать после сбора урожая. Добавление R-spondin1 кондиционированной среды ежедневно инициирует рост и почкование органоидов. Рост органоидами показан на рисунке 1А - F, и является представителем кишечных органоидов в дни 1, 2, 4, 5, 6 и день 14. Рисунок 1F представляет собой неоднородные характеристики роста органоидами на 14 -й день.
После того, как органоиды выращивают в соответствующем количестве, они могут быть снова высевали и заражают различными PAMPs и / или микробов. Анализ экспрессии может быть осуществлено с помощью стандартных методик. Это представлено на рисунке 2А-С , которая показывает экспрессию мРНК воспалительных цитокинов IL-18, IL-6, и ФНО , которые были проанализированы следующие за24 ч проблема органоидами с тепла убит L. моноцитогенес и флагеллином PAMP. Обоснование для оценки экспрессии мРНК цитокинов ИЛ-18, ИЛ-6, и TNF-alpha было, что они были хорошими кандидатами для модулирования эпителиальными клетками в ответ на патогенную вызов, и модуляция этих воспалительных цитокинов продемонстрирует эффективность техники.
Рисунок 3A - C демонстрирует относительную ядерное окрашивание кишечной органоидами с окрашиванием красителем ядерной после записи с минимальным фоном окрашивания мусора в матрице резидентов белка. Этот метод фиксации и окрашивания могут быть применены для нормализации анализов, которые будут составлять разное число клеток в каждой лунке. Это видно на рисунке 4 , при генерации стандартной кривой серийных разведений Сасо-2 клеток высевали в протеиновую матрицу, а затем фиксировали и окрашивали ядернымОкрашивание краситель. Значение R 2 0,89 указывает на линейную зависимость между числом клеток и средней интенсивности флуоресценции, а линейное уравнение можно использовать для нормализации органоиды на количество клеток. Стандартная кривая изображена на рисунке 4 начинает достигать предела насыщения за пределами 30000 клеток на лунку. Титрование клеток выше 30000 клеток на лунку , как было показано на рисунке 4 , чтобы включать в себя диапазон насыщенности окрашивания красителем ядерного. Повышение точности нормализации будет получена с числом клеток, который отражает линейный диапазон окрашивании красителем ядерного до того предела насыщения достигается.
Рисунок 1:. Малый Кишечные Органоид Рост Временной ход роста для мышиных тонкой кишки , полученных органоидами после изоляции. (А) День 1. (B) День 2. (С) День 4. (D) День 5. (Е) День 6. (F) День 14. Изображения являются репрезентативными органоид роста для каждого данного дня. Шкала баров равна 200 мкм в левом изображении для A, B, C, D и E. Шкала баров равна 100 мкм в правом изображении для A, B, C, D и E. Шкала баров равна 1000 мкм и 200 мкм для левого и правого изображений для F соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: экспрессия мРНК воспалительными цитокинами После 24 ч PAMP вызов Относительная экспрессия мРНК кишечных органоидами дикого типа вызов в течение 24 ч с PAMPs и тепла убит листерий (А - С) представляют собой кратное изменение I.. nflammatory цитокины ИЛ-18, ИЛ-6 и ФНО соответственно. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение (SD) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Относительная Флуоресцентные Окрашивание органоидами для нормализации Ядерное окрашивание органоидами с последующей фиксацией.. (A) Яркое поле органоидов. (B) Флуоресцентные окрашивание органоидами с окрашиванием красителем ядерной. (C) Объединенное изображение светлого поля и флуоресцентного окрашивания. Шкала баров равна 400 мкм во всех изображениях. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Стандартная кривая генерируется из Сасо-2 клеток стандартной кривой , полученной из трех лунок.. Cell Посев был диапазон , начиная с 60000 клеток на лунку с разведений вплоть до 2500 клеток на лунку. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 5: Обзор Протокола Диаграмма 1 Верхняя панель на рисунке показана уборки R-spondin1 кондиционированной среды. 2-средняя панель на рисунке иллюстрирует аспекты протокола для сбора урожая и культуры тонкого кишечника мыши органоидов. 3-Нижняя панель На рисунке показано: (А) металлизация 14 день культивируемых органоидов. (B) Вызов с PAMPs / L.моноцитогенес и оставляя незаполненные скважины для получения стандартной кривой. (C) После вызова PAMP, обшивку Сасо-2 клеток в ранее не заселенных скважин для получения стандартной кривой. (D) После фиксации и добавления красителя для окрашивания ядерного, измерения возбуждения / испускания лунок и нормализацию против стандартной кривой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Культура и содержание кишечных органоидами является процедурой, которая может быть освоена любым человеком с адекватной техникой тканевой культуры. Есть тонкости в пересева, когда по сравнению с выращивания клеток в более традиционных монослоя, но эти тонкости не трудно преодолеть. Критические этапы этого метода включают возможность вырастить органоиды до достаточно высокой плотности для оптимального высева. Эксперименты должны быть уменьшены с органелл, как большие плотности высева, которые обычно могут быть достигнуты с клеточными линиями, не практично. Это становится особенно очевидным, когда есть несколько групп лечения.
Этот протокол предназначен для обеспечения способа шаг за шагом изучить хозяин-патоген взаимодействия кишечного эпителия с различными различных бактериальных, вирусные и грибковые патогены, а также трудности, адреса, использующие эту систему относительно нормализации. Отчеты доступны, что describе взаимодействия кишечных органоидами с бактериальным патогеном Salmonella, пока не рассматривают методы нормализации при измерении секретируют цитокины 13.
Есть несколько трудностей, с которыми сталкиваются при нормализации Органоид культур различными методами. Нормализация секретируемый белок с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA) вариант; Тем не менее, компоненты , необходимые для роста Органоид культуры (N2 и / или витамин В27) вли ни на анализ ВСА (данные не показаны) , нормализующих через жизнеспособности клеток, таких как модифицированный тест МТТ описан 14. Однако, лечение , которое изменяет митохондриальную метаболическую активность органоидами представит неточные метод нормализации с помощью этой методики , как МТТ основан на восстановлении под действием митохондриальных дегидрогеназ 15. Кроме того, необходимо, чтобы удалить N-ацетил-цистеин (NAC) из средств массовой информации, а не наLY если нормализация с помощью метода МТТ желательно, но если лечение с бактериальным патогеном , как NAC может подавлять рост бактерий 16.
Преимущества этого метода является то, что секретируемые цитокины и белковые продукты из органоидам теперь могут быть нормализованы по стандартной кривой клеток Сасо-2. Ограничения этого метода является то, что нормализация является коррелятивная, поскольку ядерное окрашивание нетрансформированных первичных эпителиальных органоидами нормированы против ядерного окрашивания толстой кишки линии раковых клеток. Авторы считают, что фиксация с метанолом и окрашивания ядер с ядерными окрашивания краситель является эффективным методом нормализации по стандартной кривой клеток Сасо-2. Хотя характеристики роста этой клеточной линии рака толстой кишки не точно имитировать характеристики роста кишечных органоидов, с использованием ядерного пятна и измерения средней интенсивности флуоресценции является хорошей стратегией для нормализации против общего числа клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Section 1,3,6) Or equivalent brand |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Section 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells |
| HEK293T-Rspondin1 secreting cell line | (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. | ||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | (Section 1) Or equivalent brand |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (Section 1) Or equivalent brand |
| Protein Matrix | Corning | 356231 | (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Section 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Section 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 Well TC Plates | Corning | 3524 | (Section 2) |
| N2 Supplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Section 2) |
| B27 without vitamin A 50x | Life Technologies | 12587-010 | (Section 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| 10ml Serological Pipet | Falcon | 357551 | (Section 2) Or equivalent brand |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Section 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (Section 2) Stock = 1M |
| Recombinant Mouse EGF | Biolegend | 585608 | (Section 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Section 3) | |
| dissecting scissors | (Section 3) | ||
| forceps | (Section 3) | ||
| glass slides | (Section 3) | ||
| dissecting tweezers | (Section 3) | ||
| 25 ml Serological Pipet | Falcon | (Section 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher | FB0875712 | (Section 3) Or equal sized TC dish |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| Flagellin from Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Section 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Section 5,6) (Murray et al.) |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Section 5,6)Or equivalent brand |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Section 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (section 6) |
| Methanol | Fisher | A412-4 | (Section 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Section 6) | |
| 96 Well Assay Plate | Corning | 3603 | (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated |
| Nuclear Staining Dye | Life Technologies | H1399 | (section 6) Hoechst 33342 |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | (Section 6) Or equivalent brand |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | (Section1,3) Or equivalent brand |
| 1.7 ml polypropylene tube | Bioexpress | C-3262-1 | Or equivalent brand |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Or equivalent brand |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman gene expression assay kit |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Freshney, R. I., Freshney, M. G. Culture of epithelial cells. 2nd edn. , Wiley-Liss. (2002).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).
- Allen, I. C., et al. NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways. Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).
- Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiol Rep. 2 (9), (2014).
- Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5, 1228 (2014).
- Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts. Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).
- Parry, M. F., Neu, H. C. Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro. J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).
