Summary
Hier stellen wir ein Protokoll für die Synthese von virusähnlichen Partikeln entweder Baculovirus oder Säuger-Expressionssystemen und Ultrazentrifugation Reinigung. Dieser hochgradig anpassbare Ansatz wird verwendet, um virale Antigene als Impfstoff Ziele in eine sichere und flexible Art und Weise identifizieren.
Abstract
Virus-ähnliche Partikel (VLPs) und subvirale Partikel (SVPs) sind ein alternativer Ansatz zu viraler Impfstoff-Design, das die Vorteile der erhöhten biologischen Sicherheit und Stabilität gegenüber der Verwendung von lebenden Pathogenen bietet. Nicht-infektiös und selbstorganisierenden, VLPs werden verwendet, Strukturproteine als Immunogene darzustellen, wodurch die Notwendigkeit für lebende Pathogene oder rekombinanter viraler Vektoren für die Antigenabgabe umgehen. In diesem Artikel zeigen wir die verschiedenen Stadien der VLP-Design und Entwicklung für zukünftige Anwendungen in der präklinischen Tierversuche. Das Verfahren umfasst die folgenden Phasen: Auswahl des Antigens, die Expression von Antigen in Zelllinie der Wahl, Reinigung von VLPs / SVP und Quantifizierung für Antigen Dosierung. Wir demonstrieren den Einsatz beider Säugetier- und Insektenzelllinien zur Expression unserer Antigene und zeigen, wie Methoden der Ausbeute unterscheiden. Die Methodik dargestellt kann auf eine Vielzahl von Pathogenen anwendbar und kann durch Einsetzen der Antigene mit immunogenen str erreicht werdenuctural Proteine des Mikroorganismus von Interesse des Benutzers. VLPs und SVP unterstützen mit Antigen Charakterisierung und Auswahl der besten Impfstoffkandidaten.
Introduction
Virus-ähnliche Partikel (VLPs) sind eine bewährte Technologie für die menschliche Impfung. In der Tat beschäftigen einige der contemporarily zugelassene Impfstoffe, einschließlich der humanen Papillomviren (HPV) und Hepatitis Β (HepΒ) Impfstoffe diesen Ansatz. VLPs sind in der Lage die Selbstorganisation von Strukturproteinen gebildet. Die zusammengesetzten Teilchen nachahmen viral Morphologien, kann aber nicht infizieren oder zu replizieren, weil sie viralen Genomen fehlt. VLPs können aus einer Reihe von prokaryotischen und eukaryotischen Systemen exprimiert und gereinigt werden. Eine Überprüfung der Literatur ergab , dass unterschiedliche Expressionssysteme mit den folgenden Raten eingesetzt werden: Bakterien - 28%, Hefe - 20%, Pflanzen - 9%, Insekten - 28%, und Säuger - 15% 1. Zu beachten ist , Protein - Impfstoffe HPV basierend auf L1 - Kapsid in Hefe (Gardasil) oder in einer Insektenzellsystem (Cervarix) 2 hergestellt. HepΒ Impfstoffe, Recombivax und Engerix-Β, werden auch in Hefe hergestellt und bestehen aus HepΒ Oberflächenantigen 3, 4.
Wir verwenden Säuger- und Insektenzellexpressionssysteme VLPs herzustellen erfordern Coexpression von mehreren Strukturproteinen für die Montage. Unsere Arbeit konzentriert sich auf die Gestaltung, Herstellung und Reinigung von VLP-basierte Impfstoffe gegen humanpathogene Erreger: Influenza-Virus, Respiratory-Syncytial-Virus (RSV), Dengue-Virus (DENV) und Chikungunya-Virus (CHIKV). Unsere Verfahren sind flexibel genug , um die Coexpression der mehreren Strukturproteinen aus mehreren Expressionsplasmiden oder einem einzigen Expressionsplasmid (Figur 1) zu ermöglichen. Zuvor produzierten wir und gereinigter H5N1 VLPs zusammengesetzt aus der Co-Expression von Plasmiden codiert , Influenza - Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und Matrix (M1) in humane embryonale Nierenzellen 293T 5,6. Die Gene wurden für die Expression in Säugerzellen-Kodon-optimierten und kloniert in pTR600, einem eukaryotischen Expressionsvektor, der Cytomegalovirus-immediate-early-Promotor und Intron A zum Initiieren umschrift enthaltendription von eukaryotischen Einsätze und das Rinderwachstumshormon - Polyadenylierungssignal für die Beendigung der Transkription 7. Ein ähnlicher Ansatz der drei Plasmid Co-Expression von HA, NA (1A) und eine alternative virale Matrix - Protein, HIV Gag p55, wurde unter Verwendung von für die Erzeugung von menschlichen saisonalen Influenza - Subtyp H3N2 VLPs in dieser Studie verwendet und wurde zu generieren gezeigt VLPs von ähnlicher Größe wie Influenza Partikel 8. Obwohl überwiegend Influenza - Impfstoffe Anti-HA - Antikörper hervorzurufen, vermittelt die Zugabe von Influenza - Neuraminidase Sialidaseaktivität VLP zu ermöglichen , von transfizierten Zellen 9 und auch vorhanden zusätzliche immunogene Ziele Knospung. Um RSV VLPs herzustellen, wählten wir auch die in keinem Zusammenhang Kern von HIV - Gag zu prototypische Impfstoffe entwickeln , die weiter ausschließlich RSV Oberfläche Glykoproteine präsentieren Flexibilität der VLP - Bildung zeigen , unter Verwendung von HIV - Gag, wie zuvor durch Elektronenmikroskopie 6,10 beschrieben und charakterisiert. AndereVerwendung zusammengebaut werden verschiedene virale Komponenten von Newcastle Disease Virus (NDV) 11, und Influenza - Matrix 12 , dass VLPs präsentiert RSV - Glykoproteine können zuvor gezeigt haben. Voller Länge Oberfläche Glykoprotein-Sequenzen wurden in dieser Studie verwendet, um nativen Konformationen behalten, die für funktionelle Rezeptorbindung und Antikörper-Erkennungs Assay durch enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) notwendig sein kann.
Unsere Beispiele für die Verwendung von einzelnen Plasmid-Expressionssysteme Partikel sind DENV und CHIKV zu erzeugen. Im Falle von DENV können wir subvirale Partikel (SVPs) ohne Kapsid in 293T - Zellen aus einem einzelnen Plasmid , das ein prM / E - Strukturgens Expressionskassette enthält 13 herzustellen. Der Begriff SVP wird verwendet, um das Fehlen eines Kerns oder Kapsidprotein in der Montage von viralen Strukturproteine zu bezeichnen. CHIK VLPs können auch ein einzelnes Plasmid, das ein CHIKV strukturelle Gen-Kassette, die Codierung Kapsid und Hüllproteine gewonnen werden, enthält, oder in insect Zellen mit einem rekombinanten Baculovirus codiert , die gleiche strukturelle Genkassette optimiert für Insektenzellexpressions (1B - C) zu infizieren.
Das Endergebnis des Ausdrucks oben diskutierten Ansätze ist die Freisetzung von VLPs in den Zellkulturmedium, das dann über Ultrazentrifugation durch einen 20% Glycerin Kissen leicht gereinigt werden. In diesem Bericht stellen wir Methoden, um diese VLPs aus Säugetier- und Insektenzellsysteme, zum Ausdruck zu bringen und zu reinigen.
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Protocol
1. Mammalian Expression System zur Erzeugung von Influenza H3N2 VLP
- Subklon viralen Struktur Glykoproteine Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und Human Immunodeficiency Virus (HIV) Gag p55 in eukaryotische Expressionsvektoren, wie zuvor beschrieben pTR600. 7
- Amplify DNA in chemisch kompetente Escherichia coli (zB DH5a) und zu isolieren , die Transfektion-grade - Plasmid ein Plasmid - Reinigungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . DNA-Menge ist abhängig von Ertrag und Anforderungen des Benutzers.
- Pflegen Säugerzelllinie, 293T, in Wachstumsmedium , enthaltend 10% fötales-Rinderserum (FBS) bei 37 ° C mit 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator.
- Zellen wachsen , so dass ein T-150 - Gewebekulturkolben 45-75 x 10 6 Zellen pro Kolben enthält , so dass Kolben vollständige Zellhaftung und 85-95% Zellkonfluenz durch die folgenden Tag erhält. Untersuchen Zellen unter dem Mikroskop für die gewünschte confluparenz.
Hinweis: Hochzelldichte wird in der Regel eine optimale Proteinexpression mit minimaler Zytotoxizität ergeben empfohlen, wenn es um kommerzielle Transfektionsreagentien jedoch über Konfluenz unter Verwendung von Nebenprodukten in Akkumulation von zellulären Abfällen führen kann und die Lebensfähigkeit der Zellen zu reduzieren. - Am Tag der Transfektion vorbereiten Liposomen und DNA-Gemisch gemäß den Empfehlungen des Herstellers und DNA-Zellen mit einer DNA-Zusammensetzung von 1 transfizieren: 1: 2 von HA: NA: Gag mit einer Gesamt-DNA-Menge von 40 ug pro T-150-Kolben. Verdünnte DNA und Liposomen-Lösungen in serumfreiem Transfektionsmedium ohne Antibiotika, so dass jeder Kolben mit einem Gesamtvolumen von 20 bis 30 ml enthält.
Hinweis: Verhältnis der Genkonstrukte können Benutzer Optimierung erfordern. 1-Verhältnis: Obwohl hier nicht gezeigt, eine ähnliche Transfektionsverfahren mit Respiratory Syncytial Virus (RSV) F und HIV Gag wurde bei einer 1 durchgeführt. Für DENV und CHIKV einzelnen Expressionsplasmide, insgesamt 20 & mgr; g DNA pro T-150-Kolben werden für optimale e verwendetxpression. DNA: Transfektionsreagenz Verhältnisse sind Anwender optimiert. Verwendung empfohlen Transfektionsmedium basierend auf Transfektionsverfahren, dh polykationischen Lipids Transfektionen Reduktion oder Abwesenheit von fötalem Rinderserum empfehlen daher mit Wachstumshormonen und Spurenelemente ergänzt werden können Medien Wachstum in Abwesenheit von Serum zu unterstützen. - Rückkolben auf 37 ° C mit 5% CO 2 -Inkubator. Bei einem Volumen von 200 ml, verwenden 9 T-150 Flaschen. Die Zellen werden in der Transfektion Kulturmedium bis zum Tag der VLP Ernte gehalten.
- Ernte-Kulturüberstand von Zellen nach 72-96 Stunden nach der Transfektion auf Antigen-abhängig, oder wenn die Lebensfähigkeit der Zellen wurde auf 70-80% verringert, wie durch mikroskopische Untersuchung geschätzt. Übertragungsüberstand in 50 ml konische Röhrchen und spin die Zellen nach unten bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C um Zelltrümmer zu pelletieren.
Hinweis: Ersatz von 3 Tage Überstand mit frischem vorgewärmten, Serum-freien Transfektionsmedien zu adhärenten Zellen werden yielda zweite Menge von VLPs mit ähnlichen oder leicht verminderte Ausbeute und sollten durch Anwender optimiert werden. - Pool Überstand und filtriert durch ein 0,22 um Porenmembran vor der Sedimentation mittels Ultrazentrifugation.
- Testen Sie die Hämagglutinationsaktivität der HA-exprimierenden VLPs durch Standard Hämagglutinationsassay 14 0,8% Pute oder roten Blutkörperchen von Säugetieren oder gehen Sie mit Antigen-spezifischen ELISA. Siehe Abbildung 2 für repräsentative Ergebnisse.
2. CHIK VLP Expression unter Verwendung von Baculovirus / Insektenzellen-System
- Generieren rekombinanten Baculovirus exprimiert Chikungunya-Virus-Kapsid und Hüllproteine (C-E3-E2-6K-E1) von S-27-Stamm Kommerzielle Baculovirusexpressionssystems verwenden.
- Kultur Spodoptera frugiperda Sf9 - Zellen in serumfreiem Sf9 Wachstumsmedium mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin bei 28 ° C. Verwenden Sie 3-5 x 10 5 c / ml Rührflasche Kulturen für suspens zu initiierenIonen-Zellwachstum. Passage routinemäßig , wenn sie erreichen Zelldichten von 2-4 x 10 6 c / ml (alle 3-4 Tage).
- Kultur Sf9-Zellen in Suspension in Spinnerflaschen mit auf einem Mehr Rührerplatte System bei 130 Umdrehungen pro Minute gerührt. Für eine ordnungsgemäße Belüftung Kulturvolumina bei nicht mehr als die Hälfte des Volumens des Rührflasche halten.
- Zur Expression von VLPs CHIK, Sf9 Zellen bei einer Dichte von 2 x 10 6 Zellen / ml mit rekombinantem Baculovirus mit einer Multiplizität der Infektion von 1 und zurück auf 28 ° C Inkubator infizieren. Typischerweise infizieren ein oder zwei Spinnerflaschen mit 250 ml Sf9-Zellen.
Hinweis: Während wir diese Methode nicht verwenden, können Sf9-Zellen bei 28 ° C in Schüttelkolben kultiviert werden, einen Shaker-Plattform. - Ernte Kulturen nach 72-96 h nach der Infektion, oder wenn die Lebensfähigkeit der Zellen auf 70-80% verringert hat, wie durch Trypanblau-Ausschluss bestimmt nach dem Protokoll des Herstellers.
Anmerkung: Die Zellen fortzusetzen, während infizierte zu proliferieren, und es gibta ~ 80% Lebensfähigkeit in Sf9 Kulturen mit rekombinanten CHIK VLP Baculovirus infiziert bei 3 Tage nach der Infektion (dpi). Baculovirus-infizierte Zellen sind größer in Erscheinung. Morphologie kann auch von rund bis länglich ändern. In der späten Stadien der Baculovirus-Infektion begannen die Zellen zu lysieren. - Transfer Kulturen direkt aus Suspensionskultur in 50 ml konische Röhrchen und die Zellen des Abschaltens bei 500 × g für 5 Minuten bei 4 ° C.
- Sammeln Sie Stände und filtriert durch ein 0,22 um Porenmembran vor der Sedimentation über Ultrazentrifugation.
3. Sedimentation / Reinigung von VLP / SVP
- Sterilisieren 25 mm x 89 mm nach oben offenen Ultrazentrifuge Rohre mit 70% Ethanol in Biosicherheit Kapuze. Stellen Sie sicher, das Ethanol vor dem Gebrauch durchgetrocknet ist.
- Legen Sie bis zu 32 ml Überstand in ein sauberes Röhrchen. Ein minimales Volumen von 25 ml wird empfohlen, von nicht ausreichend gefüllt Ultrazentrifugenröhrchen Kollaps und Schäden zu vermeiden.
- Sorgfältig unterlegen Stände Witzh sterile 3 ml 20% Glycerin in PBS (v / v). Stellen Sie sicher, Rohre ausgeglichen sind.
- Spin bei 135.000 xg für 4 h bei 4 ° C.
- Überstand entfernen, wird das Pellet gewährleisten nicht aus dem Rohr entfernen.
- Resuspendieren sedimentiert VLPs an Boden der Röhrchen mit sterilem PBS durch kräftiges Pipettieren nach oben und unten. Die Menge an PBS benötigt VLPs zu suspendieren, hängt von VLP Gesamtproteinausbeute und Downstream-Anwendungen. Typischerweise resuspendieren jedes Pellet VLP in mindestens 100 & mgr; l.
- Store Proben 4 ° C für die kurzzeitige Lagerung und -80 ° C Lagerung für die Langzeitlagerung.
4. Bestimmung Proteinausbeuten und spezifische Antigen Ausbeuten
- Bestimmen Sie den Gesamtproteingehalt Kommerzielle Proteinquantifizierung Verfahren, wie BCA-Test gemäß Herstellerprotokoll.
- Um spezifische Antigengehalt beurteilen, führen direkte Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA) durch Beschichtung serielle Verdünnungen von Standard-Antigens und 2-51; g Gesamtproteinprobe auf einem ELISA-96-Well-Platte mit flachem Boden.
- Folgen mit antigen-spezifischen Antikörpern die Anwesenheit der Antigene auf der Platte zu sondieren und konventionellen ELISA Entwicklung Substrate verwenden, um nachweisbare Absorption für Mikrotiterplatten-Lesegerät herzustellen. Siehe Abbildung 2 für repräsentative Ergebnisse von HA und ELISA - Test für eine Probe VLP-HA zum Ausdruck bringen; viele Kombinationen von HA und NA sind möglicherweise aber gibt bei der HA-NA - Kompatibilität 15 unterscheiden.
Hinweis: Antigen-spezifischen Antikörper weisen variable Affinitäten und es wird empfohlen, dass Endpunktverdünnungs-Titration von Antikörpern vor der Durchführung VLP Quantifizierung bestimmt werden. Kommerzielle Antikörper haben vorgeschlagen, Konzentrations- oder Verdünnungsbereich für die Verwendung in ELISA sowie vorgeschlagenen Protokollen.
- Folgen mit antigen-spezifischen Antikörpern die Anwesenheit der Antigene auf der Platte zu sondieren und konventionellen ELISA Entwicklung Substrate verwenden, um nachweisbare Absorption für Mikrotiterplatten-Lesegerät herzustellen. Siehe Abbildung 2 für repräsentative Ergebnisse von HA und ELISA - Test für eine Probe VLP-HA zum Ausdruck bringen; viele Kombinationen von HA und NA sind möglicherweise aber gibt bei der HA-NA - Kompatibilität 15 unterscheiden.
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Representative Results
VLP Ausbeuten waren variabel durch virale Antigen-Konstrukt-Design. In diesem Protokoll haben wir die Verwendung von Insekten- und Säugerzellen für die Produktion von VLPs SVP oder in Überstand und die Reinigung durch Ultrazentrifugation demonstriert. Vier Subtypen von DENV prM / E - Strukturgens Expressionskassetten wurden verwendet , um die Versionen von DENV SVPs zu konstruieren (wie abgegrenzte 1-4) in Tabelle 1 und zeigen einen Bereich zwischen 1,1 bis 2,6 mg Gesamtprotein in 0,6 ml Volumen. Für VLPs, die ein drei Genkonstrukte erfordern, fanden wir die optimierte DNA-Transfektion Verhältnis von 1: 1: 2 HA: NA: Gag bzw. Influenza-VLPs zu synthetisieren; Im Gegensatz dazu exprimieren multiple chikungunya viralen Proteine war ausreichend für die Erzeugung von rekombinantem Baculovirus und Säuger CHIK VLP ein einzelnes Plasmid. Zusätzlich ist ein Dual-Plasmid-Transfektionsverfahren ist auch möglich, mit Säugerzellen, die als solche mit RSV F und Gag bei einem 1 transfiziert: 1-Verhältnis und ergibt approxirungsweise 0,01 mg / ml des gesamten Zellkulturüberstand. Wie in der Tabelle 1 kann zwischen 0,008-0,016 mg Gesamtprotein / ml Überstand Volumen, während die Produktion durch Säugetier - 293T erhält man eine 10-fache Reduktion von Protein aus Sf9 Zellen SVP Ausbeute CHIK gezeigt liegen. Zwischen den beiden Versionen von H3N2 VLPs mit verschiedenen Wildtyp, in voller Länge HA Plasmide, hatte das H3N2-VLP-Probe 2 eine reduzierte Ausbeute von sowohl Gesamtprotein und spezifischen HA-Gehalt. Andere Proben VLP HA Mengen sind in den 2 und 3 gezeigt und zeigen , wie HA und ELISA verwendet Oberfläche Inhalte auf den VLPs abzuschätzen. Wie bei einem herkömmlichen Verfahren direkten ELISA wird eine Standardkurve erzeugt H3 VLPs auf eine ELISA-Platte geladen unter Verwendung von bekannten Konzentrationen eines rekombinanten HA zu vergleichen ELISA-Reaktivität abzutasten. ELISA oder ähnliche Immunoassay werden zur Quantifizierung von VLPs empfohlen, die leicht verfügbar monoklonalen Antikörpern mit bekannter Kreuzreaktivität zu einer gut konservierten EPIT habenopes, aber möglicherweise nicht für alle Antigene zur Verfügung stehen. RSV F ist gut charakterisierten, daher ein ELISA monoklonalen anti-RSV-F-Antikörpers ist auch anwendbar für die Quantifizierung der Oberfläche F auf pelle RSV F VLPs. Zusätzlich zu Antigen Funktionalität und Antigenerkennung durch spezifische Antikörper, VLP Präparationen strukturell werden kann durch Elektronenmikroskopie bewertet. 4 ist ein repräsentatives Bild zeigen , daß HA (Gag-core) influenza VLPs sind erfolgreich exprimiert, zusammengesetzt, und gereinigt , wie VLPs.
| Beschreibung | Kultur Vol (ml) | Ernte ein | Volle Lautstärke | Total Protein Ausbeute (mg) | Ausbeute (mg) / Vol (ml) | Spezifische Antigengehalt |
| DENV1 SVP | 293T186 | 4 d | 0,6 ml | 1,115 | 0,006 | nd |
| DENV2 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 ml | 2.5 | 0,0134 | nd |
| DENV3 SVP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 ml | 1,536 | 0,0083 | nd |
| DENV4 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 ml | 2,613 | 0,014 | nd |
| CHIK VLP | Sf9 / 186 | 3 dpi | 0,6 ml | 1,503 | 0,0081 | nd |
| CHIK VLP | Sf9 / 500 | 4 dpi | 2,0 ml | 8,276 | 0,0166 | nd |
| CHIK VLP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 ml | 0,296 | 0,0016 | nd |
| H3N2 VLP 1 | 293T /216 | 3 d | 0,6 ml | 1,25 | 0,0058 | 1,9 ug HA / ul |
| H3N2 VLP 2 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 0,956 | 0,0044 | 0,96 & mgr; g HA / ul |
| H3N2 VLP 3 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 1.6 | 0,0074 | 1,2 ug HA / ul |
| H3N2 VLP 4 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 1,54 | 0,0071 | 0,98 ug HA / ul |
| RSV-F-VLP | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 2.3 | 0,0106 | 0,15 & mgr; g RSV F / ul |
| a d = Tage nach der Transfektion dpi = Tage nach der Infektion | ||||||
Tabelle 1: subviraler und v irus artige Partikel Ausbeuten durch Konstrukt. Repräsentative Daten von VLP Volumen, Gesamtproteinausbeute (durch herkömmliche BCA - Test bestimmt) oder spezifische Antigengehalt (bestimmt durch ELISA) wird unter einer Vielzahl von SVP / VLP - Konstrukte gezeigt. Die Renditen sind variabel aufgrund der Differenz in SVP / VLP Montage und Zelltyp und maximale Erträge können Benutzer Optimierung erfordern. Die verschiedenen Versionen von entweder DENV1-4 basierend auf Serotyp unterscheiden, während die CHIK VLPs die gleiche Reihenfolge verwenden, aber Präparate unterscheiden sich in entweder Volumen oder Zellkultur Typ. Die verschiedenen Versionen von H3N2 VLPs (1-4) ausdrücken vier einzigartige HA-Sequenzen, die ein HA-spezifischen ELISA reaktive Epitop teilen und wurden mit dem gleichen NA und gag Kern coexprimiert. Die RSV F VLP, das aus einem Dual-Plasmid-Transfektion von RSV F und Gag erzeugt wird, wurde synthetisiert und RSV F-Gehalt wurde unter Verwendung von RSV F-spezifischen ELISA-Assay approximiert.
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Abb . 1: Approach - VLP Design, die Synthese und Reinigung Schematische Darstellung von Plasmid - Gen - Designs für die Expression viraler Strukturproteine , die VLPs bilden: (A) Co-Expression von mehreren Strukturproteinen durch Cotransfektion von drei Plasmiden in 293T - Zellen , (B) Expression der Strukturproteine von einem einzelnen Gen - Kassette in einem einzigen Plasmid in 293T - Zellen codiert, und (C) rekombinanten Baculovirus Codierungs CHIK Strukturproteine verwendet , Sf9 - Zellen, die in Spinnerflaschen zu infizieren hoher Dichte das Zellwachstum in Suspension zu fördern , . Die VLPs werden aus den Zellkulturmedien geerntet, von Zelltrümmern geklärt und aus Nicht-Partikel über Sedimentation durch Ultrazentrifugation auf einem Kissen 20% Glycerin abgetrennt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. Abbildung 2: Beispiel Hämagglutinationstest von H3 VLPs Ein herkömmlicher Hämagglutination - Assay wurde an einer repräsentativen Probe des H3N2 VLP und seine entsprechende geklärte Überstand durchgeführt wird ; H3N2 HA-Assay durchgeführt werden kann, 0,8% Türkischrotöl Blutkörperchen oder Meerschweinchen roten Blutzellen (nicht gezeigt) verwendet wird. Gesamtproteingehalt wird mit dem Standard-BCA-Test auf dem gereinigten VLP geschätzt und wurde nicht für geklärte Überstand durchgeführt oder empfohlen. ELISA wurde auf dem gereinigten VLP durchgeführt und HA - Gehalt wurde eine rekombinante HA - Standard bekannter Konzentration geschätzt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Ex reichlich H3 ELISA zur Quantifizierung von H3 - Gehalt in H3 VLPs. Ein ELISA - Platte wurde mit Reihenverdünnungen eines rekombinanten HA - Standard bekannter Konzentration und verdünnt H3N2 VLP Proben aus verschiedenen HA - Sequenzen (Proben 1-9) erzeugt beschichtet. Korrelieren der Konzentration (ug / ul) des Standards an die optischen Dichtewerte bei 492 nm erhalten (OD) sind Konzentrationen, die durch den x-Wert abzuleiten, der den linearen Teil der Standardkurve schneidet. Verdünnungen von rekombinanten HA-Standard und unbekannten Proben wurden in zweifacher Ausfertigung in Vertiefungen A & B oder C & D bzw. geladen. Die endgültige Konzentration der VLP - Probe durch Multiplikation der Konzentration mit dem Verdünnungsfaktor des VLP Probe bestimmt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 4: Elektronenmikroskopie von HA-VLPs mit Gag-Core Repräsentative elektronenmikroskopische Aufnahme von gereinigtem Influenza - HA - VLPs.. VLPs montieren zu kugelförmigen Teilchen mit HA beschichtet. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir haben die Techniken, die oben beschrieben erfolgreich verwendet, um auszudrücken und zu reinigen, SVP und VLPs aus mehreren Strukturproteine für verschiedene Krankheitserreger. In der Regel verwenden wir Säugetier-Expressionssysteme unserer VLPs zu erzeugen. in unseren Händen, abgeleitet Säugetier-Zelle jedoch CHIK VLP Ausbeuten waren gering. CHIK VLP Ausbeute war robuster, wenn ein rekombinantes Baculovirus-Insektenzellsystem. Im allgemeinen Baculovirus-Insektenzellsysteme, ergeben höhere Mengen an rekombinanten Proteinen, die von den höheren Zelldichten führen kann, die in Spinnerflaschen im Vergleich zu Gewebekulturflaschen, und auch aufgrund der hohen Grad der Expression von Fremdgenen, während unter der Kontrolle kultiviert werden können jedoch des Baculovirus - Polyhedrin - Promotors. 16 ist ein Nachteil der Verwendung von Baculovirus ist die Anwesenheit von Baculovirus in VLP Zubereitungen, die Adjuvans - Aktivität hat und skew immunologische Ergebnisse in Impfstoffstudien 17 Wir fanden auch die Variabilität der Ausbeute von Influenza VLPs in Abhängigkeit von den HA- und NA-Kombinationen verwendet werden; H3N2 VLP2 hatten relativ Ausbeute reduziert im Vergleich zu H3N2 VLP1 möglicherweise aufgrund weniger effizient VLP Montage oder NA-compatibility 15 und bleibt weiter untersucht werden. Optimierung der DNA-Konstrukte und Transfektion Verhältnisse bleiben wichtige Schritte für eine optimale VLP Ausbeuten zu gewährleisten. Wir entschieden uns ein Säugetier-Vektor pTR600 konsequent bei unseren Säugetierbasierten VLPs zu verwenden, da die Expression im Allgemeinen effizient und Subklonierung ist bequem mit mehreren Restriktionsenzymen. Die Verhältnisse der Plasmide können für Anforderungen des Benutzers angepasst werden VLP Ausbeuten zu verbessern. Wie jedoch erwähnt, bleiben die jeweiligen Einschränkungen der Säugetier-VLP-Produktion mit Kosten für die Transfektion und die Fähigkeit, das Zellwachstum in den Flaschen Kultur aktuellen Gewebe. Obwohl es nicht in diesem Protokoll durchgeführt wird , haben wir in transfizierten Zellen weitere erfolgreiche Produktion von VLPs beobachtet , wenn Medien mit frischem Wachstumsmedium (zB OptiMEM) nach den Tannen aufgefüllt wirdt 72 Stunden Ernte und anschließende Sammlung von VLPs nach weiteren 72 Stunden, obwohl Ausbeuten können geringfügig im Vergleich zu der ersten Sammlung von VLPs reduziert werden.
Wir zeigen ein Verfahren für Kulturen in entweder Insekten- oder Säugerzelle viralen Strukturproteine exprimieren VLPs in dem Überstand freizugeben für halb Reinigung durch Ultrazentrifugation. Die SVP / VLPs sind im allgemeinen stabil für den Einsatz in Antigen - Immunoassays und Impfung Studien und weniger Sicherheit Bedrohungen darstellen , im Vergleich Viruspartikel zu leben, vor allem für ausgewählte Agenten oder hoch Erreger der Aviären Influenza (HPAI) Stämme 8,18, das Biosafety Level erfordern 3 (BSL-3) Laborbedingungen 19. VLP Herstellung ist relativ einfach und häufig ergibt Teilchen, die von Antikörpern erkannt werden können gegen natives viralen Strukturproteine hervorgerufen, nicht ausschließlich denaturierten lineare Epitope. VLPs dienen als nützliche Plattform für spezifische Immunreaktionen gegen das Antigen hervorzurufen und kannein vielversprechender Kandidat in der Impfstoffentwicklung sein.
Dieses Protokoll zeigt, zwei Ansätze für die virale Gene in Säugetiersystem transfizieren. In dieser Darstellung sind zwei Influenza-Gene HA und NA werden co-transfiziert mit dem HIV-Gag ein VLP zu erzeugen, das ein Gag inneren Kern aufweist, wobei HA und NA auf der Oberfläche zusammengesetzt. Die Substitution von Gag anstelle von Influenza Matrix 1 (M1) veranschaulicht die Flexibilität des Gag-basierten VLPs mit nicht verwandten viralen Glykoproteine, wie RSV F und möglicherweise andere. Alternativ verwendet die Synthese von CHIKV eine strukturelle Genkassette, die die notwendigen Komponenten für die SVP Selbstmontage, mit CHIKV E Proteinen präsentiert auf der Oberfläche eines Zentrums, bestehend aus C-Protein exprimiert. Diese beiden Ansätze zeigen die Flexibilität der VLP-Synthese, die minimale strukturelle Virusproteine erfordert aus transfizierten Zellen zu montieren.
Schließlich, während präsentierten wir allgemeine Protokolle und Vertreter Results für die Expression und Reinigung von H3N2, RSV, DENV und CHIKV sind diese Verfahren leicht zugänglich für die Erzeugung von VLPs anderer viraler Proteine verwenden. Diese Verfahren wurden von unserer Gruppe in der Erzeugung von anderen Subtypen des Influenzavirus einschließlich H1, H5 und H7-Viren erfolgreich eingesetzt. Darüber hinaus ist die einzige Plasmid, prM / E Entwurf für die Erzeugung von DENV SVP verwendet wird, kann zur Erzeugung von SVP für andere Mitglieder der Flavivirus-Familie angepasst werden, dass West-Nil und Japanische Enzephalitis-Viren enthalten. Auf ähnliche Weise können Methoden der CHIK VLP Produktion für andere Mitglieder der Familie Togaviridae verwendet werden, einschließlich der venezolanischen, Ost- und West-Pferde-Enzephalitis-Viren.
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Disclosures
Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir wünschen den Stand der Mitglieder des Ross-Labor zu erkennen, die das Protokoll für maximale Effizienz und die Erträge zu optimieren geholfen haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 ml) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
References
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