用于疫苗接种的病毒样颗粒的表达与纯化

摘要

本文介绍了一种利用杆状病毒或哺乳动物表达系统合成病毒样颗粒并结合超速离心纯化的实验方案。该方法具有高度可定制性，可用于以安全且灵活的方式鉴定病毒抗原作为疫苗靶点。

摘要

病毒样颗粒（VLPs）和亚病毒颗粒（SVPs）为病毒疫苗设计提供了一种替代策略，相较于使用活病原体，具有更高的生物安全性和稳定性优势。VLPs无感染性且可自我组装，可用于呈递结构蛋白作为免疫原，从而避免了使用活病原体或重组病毒载体进行抗原递送的需要。本文展示了VLP在临床前动物试验未来应用中的不同设计与开发阶段，包括以下步骤：抗原选择、在选定细胞系中表达抗原、VLPs/SVPs的纯化以及抗原剂量的定量分析。我们展示了利用哺乳动物和昆虫细胞系表达抗原的方法，并比较了不同方法在产量上的差异。本文所述方法可适用于多种病原体，只需将抗原替换为使用者感兴趣的微生物中的免疫原性结构蛋白即可。VLPs和SVPs有助于抗原的表征，并辅助筛选最佳疫苗候选物。

引言

病毒样颗粒（VLPs）是一种已获批准用于人类疫苗接种的技术。事实上，一些近年来获批的疫苗，包括人乳头瘤病毒（HPV）疫苗和乙型肝炎疫苗，均采用了该技术。 Β （HepΒ）疫苗采用这一方法。病毒样颗粒（VLPs）由能够自我组装的结构蛋白形成。组装后的颗粒模拟病毒的形态，但由于缺乏病毒基因组，不具备感染性和复制能力。VLPs 可从多种原核和真核表达系统中表达并纯化。文献综述显示，不同表达系统的使用比例如下：细菌—28%，酵母—20%，植物—9%，昆虫—28%，哺乳动物—15%¹值得注意的是，基于L1衣壳蛋白的HPV疫苗是在酵母（Gardasil）或昆虫细胞系统（Cervarix）中生产的。²肝Β 疫苗，Recombivax 和 Engerix-Β，也在酵母中产生，且由 Hep 组成Β 表面抗原^3,4.

我们采用哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统来生产需要多种结构蛋白共表达才能组装的病毒样颗粒（VLPs）。本研究的重点是设计、生产及纯化针对人类病原体的基于VLP的疫苗：流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、登革病毒（DENV）和基孔肯雅病毒（CHIKV）。我们的方法具有足够的灵活性，可实现多个表达质粒或单个表达质粒中多种结构蛋白的共表达（图1）。此前，我们在人胚肾293T细胞中通过共转染编码流感病毒血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA....

方案

1. 用于产生流感H3N2病毒样颗粒的哺乳动物表达系统

1. 将病毒结构糖蛋白血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）以及人类免疫缺陷病毒（HIV）Gag p55 亚克隆至真核表达载体中，例如先前描述的 pTR600⁷。
2. 在化学感受态大肠杆菌（例如，DH5α）中扩增 DNA，并按照制造商说明使用质粒纯化试剂盒分离转染级质粒。DNA 用量取决于产量及使用者需求。
3. 在含 10% 胎牛血清（FBS）的培养基中，于 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中培养哺乳动物细胞系 293T。
4. 培养细胞，使每个 T-150 组织培养瓶含有 45–75 × 10⁶ 个细胞，确保次日细胞完全贴壁且融合度达到 85–95%。在显微镜下检查细胞以确认所需融合度。
   注意：通常建议采用高细胞密度，以在使用商业转染试剂时获得最佳蛋白表达并尽量减少细胞毒性；但过度融合可能导致细胞代谢废物积累，降低细胞活力。
5. 转染当天，按照制造商推荐方法制备脂质体与 DNA 混合物，并以 HA:NA:Gag 为 1:1:2 的比例进行转染，每 T-150 培养瓶总 DNA 用量为 40 µg。将 DNA 和脂质体溶液用无血清、不含抗生素的转染培养基稀释，使每瓶总体积为 20–30 ml。
   注意：基因构建体的比例可能需要使用者优化。尽管本文未展示，但类似转染程序曾以 1:1 比例用....

结果

病毒样颗粒的产量因病毒抗原构建设计的不同而有所差异。在本方案中，我们展示了利用昆虫细胞和哺乳动物细胞在上清液中生产SVP或VLP，并通过超速离心进行纯化的方法。使用了四种登革病毒（DENV）prM/E结构基因表达盒，构建了四种不同版本的DENV SVP（标记为1-4） 表1 在0.6 ml体积中，总蛋白含量介于1.1–2.6 mg之间。对于需要三种基因构建体的病毒样颗粒（VLP），我们发现合成流感病毒样颗粒的最佳DNA转染比例为HA:NA:Gag = 1:1:2；相比之下，单个表达多种基孔肯雅病毒蛋白的质粒足以用于生成重组杆状病毒和哺乳动物细胞来源的CHIK VLP。此外，哺乳动物细胞也可采用双质粒转染方法，例如以1:1的比例共转染RSV F和Gag，可获得约0.01 mg/ml的总细胞培养上清液蛋白量。如图所示 表1，CHIK SVP 在 Sf9 细胞中的产量可达到每毫升上清液 0.008–0.016 mg 总蛋白，而通过哺乳动物 293T 细胞生产时，蛋白产量降低 10 倍。在使用不同野生型全长 HA.......

讨论

我们已采用上述技术，成功表达并纯化了由多种结构蛋白组成的针对不同病原体的SVPs和VLPs。通常情况下，我们使用哺乳动物表达系统来制备VLPs。然而，在我们的实验中，来源于哺乳动物细胞的CHIK VLP产量较低。当采用重组杆状病毒-昆虫细胞系统时，CHIK VLP的产量更为可观。总体而言，杆状病毒-昆虫细胞系统能够产生更高水平的重组蛋白，这可能归因于与组织培养瓶相比，旋转瓶中可培养的细胞密度更高，同时也由于在杆状病毒多角体蛋白启动子控制下，外源基因的表达水平较高¹⁶。然而，使用杆状病毒的一个缺点是VLP制备物中存在杆状病毒本身，其具有佐剂活性，可能干扰疫苗研究中的免疫学结果¹⁷。我们还发现流感VLP的产量因所使用的HA和NA组合不同而存在差异；H3N2 VLP2的产量相较于H3N2 VLP1相对较低，这可能与VLP组装效率较低或NA兼容性有关¹⁵，仍需进一步研究。DNA构建体的优化以及转染比例的调整仍是确保VLP最佳产量的关键步骤。在基于哺乳动物系统的VLP制备中，我们选择始终使用哺乳动物表达载体pTR600，因其表达效率通常较高，且利用多种限制性内切酶进行亚克隆操作较为.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
质粒大提试剂盒	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamine	Life Technologies	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
杆状病毒Bac-to-Bac表达系统	Life Technologies	10359-016
Cimarec I 6 多点搅拌器板	赛默飞世尔科技	50094596
Polyclear 超速离心管	赛顿	7025	确认超速离心机及吊桶尺寸适用的离心管
Micro BCA 蛋白检测试剂盒	赛默飞世尔科技	23235
磷酸盐柠檬酸盐缓冲液	Sigma	P4922
邻苯二胺二盐酸盐	Sigma	P8287
0.22 μm 真空滤器上部（500 ml）	Nalgene	569-0020
甘油	Sigma	G5516
H2SO4	Sigma	339741
Sf-900 II SFM	赛默飞世尔科技	10902-096