Summary
هنا، نقدم بروتوكول لتجميع جزيئات تشبه الفيروس باستخدام الفيروسة العصوية أو الأنظمة التعبير الثدييات، وتنقية تنبيذ فائق. يستخدم هذا النهج عالية للتخصيص لتحديد المضادات الفيروسية كأهداف لقاح بطريقة آمنة ومرنة.
Abstract
جزيئات الفيروسات مثل (VLPs) والجسيمات subviral (SVPs) هي مقاربة بديلة لتصميم لقاح فيروسي التي توفر مزايا زيادة السلامة الأحيائية والاستقرار على استخدام مسببات الأمراض الحية. غير المعدية وتجميع الذات، وتستخدم VLPs لتقديم البروتينات الهيكلية كما immunogens، تجاوز الحاجة لمسببات الأمراض حية أو ناقلات فيروسية المؤتلف للتسليم المستضد. في هذه المقالة، ونحن لشرح مراحل مختلفة من التصميم فلب والتنمية للتطبيقات المستقبلية في التجارب على الحيوانات قبل السريرية. ويشمل الإجراء المراحل التالية: مجموعة مختارة من مستضد والتعبير عن مستضد في خط الخلية في الاختيار، وتنقية VLPs / SVPs، وتقدير للمستضد الجرعات. ونحن لشرح استخدام كل من خطوط خلايا الثدييات والحشرات للتعبير عن المستضدات لدينا وإظهار كيف تختلف المنهجيات في العائد. قد يتم تطبيق منهجية عرضها على مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض ويمكن أن يتحقق عن طريق استبدال مولدات المضادات مع شارع مناعةالبروتينات uctural من الكائنات الحية الدقيقة المستخدم من الفائدة. VLPs وSVPs تساعد مع توصيف مستضد واختيار أفضل المرشحين لقاح.
Introduction
جزيئات الفيروسات مثل (VLPs) هي تكنولوجيا معتمدة للتطعيم البشري. في الواقع، بعض اللقاحات المرخصة أكثر معاصرون، بما في ذلك فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) وΒ التهاب الكبد (HepΒ) اللقاحات تستخدم هذا النهج. تتشكل VLPs من البروتينات الهيكلية قادرة على التجميع الذاتي. الجسيمات تجميعها تحاكي الأشكال التضاريسية الفيروسية، ولكن لا يمكن أن تصيب أو تكرار لأنها تفتقر إلى الجينوم الفيروسي. VLPs يمكن التعبير عن وتنقيته من عدد من أنظمة بدائية النواة وحقيقية النواة. كشفت مراجعة للأدبيات التي نظم التعبير المختلفة ويعمل على أساس المعدلات التالية: البكتيريا - 28٪، الخميرة - 20٪، والنبات - 9٪، الحشرات - 28٪، والثدييات - 15٪ 1. من المذكرة، ويتم إنتاج لقاحات فيروس الورم الحليمي البشري على أساس L1 البروتين قفيصة في الخميرة (جارداسيل) أو في نظام خلية الحشرات (سيرفاريكس) 2. اللقاحات HepΒ، Recombivax وEngerix-Β، وتنتج أيضا في الخميرة، وتتألف من HepΒ سطح المستضد 3، 4.
نحن نستخدم أنظمة التعبير خلايا الثدييات والحشرات لإنتاج VLPs تتطلب شارك في التعبير عن البروتينات الهيكلية متعددة للتجميع. يركز عملنا على تصميم وانتاج، ولقاحات من فلب تنقية ضد مسببات الأمراض البشرية: فيروس الإنفلونزا، الجهاز التنفسي المخلوي فيروس (RSV)، فيروس حمى الضنك (DENV)، وفيروس شيكونغونيا (CHIKV). طرقنا مرنة بما يكفي للسماح للمشاركة في التعبير عن البروتينات الهيكلية متعددة من البلازميدات التعبير متعددة، أو التعبير البلازميد واحد (الشكل 1). سابقا، وأنتجنا وتنقيته H5N1 VLPs تجميعها من شارك في التعبير عن البلازميدات ترميز هيماغلوتينين الإنفلونزا (HA)، النورامينيداز (NA)، ومصفوفة (M1) في الجنينية خلايا 293T الكلى البشرية 5،6. الجينات وكودون الأمثل للتعبير في خلايا الثدييات والمستنسخة في pTR600، ناقل التعبير حقيقية النواة تحتوي على الفيروس المضخم للخلايا فوري أوائل المروج بالإضافة إلى إنترون ألف لبدء transcription من إدراج حقيقية النواة والأبقار هرمون النمو إشارة تذييل بعديد الأدينيلات لإنهاء النسخ 7. تم استخدام نهج مماثل باستخدام ثلاث البلازميد شارك في التعبير عن HA، NA (الشكل 1A) والبروتين مصفوفة الفيروسي بديل، فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة P55، لجيل من البشر سلالة الانفلونزا الموسمية H3N2 VLPs في هذه الدراسة، ولقد ثبت لتوليد VLPs مشابهة من حيث الحجم على شكل جسيمات أنفلونزا 8. على الرغم من أن لقاحات الأنفلونزا تثير في الغالب الأجسام المضادة-HA، إضافة نورامينيداز الإنفلونزا تتوسط النشاط سياليداز لتمكين فلب في مهدها من خلايا transfected 9 و أيضا أهدافا مناعة إضافية الحالية. لإنتاج RSV VLPs، اخترنا أيضا جوهر لا علاقة لها من فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة لتصميم اللقاحات نموذجية التي تقدم بروتينات سكرية سطح RSV حصرا لمواصلة إبداء المرونة من تشكيل فلب باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة، كما هو موضح سابقا والتي تتميز المجهر الإلكتروني 6،10. آخرونوقد أظهرت في وقت سابق ان VLPs تقديم بروتينات سكرية RSV يمكن تجميعها باستخدام مكونات فيروسية مختلفة من فيروس مرض نيوكاسل (نيوكاسل) 11، ومصفوفة أنفلونزا 12. واستخدمت كامل طول سطح تسلسل بروتين سكري في هذه الدراسة إلى الإبقاء على التشكل الأصلية التي قد تكون ضرورية لمستقبل وظيفي ملزمة والأجسام المضادة الاعتراف الفحص من خلال الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
لدينا أمثلة لاستخدام نظم التعبير البلازميد واحدة لتوليد الجسيمات DENV وCHIKV. في حالة DENV، فإننا يمكن أن تنتج جزيئات subviral (SVPs) مع عدم وجود القفيصة في الخلايا 293T من البلازميد واحد يحتوي على PRM / E الجينات الهيكلي التعبير كاسيت 13. يتم استخدام SVP المصطلح للدلالة على عدم وجود الأساسية أو قفيصة البروتين في تجميع البروتينات الهيكلية الفيروسية. ويمكن أيضا أن تنتج تشيك VLPs استخدام البلازميد واحد يحتوي على CHIKV كاسيت الجين الهيكلي، القفيصة الترميز والمغلف البروتينات، أو في الاولخلايا nsect عن طريق إصابة مع الفيروسة العصوية المؤتلف ترميز نفس كاسيت الجين الهيكلي الأمثل للتعبير عن خلية الحشرات (الشكل 1B - C).
النتيجة النهائية للتعبير النهج التي نوقشت أعلاه هي الافراج عن VLPs إلى مستنبت الخلية التي يمكن بعد ذلك تنقيته عبر تنبيذ فائق من خلال 20٪ وسادة الجلسرين. في هذا التقرير، ونحن نقدم طرق للتعبير عن وتنقية هذه VLPs من أنظمة خلايا الثدييات والحشرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. نظام التعبير الثدييات لتوليد الأنفلونزا H3N2 فلب
- Subclone الفيروسي الهيكلي بروتين هيماغلوتينين (HA)، النورامينيداز (NA)، وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) الكمامة P55 في ناقلات التعبير حقيقية النواة، مثل pTR600 سبق وصفها 7.
- تضخيم الحمض النووي في القولونية المختصة كيميائيا (على سبيل المثال، DH5α) وعزل ترنسفكأيشن الصف البلازميد باستخدام طقم تنقية البلازميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. كمية من الحمض النووي يعتمد على المحصول واحتياجات المستخدم.
- الحفاظ على خط خلية الثدييات، 293T، في وسائل الإعلام نمو تحتوي على 10٪ مصل الجنين-البقري (FBS) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب.
- تنمو الخلايا مثل أن T-150 زراعة الأنسجة قارورة تحتوي على 45-75 × 10 6 خلايا في قارورة بحيث قارورة يحصل الالتزام خلية كاملة و85-95٪ confluency خلية في اليوم التالي. تفقد الخلايا تحت المجهر لconflu المطلوبency.
ملاحظة: عادة ما ينصح ارتفاع كثافة الخلية لانتاج بروتين تعبير الأمثل مع الحد الأدنى من السمية الخلوية عند استخدام الكواشف ترنسفكأيشن التجارية ولكن الإفراط في confluency قد يؤدي إلى تراكم النفايات الخلوية من المنتجات والحد من بقاء الخلية. - يوم ترنسفكأيشن، وإعداد الحويصلية وخليط الحمض النووي حسب توصيات الشركة الصانعة وtransfect خلايا الحمض النووي مع تركيبة الحمض النووي من 1: 1: 2 من HA: NA: الكمامة بلغ إجمالي كمية الحمض النووي من 40 ميكروغرام لكل T-150 قارورة. تمييع حلول الحمض النووي والحويصلية في وسائل الإعلام ترنسفكأيشن المصل خالية دون المضادات الحيوية مثل أن كل قارورة تحتوي على إجمالي حجم 20-30 مل.
ملاحظة: نسبة يبني الجين قد تتطلب التحسين المستخدم. على الرغم من أن لم تظهر هنا، وقد تم تنفيذ إجراء ترنسفكأيشن مماثلة مع الجهاز التنفسي المخلوي فيروس (RSV) F وفيروس نقص المناعة البشرية الكمامة في نسبة 1: 1. لDENV وCHIKV البلازميدات تعبير واحد، أي ما مجموعه 20 ميكروغرام من الحمض النووي في T-150 قارورة تستخدم له الأمثلxpression. الحمض النووي: ترنسفكأيشن نسب الكاشف هي الاستعمال الأمثل. استخدام أوصى المتوسطة ترنسفكأيشن تعتمد على طريقة ترنسفكأيشن، أي تعداء الدهون polycationic يوصي تخفيض أو عدم وجود مصل بقري الجنين وبالتالي يمكن استكمال وسائل الإعلام مع هرمونات النمو والعناصر النزرة لدعم النمو في غياب المصل. - العودة قوارير إلى 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 الحاضنة. لحجم 200 مل، استخدم 9 T-150 قوارير. يتم الاحتفاظ الخلايا في مستنبت ترنسفكأيشن حتى يوم الحصاد فلب.
- طاف الثقافة الحصاد من الخلايا بعد 72-96 ساعة بعد ترنسفكأيشن اعتمادا على المستضد، أو عندما انخفض بقاء الخلية إلى 70-80٪، حسب تقديرات التفتيش المجهري. نقل طاف في أنابيب مخروطية 50 مل وتدور الخلايا في أسفل 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لتكوير الحطام الخلوية.
ملاحظة: استبدال 3 طاف اليوم مع الطازج قبل تحسنت، وسائل الإعلام ترنسفكأيشن خالية من المصل إلى الخلايا الملتصقة سوف yielدا الكثير الثاني من VLPs مع العائد مماثل أو انخفاض طفيف، وينبغي أن يكون الأمثل من قبل المستخدم. - تجمع طاف ومرشح من خلال غشاء 0.22 ميكرون المسام قبل الترسيب عبر تنبيذ فائق.
- اختبار التراص النشاط من VLPs HA معربا عن طريق معيار فحص التراص 14 باستخدام 0.8٪ الديك الرومي أو خلايا الدم الحمراء الثدييات أو المضي قدما مع مستضد معين ELISA. انظر الشكل 2 للحصول على نتائج تمثيلية.
2. تشيك فلب التعبير عن طريق نظام الخلايا الفيروسة العصوية / الحشرات
- توليد الفيروسة العصوية المؤتلف التعبير قفيصة فيروس شيكونغونيا والبروتينات المغلف (C-E3-E2-6K-E1) من S-27 سلالة باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية التجاري.
- خلايا Sf9 الثقافة ورق القطن frugiperda في Sf9 متوسط النمو خالية من المصل مع 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل عند 28 درجة مئوية. استخدام 3-5 × 10 5 ج / مل لبدء الثقافات الدوار قارورة لsuspensنمو الخلايا أيون. مرور روتينية عندما تصل كثافة خلية من 2-4 × 10 6 ج / مل (كل 3-4 أيام).
- خلايا الثقافة Sf9 معلق في قوارير الدوار مع التحريك في 130 دورة في الدقيقة على نظام متعددة النمام لوحة. للتهوية المناسبة، الحفاظ على أحجام الثقافة في أي أكثر من نصف حجم القارورة الدوار.
- للتعبير عن تشيك VLPs، ويصيب خلايا Sf9 في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 6 خلية / مل مع الفيروسة العصوية المؤتلف في عدد وافر من إصابة 1 والعودة إلى 28 درجة مئوية الحاضنة. عادة، ويصيب واحد أو اثنين من قوارير الدوار، تحتوي على 250 مل خلايا Sf9.
ملاحظة: في حين أننا لا تستخدم هذا الأسلوب، وخلايا Sf9 قد يكون مثقف في قوارير شاكر عند 28 درجة مئوية باستخدام منصة شاكر. - الثقافات الحصاد بعد 72-96 ساعة بعد الإصابة، أو عندما انخفض بقاء الخلية إلى 70-80٪ كما هو محدد من قبل الاستبعاد التريبان الأزرق وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
ملاحظة: تواصل الخلايا على التكاثر حين المصابين وهناكوالجدوى ~ 80٪ في الثقافات Sf9 المصابين المؤتلف الفيروسة العصوية تشيك فلب في 3 أيام بعد العدوى (نقطة في البوصة). الخلايا المصابة الفيروسة العصوية أكبر في المظهر. مورفولوجيا قد تغير أيضا من جولة إلى مستطيل. في أواخر مراحل العدوى الفيروسة العصوية، بدأت الخلايا ليز. - الثقافات نقل مباشرة من ثقافة تعليق في أنابيب مخروطية 50 مل وتدور الخلايا في أسفل 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- جمع supernatants وتصفية من خلال الغشاء 0.22 ميكرون المسام قبل الترسيب عبر تنبيذ فائق.
3. الترسيب / تنقية فلب / SVPs
- تعقيم 25 ملم × 89 ملم مكشوفة أنابيب نابذة مع 70٪ من الإيثانول في مجال السلامة الأحيائية غطاء محرك السيارة. ضمان قد جفت الإيثانول الكهربائي قبل استخدامه.
- تحميل ما يصل إلى 32 مل من طاف في أنبوب نظيفة. ينصح حجم الحد الأدنى من 25 مل لمنع انهيار وتلف أنابيب نابذة شغل غير الكافية.
- الأساس الذي تقوم عليه بعناية supernatants خفة دمح معقم 3 مل 20٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني (ت / ت). تأكد من أنابيب متوازنة.
- تدور في 135000 x ج لمدة 4 ساعات في 4 درجات مئوية.
- نضح طاف، وضمان بيليه لا طرد من الأنبوب.
- و resuspend الرسوبية VLPs في الجزء السفلي من الأنابيب مع برنامج تلفزيوني العقيمة من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا. كمية من برنامج تلفزيوني حاجة ل resuspend VLPs يعتمد على فلب محصول البروتين والتطبيقات المصب. عادة، resuspend كل بيليه فلب لا تقل عن 100 ميكرولتر.
- تخزين عينات 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير و-80 ° C تخزين لتخزين على المدى الطويل.
4. تحديد العائد البروتين والعائد مستضد معين
- تحديد محتوى البروتين الكلي باستخدام طريقة البروتين الكمي التجاري، مثل فحص BCA حسب بروتوكول الشركة الصانعة.
- لتقييم محتوى مستضد معين، نفذ انزيم مرتبط مباشرة المناعي فحص (ELISA) من خلال طلاء التخفيفات المسلسل من المستضدات القياسية و2-51؛ غرام من إجمالي العينة البروتين الدخول إلى ELISA 96-جيدا لوحة مسطحة القاع.
- اتبع مع الأجسام المضادة مستضد معين للتحقيق في وجود مستضدات على لوحة واستخدام ركائز التنمية ELISA التقليدية لإنتاج الامتصاصية للكشف عن قارئ صفيحة. انظر الشكل 2 لنتائج ممثلة من HA و ELISA فحص لعينة HA، معربا عن فلب. العديد من مجموعات من HA و NA هي ربما ولكن قد تختلف العوائد على HA-NA توافق 15.
ملاحظة: الأجسام المضادة مستضد محددة لها الانتماءات المتغيرة وينصح أن نقطة النهاية تخفيف معايرة الأجسام المضادة يتم تحديدها قبل تنفيذ فلب الكمي. والأجسام المضادة التجارية لديها تركيز أو تخفيف نطاقات المقترحة للاستخدام في ELISA، وكذلك البروتوكولات المقترحة.
- اتبع مع الأجسام المضادة مستضد معين للتحقيق في وجود مستضدات على لوحة واستخدام ركائز التنمية ELISA التقليدية لإنتاج الامتصاصية للكشف عن قارئ صفيحة. انظر الشكل 2 لنتائج ممثلة من HA و ELISA فحص لعينة HA، معربا عن فلب. العديد من مجموعات من HA و NA هي ربما ولكن قد تختلف العوائد على HA-NA توافق 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكانت غلة فلب المتغيرة التي كتبها الفيروسي تصميم مستضد بناء. في هذا البروتوكول، ونحن أثبتنا استخدام خلايا الحشرات والثدييات لإنتاج SVP أو VLPs في طاف وتنقية من قبل تنبيذ فائق. تم استخدام أربعة أنواع فرعية من DENV PRM / E الجينات الهيكلي أشرطة التعبير لبناء إصدارات DENV SVPs (ترسيمها كما 1-4) في الجدول 1 ويبرهن على وجود تتراوح ما بين 1،1-2،6 ملغ من البروتين الكلي في 0.6 مل وحدات التخزين. لVLPs التي تتطلب ثلاث بنيات الجينات، وجدنا الأمثل الحمض النووي نسبة ترنسفكأيشن من 1: 1: 2 لHA: NA: الكمامة على التوالي لتجميع VLPs الانفلونزا. في المقابل، كان البلازميد واحد معربا متعددة البروتينات الفيروسية ضدي الشيكونغونيا كافية لتوليد الفيروسة العصوية المؤتلف والثدييات تشيك فلب. بالإضافة إلى ذلك، إجراء ترنسفكأيشن ثنائي البلازميد هو أيضا ممكن مع خلايا الثدييات، على هذا النحو مع RSV F والكمامة transfected في نسبة 1: 1، وينتج يقاربالمطاف 0.01 ملغ / مل من إجمالي طاف ثقافة الخلية. كما هو مبين في الجدول رقم 1، تشيك العائد SVP من خلايا Sf9 يمكن أن تتراوح بين 0،008-0،016 ملغ البروتين الكلي / مل من حجم طاف، في حين أن الإنتاج من خلال الثدييات 293T ينتج انخفاض بمقدار 10 أضعاف من البروتين. بين الروايتين من H3N2 VLPs باستخدام مختلف من النوع البري، كامل طول البلازميدات HA، كان H3N2 فلب نموذج 2 انخفاض العائد من كل من البروتين الكلي ومحتوى معين HA. وتظهر الآخرين عينة فلب HA كميات في الشكلين 2 و 3 و توضيح كيفية استخدام HA و ELISA لتقدير المحتوى على سطح VLPs. كما هو الحال مع طريقة ELISA المباشر التقليدي، يتم إنشاء منحنى قياسي باستخدام تركيزات معروف لHA المؤتلف للمقارنة ELISA التفاعل لعينة H3 VLPs تحميلها على لوحة ELISA. ينصح ELISA أو المناعية مماثل لتقدير حجم VLPs التي لديها أجسام مضادة وحيدة النسيلة متاحة بسهولة مع تفاعلية متصالبة المعروفة لepit المحفوظة جيداOPES، ولكن قد لا تكون متاحة للجميع مولدات المضادات. RSV F هو جيد يتميز بالتالي إليسا باستخدام وحيدة النسيلة المضادة للRSV F الأجسام المضادة ينطبق ايضا على القياس الكمي للسطح F على مكعبات RSV F VLPs. بالإضافة إلى وظيفة مستضد والاعتراف مستضد عن طريق الاجسام المضادة المحددة، والأعمال التحضيرية فلب يمكن تقييم هيكليا بواسطة المجهر الإلكتروني. الشكل 4 هو صورة تمثيلية تبين أن يتم التعبير عن HA (الكمامة النواة) VLPs أنفلونزا بنجاح، وتجميعها، وتنقيته كما VLPs.
| وصف | ثقافة المجلد (مل) | حصاد | الحجم الكلي | إجمالي إنتاج البروتين (ملغ) | العائد (ملغ) / المجلد (مل) | محتوى مستضد معين |
| DENV1 SVP | 293T186 | 4 د | 0.6 مترل | 1،115 | 0.006 | الثانية |
| DENV2 SVP | 293T / 186 | 4 د | 0.6 مل | 2.5 | 0.0134 | الثانية |
| DENV3 SVP | 293T / 186 | 3 د | 0.6 مل | 1.536 | 0.0083 | الثانية |
| DENV4 SVP | 293T / 186 | 4 د | 0.6 مل | 2،613 | 0.014 | الثانية |
| تشيك فلب | Sf9 / 186 | 3 نقطة في البوصة | 0.6 مل | 1،503 | 0.0081 | الثانية |
| تشيك فلب | Sf9 / 500 | 4 نقطة في البوصة | 2.0 مل | 8،276 | 0.0166 | الثانية |
| تشيك فلب | 293T / 186 | 3 د | 0.6 مل | 0،296 | 0.0016 | الثانية |
| H3N2 فلب 1 | 293T /216 | 3 د | 0.6 مل | 1.25 | 0.0058 | 1.9 ميكروغرام HA / ميكرولتر |
| H3N2 فلب 2 | 293T / 216 | 3 د | 0.6 مل | 0.956 | 0.0044 | 0.96 ميكروغرام HA / ميكرولتر |
| H3N2 فلب 3 | 293T / 216 | 3 د | 0.6 مل | 1.6 | 0.0074 | 1.2 ميكروغرام HA / ميكرولتر |
| H3N2 فلب 4 | 293T / 216 | 3 د | 0.6 مل | 1.54 | 0.0071 | 0.98 ميكروغرام HA / ميكرولتر |
| RSV F فلب | 293T / 216 | 3 د | 0.6 مل | 2.3 | 0.0106 | 0.15 ميكروغرام RSV F / ميكرولتر |
| ود = أيام بعد ترنسفكأيشن، نقطة في البوصة = يوما بعد العدوى | ||||||
الجدول 1: Subviral والخامس عائدات الجسيمات irus تشبه التي كتبها بناء. بيانات تمثيلية من وحدات التخزين فلب، يظهر محصول البروتين (يحدده الفحص BCA التقليدية) أو محتوى مستضد معين (تحدده ELISA) بين مجموعة متنوعة من بنيات SVP / فلب. عوائد متغيرة نظرا للاختلاف في SVP / الجمعية فلب ونوع من الخلايا، وأقصى غلة قد تتطلب التحسين المستخدم. الإصدارات المختلفة سواء DENV1-4 تختلف بناء على المصلي، في حين أن تشيك VLPs استخدام نفس تسلسل لكن الاستعدادات تختلف في أي حجم أو نوع زراعة الخلايا. إصدارات مختلفة من H3N2 VLPs (1-4) تعبر عن أربع سلاسل HA الفريدة التي تشترك في ELISA حاتمة رد الفعل HA-محددة وكان شارك في أعربت بنفس NA والكمامة الأساسية. آر إس F فلب، والتي يتم إنشاؤها من ترنسفكأيشن ثنائي البلازميد RSV F والكمامة، تم تصنيعه وتقريب محتوى RSV F باستخدام RSV F محدد فحص ELISA.
.jpg و"/>
الشكل 1: نهج - فلب التصميم والتركيب وتنقية تمثيل تخطيطي من التصاميم البلازميد الجينات للتعبير عن البروتينات الهيكلية الفيروسية التي ستشكل VLPs: (أ) شارك في التعبير عن البروتينات الهيكلية المتعددة التي شارك في ترنسفكأيشن من ثلاثة البلازميدات في الخلايا 293T ، ويستخدم (ب) التعبير عن البروتينات الهيكلية من شريط كاسيت واحد الجينات المشفرة في البلازميد واحد في الخلايا 293T، و (C) المؤتلف ترميز الفيروسة العصوية تشيك البروتينات الهيكلية لتصيب خلايا Sf9 مثقف في قوارير الدوار لتعزيز نمو الخلايا كثافة عالية في تعليق . ويتم حصاد VLPs من وسائل الإعلام ثقافة الخلية، أوضح من الحطام الخلية، وفصل من غير الجسيمات عن طريق الترسيب بواسطة تنبيذ فائق على 20٪ وسادة الجلسرين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
. الشكل 2: مثال مقايسة التراص الدموي من H3 VLPs تم إجراء فحص التراص التقليدية على عينة تمثيلية من H3N2 فلب وطاف أوضح المقابلة لها. H3N2 HA فحص يمكن تنفيذها باستخدام 0.8٪ تركيا خلايا الدم الحمراء أو خنزير غينيا خلايا الدم الحمراء (لا يظهر). ويقدر محتوى البروتين الكلي باستخدام مقايسة BCA قياسي في فلب النقية و لم يتم تنفيذ أو الموصى بها لطاف أوضح. تم تنفيذ ELISA على فلب النقي وقدرت محتوى HA باستخدام معيار HA المؤتلف من تركيز معروف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): تحويلة والمغلفة وافرة H3 ELISA لتقدير حجم المحتوى H3 في لوحة H3 VLPs. إليسا مع التخفيفات المسلسل على مستوى HA المؤتلف من تركيز معروفة والمخفف عينات H3N2 فلب المتولدة من مختلف متواليات HA (عينات 1-9). ربط تركيز (ميكروغرام / ميكرولتر) من معيار للقيم الكثافة الضوئية التي تم الحصول عليها في 492 نانومتر (OD)، ويتم الحصول على تركيزات من استنتاج القيمة السينية التي يتقاطع الجزء خطية من المنحنى القياسي. تم تحميل التخفيفات القياسية وغير المعروفة عينات HA المؤتلف في نسختين في الآبار A & B أو C & D، على التوالي. يتم تحديد تركيز النهائي من العينة فلب بضرب تركيز من قبل عامل التخفيف من العينة فلب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4041 / 54041fig4.jpg "/>
الشكل 4: المجهر الإلكتروني من HA-VLPs باستخدام الكمامة النواة صورة الممثل المجهر الإلكتروني الأنفلونزا النقي HA VLPs. VLPs التجمع في جسيمات كروية المغلفة مع HA. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمنا الأساليب المذكورة أعلاه للتعبير عن بنجاح وتنقية SVPs وVLPs تتكون من البروتينات الهيكلية المتعددة لمختلف مسببات الأمراض. بشكل عام، ونحن نستخدم أنظمة التعبير الثدييات لتوليد VLPs لدينا. ومع ذلك، في أيدينا، المستمدة من الثدييات خلية كانت تشيك عوائد فلب منخفضة. وكان تشيك العائد فلب أكثر قوة عند استخدام نظام خلية الفيروسة العصوية الحشرات المؤتلف. بشكل عام، الفيروسة العصوية الحشرات نظم خلايا تسفر عن كميات أكبر من البروتينات المؤتلف، التي قد تنجم عن كثافة الخلية العليا التي يمكن تربيتها في قوارير الدوار مقابل قوارير زراعة الأنسجة، وأيضا نظرا لمستوى عال من التعبير عن الجينات الغريبة في حين تحت سيطرة من المروج polyhedrin الفيروسة العصوية. 16 ومع ذلك، فإن سيئات استخدام الفيروسة العصوية هو مجرد وجود الفيروسة العصوية في الأعمال التحضيرية فلب، التي لديها نشاط مساعد، والنتائج المناعية الانحراف في لقاح الدراسات التي 17 وجدنا أيضا التغير في العائد من انفلونزا الخامسلبس اعتمادا على تركيبات HA و NA المستخدمة؛ قد H3N2 VLP2 خفضت نسبيا الانتاجية مقارنة H3N2 VLP1، ويحتمل أن يرجع إلى الجمعية فلب أقل كفاءة أو NA-التوافق 15 ويبقى أن المزيد من التحقيق. تبقى الأمثل ليبني الحمض النووي ونسب ترنسفكأيشن خطوات حاسمة لضمان عائدات فلب المثلى. اخترنا لاستخدام pTR600 ناقلات الثدييات باستمرار بين لنا VLPs أساس الثدييات لأن التعبير فعال بصفة عامة واستنساخ فرعي هو مناسب مع الانزيمات تقييد متعددة. ويمكن تعديل النسب من البلازميدات لمتطلبات المستخدم لتحسين المحاصيل فلب. ومع ذلك، كما تمت مناقشته، لا تزال القيود الحالية للإنتاج فلب الثدييات مع تكلفة ترنسفكأيشن والقدرة نمو الخلايا في قوارير زراعة الأنسجة الحالية. وإن لم يكن أداؤها في هذا البروتوكول، ونحن لاحظنا إنتاج ناجح آخر من VLPs في خلايا transfected عند تجديد وسائل الاعلام مع وسائل الاعلام نمو جديدة (على سبيل المثال، OptiMEM) بعد التنوبر حصاد 72 ساعة ولاحقا مجموعة من VLPs بعد 72 ساعة إضافية، على الرغم من أن عائدات يمكن أن انخفاض طفيف بالمقارنة مع المجموعة الأولى من VLPs.
علينا أن نظهر إجراءات التعبير عن البروتينات الهيكلية الفيروسية في أي من الحشرات أو الثدييات الثقافات خلية للافراج عن VLPs في طاف لشبه تنقية من قبل تنبيذ فائق. حزب الشعب / VLPs مستقرة عموما للاستخدام في المناعية المستضدات والدراسات التطعيم، وتشكل تهديدا سلامة أقل بالمقارنة مع العيش الجسيمات الفيروسية، ولا سيما بالنسبة للعملاء اختيار أو أنفلونزا الطيور عالية الممرض (انفلونزا الطيور) سلالات 8،18، والتي تتطلب السلامة الأحيائية مستوى 3 شروط (BSL-3) مختبر 19. إنتاج فلب هو بسيط نسبيا، وغالبا ما ينتج الجزيئات التي يمكن أن تكون معترف بها من قبل الأجسام المضادة أثارت ضد البروتينات الهيكلية الفيروسية الأم، ليس على سبيل الحصر الحواتم الخطية التشويه والتحريف. VLPs بمثابة منصة مفيدة لانتزاع استجابات مناعية محددة للمستضد ويجوزيكون مرشحا واعدا في تطوير لقاح.
يوضح هذا البروتوكول نهجين لtransfecting الجينات الفيروسية في نظام الثدييات. في هذا التوضيح، واثنين من جينات الإنفلونزا، HA و NA، وشارك في transfected مع الكمامة فيروس نقص المناعة البشرية لتوليد فلب أن له نواة الداخلي هفوة، مع HA و NA تجميعها على السطح. استبدال الكمامة بدلا من مصفوفة أنفلونزا 1 (M1) يدل على مرونة VLPs أساس الكمامة مع بروتينات سكرية فيروسية غير ذات صلة، مثل RSV F وربما آخرين. بدلا من ذلك، توليف CHIKV يستخدم كاسيت الجين الهيكلي، والذي يعبر عن المكونات الضرورية لSVP التجميع الذاتي، مع البروتينات CHIKV E المعروضة على سطح مركز تتألف من البروتين C. هذين النهجين تظهر مرونة تركيب فلب، التي تتطلب الحد الأدنى من البروتينات الفيروسية الهيكلية لتجميع من خلايا transfected.
وأخيرا، في حين قدمنا بروتوكولات العامة وبالنتيجه التمثيليةالخبر للتعبير وتنقية H3N2، RSV، DENV، وCHIKV، هذه الإجراءات قابلة بسهولة لتوليد VLPs باستخدام البروتينات الفيروسية الأخرى. وقد استخدمت هذه الإجراءات بنجاح من قبل مجموعتنا في توليد فرعية فيروس الأنفلونزا الأخرى بما في ذلك H1، H5، H7 والفيروسات. وعلاوة على ذلك، البلازميد واحد، تصميم PRM / E تستخدم لتوليد DENV SVPs يمكن تكييفها لجيل من SVPs لأعضاء آخرين من عائلة الفيروسة المصفرة التي تشمل غرب النيل والفيروسات التهاب الدماغ الياباني. وبالمثل، وأساليب الإنتاج فلب تشيك يمكن استخدامها لأعضاء آخرين من عائلة الفيروسات الطخائية، بما في ذلك الفنزويلي، الشرق، والفيروسات التهاب الدماغ الخيلي غرب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ونود أن ننوه أعضاء مسبق من مختبر روس الذين ساهموا في تحسين بروتوكول للكفاءة القصوى والعوائد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 ml) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
References
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
- Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
- Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
- Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
- Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
- Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
- Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
- Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
- Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
- Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
- Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
- Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
- Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
- Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
- Jarvis, D. L. Methods in Enzymology. 463, Academic Press. 191-222 (2009).
- Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
- Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
- Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).
