Introduction
Metastase is een belangrijke doodsoorzaak bij patiënten met maligniteiten. Het proces van metastatische verspreiding van kankercellen wordt slecht begrepen, maar schijnt een aantal stappen, waaronder invasie van aangrenzende weefsels intravasation in de lymfevaten en bloedvaten, overleving en translocatie in de bloedsomloop, extravasatie van het vaatstelsel op de plaats van metastase, aanpassing betrekken de nieuwe micro-omgeving van de nieuwe site, en kolonisatie op de nieuwe site van proliferatie en vorming van secundaire tumoren. 1 Elk van deze biologische gebeurtenissen brengen de transformatie, verspreiding en overleving van uitgezaaide tumorcellen. Bijvoorbeeld de transformatie van de epitheliale fenotype van de tumorcel in een mesenchymale fenotype, gecombineerd met de succesvolle interactie met de extracellulaire matrix, opdat zij met aangrenzende weefsels binnen te dringen en metastaseren naar andere delen van het lichaam. 2,3 Bovendien zijn deze metastatische cellenTenslotte moet overleven in de bloedstroom circuleren en onttrekken immuunbewaking van de gastheer. 4,5, wanneer geïmplanteerd in een afgelegen locatie in het lichaam, de tumorcellen moet dus aanpassen aan hun micro-omgeving om prolifereren en vormen uitzaaiingen. 6,7 hoewel metastase is een veel voorkomend verschijnsel bij patiënten met kanker, uitgezaaide tumorcellen hebben meerdere gebieden van kwetsbaarheid die vatbaar zijn voor therapeutische interventie.
Gezien het immunogene karakter van melanoom, en de recente interesse immuuntherapie, modellen voor melanoma steeds bruikbaar. 8 In de Verenigde Staten alleen melanoom is de oorzaak van een schatting 9000 doden per jaar. 9 gemeenschappelijk locaties van melanoom metastase bot, hersenen , lever en longen. De meeste metastasen op afstand gelegen plaatsen via de bloedbaan komen. Circulerende tumorcellen in het bloed moet immuunklaring ontwijken, bereikt een capillaire bed van een distaal orgaan enbinnenvallen door de endotheelcellen van het bloedvat om zich met succes te vestigen. 4-7,10, 11
Om de gemeenschappelijke en virulente verschijnselen van metastase na te bootsen, werd het muizen B16-BL6 cellijn gecreëerd. Een overledene van de ouderlijke C57BL / 6 melanoma cellijn B16-F0, B16-BL6 is het eindproduct van 10 opeenvolgende selecties van longmetastasen van intraveneuze injectie (resulterend in B16-F10), gevolgd door 6 achtereenvolgende selecties voor blaas membraan penetratie. 12 als zodanig is het een betrouwbaar melanoma cellijn voor de vaststelling van metastatische foci in de muis, in het bijzonder bij intraveneuze injectie. 13
Na injectie van een voldoende hoeveelheid B16-BL6 cellen in de staartader van een B57BL / 6 muizen, gevolgd door twee of meer weken implantatie en groei van de B16 / BL6 cellen mogelijk zal metastatische foci te vormen in de longen. Bij euthanasie en inspectie door het ontleden van microscopie, het aantalindividuele haarden aanwezig kan worden gekwantificeerd. Dit op zijn beurt kan worden gebruikt om een dosis-metastase effect vastgesteld omdat het aantal geïnjecteerde B16-BL6 cellen correleert met het aantal foci gevormd op het oppervlak van de longen. Dit model staat bekend als "experimentele metastase," waarbij bekende metastatische cellen direct in de bloedbaan worden ingevoerd, vergemakkelijkt een snelle en voorspelbare spreiding en vestiging in de longen, lever of ander orgaan van onderzoek. Dit is in tegenstelling tot "spontane metastase," waarbij tumorcellen geïmplanteerd, meestal subcutaan en metastasen afkomstig van biologisch vergoten kankercellen. 14,15
Het is belangrijk om een geschikte hoeveelheid B16 / BL6 cellen te injecteren in de staart aderen van de muizen. Te veel en de longen bedekt met metastasen en naburige foci onderscheiden zal zijn van elkaar. Te weinig, en de invloed van een therapeutisch middel zal indiscernible als gevolg van inherente varities tussen de injecties. Om een optimaal aantal foci op de longen van de C57BL / 6-muizen te verkrijgen, is het noodzakelijk om het aantal geïnjecteerde cellen te correleren met de hoeveelheid vastgestelde metastatische foci op het oppervlak van de longen met inachtneming van de distinguishability individuele brandpunten. Dit protocol is een metastatisch muizen melanoom model voor C57BL / 6-muizen aantonen.
Protocol
Ethiek Verklaring: Het gebruik van muizen in onderzoek in gevallen waar het menselijke begrip van fundamenteel biologisch of naar de uiteindelijke behandeling van de ziekte kunnen bevorderen alleen aanvaardbaar.
1. Bestellen
- Aankoop vrouwelijke C57BL / 6 muizen (leeftijd 6-8 weken), 5 muizen per groep. Kan enkele dagen voor de muizen te passen.
2. Voorbereiding van de B16-BL6 Cells
- Verwijder celkweek borden van 37 graden incubator en plaats in een steriele kap. De platen moeten ongeveer 70% samenvloeiing met B16-BL6 muizen melanoomcellen zijn. Een grotere samenvloeiing kunnen de cellen veranderen metastatisch vermogen.
- Voeg 1 ml van 0,05% trypsine-EDTA per plaat, laat zitten gedurende 1 minuut en daarna zuig het trypsine-media oplossing.
- Voeg 1 ml trypsine per plaat en platen terug naar de incubator gedurende 10 minuten.
- Na het verplaatsen van de platen uit de incubator naar de steriele kap wordt 4 ml serumvrij Rosewell Park Memorial Institute Medium (RPMI) aan elke plaat.
- Verzamel de cellen met een steriele, gemotoriseerde pipet. Uitwerpen cellen tegen de onderzijde van de plaat, met de punt geperst bij een zeer geringe hoek te breken van de cellen. Herhaal dit een paar keer om een goede scheiding van de cel klonten, die anders het uitwerpen naald zou kunnen verstoppen te garanderen. Herinneren en over te dragen aan een 50 ml conische buis.
- Gebruik een hemocytometer om de celdichtheid te bepalen. Houden het totale aantal B16-BL6 cellen constant Bepaal het volume serumvrij RPMI nodig eindconcentraties van 0, 0,065, 0,015, 0,25, en 0,5 miljoen cellen / ml bereiken.
- Evenzeer aliquot de media in de 50 ml buis tot 15 ml conische buizen. Centrifugeer de conische buizen bij 2250 xg gedurende 5 minuten. Schenk de media. Voeg een geschikt volume van serumvrij RPMI en bevestig de gewenste cel dichtheid via hemacytometer. Pas densities- door het toevoegen van extra RPMI of spinnen en resuspenderen in een kleinere volume- dienovereenkomstig.
- Aliquot 500 pivan elke celsuspensie in gelabelde 1,8 ml buisjes op ijs.
3. Tail Vein Injection
- Neem een muis, in het bezit van de staart, en begeleiden zij achter-first in de muis weerhouder. Met de romp in de belangrijkste kamer van de weerhouder, met de staart buiten, trekt u de muis naar het einde van de weerhouder. Steek de weerhouder-zuiger, blijft druk totdat de muis is beveiligd.
- Draai de muis 90 graden zodat één van de laterale staartaders naar boven is gericht. Met behulp van een doekje met alcohol, krachtig reinigen van de kant van de staart van de muis, in het bijzonder wanneer de staartader het meest zichtbaar is.
Let op: Goede verlichting is essentieel voor een effectieve staartader visualisatie op B57BL / 6J muizen. Warmtelampen of verwarmd chirurgie pads, maar niet noodzakelijk, zal ook het volume van de staartader verhogen. - In een steriele cultuur kap, verzamelen 300 pi celkweekmedium van de 2.000.000 cellen / ml buis. Omkeren van de naald, flicking de side en duwt de zuiger, om bellen te werpen uit de spuit. Eject cultuur-RPMI te resulteren in een uiteindelijk volume van 250 pl.
- Uitbreiding van de muis-staart met niet-dominante hand. Houd de staart met het proximale uiteinde van de staart verhoogd met de wijsvinger van de niet-dominante hand en het distale gedeelte van de staart ingedrukt met de duim.
Opmerking: Zo wordt de staartader gehouden in een laterale positie, parallel aan de restrainer oppervlak met een overeenkomende invoer mogelijk in de meer distale deel van de staart. - Steek de naald in de ader staart, in de richting van het distale einde, op een minuut neerwaartse hoek om te beginnen, en pas dan de naald op de hoek van de staartader bij verder inbrengen overeenkomen (het verlagen van zuiger einde van de injectiespuit ten opzichte van de naald) .
- Steek de naald ongeveer 1 cm in de staartader. Na het inbrengen, beginnen om de zuiger te duwen, die de naald stabiel.
Opmerking: Als de naald in de staartader en het einde van de naald not belemmerd de media moeten ongehinderd stromen in de ader. Effectieve injectie wordt gekenmerkt door een speling bloed uit de ader. Als er weerstand is, of een bel begint te vormen op de site in injectie, verwijder de naald en probeer het opnieuw op een meer proximale locatie langs de staartader. - Haal de naald uit de ader en gooi hem weg. Houd gaas tegen het binnendringen site om het bloeden te stoppen.
- Verwijder de zuiger uit de weerhouder en plaats de muis in de kooi ontvanger.
- Herhaal dit voor alle andere concentraties.
Let op:. Lung brandpunten vestiging duurt ongeveer 2-3 weken, met variabiliteit afhankelijk van de cellijn en de gewenste grootte van de brandpunten 9 In de tussentijd, muizen moeten worden gecontroleerd op symptomen die vroege euthanasie zou kunnen rechtvaardigen, zoals overmatig hijgen.
4. Het tellen van de Lung Foci
- Euthanaseren de muis door in een CO 2 kamer en blootgesteld aan 100% CO 2
- Splay de muis op piepschuim. Gebruik chirurgische schaar, maakt een incisie langs het borstbeen.
- Eens twee insnijdingen, zowel vanaf de bovenkant van het borstbeen incisie en vertakking naar de schouders van de muis, waardoor de ribbenkast.
- Maak twee sneden, elk langs de laterale zijden van het borstbeen, de ribbenkast van de romp verwijderd, waardoor de longen en het hart.
- Het houden van het hart met chirurgische pincet, snijd de slokdarm en de luchtpijp, het vrijmaken van het hart en de longen van de muis. Plaats onder een dissectie microscoop bij 10X vergroting, voor een betere visualisatie.
- Ontleden het hart uit de longen en verwijder de thymus, waardoor alleen de twee longen.
- De longen onder een dissectie scope, beginnen de longen foci tellen. Ieder focus verschijnt als een cirkel, bruine het opdringen op het oppervlak van de longen.
- Voorsamenhang tussen muizen, tel het aantal foci op het oppervlak van een kwab en keer dan dat kwab. Doen alle vier lobben afzonderlijk zorgt voor eenvoudiger tellen.
- Opslaan en de longen repareren als het uitvoeren van IHC, anders gooi de overblijfselen.
Representative Results
Bij visueel onderzoek, de variatie in oppervlak foei zichtbaar. Het tellen van het aantal tumoren onder een dissectie microscoop moet een lineair verband tussen het aantal geïnjecteerde tumorcellen en het aantal verkregen en telbaar foci verkregen. Via een optimaal aantal injecteerbare cellen, het doel waar de longen niet volledig bedekt, omdat zij bij 500.000 cellen / ml in Figuur 1A en niet te dun bedekt, omdat zij bij 62.500 cellen / ml en 125.000 cellen / ml. Dit is meetbaar door lineaire correlatie (Figuur 1B).
Figuur 1. Lung Foci Voortvloeiend uit staartader geïnjecteerd B16 / BL6 Cells. (A) Long foci kunnen worden gevisualiseerd op het oppervlak van longen van C57BL / 6 muizen bruin cirkel massa (vertegenwoordiger foci onder pijlen). Zoals de holenteit van de geïnjecteerde celcultuur (boven elke afbeelding) toeneemt, neemt ook de overeenkomstige aantal als gevolg long brandpunten (onder elke afbeelding). De longen van de muis met de hoogste dichtheid van geïnjecteerde cellen heeft de grootste visuele bereik van long foci. Schaalbalken vertegenwoordigen 20 mm. (B) Opsomming van de long foci opzichte van de celkweek dichtheid. Er is een ongeveer lineair verband boven 125.000 cellen / ml, zoals bepaald door hemacytometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Circulerende tumorcellen uit een injectie in de staartader vertegenwoordigen de metastasen die sites van de primaire groei ontwijken en migreren door routes, zoals de bloedbaan of lymfestelsel, af en toe zich te vestigen in de capillaire bedden van verre locaties. 14 Het protocol hierboven beschreven dient als model voor het voortgezet metastasen. Met een optimaal aantal B16-BL6 cellen geïnjecteerd, kunnen onderzoekers het relatieve effect van een toegediend geneesmiddel of immuuncel populatie, na neutralisatie, op kankercellen metastase bepalen.
Dit protocol heeft beperkingen. De circulerende tumorcellen zijn geselecteerd op hun vermogen om te metastaseren en dus niet-immunogeen, met lage niveaus van groot histocompatibiliteit complex klasse 1 moleculen. 12 Ook de plotselinge en geclusterde introductie van grote aantallen metastasen in tegenstelling tot de typische scenario patiënten waar kleine aantallen metastatische tumorcellendissiperen gedurende een langdurige tijdsperiode uit de primaire tumor locatie. Bovendien, de intraveneus ingebracht tumorcellen uit weefselkweek en niet van een primaire tumor oorsprong. Daarom zijn deze cellen in tegenstelling tot de secundaire metastasen die resulteren uit veranderingen in celhechting, migratie immuunherkenning en ontvangende organen inrichting. 15,16
Een alternatief protocol zou subcutane injectie van B16 / BL6 voor het genereren van primaire tumoren en de analyse van de resulterende "spontane" pulmonaire metastasen. Deze "spontane" metastasen bleken meer heterogeniteit dan de "experimentele" tegenhangers bevatten, beter passen bij die van menselijke patiënten. Het protocol is beperkt in zijn vermogen om de invloed van de experimentele verbinding bepaald op metastase. Met een laterale staartader injectie, kan het aantal melanoomcellen geïnjecteerd in de bloedbaan worden benaderd via hemocytometer. Met "spontane" metastase, maar er is meer heterogeniteit tussen tumoren, toevoegen van een extra variabele om het aantal foci verkregen long. 16
Concluderend, de staartader B16-BL6 muizen melanoom model vertegenwoordigt een eenvoudig model voor het bepalen van de invloed van een behandeling of immunotherapie op metastase. Door intraveneus injecteren van circulerende tumorcellen, kunnen onderzoekers repliceren enigszins patiënten post-metastase. Gezien de destructieve effecten van uitgezaaide tumorcellen bij kankerpatiënten, dit model is een krachtig hulpmiddel om het meerstaps proces van metastase.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Deels gesteund door een National Cancer Institute subsidie 1R03CA172923.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin | Corning | MT25052CV | |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT15040CM | |
| Phase Contraast Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | |
| Micro-Fine IV Insulin Syringes | BD | 14-829-1D | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Mouse Restrainer | Braintree Scientific | NC9999969 | Restrainer choice depends on age/size of mice |
| Heating Pad | Harry Schein | NC0012697 | Optional |
References
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis. Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).
- Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease. Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape. Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).
- Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression. J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).
- Kang, Y., Massague, J. Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis. Cell. 118, 277-279 (2004).
- Hodi, S. F., et al. Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma. NEJM. 363 (13), 711-723 (2002).
- Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States. J. Am. Acad. Dermatol. 65, 5 Supple 1 133-143 (2011).
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).
- Weinberg, R. A. Is metastasis predetermined. Mol. Oncol. 1 (3), 263-264 (2007).
- Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials. Cancer Res. 56 (4), 875-879 (1996).
- Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406, 532-535 (2000).
- Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M. Tumor cell metastasis. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 5 (2), 87-114 (1986).
- Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Curr Protoc in Cell Biol. , Chapter 19, Unit 19.2 (2001).
- Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review). Int. J. Oncol. 18 (4), 669-681 (2001).
- Hart, I. The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma. Am J Pathol. 97 (3), 587-600 (1979).
- Overwijk, W. W., Restifo, N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma. Curr Protoc Immunol. 20 (1), (2001).
