Summary
Ici, nous présentons un protocole pour la synthèse de particules de type viral en utilisant soit baculovirus ou systèmes d'expression de mammifères, et la purification de l'ultracentrifugation. Cette approche hautement personnalisable est utilisée pour identifier des antigènes viraux comme cibles de vaccins d'une manière sûre et flexible.
Abstract
Les particules virales (VLP) et des particules sous-virales (de SSVP) sont une approche alternative à la conception de vaccins viraux qui offre les avantages de l'augmentation de la biosécurité et de la stabilité sur l'utilisation d'agents pathogènes vivants. Non-infectieuses et auto-assemblage, les VLP sont utilisés pour présenter les protéines structurales comme immunogènes, en contournant la nécessité d'agents pathogènes vivants ou des vecteurs viraux recombinants pour la livraison de l'antigène. Dans cet article, nous démontrons les différentes étapes de la conception et le développement VLP pour des applications futures dans l'expérimentation animale préclinique. La procédure comprend les étapes suivantes: la sélection de l'antigène, l'expression de l'antigène dans la lignée cellulaire de choix, la purification des VLP / des SVP, et la quantification de l'antigène dosage. Nous démontrons l'utilisation des deux lignées cellulaires de mammifères et d'insectes pour l'expression de nos antigènes et de démontrer comment les méthodologies diffèrent du rendement. La méthodologie présentée peut demander à une variété d'agents pathogènes et peut être obtenue en substituant les antigènes avec str immunogèneuctural protéines de la micro-organisme de l'utilisateur d'intérêt. VLP et aider avec l'antigène des SVP caractérisation et sélection des meilleurs candidats vaccins.
Introduction
Les particules virales (VLP) sont une technologie approuvée pour la vaccination humaine. En fait, certains des vaccins plus contemporarily sous licence, y compris le virus du papillome humain (VPH) et l'hépatite Β (HepΒ) vaccins utilisent cette approche. Les VLP sont formées à partir des protéines structurales capables d'auto-assemblage. Les particules assemblées imitent morphologies virales, mais ne peuvent pas infecter ou de reproduire parce qu'ils manquent de génomes viraux. Les VLP peuvent être exprimés et purifiés à partir d'un certain nombre de systèmes procaryotes et eucaryotes. Une revue de la littérature a révélé que différents systèmes d'expression sont employés aux taux suivants: bactéries - 28%, de la levure - 20%, plante - 9%, insecte - 28%, et de mammifères - 15% 1. Il faut noter que les vaccins HPV à base de protéine de capside L1 sont produites dans la levure (Gardasil) ou dans un système de cellules d'insecte (Cervarix) 2. Vaccins HepΒ, Recombivax et Engerix-Β, sont également produites dans la levure, et sont composés de HepΒ antigène de surface 3, 4.
Nous utilisons des systèmes d'expression de cellules d'insectes et de mammifères pour produire des VLP nécessitant une co-expression de plusieurs protéines structurales pour l'assemblage. Notre travail se concentre sur la conception, la production et les vaccins à base de VLP-purifiantes contre les agents pathogènes humains: virus de la grippe, le virus respiratoire syncytial (RSV), le virus de la dengue (DENV), et le virus du chikungunya (CHIKV). Nos méthodes sont suffisamment souples pour permettre la co-expression des protéines structurales multiples à partir de plusieurs plasmides d'expression ou un plasmide d'expression (figure 1). Auparavant, nous avons produit et purifié H5N1 VLP assemblé à partir de la co-expression de plasmides codant pour la grippe hémagglutinine (HA), la neuraminidase (NA), et de la matrice (M1) dans des cellules de rein embryonnaire humain 293T 5,6. Les gènes ont été codons optimisés pour l'expression dans des cellules de mammifères et clones dans pTR600, un vecteur d'expression eucaryote contenant le cytomégalovirus promoteur immédiat-précoce, plus Intron A pour initier transcription d'inserts eucaryotes et le signal de polyadénylation de l' hormone de croissance bovine pour la terminaison de la transcription 7. Une approche similaire en utilisant la co-expression de trois plasmides de HA, NA (figure 1A) et une protéine de matrice du virus de remplacement, le VIH Gag p55, a été utilisé pour la production du sous - type de grippe humaine saisonnière H3N2 VLP dans cette étude et a été montré pour générer VLP de taille similaire à celle des particules de la grippe 8. Bien que les vaccins contre la grippe provoquent principalement des anticorps anti-HA, l'addition de neuraminidase de la grippe médie l' activité de la sialidase pour permettre le bourgeonnement des VLP à partir des cellules transfectées et 9 présentent également des cibles immunogènes supplémentaires. RSV pour produire des VLP, nous avons choisi le noyau non lié du VIH Gag pour concevoir des vaccins prototypes qui présentent des glycoprotéines de surface RSV exclusivement pour démontrer davantage la flexibilité de la formation de VLP en utilisant Gag du VIH, comme décrit précédemment et caractérisé par microscopie électronique à 6,10. Autresont précédemment montré que les VLP présentant glycoprotéines de RSV peuvent être assemblés en utilisant différents composants viraux du virus de la maladie de Newcastle (NDV) 11 et la matrice 12 de la grippe. Pleine longueur surface des séquences de glycoprotéine ont été utilisées dans cette étude pour conserver des conformations natives qui peuvent être nécessaires pour le récepteur fonctionnel de liaison et le dosage de reconnaissance d'anticorps par dosage immuno-enzymatique (ELISA).
Nos exemples d'utilisation de systèmes d'expression de plasmides individuels pour générer des particules sont MENV et CHIKV. Dans le cas de DENV, nous pouvons produire des particules sous - virales (de SSVP) sans capside dans des cellules 293T à partir d' un seul plasmide contenant un prM / E gène de structure cassette d' expression 13. Le terme SVP est utilisé pour désigner l'absence d'une protéine de noyau ou capside dans l'assemblage des protéines structurales virales. CHIK VLP peut également être produite en utilisant un seul plasmide contenant une cassette CHIKV gène de structure codant pour les protéines de capside et d'enveloppe, ou insect cellules par infection avec un baculovirus recombinant codant pour la même cassette de gène structural optimisé pour l' expression de cellules d' insecte (figure 1B - C).
Le résultat de l'expression approches discutées ci-dessus final est la libération de VLP dans le milieu de culture cellulaire qui peut ensuite être purifié par une ultracentrifugation à travers un coussin de glycerol à 20%. Dans ce rapport, nous présentons les méthodes pour exprimer et purifier ces VLP à partir de systèmes cellulaires de mammifères et d'insectes.
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Protocol
1. Système d'expression mammalien pour la génération de la grippe H3N2 VLP
- Le sous - clone viral structurel glycoprotéines hémagglutinine (HA), la neuraminidase (NA) et le virus de l' immunodéficience humaine (VIH) , Gag p55 dans des vecteurs d'expression eucaryotes, tels que décrits précédemment pTR600. 7
- Amplifier l' ADN dans Escherichia coli chimiquement compétentes (par exemple, DH5a) et isoler le plasmide transfection de qualité en utilisant un kit de purification plasmidique selon les instructions du fabricant. Montant de l'ADN dépend sur le rendement et les besoins des utilisateurs.
- Maintenir une lignée cellulaire de mammifère, 293T, dans des milieux de croissance contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) à 37 ° C avec 5% de CO2 dans un incubateur humidifié.
- Cultiver des cellules telles que T-150 culture de tissus flacon contient 45-75 x 10 6 cellules par flacon de telle sorte que ballon obtient l' adhérence des cellules complètes et 85-95% de confluence des cellules par le lendemain. Inspecter les cellules sous le microscope pour Conflu désiréence.
Remarque: haute densité cellulaire est généralement recommandé pour obtenir une expression optimale de protéine avec une cytotoxicité minimale lors de l'utilisation des réactifs de transfection commerciaux mais sur-confluence peut entraîner l'accumulation de déchets cellulaires sous-produits et de réduire la viabilité cellulaire. - Le jour de la transfection, on prépare des liposomes et le mélange d'ADN selon les recommandations du fabricant et transfecter des cellules d'ADN avec une composition d'ADN de 1: 1: 2 de HA: NA: Gag avec une quantité d'ADN total de 40 pg par T-150 flacon. Des solutions diluées d'ADN et de liposomes dans le milieu de transfection sans sérum, sans antibiotiques, de telle sorte que chaque flacon contient un volume total de 20-30 ml.
Remarque: Ratio des constructions de gènes peut nécessiter l'optimisation de l'utilisateur. Bien que non montré ici, une procédure de transfection similaire a été réalisée avec le virus respiratoire syncytial (VRS) F et Gag du VIH dans un rapport de 1: 1. Pour DENV et CHIKV plasmides d'expression unique, un total de 20 pg d'ADN par T-150 flacon sont utilisés pour optimiser eXpression. ADN: transfection des rapports de réactif sont optimisés utilisateur. Utilisation recommandée milieu de transfection selon la méthode de transfection, à savoir, transfections lipidiques polycationiques recommandent la réduction ou l' absence de sérum fœtal bovin ainsi les médias peuvent être complétées avec des hormones de croissance et d' oligo - éléments pour soutenir la croissance en l'absence de sérum. - Flacons revenir à 37 ° C avec 5% de CO 2 incubateur. Pour un volume de 200 ml, utiliser 9 T-150 flacons. Les cellules sont maintenues dans un milieu de culture de transfection jusqu'au jour de la récolte de la VLP.
- Récolte surnageant de culture de cellules après 72-96 heures après la transfection en fonction de l'antigène, ou lorsque la viabilité cellulaire a diminué à 70-80%, selon les estimations de l'inspection microscopique. Transférer le surnageant dans des tubes coniques de 50 ml et de faire tourner les cellules vers le bas à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C pour sédimenter les débris cellulaires.
Remarque: Le remplacement de 3 jour surnageant avec préchauffée, transfection du milieu frais sans sérum pour les cellules adhérentes se yielda second lot de VLP avec un rendement et similaire ou légèrement réduite doit être optimisée par l'utilisateur. - Piscine surnageant et filtre à travers une membrane de 0,22 um des pores avant la sédimentation par ultracentrifugation.
- Testez l'activité d'hémagglutination des VLP HA exprimant par hémagglutination norme 14 en utilisant 0,8% de dinde ou de globules rouges de mammifères ou de procéder à spécifique de l' antigène ELISA. Voir Figure 2 pour des résultats représentatifs.
2. CHIK VLP Expression Utilisation du système cellulaire baculovirus / Insecte
- Générer baculovirus recombinants exprimant capside du virus du chikungunya et de protéines d'enveloppe (C-E3-E2-6K-E1) de S-27 souche en utilisant un système d'expression baculovirus commerciale.
- Culture Spodoptera frugiperda cellules Sf9 dans du milieu de croissance Sf9 sans sérum avec 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine à 28 ° C. Utilisez 3-5 x 10 5 c / ml pour initier des cultures spinner flacon pour suspensla croissance cellulaire ionique. Passage régulièrement quand ils atteignent des densités de cellules de 2-4 x 10 6 c / ml (tous les 3-4 jours).
- cellules Culture Sf9 en suspension dans des flacons spinner avec agitation à 130 rpm sur un système multipoint de plaque d'agitateur. Pour une bonne aération, de maintenir des volumes de culture à pas plus de la moitié du volume de la fiole centrifuge.
- Pour l' expression de VLP CHIK, infecter des cellules Sf9 à une densité de 2 x 10 6 cellules / ml avec un baculovirus recombinant à une multiplicité d'infection de 1 et retour à 28 ° C incubateur. Typiquement, infecter un ou deux flacons rotatifs, contenant 250 ml de cellules Sf9.
Note: Bien que nous ne pas utiliser cette méthode, les cellules Sf9 peuvent être cultivées dans des flacons secoueurs à 28 ° C en utilisant une plate-forme de shaker. - Récolte des cultures après 72-96 heures après l'infection, ou lorsque la viabilité des cellules a diminué de 70 à 80% tel que déterminé par exclusion au bleu Trypan selon le protocole du fabricant.
Remarque: Les cellules continuent de proliférer tout en étant infecté et il y aa ~ 80% de viabilité dans les cultures Sf9 infectées par le baculovirus CHIK VLP recombinantes à 3 jours post-infection (dpi). les cellules infectées par un baculovirus sont plus grandes en apparence. Morphologie peut aussi changer de rond à oblong. Dans la fin des étapes de baculovirus infections, les cellules ont commencé à lyser. - cultures de transfert directement à partir de la culture en suspension dans 50 ml tubes coniques et tourner les cellules vers le bas à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C.
- Recueillir surnageants et filtrer à travers une membrane de 0,22 um des pores avant la sédimentation par ultracentrifugation.
3. Sédimentation / Purification de VLP / des SVP
- Stériliser 25 mm x 89 mm à toit ouvert tubes d'ultracentrifugation avec de l'éthanol à 70% dans la biosécurité capot. Vérifiez que l'éthanol a séché avant de l'utilisation.
- Chargez jusqu'à 32 ml de surnageant dans un tube propre. Un volume minimal de 25 ml est recommandée pour éviter l'effondrement et l'endommagement des tubes d'ultracentrifugation insuffisamment remplis.
- underlay soigneusement surnageants with stérile de 3 ml de glycerol à 20% dans du PBS (v / v). Assurez-vous que les tubes sont équilibrés.
- Spin à 135.000 xg pendant 4 heures à 4 ° C.
- Aspirer le surnageant, assurant la pastille ne se déloge pas de tube.
- Remettre en suspension les VLP sédimenté au fond des tubes avec du PBS stérile par pipetage vigoureusement vers le haut et vers le bas. La quantité de PBS nécessaire pour remettre en suspension les VLP dépend de VLP rendement de protéines totales et des applications en aval. Typiquement, resuspendre chaque culot de VLP dans au moins 100 pi.
- Conserver les échantillons à 4 ° C pour le stockage à court terme et -80 ° C de stockage pour le stockage à long terme.
4. Déterminer les rendements de protéines et rendements d'antigènes spécifiques
- Déterminer la teneur en protéines totales en utilisant une méthode de quantification de protéine du commerce, tel que le dosage BCA selon le protocole du fabricant.
- Pour évaluer le contenu spécifique de l'antigène, effectuer de dosage immuno-enzymatique directe (ELISA) par enrobage des dilutions en série d'antigène standard et 2-51; g de l'échantillon de protéine totale à une plaque à 96 puits à fond plat ELISA.
- Suivez avec des anticorps spécifiques de l'antigène pour sonder la présence des antigènes sur la plaque et utiliser des substrats de développement ELISA classiques pour produire absorbance détectable pour lecteur de microplaques. Voir la figure 2 pour obtenir des résultats représentatifs de HA et ELISA pour un échantillon VLP HA exprimant; de nombreuses combinaisons de HA et NA sont peut - être , mais les rendements peuvent différer de la compatibilité HA-NA 15.
Note: les anticorps spécifiques de l'antigène ont des affinités variables et il est recommandé que endpoint-titrage de dilution d'anticorps déterminée avant d'effectuer la quantification VLP. anticorps commerciaux auront concentration ou de dilution gammes suggérés pour une utilisation dans ELISA, ainsi que les protocoles proposés.
- Suivez avec des anticorps spécifiques de l'antigène pour sonder la présence des antigènes sur la plaque et utiliser des substrats de développement ELISA classiques pour produire absorbance détectable pour lecteur de microplaques. Voir la figure 2 pour obtenir des résultats représentatifs de HA et ELISA pour un échantillon VLP HA exprimant; de nombreuses combinaisons de HA et NA sont peut - être , mais les rendements peuvent différer de la compatibilité HA-NA 15.
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Representative Results
les rendements des VLP étaient variables par virale conception antigène construction. Dans ce protocole, nous avons démontré l'utilisation de cellules insectes et de mammifères pour la production de VLP UDC ou dans le surnageant et la purification par ultracentrifugation. Quatre sous - types de DENV prM / E gène structurel des cassettes d'expression ont été utilisés pour construire les versions de DENV (délimitées comme des SVP 1-4) dans le tableau 1 et démontrer une plage comprise entre 01.01 à 02.06 mg de protéine totale dans 0,6 ml volumes. Pour VLP qui nécessitent un trois constructions de gènes, nous avons trouvé le rapport de transfection d'ADN optimisée de 1: 1: 2 pour HA: NA: Gag respectivement pour synthétiser les VLP de la grippe; En revanche, un plasmide exprimant des protéines virales multiples Chikungunya était adéquat pour la génération d'un baculovirus recombinant et les mammifères CHIK VLP. En outre, un procédé de transfection à double plasmide est également possible avec des cellules de mammifère, en tant que tel et Gag F du VRS transfectées dans un rapport de 1: 1, et on obtient chementron 0,01 mg / ml, un total de surnageant de culture cellulaire. Comme le montre le tableau 1, CHIK rendement SVP à partir de cellules Sf9 peut varier entre 0,008 à 0,016 mg de protéines totales / ml de volume de surnageant, tandis que la production par le biais de mammifère 293T donne une réduction de 10 fois de la protéine. Entre les deux versions de H3N2 VLP en utilisant de type sauvage différent, pleine longueur plasmides HA, le H3N2 VLP échantillon 2 avait un rendement réduit à la fois la protéine totale et un contenu spécifique HA. Quantités HA Autre échantillon VLP sont présentés dans les figures 2 et 3 et illustrent comment HA et ELISA sont utilisés pour estimer la teneur en surface sur les VLP. Comme avec une méthode ELISA directe conventionnelle, une courbe standard est générée en utilisant des concentrations connues d'un HA recombinant pour comparer la réactivité ELISA pour échantillonner H3 VLP chargé sur une plaque ELISA. ELISA ou immunologique similaire sont recommandés pour la quantification des VLP qui ont des anticorps monoclonaux facilement disponibles avec réactivité croisée connue à un EPIT bien conservéopes, mais peut ne pas être disponible pour tous les antigènes. F du VRS est bien caractérisée, par conséquent, un test ELISA en utilisant un anticorps monoclonal anti-F de VRS est également applicable pour la quantification de la surface granulée F de RSV F VLP. En plus de la fonctionnalité de l' antigène et la reconnaissance des antigènes par des anticorps spécifiques, des préparations de VLP peuvent être structurellement évaluées par microscopie électronique. La figure 4 est une image représentative montrant que HA (Gag-core) VLP de la grippe sont exprimés avec succès, assemblés et purifié comme VLP.
| La description | Culture Vol (ml) | récolte un | Volume total | Rendement Protéine totale (mg) | Rendement (mg) / Vol (ml) | Teneur en antigène spécifique |
| DENV1 SVP | 293T186 | 4 d | 0,6 ml | 1.115 | 0,006 | Dakota du Nord |
| DENV2 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 ml | 2.5 | 0,0134 | Dakota du Nord |
| DENV3 SVP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 ml | 1.536 | 0,0083 | Dakota du Nord |
| DENV4 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 ml | 2.613 | 0,014 | Dakota du Nord |
| CHIK VLP | Sf9 / 186 | 3 dpi | 0,6 ml | 1.503 | 0,0081 | Dakota du Nord |
| CHIK VLP | Sf9 / 500 | 4 dpi | 2,0 ml | 8.276 | 0,0166 | Dakota du Nord |
| CHIK VLP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 ml | 0,296 | 0,0016 | Dakota du Nord |
| H3N2 VLP 1 | 293T /216 | 3 d | 0,6 ml | 1.25 | 0,0058 | 1,9 pg de HA / pl |
| H3N2 VLP 2 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 0,956 | 0,0044 | 0,96 pg de HA / pl |
| H3N2 VLP 3 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 1.6 | 0,0074 | 1,2 pg de HA / pl |
| H3N2 VLP 4 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 1,54 | 0,0071 | 0,98 pg de HA / pl |
| F du VRS VLP | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 2.3 | 0,0106 | 0,15 ug F de RSV / pl |
| a d = jours post-transfection, dpi = jours post-infection | ||||||
Tableau 1: subvirales et v Les rendements de particules irus-comme par construction. Les données représentatives des volumes de VLP, le rendement total de la protéine (déterminée par dosage BCA classique) ou le contenu de l' antigène spécifique (déterminée par ELISA) apparaît parmi une variété de constructions SVP / VLP. Les rendements sont variables en raison de la différence de SVP / assemblage de VLP et le type cellulaire et les rendements maximaux peuvent nécessiter une optimisation de l'utilisateur. Les différentes versions de chacune DENV1-4 diffèrent en fonction de sérotype, tandis que le CHIK VLP utilisent la même séquence, mais les préparations diffèrent en volume ou le type de culture cellulaire. Les différentes versions de H3N2 VLP (1-4) expriment quatre séquences HA uniques qui partagent un épitope réactif spécifique de HA ELISA et ont été co-exprimées avec le même noyau NA et Gag. La RSV F VLP, qui est généré à partir d'une double transfection de plasmide F de RSV et Gag, a été synthétisé et la teneur F de VRS a été évaluée en utilisant F du VRS test ELISA spécifique.
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Figure 1:. Approche - VLP conception, la synthèse et la purification de la représentation schématique de la conception des gènes de plasmides pour l' expression des protéines structurales virales qui formera VLP: (A) la co-expression des protéines structurales multiples par co-transfection de trois plasmides dans des cellules 293T (B) expression des protéines structurales à partir d' une cassette d' un seul gène codé dans un seul plasmide dans des cellules 293T, et (C) codant pour le baculovirus recombinant de protéines structurales CHIK est utilisé pour infecter des cellules Sf9 cultivées dans des flacons à centrifuger pour favoriser la croissance des cellules à haute densité en suspension . Les VLP sont récoltées à partir des milieux de culture cellulaire, clarifié des débris cellulaires, et séparés des non-particules par sédimentation par ultracentrifugation sur un coussin de glycérol 20%. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
. Figure 2: Exemple de test d' hemagglutination H3 VLP Un essai d'hemagglutination classique a été réalisée sur un échantillon représentatif de VLP H3N2 et le surnageant clarifié correspondant; dosage H3N2 HA peut être effectuée en utilisant 0,8% de dinde de globules rouges ou de porc Guinée globules rouges (non représenté). La teneur totale en protéine est estimée en utilisant le dosage BCA standard sur le VLP purifié et n'a pas été effectué ou recommandé pour surnageant clarifié. ELISA a été réalisée sur la VLP purifiées et contenu HA a été estimé en utilisant un standard HA recombinant de concentration connue. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Ex ample H3 ELISA pour la quantification du contenu H3 dans la plaque H3 VLP. Un test ELISA a été revêtue avec des dilutions en série d'une norme HA recombinant de concentration connue et des échantillons H3N2 VLP dilués provenant de différentes séquences HA (échantillons 1-9). Corréler la concentration (ug / ul) de la norme aux valeurs de densité optique obtenues à 492 nm (DO), les concentrations sont obtenues en déduisant la valeur de x qui coupe la partie linéaire de la courbe standard. Dilutions d'échantillons recombinantes standards et inconnus HA ont été chargés en double dans les puits A & B ou C et D, respectivement. La concentration finale de l'échantillon de VLP est déterminée en multipliant la concentration par le facteur de dilution de l'échantillon de VLP. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 4: La microscopie électronique de HA-VLP en utilisant Gag-core image de microscopie électronique représentatif de la grippe purifié HA VLP.. VLP assemblent en particules sphériques revêtues de HA. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous avons utilisé les techniques décrites ci-dessus pour exprimer et purifier avec succès et les VLP composées des SVP de protéines structurales multiples pour différents agents pathogènes. En général, nous utilisons des systèmes d'expression de mammifères pour générer nos VLP. Cependant, dans nos mains, de cellules de mammifères dérivé CHIK rendements VLP étaient faibles. rendement VLP CHIK était plus robuste lors de l'utilisation Un système de cellules baculovirus-insecte recombinant. En général, baculovirus-insectes systèmes cellulaires donnent des quantités plus élevées de protéines recombinantes, qui peuvent résulter des densités cellulaires plus élevées qui peuvent être cultivées dans des flacons spinner contre des flacons de culture de tissu, et aussi en raison de haut niveau d'expression de gènes étrangers alors que sous le contrôle du promoteur de la polyhédrine de baculovirus. 16 Cependant, un inconvénient de l' utilisation de baculovirus est la présence de baculovirus dans des préparations de VLP, qui possède une activité d'adjuvant, et les résultats immunologiques biais dans le vaccin des études 17 Nous avons également constaté la variabilité du rendement de la grippe VLPs en fonction des combinaisons HA et NA utilisées; H3N2 VLP2 avait relativement réduit le rendement par rapport à H3N2 VLP1, potentiellement due à l' assemblage de VLP moins efficace ou NA-compatibilité 15 et reste à être étudiée plus. Optimisation des constructions d'ADN et les rapports de transfection restent des étapes cruciales pour assurer des rendements de VLP optimaux. Nous avons choisi d'utiliser un vecteur pTR600 mammifère toujours parmi nos VLP de mammifères à base parce que l'expression est généralement efficace et le sous-clonage est pratique avec plusieurs enzymes de restriction. Ratios de plasmides peuvent être ajustés pour les besoins de l'utilisateur pour améliorer le rendement des VLP. Cependant, comme décrit, les limites actuelles de la production de VLP de mammifère restent avec le coût de la transfection et la capacité de croissance des cellules dans des flacons en cours de culture tissulaire. Bien que pas effectué dans ce protocole, nous avons observé une production réussie supplémentaire de VLP dans les cellules transfectées lorsque les médias est reconstitué avec les médias de croissance frais (par exemple, OptiMEM) après les sapinst la récolte 72 h et la collecte ultérieure des VLP après une supplémentaire de 72 heures, bien que les rendements peuvent être légèrement réduites par rapport à la première collection de VLP.
Nous démontrons une procédure pour exprimer des protéines structurales virales soit dans des cultures de cellules de mammifères ou d'insectes pour libérer VLP dans le surnageant pour semi-purification par ultracentrifugation. L'UDC / VLP sont généralement stables pour une utilisation dans des immunoessais d'antigène et des études de vaccination, et posent moins de menaces de sécurité par rapport à vivre des particules virales, en particulier pour certains agents ou de haute pathogène influenza aviaire (HPAI) souches 8,18, qui exigent de niveau de biosécurité 3 conditions (BSL-3) laboratoire 19. la production de VLP est relativement simple et donne souvent des particules qui peuvent être reconnus par des anticorps induits contre les protéines structurales virales indigènes, et non pas exclusivement des épitopes linéaires dénaturées. VLP servir de plate-forme utile pour déclencher des réponses immunitaires spécifiques à l'antigène et peutêtre un candidat prometteur dans le développement de vaccins.
Ce protocole démontre deux approches pour la transfection de gènes viraux dans le système de mammifère. Dans cet exemple, deux gènes de la grippe, HA et NA, sont co-transfectés avec le VIH Gag pour générer une VLP qui a un noyau interne Gag, HA et NA assemblées sur la surface. La substitution de Gag au lieu de la grippe Matrice 1 (M1) démontre la flexibilité de VLP à base de Gag avec glycoprotéines virales non apparentés, tels que RSV F et potentiellement d'autres. En variante, la synthèse de CHIKV utilise une cassette de gène de structure qui exprime les composants nécessaires pour l'auto-assemblage UDC, avec CHIKV E protéines présentes sur la surface d'un centre constitué de la protéine C. Ces deux approches démontrent la flexibilité de la synthèse des VLP, ce qui nécessite des protéines virales structurales minimales pour assembler à partir de cellules transfectées.
Enfin, alors que nous avons présenté les protocoles généraux et resul représentantts pour l'expression et la purification de H3N2, RSV, MENV et CHIKV, ces procédures sont facilement prête pour la production de VLP en utilisant d'autres protéines virales. Ces procédures ont été utilisées avec succès par notre groupe dans la génération d'autres sous-types de virus de la grippe, y compris H1, H5, H7 et les virus. En outre, le plasmide unique, la conception de prM / E utilisée pour la production de DENV des SVP peut être adapté pour la production d'autres membres pour des SVP de la famille des flavivirus qui incluent des virus du Nil occidental et l'encéphalite japonaise. De même, les méthodes de production de CHIK VLP peuvent être utilisés pour d'autres membres de la famille des Togaviridae, y compris le Venezuela, l'Est et virus de l'encéphalite équine de l'Ouest.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les membres antérieurs du laboratoire Ross qui ont permis d'optimiser le protocole pour l'efficacité et le rendement maximal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 ml) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
References
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