Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינתזה חלקיקים דמויי וירוס באמצעות baculovirus או או מערכות ביטוי יונקים, וטיהור ultracentrifugation. גישה להתאמה אישית זה משמשת לזיהוי אנטיגנים נגיפיים כמטרות חיסון בצורה בטוחה וגמישה.
Abstract
חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) וחלקיקי subviral (SVPs) הם גישה חלופית עיצוב חיסון ויראלי מציע את היתרונות של בטיחות ביולוגית מוגברת יציבות לאורך שימוש פתוגנים חיים. ללא זיהומיות עצמית הרכבה, VLPs משמש להציג חלבונים מבניים כמו immunogens, תוך עקיפת צורך פתוגנים חיים או וקטורים ויראליים רקומביננטי למסירת אנטיגן. במאמר זה, אנחנו מדגימים את השלבים השונים של עיצוב VLP ופיתוח עבור יישומים עתידיים ניסויים בבעלי חיים פרה-קליניים. ההליך כולל את השלבים הבאים: בחירה של אנטיגן, ביטוי של אנטיגן בתור תא של בחירה, טיהור VLPs / SVPs, וכימות עבור מינון האנטיגן. אנו מדגימים שימוש בשני שורות תאי יונקי חרקים לביטוי של אנטיגנים שלנו להדגים כיצד מתודולוגיות שונות בתשואה. המתודולוגיה הציג עשויה לחול על מגוון רחב של פתוגנים יכול להיות מושגת על ידי החלפת אנטיגנים עם str immunogenicחלבוני uctural של מיקרואורגניזם המשתמש של עניין. VLPs ו SVPs לסייע באפיון אנטיגן ובחירת המועמדים החיסון הטוב ביותר.
Introduction
חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) מהווים טכנולוגיה אושרה לחיסון אדם. למעשה, חלק מן החיסונים מורשים יותר contemporarily, כולל וירוס הפפילומה האנושי (HPV) Β הפטיטיס (HepΒ) חיסונים להעסיק את הגישה הזו. VLPs נוצר חלבונים מבניים מסוגלים הרכבה עצמית. החלקיקים התאספו לחקות מורפולוגיות ויראלי, אבל לא יכולים להדביק או לשכפל משום שהם חסרי הגנום נגיפי. VLPs יכול לבוא לידי ביטוי מטוהרים מן מספר מערכות פרוקריוטים ו האיקריוטים. סקירה של הספרות עולה כי מערכות ביטוי שונות מועסקות בשיעורים הבאים: החיידקים - 28%, שמרים - 20%, צמח - 9%, חרק - 28%, ו יונקים - 15% 1. ראוי לציין, חיסוני HPV מבוססים על חלבון קפסיד L1 מיוצרים שמרים (Gardasil) או מערכת תא חרק (Cervarix) 2. חיסוני HepΒ, Recombivax ו Engerix-Β, מיוצרים גם בשמרים, והם מורכבים אנטיגן שטח HepΒ 3, 4.
אנו משתמשים במערכות ביטוי תאי יונקים וחרקים לייצר VLPs המחייב שיתוף ביטוי של חלבונים מבניים מרובים להרכבה. העבודה שלנו מתמקדת בעיצוב, ייצור, וחיסונים VLP מבוססי טיהור נגד פתוגנים אנושיים: נגיף שפעת, וירוס סינסיציאלי הנשימה (RSV), וירוס דנגה (DENV), ו Chikungunya וירוס (CHIKV). השיטות שלנו גמישות מספיק כדי לאפשר שיתוף ביטוי של החלבונים המבניים המרובים פלסמידים ביטוי מרובים, או פלסמיד ביטוי יחיד (איור 1). בעבר, שהפקנו מטוהרים H5N1 VLPs התאספו מן שיתוף ביטוי של פלסמידים קידוד hemagglutinin שפעת (HA), נורמינידאז (NA), מטריצה (M1) בתאים עובריים אנושיים כליות 293T 5,6. הגנים היו קודון אופטימיזציה עבור ביטוי בתאי יונקים ו משובטים לתוך pTR600, וקטור ביטוי איקריוטיים המכיל את ציטומגלווירוס מיידית-מוקדם אמרגן אחד פלוס אינטרון לייזום transcription מוסיף איקריוטיים ואת האות polyadenylation הורמון גדילה שור להפסקת שעתוק 7. גישה דומה באמצעות שלושת פלסמיד שיתוף הביטוי של HA, NA (איור 1 א) ו חלבון מטריקס ויראלי חלופי, HIV Gag P55, שמשה דור VLPs H3N2 תת סוג שפעת עונתית אדם במחקר זה הוכח ליצור VLPs בגודל דומה כחלקיקים שפעת 8. למרות החיסונים לשפעת בעיקר לעורר נוגדנים אנטי-HA, תוספת של נורמינידאז שפעת מתווכת פעילות sialidase לאפשר VLP ניצני מתאי transfected 9 וגם בהווה מטרות immunogenic נוספים. כדי לייצר RSV VLPs, אנחנו גם נבחרנו הליבה הקשורה של HIV Gag לעצב חיסונים אבטיפוס שמציגים גליקופרוטאינים משטח RSV בלעדי להפגין עוד יותר גמישות של היווצרות VLP באמצעות HIV Gag, כפי שתואר לעיל ואופיין על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני 6,10. אחריםבעבר הראו כי VLPs הצגת ניתן להרכיב גליקופרוטאינים RSV באמצעות מרכיבים נגיפיים שונים וירוס מחלת ניוקאסל (NDV) 11, ושפעת מטריקס 12. רצפים גליקופרוטאין משטח באורך מלא נוצלו במחקר זה כדי לשמור על תצורות הילידים כי ייתכן שיהיה צורך עבור קולטן פונקציונלי assay הכרה נוגדן איגוד באמצעות assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA).
דוגמאות שלנו עבור שימוש במערכות ביטוי פלסמיד בודד כדי ליצור חלקיקים הם DENV ו CHIKV. במקרה של DENV, נוכל לייצר חלקיקים subviral (SVPs) ללא קפסיד בתאים 293T מתוך פלסמיד יחיד המכיל קלטת ביטוי גנים מבניים PRM / E 13. סגן נשיא בכיר המונח משמש כדי לציין את חוסר חלבון הליבה או קפסיד באסיפה של חלבונים מבניים ויראלי. לחי VLPs ניתן לייצר גם באמצעות פלסמיד יחיד המכיל קלטת גנים מבניים CHIKV, קפסיד קידוד חלבוני מעטפה, או אניתאי nsect על ידי הדבקה עם baculovirus רקומביננטי קידוד קלטת הגנים מבני באותו אופטימיזציה עבור ביטוי תא חרקים (1B איור - C).
התוצאה הסופית של ביטוי גישות שנדון לעיל היא השחרור VLPs לתוך מדיום תרבית תאים כי אז יכול להיות מטוהר באמצעות ultracentrifugation באמצעות כרית גליצרול 20%. בדו"ח זה, אנו מציגים שיטות להביע ולטהר VLPs אלה ממערכות תאי יונקים וחרקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מערכת ביטוי יונקת עבור דור של שפעת H3N2 VLP
- Subclone hemagglutinin גליקופרוטאינים מבניים ויראלי (HA), נורמינידאז (NA), וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) P55 Gag לתוך וקטורים ביטוי איקריוטיים, כגון pTR600 שתואר לעיל. 7
- להגביר דנ"א coli Escherichia המוסמכות כימית (למשל, DH5α) ולבודד פלסמיד transfection כיתה באמצעות ערכת טיהור פלסמיד לפי הוראות היצרן. כמות ה- DNA תלויה תשואה והצרכים של המשתמש.
- לשמור על שורת תאים יונקים, 293T, בתקשורת צמיחה המכיל 10% נסיוב עוברי-שור (FBS) על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 באינקובטור humidified.
- לגדל תאים כאלה בבקבוק בתרבית רקמה T-150 מכיל 45-75 x 10 6 תאים לכל בקבוק כזה כי הבקבוק משיג דבקות תא שלם confluency התא 85-95% על ידי למחרת. בדוק התאים תחת מיקרוסקופ עבור conflu הרצויency.
הערה: צפיפות התאים גבוהה מומלץ בדרך כלל להניב ביטוי חלבון אופטימלי עם רעילות מינימלית כאשר באמצעות ריאגנטים transfection המסחריים אולם יתר confluency עלול לגרום הצטברות של פסולת הסלולר תוצרי לוואי ולהפחית כדאיות התא. - ביום transfection, להכין ליפוזום תערובת DNA על פי המלצות היצרן ו transfect תאי DNA עם רכב ה- DNA של 1: 1: 2 של HA: NA: Gag עם כמות ה- DNA כוללת של 40 מיקרוגרם לכל בקבוק T-150. לדלל פתרונות דנ"א ליפוזום במדיה transfection סרום ללא ללא אנטיביוטיקה כך שכל בקבוק מכיל בהיקף כולל של 20-30 מ"ל.
הערה: יחס של מבני גן עשוי לדרוש אופטימיזציה למשתמש. אמנם לא הפגין כאן, הליך transfection דומה שבוצע עם וירוס סינסיציאלי נשימה (RSV) F ו- HIV Gag ביחס של 1: 1. עבור פלסמידים ביטוי יחיד DENV ו CHIKV, סך של 20 מיקרוגרם של ה- DNA לכל בקבוק T-150 משמשים דואר אופטימליxpression. דנ"א: יחסי מגיב transfection מותאמים למשתמש. שימוש מומלץ בינוני transfection ויסות בשיטות transfection, כלומר, transfections שומני polycationic ממליץ הפחתה או העדר בסרום שור עובר ובכך תקשורת ניתן להשלים עם הורמוני גדילה ויסודות קורט כדי לתמוך בצמיחה בהעדר בסרום. - חזור צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס עם חממת 5% CO 2. עבור נפח של 200 מ"ל, השתמש 9 T-150 צלוחיות. התאים נשמרים בינוני תרבות transfection עד יום קציר VLP.
- supernatant תרבות קציר מתאי לאחר 72-96 שעות-transfection פוסט תלוי אנטיגן, או כאשר כדאיות התא ירדה ל 70-80%, כפי שהוערך על ידי בדיקה מיקרוסקופית. העברת supernatant לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטי ספין התאים למטה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולה פסולת הסלולר.
הערה: החלפת supernatant 3 ימים עם תקשורת transfection מחומם מראש, סרום ללא טריה תאים חסידים יהיה yielמנה שנייה da של VLPs עם תשואה דומה או מופחת מעט צריכה להיות מותאמת על ידי משתמש. - supernatant ולסנן ברכה דרך קרום 0.22 מיקרומטר נקבוביים לפני השקיעה באמצעות ultracentrifugation.
- בדוק את פעילות hemagglutination של VLPs HA-להביע ידי assay hemagglutination תקן 14 באמצעות טורקיה 0.8% או כדוריות דם אדומות יונקים או להמשיך עם ELISA אנטיגן ספציפי. ראה איור 2 תוצאות נציג.
2. ביטוי VLP לחי שימוש מערכת תא baculovirus / חרקים
- צור baculovirus רקומביננטי להביע קפסיד Chikungunya וירוס וחלבוני מעטפה (C-E3-E2-6K-E1) מן זן S-27 באמצעות מערכת ביטוי baculovirus מסחרית.
- תרבות Spodoptera frugiperda תאים Sf9 במדיום הגידול Sf9 סרום ללא עם 100 U / פניצילין מ"ל ו סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 28 ° C. השתמש 3-5 x 10 5 ג / מ"ל ליזום תרבויות בקבוק טווה עבור suspensצמיחת תאי יון. המעבר שגרתי, כאשר הם מגיעים צפיפות התא של 2-4 x 10 6 ג / מ"ל (כל 3-4 ימים).
- Sf9 תרבות תאים בתרחיף צלוחיות טווות עם הערבוב ב 130 סל"ד על מערכת צלחת בוחש מרובה. עבור אוורור נאות, לשמור כרכי תרבות ללא יותר ממחצית הנפח של הבקבוק הטווה.
- עבור הביטוי של הלחי VLPs, להדביק תאים Sf9 בצפיפות של 2 x 10 מ"ל 6 תאים / עם baculovirus רקומביננטי על ריבוי של זיהום של 1 ולחזור 28 ° C חממה. בדרך כלל, להדביק צלוחיות טווה אחד או שניים, המכיל 250 מ"ל תאים Sf9.
הערה: למרות שאנו לא משתמשים בשיטה זו, תאי Sf9 עלולים להיות מתורבתים צלוחיות שייקרו ב 28 ° C באמצעות פלטפורמה שייקרה. - תרבויות קציר לאחר 72-96 שעות לאחר הפגיעה, או כאשר כדאיות התא ירדה ל 70-80% כפי שנקבע על ידי הכללת Trypan כחול על פי פרוטוקול של היצרן.
הערה: התאים ממשיכים להתרבות בעוד נגוע וישכדאיות מצוינת ~ 80% בתרבויות Sf9 נגועים baculovirus הלחי VLP רקומביננטי ב 3 ימים לאחר פגיעה (dpi). תאים נגועים baculovirus גדולים במראה. מורפולוגיה עשויה גם לשנות מן הסיבוב כדי מלבני. In-בשלבים המאוחרים של זיהומים baculovirus, התאים החלו lyse. - העברת תרבויות ישירות מתרבות ההשעיה לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטי ספין למטה התאים ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 °.
- אסוף supernatants ולסנן דרך קרום 0.22 מיקרומטר נקבוביים לפני השקיעה באמצעות ultracentrifugation.
3. שקיעה / טיהור VLP / SVPs
- לעקר 25 מ"מ x 89 מ"מ צינורות ultracentrifuge גג פתוח עם אתנול 70% במנדף בטיחות ביולוגית. ודא אתנול התייבש מעל לפני השימוש.
- טען עד 32 מ"ל של supernatant לתוך צינור נקי. בהיקף מינימלי של 25 מ"ל מומלץ כדי למנוע קריסה ונזק של צינורות ultracentrifuge מולא כראוי.
- בזהירות בבסיס שנינות supernatantsג 3 מ"ל 20% גליצרול סטרילי ב PBS (v / v). הפוך צינורות בטוחים מאוזנים.
- ספין על 135,000 XG במשך 4 שעות ב 4 ° C.
- לשאוב supernatant, הבטחת הגלולה לא לעקור מן הצינור.
- Resuspend משקעים VLPs בתחתית הצינורות עם PBS סטרילי על ידי pipetting למעלה ולמטה במרץ. כמות PBS צריך resuspend VLPs תלוי תשואה חלבון VLP הכולל ויישומים במורד הזרם. בדרך כלל, resuspend כל גלולה VLP בלפחות 100 μl.
- חנות דגימות 4 ° C עבור אחסון לטווח קצר -80 ° C אחסון עבור אחסון לטווח ארוך.
4. קביעת תשואות חלבון ותשואות אנטיגן ספציפיות
- קבע את תכולת החלבון הכולל בשיטת כימות חלבון מסחרית, כגון assay BCA לפי הפרוטוקול של היצרן.
- כדי להעריך תוכן אנטיגן ספציפי, לבצע assay immunosorbent הישיר enzyme-linked (ELISA) על ידי ציפוי דילולים סידוריים של אנטיגן סטנדרטי 2-51; גרם של מדגם חלבון הכולל על צלחת ELISA 96-גם שטוח תחתונה.
- עקוב עם נוגדני אנטיגן ספציפי לחקור את הנוכחות של אנטיגנים על הצלחת ולהשתמש מצעי פיתוח ELISA קונבנציונליים לייצר ספיגה לזיהוי עבור קורא microplate. ראה איור 2 תוצאות נציג assay HA ו ELISA למדגם HA-להביע VLP; שילובים רבים של HA ו NA הם אולי אבל התשואות עשויות להיות שונות על תאימות HA-NA 15.
הערה: נוגדנים אנטיגן ספציפי יש זיקות משתנה ומומלץ כי טיטרציה דילול נקודת הסיום של נוגדנים להיקבע לפני ביצוע כימות VLP. נוגדנים מסחריים יצטרכו טווחי ריכוז או דילול מומלצים לשימוש ELISA, כמו גם פרוטוקולים שהציעו.
- עקוב עם נוגדני אנטיגן ספציפי לחקור את הנוכחות של אנטיגנים על הצלחת ולהשתמש מצעי פיתוח ELISA קונבנציונליים לייצר ספיגה לזיהוי עבור קורא microplate. ראה איור 2 תוצאות נציג assay HA ו ELISA למדגם HA-להביע VLP; שילובים רבים של HA ו NA הם אולי אבל התשואות עשויות להיות שונות על תאימות HA-NA 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תשואות VLP היו משתנות על ידי עיצוב מבנה אנטיגן ויראלי. בפרוטוקול זה, אנו הוכחנו שימוש בתאי חרקים יונקים לייצור SVP או VLPs ב supernatant וטיהור על ידי ultracentrifugation. ארבעה תת-סוגים של DENV PRM / E קלטות ביטוי מבני גן ששמשו לבניית הגירסות של SVPs DENV (המסומן כמו 1-4) בלוח 1 ולהפגין בטווח שבין 1.1-2.6 מ"ג של חלבון מסך 0.6 מיליליטר כרכים. לקבלת VLPs הדורשים בונה גן השלושה, מצאנו את יחס transfection DNA אופטימיזציה של 1: 1: 2 HA: NA: Gag בהתאמה לסנתז VLPs שפעת; לעומת זאת, פלסמיד יחיד לבטא חלבונים נגיפיים Chikungunya מרובים היה מספיק עבור הדור של baculovirus רקומביננטי VLP הלחי היונק. בנוסף, הליך transfection כפול פלסמיד הוא גם אפשרי עם בתאי יונקים, וככזה עם RSV F ו- Gag טרנספקציה ביחס של 1: 1, ומניבה approximately 0.01 מ"ג / מ"ל של supernatant תרבית תאים הכולל. כפי שניתן לראות בטבלה 1, התשואה SVP הלחי מתאי Sf9 יכול לנוע בין 0.008-0.016 מ"ג חלבון הכל / מ"ל של נפח supernatant, בעוד הייצור באמצעות יונקים 293T מניב הפחתה של פי 10 של חלבון. בין שתי הגירסות של H3N2 VLPs באמצעות פלסמידים wild-type השונה, באורך מלא HA, מדגם VLP H3N2 2 היה תשואה מופחתת של שני חלבון הכולל ותוכן HA ספציפי. כמויות HA VLP מדגם אחר מוצגות איורים 2 ו -3 ותדגמנה HA ו ELISA משמשים לאמידת תוכן שטח על VLPs. כמו עם שיטת ELISA קונבנציונלית ישירה, עקומת סטנדרט נוצרת באמצעות ריכוזים ידועים של רקומביננטי HA להשוות תגובתיות ELISA לדגום H3 VLPs טעון לצלחת ELISA. ELISA או immunoassay דומה המומלצים כימות של VLPs שיש נוגדנים חד שבטיים זמינים עם crossreactivity ידוע על epit נשמרת היטבopes, אבל לא יכול להיות זמין עבור כל אנטיגנים. RSV F הוא מאופיין היטב, אפוא ELISA באמצעות נוגדן אנטי RSV monoclonal F הוא גם ישים עבור כימות של F השטח על pelleted RSV F VLPs. בנוסף לפונקציונליות אנטיגן והכרת אנטיגן על ידי נוגדנים ספציפיים, הכנות VLP ניתן להעריך מבחינה מבנית על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים. איור 4 הן תמונת נציג מראה כי HA (Gag הליבות) VLPs השפעת באות לידי ביטוי בהצלחה, התאספה, וטהרה כפי VLPs.
| תיאור | כרך תרבות (מ"ל) | בציר | נפח כולל | תשואת חלבון סה"כ (מ"ג) | תשואה (מ"ג) / כרך (מ"ל) | תוכן אנטיגן ספציפי |
| SVP DENV1 | 293T186 | 4 ד | 0.6 מl | 1.115 | 0.006 | nd |
| SVP DENV2 | 293T / 186 | 4 ד | 0.6 מ"ל | 2.5 | .0134 | nd |
| SVP DENV3 | 293T / 186 | 3 ד | 0.6 מ"ל | 1.536 | .0083 | nd |
| SVP DENV4 | 293T / 186 | 4 ד | 0.6 מ"ל | 2.613 | 0.014 | nd |
| הלחי VLP | Sf9 / 186 | 3 dpi | 0.6 מ"ל | 1.503 | .0081 | nd |
| הלחי VLP | Sf9 / 500 | 4 dpi | 2.0 מ"ל | 8.276 | .0166 | nd |
| הלחי VLP | 293T / 186 | 3 ד | 0.6 מ"ל | .296 | 0.0016 | nd |
| H3N2 VLP 1 | 293T /216 | 3 ד | 0.6 מ"ל | 1.25 | 0.0058 | 1.9 מיקרוגרם HA / μl |
| H3N2 VLP 2 | 293T / 216 | 3 ד | 0.6 מ"ל | .956 | .0044 | 0.96 מיקרוגרם HA / μl |
| H3N2 VLP 3 | 293T / 216 | 3 ד | 0.6 מ"ל | 1.6 | .0074 | 1.2 מיקרוגרם HA / μl |
| H3N2 VLP 4 | 293T / 216 | 3 ד | 0.6 מ"ל | 1.54 | .0071 | 0.98 מיקרוגרם HA / μl |
| VLP RSV F | 293T / 216 | 3 ד | 0.6 מ"ל | 2.3 | .0106 | 0.15 מיקרוגרם RSV F / μl |
| d-= ימים-transfection פוסט, dpi = ימים לאחר הפגיעה | ||||||
טבלה 1: Subviral ו נ irus דמויים תשואות חלקיקים על ידי מבנה. נציג נתונים כרכים VLP, תשואת חלבון כוללת (נקבעה על ידי assay BCA הקונבנציונלי) או תוכן אנטיגן ספציפי (נקבע על ידי ELISA) מוצגת בין מגוון של מבני SVP / VLP. תשואות הן משתנות בשל הבדל הרכבת SVP / VLP וסוג התא, ותשואות מרביות עשויות לדרוש אופטימיזציה למשתמש. הגרסאות השונות של כל אחד DENV1-4 משתנות בהתאם סרוטיפ, בעוד VLPs הלחי להשתמש באותו רצף אבל ההכנות נבדלים נפח או או סוג תרבית תאים. הגירסות השונות של H3N2 VLPs (1-4) להביע ארבעה רצפי HA ייחודיים חולקות epitope HA ספציפית ELISA תגובתי והיו שיתוף הביעו באותה הליבה NA ו Gag. לכלי הרכב F VLP, אשר מופק transfection כפול פלסמיד של RSV F ו- Gag, היה מסונתז ותוכן RSV F היה מקורב באמצעות assay ELISA ספציפיים RSV F.
.jpg "/>
איור 1:. גישה - VLP עיצוב, סינתזה, וטיהור ייצוג סכמטי של עיצובים גן פלסמיד ביטוי של חלבונים מבניים ויראלי שיהוו VLPs: (א) שיתוף ביטוי של חלבונים מבניים מרובים על ידי שיתוף transfection של שלושה פלסמידים בתאים 293T ביטוי של חלבונים מבניים, (ב) מתוך קלטת גן יחידה מקודדות פלסמיד יחיד בתאי 293T, ו- (ג) קידוד baculovirus רקומביננטי וחלבונים מבניים לחי משמש להדביק תאי Sf9 בתרבית צלוחיות טווות כדי להאיץ גדילת תאי צפיפות גבוהה בתרחיף . VLPs נקצר מתקשורת תרבית תאים, הבהיר של פסולת תא, ומופרד שאינם חלקיקים באמצעות שקיעה על ידי ultracentrifugation על כרית גליצרול 20%. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
FO: keep-together.within-page = "1"> 
. איור 2: assay דוגמא Hemagglutination של H3 VLPs assay hemagglutination קונבנציונלי בוצע על מדגם מייצג של H3N2 VLP ו supernatant הבהיר המתאים לו; assay H3N2 HA יכול להתבצע באמצעות טורקיה 0.8% תאי דם אדומים או תאי דם אדומים שרקן (לא מוצג). תכולת החלבון סה"כ נאמד באמצעות assay BCA התקן על VLP מטוהרים ולא בוצעה או מומלץ supernatant הבהיר. ELISA בוצע על VLP מטוהר ותוכן HA נאמד באמצעות תקן HA רקומביננטי של ריכוז ידוע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: Ex H3 ELISA בשפע כימות של תוכן H3 ב H3 VLPs. צלחת ELISA מטויח דילולים סידוריים של תקן HA רקומביננטי של ריכוז ידוע ודוגמאות H3N2 VLP בדילול המופקים רצפי HA שונים (דוגמאות 1-9). בדיקת ההתאמה בין הריכוז (מיקרוגרם / μl) של ההתקן לערכי הצפיפות האופטיים השיגו ב 492 ננומטר (OD), ריכוזיים מתקבלים על ידי והסיק את ערך x שחוצה את החלק הליניארי של עקומת הסטנדרט. דילולים של דגימות תקן HA רקומביננטי ובלתי ידועים הועמסו כפולים בבארות A & B או C & D, בהתאמה. הריכוז הסופי של מדגם VLP נקבע על ידי הכפלת הריכוז על ידי גרם לדילול של מדגם VLP. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
4041 / 54041fig4.jpg "/>
איור 4: מיקרוסקופית אלקטרונים של HA-VLPs באמצעות Gag ליבות תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים נציג של VLPs HA שפעת מטוהרים.. VLPs יותך חלקיקים כדוריים צופה HA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השתמשנו הטכניקות המתוארות לעיל להביע בהצלחה ולטהר SVPs ו VLPs מורכבת של חלבונים מבניים מרובים עבור פתוגנים שונים. באופן כללי, אנו משתמשים במערכות ביטוי יונקים ליצור VLPs שלנו. עם זאת, בידינו, תאים יונקים נגזרים תשואות VLP לחי היו נמוכות. תשואת VLP לחי הייתה חזקה יותר בעת השימוש במערכת תא רקומביננטי baculovirus-חרקים. באופן כללי, baculovirus חרקים מערכות תא להניב כמויות גדולות יותר של חלבונים רקומביננטיים, אשר עשוי לנבוע צפיפות התא גבוה שיכול להיות מתורבת צלוחיות טווה מול צלוחיות בתרבית רקמה, וכן בשל רמה גבוהה של ביטוי גנים זרים תוך בשליטת של אמרגן polyhedrin baculovirus. 16 עם זאת, חסרון של שימוש baculovirus הוא עצם הנוכחות של baculovirus בהכנות VLP, אשר יש פעילות אדג'ובנט, ותוצאות אימונולוגיים מלוכסנות בחיסון מחקרי 17 מצאנו גם השתנות בתשואת השפעת Vתקליטים תלוי שילובים HA ו NA בשימוש; H3N2 VLP2 צמצמה יחסית תשואה לעומת H3N2 VLP1, פוטנציאל בשל הרכבת VLP יעילה פחות או NA-תאימות 15 ונשארה להיחקר נוסף. אופטימיזציה של בונת DNA ויחסי transfection להישאר צעדים חיוניים להבטחת תשואות VLP אופטימליות. אנו שבחרנו להשתמש pTR600 וקטור יונק באופן עקבי בין VLPs היונק המבוססת שלנו כי ביטוי הוא יעיל בדרך כלל subcloning נוח עם אנזימי הגבלה מרובים. יחסים של פלסמידים עשויים להיות מותאמים לדרישות של המשתמש כדי לשפר תשואות VLP. עם זאת, כפי שראינו, המגבלות הנוכחיות של ייצור VLP יונקים להישאר עם עלות transfection ואת יכולת הצמיחה התא צלוחיות בתרבית רקמה הנוכחי. למרות שלא בצע בפרוטוקול זה, ראינו ייצור מוצלח נוסף של VLPs בתאי transfected כאשר תקשורת הוא מתחדש עם תקשורת צמיחה טריה (למשל, OptiMEM) לאחר עצי האשוחT-72 HR קציר והאיסוף הבא של VLPs לאחר 72 שעות נוספות, למרות תשואות עשויות להיות מופחתות במעט לעומת האוסף הראשון של VLPs.
אנו מדגימים נוהל לבטא חלבונים מבניים ויראלי או בתרביות תאים חרקים או יונקים לשחרר VLPs ב supernatant עבור טיהור למחצה על ידי ultracentrifugation. סגן הנשיא הבכיר / VLPs יציב בדרך כלל לשימוש immunoassays אנטיגן ומחקרי חיסון, להוות איום בטיחותי פחות לעומת לחיות חלקיקים נגיפיים, במיוחד עבור סוכנים נבחרים או שפעת עופות הגבוה הפתוגן (HPAI) זני 8,18, הדורשים בטיחות ביולוגית רמה 3 (BSL-3) בתנאי מעבדה 19. ייצור VLP הוא פשוט יחסית, ולעתים קרובות מניב חלקיקים שעשויים להיות מוכר על ידי נוגדנים שהושרו נגד חלבונים מבניים ויראלי ילידים, לא אפיטופים ליניארי מפוגלים בלעדי. VLPs לשמש פלטפורמה שימושית לעורר תגובות חיסוניות ספציפיות לאנטיגן והוא רשאילהיות מועמד מבטיח בפיתוח חיסון.
פרוטוקול זה מדגים שתי גישות transfecting גנים ויראלי במערכת היונקת. באיור זה, שני גנים שפעת, HA ו NA, הם שיתוף transfected עם Gag HIV כדי ליצור VLP כי יש ליבה פנימית Gag, עם HA ו NA התאספו על פני השטח. ההחלפה של Gag במקום שפעת מטריקס 1 (M1) מדגימה גמישות של VLPs המבוסס Gag עם גליקופרוטאינים ויראלי לא קשורים, כגון RSV F ואפשרות אחר. לחלופין, את הסינתזה של CHIKV מנצלת קלטת גנים מבנית, המבטאת את המרכיבים הדרושים להרכבה עצמית SVP, עם חלבוני CHIKV E מוצגים על פני השטח של מרכז המורכב חלבון C. שתי גישות אלה מדגימות את הגמישות של סינתזת VLP, מחייב חלבונים נגיפיים מבניים מינימאליים להרכיב מתאי transfected.
לבסוף, בעוד הצגנו פרוטוקולים בכלל resul נציגts לביטוי וטיהור H3N2, RSV, DENV, ו CHIKV, נהלים אלה ניתנים בקלות עבור הדור של VLPs באמצעות חלבונים נגיפיים אחרים. נהלים אלה שימשו בהצלחה על ידי הקבוצה שלנו בדור של תת וירוס שפעת אחרים, כולל H1, H5, ווירוסים H7. יתר על כן, הפלסמיד יחיד, PRM / E העיצוב נעשה שימוש עבור הדור של DENV SVPs ניתן להתאים לכל דור SVPs בשביל שחברי המשפחה Flavivirus הכוללים הנילוס המערבי ווירוסים קדחת המוח היפנית. באופן דומה, שיטות יצור VLP הלחי יכול לשמש בשביל שחברי המשפחה Togaviridae, כולל ונצואלה, מזרח, ווירוסים אנצפליטיס המערבית סוסים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מבקשים להודות לחברים מראש של מעבדת רוס שעזרו לייעל את הפרוטוקול ליעילות ותשואות מקסימליים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 ml) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
References
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
- Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
- Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
- Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
- Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
- Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
- Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
- Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
- Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
- Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
- Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
- Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
- Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
- Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
- Jarvis, D. L. Methods in Enzymology. 463, Academic Press. 191-222 (2009).
- Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
- Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
- Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).
