Summary
Hier presenteren we een protocol voor het synthetiseren van virusachtige deeltjes met behulp van baculovirus of zoogdierlijke expressiesystemen en ultracentrifugatie zuivering. Deze zeer flexibele aanpak wordt gebruikt om virale antigenen vaccin taakstellingen op veilige en soepele wijze.
Abstract
Virusachtige deeltjes (VLP's) en subvirale deeltjes (SVP) een alternatieve benadering voor virale vaccins die de voordelen van een verhoogde biologische veiligheid en stabiliteit op het gebruik van levende pathogenen heeft. Niet-infectieuze en zelfassemblerende VLP's worden gebruikt voor structurele eiwitten presenteren als immunogenen, het omzeilen van de behoefte aan levende pathogenen of recombinante virale vectoren voor antigeen-afgifte. In dit artikel tonen we de verschillende stadia van VLP ontwerp en ontwikkeling voor toekomstige toepassingen in preklinische dierproeven. De procedure omvat de volgende stadia: selectie van antigeen expressie van antigeen in cellijn naar keuze, zuivering van VLP's / SVP en kwantificering van antigeen doseren. We demonstreren gebruik van zowel zoogdieren en insecten cellijnen voor expressie van onze antigenen en tonen hoe methoden verschillen opbrengst. De gepresenteerde methode kan voor een verscheidenheid aan pathogenen en kan worden bereikt door het substitueren van de immunogene antigenen met structural eiwitten van micro-organisme van het belang van de gebruiker. VLP's en SVP helpen met antigeen karakterisering en selectie van de beste kandidaat-vaccins.
Introduction
Virusachtige deeltjes (VLP's) zijn een erkende technologie voor de vaccinatie van mensen. In feite zijn sommige van de meer eigentijdse geregistreerde vaccins, zoals de menselijke papillomavirus (HPV) en hepatitis Β (HepΒ) vaccins gebruiken deze aanpak. VLP's worden gevormd uit structurele eiwitten die in staat zelf te monteren. De samengestelde deeltjes nabootsen virale morfologie, maar kan infecteren of te repliceren, omdat ze geen virale genomen. VLP's kunnen tot expressie worden gebracht en gezuiverd uit een aantal prokaryotische en eukaryotische systemen. Een overzicht van de literatuur is gebleken dat verschillende expressie systemen worden ingezet tegen de volgende tarieven: bacteriën - 28%, gist - 20%, plant - 9%, insect - 28%, en van zoogdieren - 15% 1. Van de nota, zijn HPV-vaccins gebaseerd op L1 capside-eiwit geproduceerd in gist (Gardasil) of in een insect cel systeem (Cervarix) 2. HepΒ vaccins Recombivax en Engerix-Β, worden geproduceerd in gist, en bestaan uit HepΒ oppervlakteantigeen 3, 4.
We gebruiken zoogdier- en insectencellen-expressiesystemen tot VLP's die co-expressie van meerdere eiwitten voor structurele assemblage produceren. Ons werk richt zich op het ontwerpen, produceren en zuiveren-VLP gebaseerde vaccins tegen menselijke pathogenen: griepvirus, respiratoir syncytieel virus (RSV), dengue virus (DENV) en chikungunya-virus (CHIKV). De methoden zijn flexibel genoeg om voor co-expressie van meerdere structurele eiwitten van verschillende expressieplasmiden of een expressieplasmide (figuur 1). Eerder hebben we geproduceerd en gezuiverd H5N1 VLP's opgebouwd uit de co-expressie van plasmiden die coderen voor influenza hemagglutinine (HA), neuraminidase (NA) en matrix (M1) in humane embryonale nier 293T-cellen 5,6. De genen werden codon geoptimaliseerd voor expressie in zoogdiercellen en gekloneerd in pTR600, een eukaryotische expressievector die de cytomegalovirus immediate-early promotor plus intron A voor het initiëren Transcription van eukaryote inserts en runderen groeihormoon polyadenyleringssignaal voor beëindiging van de transcriptie 7. Een vergelijkbare benadering met behulp van drie plasmide co-expressie van HA, NA (figuur 1A) en een andere virale matrix eiwit, HIV Gag p55, werd gebruikt voor het verkrijgen van seizoensgebonden influenzasubtype menselijke H3N2 VLP's in dit onderzoek en blijkt genereren VLP's van soortgelijke grootte als influenza deeltjes 8. Hoewel griepvaccins hoofdzakelijk opwekken anti-HA-antilichamen, de toevoeging van griep neuraminidase bemiddelt sialidase activiteit VLP budding uit getransfecteerde cellen en 9 aanwezig additionele immunogene targets mogelijk. RSV VLP produceren we ook de geselecteerde verbonden kern van HIV Gag prototypische vaccins die uitsluitend RSV-glycoproteïnen van het oppervlak presenteren verder aan te tonen flexibiliteit van VLP-vorming middels HIV Gag, zoals eerder beschreven en gekenmerkt door elektronenmicroscopie 6,10 ontwerpen. anderenhebben eerder aangetoond dat VLP presenteren RSV-glycoproteïnen kunnen worden geassembleerd met behulp van verscheidene virale componenten van Newcastle Disease virus (NDV) 11 en 12 influenza matrix. Full-length oppervlakte glycoproteïne sequenties werden gebruikt in deze studie natieve conformaties die noodzakelijk zijn voor receptorbinding en functionele antilichaamherkenning assay kan worden door middel van enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) behouden.
Onze voorbeelden voor het gebruik van enkel plasmide expressie systemen om deeltjes te genereren DENV en CHIKV. Bij DENV, kunnen we subvirale deeltjes (SVP) zonder capside in 293T cellen van een plasmide dat een prM / E structurele genexpressiecassette 13 produceren. De term SVP wordt gebruikt om het gebrek aan een kern- of capside-eiwit in de assemblage van virale structurele proteïnen duiden. CHIK VLP's kunnen ook worden geproduceerd met een plasmide dat een structureel gen CHIKV cassette codeert capside en envelop eiwitten of insect cellen door het infecteren met een recombinant baculovirus coderend voor hetzelfde gen cassette structureel geoptimaliseerd voor insectencel expressie (Figuur 1B - C).
Het eindresultaat van de expressie benaderingen hierboven besproken is het vrijkomen van VLP's in celkweekmedium dat dan via ultracentrifugatie kan worden gezuiverd door een 20% glycerol kussen. In dit rapport presenteren we methoden om uit te drukken en te zuiveren van deze VLP's van zoogdieren en insecten cel systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mammalian Expression Systeem voor het genereren van Influenza H3N2 VLP
- Subkloon virale structurele glycoproteïnen hemagglutinine (HA), neuraminidase (NA) en humaan immunodeficiëntie virus (HIV) Gag p55 in eukaryotische expressievectoren zoals eerder beschreven pTR600. 7
- Amplificeren DNA in chemisch competente Escherichia coli (bijvoorbeeld DH5a) en isoleren transfectie-grade plasmide met een plasmide zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Hoeveelheid DNA is afhankelijk van de opbrengst en de wensen van de gebruiker.
- Handhaaf zoogdiercellijn, 293T, in groeimedia bevattende 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C met 5% CO2 in een bevochtigde incubator.
- Groeien cellen zodanig dat een T-150 weefselkweek kolf bevat 45-75 x 10 6 cellen per fles zodanig dat fles verkrijgt volledige cel hechting en 85-95% cel confluentie door de volgende dag. Inspecteer cellen onder de microscoop op gewenste conflurantie.
Opmerking: De hoge celdichtheid wordt meestal aanbevolen om optimale eiwit expressie opleveren met minimale cytotoxiciteit bij het gebruik van commerciële transfectie reagentia echter over-confluentie kan leiden tot ophoping van cellulaire afval bijproducten en levensvatbaarheid van de cellen te verminderen. - Op de dag van transfectie bereiden liposomen en DNA-mengsel volgens de aanbevelingen van de fabrikant en transfecteren DNA cellen met een DNA samenstelling van 1: 1: 2 of HA: NA: Gag met totaal DNA hoeveelheid 40 ug per T-150 kolf. Verdun DNA- en liposoomoplossingen in serumvrije transfectie media zonder antibiotica zodat elke kolf een totaal volume van 20-30 ml.
Let op: Ratio van gen-constructen kunnen gebruikers optimalisatie nodig. Hoewel hier niet getoond, heeft een soortgelijke transfectie procedure uitgevoerd met respiratoir syncytieel virus (RSV) en F HIV Gag op een 1: 1 ratio. Voor DENV en CHIKV één expressieplasmiden totaal 20 ug DNA per T-150 kolf gebruikt voor optimale eXpression. DNA: transfectiereagens verhoudingen gebruiker geoptimaliseerd. Gebruik aanbevolen transfectiemedium gebaseerd op transfectie methode, dwz polykationische lipide transfecties aanbevolen door verlaging of afwezigheid van foetaal runderserum aldus media worden gesupplementeerd met groeihormonen en sporenelementen groei in de afwezigheid van serum ondersteunen. - Terugkeren kolven tot 37 ° C met 5% CO2 incubator. Voor een volume van 200 ml, gebruiken 9 T-150 kolven. De cellen worden gehandhaafd in transfectie kweekmedium tot de dag van VLP oogst.
- Oogst kweeksupernatant van cellen na 72-96 uur na transfectie afhankelijk antigeen, of wanneer cellevensvatbaarheid is gedaald tot 70-80%, zoals geschat door microscopische inspectie. Overdracht supernatant in 50 ml conische buizen en spin de cellen neer op 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om celresten te pelleteren.
Opmerking: Vervanging van 3 dagen supernatant met verse voorverwarmde, serumvrije transfectie media om hechtende cellen zal yielda tweede partij van VLPs met gelijke of iets lagere opbrengst en worden geoptimaliseerd door gebruiker. - Pool supernatant en filter door een 0,22 pm porie membraan voor sedimentatie via ultracentrifugatie.
- Test de hemagglutinatie activiteit van de HA-expressie VLP's door standaard hemagglutinatietest 14 bij 0,8% kalkoen of zoogdiercellen rode bloedcellen of doorgaan met antigeen-specifieke ELISA. Zie figuur 2 voor representatieve resultaten.
2. CHIK VLP expressie met behulp van baculovirus / Insect Cell System
- Genereren recombinant baculovirus tot expressie chikungunyavirus capside en envelop-eiwitten (C-E3-E2-6K-E1) van S-27-stam onder toepassing van een commercieel baculovirus expressiesysteem.
- Cultuur Spodoptera frugiperda Sf9-cellen in serumvrij Sf9 groeimedium met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine bij 28 ° C. Gebruik 3-5 x 10 5 c / ml tot centrifugekolf culturen voor suspens initiërenion celgroei. Passage routinematig bij het bereiken celdichtheden van 2-4 x 10 6 c / ml (om de 3-4 dagen).
- Cultuur Sf9 cellen in suspensie in spinner flessen met roeren bij 130 rpm op een multipoint roerder plate-systeem. Voor een goede beluchting, te handhaven cultuur volumes op niet meer dan de helft van het volume van de spinner kolf.
- Voor expressie van CHIK VLP infecteren Sf9-cellen bij een dichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml recombinant baculovirus met een multipliciteit van infectie van 1 en terugkeer naar 28 ° C incubator. Gewoonlijk infecteren één of twee spinner flessen gemaakt met 250 ml Sf9-cellen.
Let op: Hoewel we niet deze methode gebruikt, kan Sf9 cellen gekweekt in schudkolven bij 28 ° C met behulp van een shaker platform. - Oogst kweken na 72-96 uur na infectie, of wanneer cellevensvatbaarheid is gedaald tot 70-80% zoals bepaald door trypan blauw exclusie volgens het protocol van de fabrikant.
Opmerking: De cellen blijven prolifereren terwijl geïnfecteerde en ereen ~ 80% levensvatbaarheid Sf9 kweken geïnfecteerd met recombinant baculovirus CHIK VLP op 3 dagen na infectie (dpi). -Baculovirus geïnfecteerde cellen zijn groter van uiterlijk. Morfologie ook veranderen van rond tot langwerpig. In de late stadia van baculovirus infecties, de cellen begon te lyseren. - Transfer kweken direct van suspensiekweek in 50 ml conische buizen en spin de cellen neer op 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Verzamel supernatanten en te filteren door middel van een 0,22 pm porie membraan voor sedimentatie via ultracentrifugatie.
3. Sedimentatie / Zuivering van VLP / SVP
- Steriliseren 25 mm x 89 mm met open dak ultracentrifuge buizen met 70% ethanol in bioveiligheid kap. Zorg ervoor dat de ethanol is opgedroogd af voor gebruik.
- Plaats maximaal 32 ml van de bovenstaande in een schone buis. Een minimaal volume van 25 ml wordt aanbevolen om collaps en beschadiging van onvoldoende gevuld ultracentrifuge buizen te voorkomen.
- onderlaag zorgvuldig supernatanten with steriele 3 ml 20% glycerol in PBS (v / v). Controleer buizen zijn gebalanceerd.
- Spin bij 135.000 g gedurende 4 uur bij 4 ° C.
- Zuig supernatant, het waarborgen van de pellet niet los van de buis.
- Hersuspenderen gesedimenteerd VLP onderaan de buizen met steriele PBS door krachtig pipetteren en neer. De hoeveelheid PBS nodig resuspenderen VLP afhankelijk VLP totale eiwitopbrengst en verdere toepassingen. Typisch, resuspendeer pellet in elk VLP ten minste 100 pl.
- Store monsters 4 ° C voor de korte termijn opslag en -80 ° C opslag voor de lange termijn opslag.
4. Vaststellen Eiwit Opbrengsten en Specifiek Antigeen Opbrengsten
- Bepaal het totale eiwitgehalte onder toepassing van een commerciële eiwit kwantificering werkwijze, zoals BCA assay volgens protocol van de fabrikant.
- Specifieke antigeengehalte beoordelen voeren direct enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) door bekleding van seriële verdunningen van standaard antigen en 2-51, g totaal eiwit monster een ELISA 96-well plaat met vlakke bodem.
- Breng vervolgens antigeenspecifieke antilichamen om de aanwezigheid van de antigenen op de plaat sonde en gebruik conventionele ELISA ontwikkeling substraten detecteerbare absorptie voor microplaatlezer produceren. Zie figuur 2 voor representatieve resultaten van HA en ELISA bepaling voor een monster HA tot expressie VLP; vele combinaties van HA en NA zijn mogelijk, maar de opbrengst kan verschillen bij HA-NA compatibiliteit 15.
Opmerking: Antigeen-specifieke antilichamen hebben variabele affiniteiten en het wordt aanbevolen dat eindpunt-verdunning titratie van antilichamen worden bepaald voordat VLP kwantificering. Commerciële antilichamen voorgestelde concentratie of verdunning bereiken voor gebruik in ELISA, alsmede gesuggereerd protocollen.
- Breng vervolgens antigeenspecifieke antilichamen om de aanwezigheid van de antigenen op de plaat sonde en gebruik conventionele ELISA ontwikkeling substraten detecteerbare absorptie voor microplaatlezer produceren. Zie figuur 2 voor representatieve resultaten van HA en ELISA bepaling voor een monster HA tot expressie VLP; vele combinaties van HA en NA zijn mogelijk, maar de opbrengst kan verschillen bij HA-NA compatibiliteit 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VLP opbrengsten waren variabel door virale antigeen construct ontwerp. In dit protocol hebben we gebruik van insectencellen en zoogdiercellen voor de productie van SVP of VLP's in supernatant en zuivering door ultracentrifugatie toonde. Vier subtypen van DENV prM / E structuurgen expressiecassettes werden gebruikt om de versie van DENV SVP (afgebakend zoals 1-4) construct in tabel 1 en tonen een bereik tussen 1,1-2,6 mg totaal eiwit in 0,6 ml volumes. Voor VLP dat een drie genconstructen vereisen, vonden we het optimale DNA transfectie verhouding van 1: 1: 2 voor HA: NA: Gag respectievelijk influenza VLP synthetiseren; in contrast, een plasmide dat meerdere Chikungunya virale eiwitten was voldoende voor het genereren van recombinant baculovirus en zoogdierlijke CHIK VLP. Bovendien, een dual-plasmide transfectie procedure kan ook met zoogdiercellen, als zodanig RSV F en Gag getransfecteerd in een 1: 1 verhouding en levert onderlingeveer 0,01 mg / ml totaal celcultuur supernatant. Zoals getoond in tabel 1, kunnen CHIK SVP opbrengst van Sf9-cellen variëren tussen 0,008-0,016 mg totaal eiwit / ml supernatant volume, terwijl de productie door middel van zoogdierlijke 293T levert een 10-voudige reductie van eiwitten. Tussen de twee versies van H3N2 VLP's met verschillende wild-type, full-length HA plasmiden, de H3N2 VLP Monster 2 had een verminderde opbrengst van totale eiwitten en specifieke HA inhoud. Andere sample VLP HA hoeveelheden worden in figuren 2 en 3 en laten zien hoe HA en ELISA worden gebruikt om het oppervlak inhoud op de VLP te schatten. Net als bij een conventionele ELISA directe werkwijze wordt een standaardcurve gegenereerd met bekende concentraties van een recombinant HA ELISA reactiviteit vergelijken monsters H3 VLP geladen op een ELISA-plaat. ELISA en dergelijke immunoassay worden aanbevolen voor kwantificering van VLP's die beschikbaar monoklonale antilichamen met bekende kruisreactiviteit hebben een goed geconserveerd Epitopes, maar mogelijk niet beschikbaar voor alle antigenen zijn. RSV F is goed gekarakteriseerd, derhalve een ELISA met gebruikmaking van monoklonaal anti-RSV F antilichaam ook voor kwantificering oppervlak Vrouw gepelleteerd RSV F VLP. Behalve antigeen en functionaliteit antigen herkenning door specifieke antilichamen kunnen preparaten VLP structureel bepaald door elektronenmicroscopie. Figuur 4 is een representatief beeld tonen dat HA (Gag-kern) influenza VLP succesvol zijn uitgedrukt, geassembleerd en gezuiverd zoals VLP's.
| Beschrijving | Cultuur Vol (ml) | oogst een | Totale volume | Total Protein Opbrengst (mg) | Opbrengst (mg) / Vol (ml) | Specifiek antigeen inhoud |
| DENV1 SVP | 293T186 | 4 d | 0,6 ml | 1.115 | 0,006 | nd |
| DENV2 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 ml | 2.5 | 0,0134 | nd |
| DENV3 SVP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 ml | 1.536 | ,0083 | nd |
| DENV4 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 ml | 2,613 | 0,014 | nd |
| CHIK VLP | Sf9 / 186 | 3 dpi | 0,6 ml | 1.503 | 0,0081 | nd |
| CHIK VLP | Sf9 / 500 | 4 dpi | 2,0 ml | 8,276 | 0,0166 | nd |
| CHIK VLP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 ml | 0,296 | 0,0016 | nd |
| H3N2 VLP 1 | 293T /216 | 3 d | 0,6 ml | 1.25 | 0,0058 | 1,9 ug HA / ul |
| H3N2 VLP 2 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 0,956 | 0,0044 | 0,96 ug HA / ul |
| H3N2 VLP 3 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 1.6 | 0,0074 | 1,2 ug HA / ul |
| H3N2 VLP 4 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 1.54 | 0,0071 | 0,98 ug HA / ul |
| RSV F VLP | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 2.3 | 0,0106 | 0.15 ug RSV F / ul |
| a d = dagen na transfectie dpi = dagen na infectie | ||||||
Tabel 1: Subvirale en v irus-achtige deeltje opbrengsten door construct. Representatieve gegevens van VLP volumes, is totaal eiwit opbrengst (bepaald door conventionele BCA-test) of specifiek antigeen (bepaald door ELISA) blijkt uit een verscheidenheid van de SVP / VLP constructen. De opbrengsten zijn variabel te wijten aan verschil in SVP / VLP assemblage en celtype, en een maximale opbrengst kan de gebruiker optimalisatie nodig. De verschillende versies van beide DENV1-4 verschillen op basis van serotype, terwijl de CHIK VLP dezelfde volgorde te gebruiken, maar de voorbereidingen verschillen in volume of celtype cultuur. De verschillende versies van H3N2 VLP's (1-4) tot expressie vier unieke HA sequenties die een HA-specifiek ELISA reactieve epitoop te delen en werden mede tot expressie gebracht met dezelfde NA en Gag kern. De RSV F VLP, die wordt gegenereerd uit een dual-plasmide transfectie van RSV F en Gag, werd gesynthetiseerd en RSV F-gehalte werd benaderd met behulp van RSV F specifieke ELISA-test.
.jpg "/>
Figuur 1:. Approach - VLP ontwerp, de synthese en zuivering Schematische weergave van plasmide genen ontwerpen voor expressie van virale structurele eiwitten die VLP's zullen vormen: (A) co-expressie van meerdere structurele eiwitten door co-transfectie van drie plasmiden 293T-cellen (B) expressie van structurele eiwitten van een enkel gen cassette gecodeerd in een enkel plasmide 293T-cellen, en (C) recombinant baculovirus coderend CHIK structurele eiwitten wordt gebruikt om Sf9-cellen gekweekt infecteren spinner flessen tot hoge dichtheid celgroei in suspensie bevorderen . De VLP's worden geoogst uit de celkweek media, verduidelijkt van de cel puin, en gescheiden van de niet-deeltjes via sedimentatie door ultracentrifugatie op een 20% glycerol kussen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 2: Voorbeeld haemagglutinine-assay van H3 VLP Een conventionele hemagglutinatie-test werd uitgevoerd op een representatieve steekproef van H3N2 VLP en de bijbehorende verduidelijkt supernatant; H3N2 HA test kan worden uitgevoerd met 0,8% kalkoen rode bloedcellen of cavia rode bloedcellen (niet getoond). Totaal eiwitgehalte wordt geschat met behulp van de standaard BCA-test op het gezuiverde VLP en werd niet uitgevoerd of aanbevolen voor verduidelijkt supernatant. ELISA werd uitgevoerd op het gezuiverde VLP en HA-gehalte werd geschat met behulp van een recombinant HA standaard van bekende concentratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Ex voldoende H3 ELISA voor de kwantificering van H3 inhoud H3 VLP. Een ELISA plaat werd bekleed met seriële verdunningen van recombinant HA standaard van bekende concentratie en verdund H3N2 VLP monsters gegenereerd uit verschillende HA sequenties (monsters 1-9). Correleren van de concentratie (pg / pl) van de standaard aan de optische dichtheidswaarden verkregen bij 492 nm (OD) worden concentraties verkregen door het afleiden van de x-waarde die het lineaire gebied van de standaardcurve snijdt. Verdunningen van recombinant HA standaard en onbekende monsters werden in tweevoud geladen in wells A & B of C & D, respectievelijk. De uiteindelijke concentratie van de VLP monster wordt bepaald door de concentratie van de verdunningsfactor van de VLP monster te vermenigvuldigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4041 / 54041fig4.jpg "/>
Figuur 4: Elektronenmicroscopie van HA-VLP's met behulp van Gag-core vertegenwoordiger elektronenmicroscopie beeld van gezuiverde influenza HA VLP.. VLP's assembleren in bolvormige deeltjes bekleed met HA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben de hierboven beschreven technieken die worden gebruikt om met succes uit te drukken en te zuiveren SVP en VLP samengesteld uit meerdere structurele eiwitten van verschillende ziekteverwekkers. In het algemeen gebruiken we zoogdierexpressiesystemen onze VLP's te genereren. Echter, in onze handen, zoogdieren cel afkomstige CHIK VLP opbrengsten waren laag. CHIK VLP opbrengst was robuuster bij het gebruik van een recombinant baculovirus-insectencel systeem. In het algemeen baculovirus-insectencel systemen leveren grotere hoeveelheden recombinante eiwitten, die kunnen voortvloeien uit de hogere celdichtheden die kunnen worden gekweekt in spinner kolven versus weefselkweek kolven en ook vanwege de hoge mate van expressie van vreemde genen tijdens onder toezicht van de baculovirus polyhedrine promotor. 16 een nadeel van het gebruik van baculovirus is de aanwezigheid van baculovirus in VLP preparaten die adjuvans activiteit heeft en scheef immunologische resultaten in vaccinstudies 17 We vonden ook variabiliteit in de opbrengst van influenza VLPs afhankelijk van het HA en NA combinaties gebruikt; H3N2 VLP2 had relatief verminderde opbrengst in vergelijking met H3N2 VLP1, mogelijk als gevolg van minder efficiënte VLP montage of NA-compatibiliteit 15 en blijft verder worden onderzocht. Optimalisatie van DNA constructen en transfectie verhoudingen kritisch zijn stappen voor een optimale VLP opbrengsten. We kozen voor een zoogdier vector pTR600 consequent onder onze VLP-zoogdieren op basis gebruiken, want expressie is over het algemeen efficiënt en subklonering is handig met meerdere restrictie-enzymen. Verhoudingen van plasmiden kunnen worden aangepast gebruikersbehoeften om VLP opbrengsten verbeteren. Zoals besproken, karakteristieken van het zoogdier VLP vervaardiging ervan met kosten van transfectie en de celgroei capaciteit huidige weefselkweek kolven. Hoewel niet uitgevoerd in dit protocol, hebben we extra succesvolle productie van VLP's waargenomen in getransfecteerde cellen wanneer media wordt aangevuld met verse groei media (bijvoorbeeld OptiMEM) na de sparrent 72 uur oogst en daaropvolgende verzameling van VLP na nog eens 72 uur, hoewel de opbrengst enigszins kan worden verminderd in vergelijking met de eerste verzameling VLP.
We tonen een procedure voor het tot expressie virale structurele eiwitten in zowel insecten of zoogdierlijke celkweken te VLP release in de supernatant voor semi-zuivering door ultracentrifugatie. De SVP / VLP's zijn over het algemeen stabiel voor gebruik in antigeen immunoassays en vaccinatie studies, en minder veiligheid bedreigingen opleveren in vergelijking met virale deeltjes, in het bijzonder voor bepaalde agenten of high-pathogeen aviaire influenza (HPAI) stammen 8,18, die Biosafety Level vereisen wonen 3 (BSL-3) laboratoriumomstandigheden 19. VLP produktie relatief eenvoudig en levert vaak deeltjes die door antilichamen opgewekt tegen natieve virale structurele proteïnen, niet uitsluitend gedenatureerde lineaire epitopen worden herkend. VLP's een nuttig platform voor het opwekken van immuunresponsen tegen het antigeen en kunnenzijn een veelbelovende kandidaat in de ontwikkeling van vaccins.
Dit protocol toont twee benaderingen voor transfectie virale genen in het zoogdiersysteem. In dit voorbeeld, twee influenza genen HA en NA, zijn co-getransfecteerd met het HIV Gag een VLP dat een Gag interne kern met HA en NA vervaardigd op het oppervlak te genereren. De vervanging van Gag plaats van influenza matrix 1 (M1) toont flexibiliteit van Gag-gebaseerde VLPs met niet verwante virale glycoproteïnen, zoals RSV F en mogelijk andere. Als alternatief kan de synthese van CHIKV gebruikt een structureel gen-cassette, die de noodzakelijke componenten voor SVP zelfassemblage tot expressie brengt, met CHIKV E proteïnen gepresenteerd op het oppervlak van de centra uit C-eiwit. Deze twee benaderingen demonstreren de flexibiliteit van VLP synthese, die minimale structurele virale eiwitten vereist montage van getransfecteerde cellen.
Tot slot, terwijl we gepresenteerd algemene protocollen en representatieve results voor expressie en zuivering van H3N2, RSV, DENV en CHIKV, deze procedures zijn gemakkelijk vatbaar voor het genereren van VLP gebruik van andere virale eiwitten. Deze procedures zijn met succes gebruikt door onze groep in het genereren van andere influenzavirussubtypes waaronder H1, H5 en H7 virussen. Bovendien, de enkel plasmide, prM / E ontwerp gebruikt voor het verkrijgen van DENV SVP kan worden aangepast voor het genereren van SVP de leden van de Flavivirus-familie die West Nile en Japanse encefalitis virussen bevatten. Evenzo kunnen werkwijzen van CHIK VLP productie worden gebruikt voor andere leden van de familie Togaviridae, waaronder het Venezolaanse, Oost en West equine encefalitis virussen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen de voorafgaande leden van de Ross lab die hebben geholpen optimaliseren protocol voor maximale efficiëntie en opbrengst erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 ml) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
References
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
- Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
- Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
- Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
- Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
- Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
- Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
- Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
- Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
- Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
- Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
- Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
- Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
- Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
- Jarvis, D. L. Methods in Enzymology. 463, Academic Press. 191-222 (2009).
- Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
- Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
- Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).
