Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

अभिव्यक्ति और टीकाकरण के लिए वायरस कणों की तरह की शुद्धि

Published: June 2, 2016 doi: 10.3791/54041
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Vaccines and Immunology, Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia

Summary

यहाँ, हम वायरस की तरह या तो baculovirus या स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणालियों, और ultracentrifugation शुद्धि का उपयोग कर कणों synthesizing के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। यह उच्च अनुकूलन दृष्टिकोण एक सुरक्षित और लचीले तरीके से वैक्सीन लक्ष्य के रूप में वायरल एंटीजन की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है।

Abstract

वायरस की तरह कणों (VLPs) और subviral कणों (SVPs) वायरल वैक्सीन डिजाइन है कि लाइव रोगजनकों के उपयोग में वृद्धि हुई जैव सुरक्षा और स्थिरता का लाभ प्रदान करता है के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण हैं। गैर संक्रामक और स्व-संयोजन, VLPs लाइव रोगजनकों या प्रतिजन प्रसव के लिए पुनः संयोजक वायरल वैक्टर के लिए आवश्यकता को दरकिनार, immunogens के रूप में संरचनात्मक प्रोटीन पेश करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इस अनुच्छेद में, हम preclinical पशु परीक्षण में भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए VLP के डिजाइन और विकास के विभिन्न चरणों का प्रदर्शन। प्रक्रिया के बाद के चरणों में शामिल हैं: प्रतिजन खुराक के लिए प्रतिजन के चयन, चुनाव की सेल लाइन, VLPs / SVPs की शुद्धि में प्रतिजन की अभिव्यक्ति है, और मात्रा का ठहराव। हम अपने एंटीजन की अभिव्यक्ति के लिए दोनों स्तनधारी और कीट सेल लाइनों के उपयोग के प्रदर्शन और प्रदर्शन कैसे तरीके उपज में मतभेद है। प्रस्तुत कार्यप्रणाली रोगाणुओं की एक किस्म के लिए आवेदन कर सकते हैं और immunogenic एसटीआर साथ एंटीजन प्रतिस्थापन द्वारा प्राप्त किया जा सकताब्याज के उपयोगकर्ता के सूक्ष्मजीव की uctural प्रोटीन। VLPs और SVPs प्रतिजन लक्षण और सबसे अच्छा वैक्सीन उम्मीदवारों के चयन के साथ सहायता करते हैं।

Introduction

वायरस की तरह कणों (VLPs) मानव टीकाकरण के लिए एक अनुमोदित प्रौद्योगिकी रहे हैं। वास्तव में, मानव पेपिलोमा वायरस (एचपीवी) और हेपेटाइटिस Β सहित अधिक contemporarily लाइसेंस टीकों में से कुछ (HepΒ) टीके इस दृष्टिकोण को रोजगार। VLPs संरचनात्मक विधानसभा स्वयं करने में सक्षम प्रोटीन से बनते हैं। इकट्ठे कणों वायरल morphologies की नकल है, लेकिन संक्रमित या नकल क्योंकि वे वायरल जीनोम की कमी नहीं कर सकते हैं। VLPs व्यक्त की और prokaryotic और यूकेरियोटिक प्रणालियों के एक नंबर से शुद्ध किया जा सकता है। साहित्य की समीक्षा से पता चला है कि विभिन्न अभिव्यक्ति सिस्टम निम्न दरों पर कार्यरत हैं: बैक्टीरिया - 28%, खमीर - 20%, संयंत्र - 9%, कीट - 28%, और स्तनधारी - 15% 1। ध्यान से, एचपीवी एल 1 कैप्सिड प्रोटीन पर आधारित टीके खमीर (गार्डसिल) में या एक कीट सेल प्रणाली (Cervarix) 2 में उत्पादित कर रहे हैं। HepΒ टीके, Recombivax और Engerix-Β भी खमीर में उत्पादित कर रहे हैं, और HepΒ सतह प्रतिजन 3 से बना रहे हैं4।

हम स्तनधारी और कीट सेल अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग विधानसभा के लिए कई संरचनात्मक प्रोटीन की सह अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है VLPs उत्पादन करने के लिए। इन्फ्लूएंजा वायरस, श्वसन syncytial वायरस (आरएसवी), डेंगू वायरस (DENV), और चिकनगुनिया वायरस (CHIKV): हमारा काम डिजाइन, निर्माण, और मानव रोगजनकों के खिलाफ सफ़ाई VLP आधारित टीकों पर केंद्रित है। हमारे तरीके काफी लचीला कई अभिव्यक्ति plasmids से कई संरचनात्मक प्रोटीन की सह अभिव्यक्ति, या एक ही प्लाज्मिड अभिव्यक्ति (चित्रा 1) के लिए अनुमति देने के लिए कर रहे हैं। इससे पहले, हम उत्पादन और शुद्ध H5N1 VLPs मानव भ्रूण गुर्दे 293T कोशिकाओं 5,6 में इन्फ्लूएंजा hemagglutinin (हेक्टेयर), neuraminidase (एनए), और मैट्रिक्स (एम 1) एन्कोडिंग plasmids के सह अभिव्यक्ति से इकट्ठे हुए। जीन स्तनधारी कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के लिए कोडोन अनुकूलित और pTR600, एक यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति cytomegalovirus transc की शुरुआत के लिए तत्काल-जल्दी प्रमोटर प्लस Intron ए युक्त वेक्टर में क्लोन किया गयायूकेरियोटिक सम्मिलित करता है की ription और प्रतिलेखन 7 की समाप्ति के लिए गोजातीय वृद्धि हार्मोन polyadenylation संकेत। एक समान दृष्टिकोण हा, एनए (चित्रा 1 ए) और एक वैकल्पिक वायरल मैट्रिक्स प्रोटीन, एचआईवी चुप P55 के तीन-प्लाज्मिड सह अभिव्यक्ति का उपयोग करते हुए इस अध्ययन में मानव मौसमी फ्लू के उप प्रकार H3N2 VLPs की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया गया था और उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है इन्फ्लूएंजा कणों के रूप में 8 समान आकार के VLPs। फ्लू के टीके मुख्य रूप से विरोधी हा एंटीबॉडी बटोर हालांकि, इन्फ्लूएंजा neuraminidase के अलावा ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं 9 और भी उपस्थित अतिरिक्त immunogenic लक्ष्य से नवोदित VLP सक्षम करने के लिए sialidase गतिविधि मध्यस्थता करता है। आरएसवी VLPs का उत्पादन करने के लिए, हम भी एचआईवी चुप के असंबंधित कोर प्रोटोटाइप टीके कि वर्तमान विशेष रूप से आरएसवी सतह ग्लाइकोप्रोटीन के रूप में पहले से वर्णित और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 6,10 की विशेषता इसके अलावा, एचआईवी चुप का उपयोग कर VLP गठन का लचीलापन प्रदर्शित करने के लिए डिजाइन करने के लिए चयन किया। अन्य लोगपहले से पता चला है कि आरएसवी पेश ग्लाइकोप्रोटीन न्यूकासल रोग वायरस (NDV) 11, और इन्फ्लूएंजा मैट्रिक्स 12 से विभिन्न वायरल घटकों का उपयोग कर इकट्ठा किया जा सकता VLPs है। पूर्ण लंबाई सतह ग्लाइकोप्रोटीन दृश्यों मूल रचना एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) के माध्यम से कार्यात्मक रिसेप्टर बंधन और एंटीबॉडी मान्यता परख के लिए आवश्यक हो सकता है कि बनाए रखने के लिए इस अध्ययन में उपयोग किया गया।

एकल प्लाज्मिड अभिव्यक्ति सिस्टम के उपयोग के कणों को उत्पन्न करने के लिए हमारे उदाहरण DENV और CHIKV हैं। DENV के मामले में, हम एक पी आर एम / ई संरचनात्मक जीन अभिव्यक्ति कैसेट 13 से युक्त एक भी प्लाज्मिड से 293T कोशिकाओं में कोई कैप्सिड साथ subviral कणों (SVPs) का उत्पादन कर सकते हैं। अवधि एस वी पी वायरल संरचनात्मक प्रोटीन की विधानसभा में एक कोर या कैप्सिड प्रोटीन की कमी को निरूपित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। , या मैं में CHIK VLPs भी एक CHIKV संरचनात्मक जीन कैसेट, एन्कोडिंग capsid और लिफाफा प्रोटीन युक्त एक भी प्लाज्मिड का उपयोग कर उत्पादन किया जा सकताएक ही संरचनात्मक जीन कैसेट कीट सेल अभिव्यक्ति (- सी चित्रा 1 बी) के लिए अनुकूलित एन्कोडिंग एक पुनः संयोजक baculovirus साथ संक्रमण से nsect कोशिकाओं।

अभिव्यक्ति के ऊपर चर्चा के दृष्टिकोण के अंत परिणाम सेल संस्कृति के माध्यम से तो एक 20% ग्लिसरॉल तकिया के माध्यम से ultracentrifugation के माध्यम से शुद्ध किया जा सकता है कि में VLPs की रिहाई है। इस रिपोर्ट में, हम तरीकों को पेश व्यक्त करने और स्तनधारी और कीट सेल प्रणाली से इन VLPs शुद्ध करने के लिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इन्फ्लुएंजा H3N2 VLP की पीढ़ी के लिए 1. स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली

  1. Subclone वायरल संरचनात्मक ग्लाइकोप्रोटीन hemagglutinin (हेक्टेयर), neuraminidase (एनए), और मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) चुप P55 ऐसे में पहले से वर्णित pTR600 के रूप में यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति वैक्टर, में। 7
  2. रासायनिक सक्षम कोलाई (जैसे, DH5α) में डीएनए बढ़ाना और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक प्लाज्मिड शुद्धि किट का उपयोग अभिकर्मक ग्रेड प्लाज्मिड अलग। डीएनए की मात्रा उपज और उपयोगकर्ता की जरूरतों पर निर्भर है।
  3. स्तनधारी सेल लाइन, 293T, विकास एक humidified इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण-गोजातीय सीरम (FBS) युक्त मीडिया में बनाए रखना।
  4. कोशिकाओं को विकसित ऐसी है कि एक टी-150 टिशू कल्चर कुप्पी फ्लास्क प्रति 45-75 x 10 6 कोशिकाओं है कि इस तरह कुप्पी पूरा सेल पालन और अगले दिन से 85-95% सेल confluency प्राप्त होता है। वांछित conflu के लिए खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षणency।
    नोट: उच्च घनत्व सेल में आम तौर पर कम से कम cytotoxicity के साथ इष्टतम प्रोटीन अभिव्यक्ति की उपज के लिए जब वाणिज्यिक अभिकर्मक अभिकर्मकों का उपयोग हालांकि ओवर-confluency द्वारा उत्पादों सेलुलर अपशिष्ट के संचय में परिणाम और सेल व्यवहार्यता कम कर सकते हैं सिफारिश की है।
  5. टी-150 फ्लास्क प्रति 40 माइक्रोग्राम की कुल मात्रा के साथ डीएनए चुप: 1:: 2 हेक्टेयर की: NA अभिकर्मक के दिन, 1 की डीएनए संरचना के साथ निर्माता की सिफारिशों के अनुसार liposome और डीएनए मिश्रण तैयार करने और transfect डीएनए कोशिकाओं। एंटीबायोटिक दवाओं के बिना सीरम मुक्त अभिकर्मक मीडिया में डीएनए और liposome समाधान पतला ऐसी है कि प्रत्येक फ्लास्क 20-30 मिलीलीटर की कुल मात्रा में शामिल है।
    नोट: जीन निर्माणों के अनुपात उपयोगकर्ता अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। : 1 के अनुपात हालांकि यहां प्रदर्शन नहीं, एक समान अभिकर्मक प्रक्रिया एक 1 श्वसन syncytial वायरस (आरएसवी) एफ और एचआईवी चुप के साथ प्रदर्शन किया गया है। DENV और CHIKV एकल अभिव्यक्ति plasmids, 20 माइक्रोग्राम प्रति टी-150 कुप्पी डीएनए की की कुल के लिए इष्टतम ई के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंहै xpression। डीएनए: अभिकर्मक अभिकर्मक अनुपातों उपयोगकर्ता अनुकूलित कर रहे हैं। उपयोग की सिफारिश की अभिकर्मक अभिकर्मक मध्यम विधि के आधार पर यानी, polycationic लिपिड transfections कमी या भ्रूण गोजातीय सीरम के अभाव इस प्रकार मीडिया वृद्धि हार्मोन के साथ पूरक हो सकता है सलाह देते हैं और तत्वों सीरम के अभाव में विकास का समर्थन करने का पता लगा।
  6. साथ 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस तक बोतल लौटें। 200 मिलीलीटर की एक मात्रा के लिए, 9 टी 150 बोतल का उपयोग करें। कोशिकाओं VLP फसल के दिन तक अभिकर्मक संस्कृति के माध्यम में रखा जाता है।
  7. बाद 72-96 घंटे बाद अभिकर्मक प्रतिजन पर निर्भर करता है, या के रूप में सूक्ष्म निरीक्षण से अनुमान लगाया सेल व्यवहार्यता, 70-80% की कमी आई है जब कोशिकाओं से फसल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला। 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और कोशिकाओं नीचे में 500 × छ 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेलुलर मलबे गोली स्पिन।
    नोट: पक्षपाती कोशिकाओं yiel जाएगा करने के लिए नए सिरे से पूर्व गर्म, सीरम मुक्त अभिकर्मक मीडिया के साथ 3 दिन तैरनेवाला की रिप्लेसमेंटसमान या थोड़ा कम उपज और साथ VLPs के दा दूसरे बहुत उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  8. पूल तैरनेवाला और ultracentrifugation के माध्यम से अवसादन से पहले एक 0.22 माइक्रोन ताकना झिल्ली के माध्यम से फिल्टर।
  9. मानक hemagglutination परख 14 से हा व्यक्त VLPs 0.8% तुर्की या स्तनधारी लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग करने का hemagglutination गतिविधि टेस्ट या विशिष्ट प्रतिजन एलिसा के साथ आगे बढ़ें। प्रतिनिधि परिणाम के लिए चित्र 2 देखें।

2. CHIK VLP अभिव्यक्ति baculovirus / कीट सेल प्रणाली का उपयोग करते हुए

  1. से एस -27 तनाव चिकनगुनिया वायरस capsid और लिफाफा प्रोटीन (सी-E3-E2-6K-E1) व्यक्त एक वाणिज्यिक baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करते हुए पुनः संयोजक baculovirus उत्पन्न करता है।
  2. 28 डिग्री सेल्सियस पर 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ सीरम मुक्त Sf9 मध्यम विकास में संस्कृति स्पोडोप्टेरा frugiperda Sf9 कोशिकाओं। सस्पेंस के लिए स्पिनर कुप्पी संस्कृतियों आरंभ करने के लिए 3-5 x 10 5 ग / एमएल का प्रयोग करेंआयन सेल के विकास। पैसेज नियमित तौर पर जब वे 2-4 एक्स 10 6 सी / एमएल (हर 3-4 दिन) के सेल घनत्व तक पहुँचने।
  3. संस्कृति Sf9 एक बहु दोषी प्लेट सिस्टम पर 130 rpm पर सरगर्मी के साथ स्पिनर बोतल में निलंबन में कोशिकाओं। उचित वेंटिलेशन के लिए, नहीं आधे से अधिक स्पिनर कुप्पी की मात्रा में संस्कृति की मात्रा बनाए रखने के लिए।
  4. CHIK VLPs की अभिव्यक्ति के लिए, 1 के संक्रमण की बहुलता पर पुनः संयोजक baculovirus के साथ 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर Sf9 कोशिकाओं को संक्रमित और 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लौटने। आमतौर पर, एक या दो स्पिनर बोतल, 250 मिलीलीटर Sf9 कोशिकाओं से युक्त संक्रमित।
    नोट: हम इस विधि का उपयोग नहीं करते हैं, Sf9 कोशिकाओं सुसंस्कृत प्रकार के बरतन बोतल में 28 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन मंच का उपयोग हो सकता है।
  5. हार्वेस्ट संस्कृतियों 72-96 घंटा के बाद संक्रमण के बाद, या के रूप में trypan नीले अपवर्जन द्वारा निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार चुना गया है जब सेल व्यवहार्यता 70-80% की कमी आई है।
    नोट: कोशिकाओं जबकि संक्रमित पैदा जारी है और वहाँ है3 दिन के बाद संक्रमण (डीपीआई) पर पुनः संयोजक CHIK VLP baculovirus से संक्रमित Sf9 संस्कृतियों में एक ~ 80% व्यवहार्यता। Baculovirus संक्रमित कोशिकाओं उपस्थिति में बड़े होते हैं। आकृति विज्ञान भी आयताकार के दौर से बदल सकता है। baculovirus संक्रमण की देर चरणों में, कोशिकाओं lyse करने लगे।
  6. निलंबन संस्कृति से सीधे 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर नीचे कोशिकाओं स्पिन स्थानांतरण संस्कृतियों।
  7. supernatants लीजिए और ultracentrifugation के माध्यम से अवसादन से पहले एक 0.22 माइक्रोन ताकना झिल्ली के माध्यम से फिल्टर।

3. अवसादन / VLP / SVPs की शुद्धि

  1. जैव सुरक्षा हुड में 70% इथेनॉल के साथ 25 मिमी x 89 मिमी खुले टॉप ultracentrifuge ट्यूबों जीवाणुरहित। सुनिश्चित करें इथेनॉल उपयोग करने से पहले बंद सूख गया है।
  2. एक साफ ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला के 32 मिलीलीटर तक लोड। 25 मिलीलीटर की एक न्यूनतम मात्रा पतन और अपर्याप्त भरा ultracentrifuge ट्यूबों के नुकसान को रोकने के लिए सिफारिश की है।
  3. ध्यान से supernatants बुद्धि बुनियादपीबीएस में ज बाँझ 3 मिलीग्राम 20% ग्लिसरॉल (वी / वी)। यकीन नलियों संतुलित हों।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए 135,000 XG पर स्पिन।
  5. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला, गोली सुनिश्चित ट्यूब से हटाना नहीं है।
  6. Resuspend सख्ती ऊपर और नीचे pipetting द्वारा बाँझ पीबीएस के साथ ट्यूब के नीचे VLPs sedimented। पीबीएस की राशि VLPs VLP कुल प्रोटीन उपज और बहाव के अनुप्रयोगों पर निर्भर करता है resuspend की जरूरत है। आमतौर पर, कम से कम 100 μl में प्रत्येक VLP गोली resuspend।
  7. स्टोर के नमूने लंबी अवधि के भंडारण के लिए अल्पकालिक भंडारण और -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।

4. प्रोटीन पैदावार और विशिष्ट एंटीजन पैदावार का निर्धारण

  1. इस तरह के निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार बीसीए परख के रूप में एक वाणिज्यिक प्रोटीन मात्रा का ठहराव विधि का उपयोग करते हुए कुल प्रोटीन सामग्री का निर्धारण।
  2. विशिष्ट प्रतिजन सामग्री का आकलन करने के लिए, कोटिंग मानक प्रतिजन और 2-5 के धारावाहिक dilutions द्वारा प्रत्यक्ष एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) प्रदर्शन1; एक एलिसा 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे की थाली पर कुल प्रोटीन के नमूने के जी।
    1. थाली पर एंटीजन की उपस्थिति की जांच और पारंपरिक एलिसा विकास substrates का उपयोग microplate पाठक के लिए पहचाने जाने absorbance का उत्पादन करने के लिए विशिष्ट प्रतिजन एंटीबॉडी के साथ पालन करें। एक नमूना हा व्यक्त VLP के लिए हा और एलिसा परख के प्रतिनिधि परिणाम के लिए चित्र 2 देखें; हा और एनए के कई संयोजन संभवतः हैं, लेकिन पैदावार हा-NA अनुकूलता 15 पर भिन्न हो सकती है।
      नोट: विशिष्ट प्रतिजन एंटीबॉडी चर समानताएं हैं और यह सिफारिश की है कि एंटीबॉडी का समापन बिंदु-कमजोर पड़ने अनुमापन VLP मात्रा का ठहराव के प्रदर्शन से पहले निर्धारित किया। वाणिज्यिक एंटीबॉडी एलिसा में उपयोग के लिए सुझाव एकाग्रता या कमजोर पड़ने पर्वतमाला, के साथ ही सुझाव दिया प्रोटोकॉल होगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

VLP पैदावार वायरल प्रतिजन निर्माण डिजाइन द्वारा चर रहे थे। इस प्रोटोकॉल में, हम ultracentrifugation द्वारा सतह पर तैरनेवाला में एसवीपी या VLPs के उत्पादन और शोधन के लिए कीट और स्तनधारी कोशिकाओं के उपयोग का प्रदर्शन किया है। DENV पी आर एम / ई संरचनात्मक जीन अभिव्यक्ति कैसेट के चार उपप्रकार तालिका 1 में DENV SVPs (1-4 के रूप में सीमांकन) के संस्करणों का निर्माण और 0.6 मिलीलीटर मात्रा में कुल प्रोटीन की 1.1-2.6 मिलीग्राम के बीच एक सीमा प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। 1: 2 हेक्टेयर के लिए: VLPs कि एक तीन जीन निर्माणों की आवश्यकता के लिए, हम 1 के अनुकूलित डीएनए अभिकर्मक अनुपात पाया NA: चुप क्रमश इन्फ्लूएंजा VLPs के संश्लेषण के लिए; इसके विपरीत, एक एकल प्लाज्मिड कई चिकनगुनिया वायरल प्रोटीन व्यक्त पुनः संयोजक baculovirus और स्तनधारी CHIK VLP की पीढ़ी के लिए पर्याप्त था। इसके अतिरिक्त, एक दोहरे प्लाज्मिड अभिकर्मक प्रक्रिया भी आरएसवी एफ और झूठ के साथ इस तरह के रूप में स्तनधारी कोशिकाओं, एक 1 पर ट्रांसफ़ेक्ट के साथ संभव है: 1 के अनुपात, और अनुमानित पैदावारmately 0.01 मिलीग्राम / कुल सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के मिलीलीटर। जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, Sf9 कोशिकाओं से CHIK एस वी पी उपज, 0.008-.016 मिलीग्राम कुल प्रोटीन / सतह पर तैरनेवाला मात्रा मिलीलीटर के बीच लेकर कर सकते हैं, जबकि स्तनधारी 293T के माध्यम से उत्पादन प्रोटीन की एक 10 गुना कमी अर्जित करता है। विभिन्न प्रकार के जंगली, पूर्ण लंबाई हा plasmids का उपयोग कर H3N2 VLPs के दो संस्करणों के बीच, H3N2 VLP नमूना 2 दोनों कुल प्रोटीन और विशिष्ट हा सामग्री का एक कम उपज था। अन्य नमूना VLP हा मात्रा में आंकड़े 2 और 3 में दिखाया गया है और वर्णन कैसे हा और एलिसा VLPs पर सतह सामग्री अनुमान लगाने के लिए किया जाता है। एक पारंपरिक प्रत्यक्ष एलिसा विधि के साथ के रूप में, एक मानक वक्र एक पुनः संयोजक हा के ज्ञात सांद्रता का उपयोग एलिसा जेट तुलना करने के लिए नमूने के लिए H3 VLPs एक एलिसा प्लेट पर लोड उत्पन्न होता है। एलिसा या इसी तरह की प्रतिरक्षा VLPs की मात्रा का ठहराव एक अच्छी तरह से संरक्षित epit करने के लिए जाना जाता है crossreactivity के साथ आसानी से उपलब्ध मोनोक्लोनल एंटीबॉडी है के लिए सिफारिश कर रहे हैंopes, लेकिन सभी एंटीजन के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता है। आरएसवी एफ अच्छी तरह से विशेषता है, इसलिए मोनोक्लोनल विरोधी आरएसवी एफ एंटीबॉडी का उपयोग कर एक एलिसा भी pelleted आरएसवी एफ VLPs पर सतह एफ की मात्रा का ठहराव के लिए लागू है। प्रतिजन कार्यक्षमता और विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा प्रतिजन मान्यता के अलावा, VLP तैयारियों संरचनात्मक रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। चित्रा 4 एक प्रतिनिधि दिखा रहा है कि हा (चुप-कोर) इन्फ्लूएंजा VLPs सफलतापूर्वक व्यक्त कर रहे हैं इकट्ठा किया, और VLPs के रूप में शुद्ध छवि है।

विवरण संस्कृति खंड (एमएल) हार्वेस्ट एक कुल मात्रा कुल प्रोटीन उपज (एमजी) यील्ड (एमजी) / खंड (एमएल) विशिष्ट प्रतिजन सामग्री
DENV1 एसवीपी 293T186 4 डी 0.6 मीटरएल 1.115 0.006 एन डी
DENV2 एसवीपी 293T / 186 4 डी 0.6 मिलीलीटर 2.5 0.0134 एन डी
DENV3 एसवीपी 293T / 186 3 डी 0.6 मिलीलीटर 1.536 0.0083 एन डी
DENV4 एसवीपी 293T / 186 4 डी 0.6 मिलीलीटर 2.613 0.014 एन डी
CHIK VLP Sf9 / 186 3 डीपीआई 0.6 मिलीलीटर 1.503 0.0081 एन डी
CHIK VLP Sf9 / 500 4 डीपीआई 2.0 मिलीलीटर 8.276 0.0166 एन डी
CHIK VLP 293T / 186 3 डी 0.6 मिलीलीटर 0.296 0.0016 एन डी
H3N2 VLP 1 293T /216 3 डी 0.6 मिलीलीटर 1.25 0.0058 1.9 माइक्रोग्राम प्रति हेक्टेयर / μl
H3N2 VLP 2 293T / 216 3 डी 0.6 मिलीलीटर 0.956 0.0044 0.96 माइक्रोग्राम प्रति हेक्टेयर / μl
H3N2 VLP 3 293T / 216 3 डी 0.6 मिलीलीटर 1.6 0.0074 1.2 माइक्रोग्राम प्रति हेक्टेयर / μl
H3N2 VLP 4 293T / 216 3 डी 0.6 मिलीलीटर 1.54 0.0071 0.98 माइक्रोग्राम प्रति हेक्टेयर / μl
आरएसवी एफ VLP 293T / 216 3 डी 0.6 मिलीलीटर 2.3 0.0106 0.15 माइक्रोग्राम आरएसवी एफ / μl
एक डी = दिनों बाद अभिकर्मक, डीपीआई = दिनों के बाद संक्रमण

तालिका 1: Subviral और वी निर्माण से irus की तरह कण पैदावार। VLP संस्करणों के प्रतिनिधि डेटा, कुल प्रोटीन उपज (पारंपरिक बीसीए परख द्वारा निर्धारित) या विशिष्ट प्रतिजन सामग्री (एलिसा द्वारा निर्धारित) एस वी पी / VLP निर्माणों की एक किस्म के बीच में दिखाया गया है। पैदावार एस वी पी / VLP विधानसभा और सेल प्रकार में अंतर के कारण चर रहे हैं, और अधिकतम पैदावार उपयोगकर्ता अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। या तो DENV1-4 के विभिन्न संस्करणों सीरोटाइप के आधार पर अलग है, जबकि CHIK VLPs उसी क्रम उपयोग करें, लेकिन तैयारियों या तो मात्रा या सेल संस्कृति के प्रकार में मतभेद है। H3N2 VLPs (1-4) के विभिन्न संस्करणों के चार अद्वितीय हा दृश्यों का हिस्सा है कि एक हा-विशिष्ट एलिसा प्रतिक्रियाशील मिलान व्यक्त करने और एक ही एनए और चुप कोर के साथ सह व्यक्त किया गया। आरएसवी एफ VLP, जो आरएसवी एफ और झूठ का एक दोहरे प्लाज्मिड अभिकर्मक से उत्पन्न होता है, संश्लेषित किया गया था और आरएसवी एफ सामग्री आरएसवी एफ विशिष्ट एलिसा परख का उपयोग अनुमानित किया गया था।

.jpg "/>
चित्रा 1:। दृष्टिकोण - वायरल संरचनात्मक प्रोटीन की अभिव्यक्ति है कि VLPs बनेगी लिए प्लाज्मिड जीन डिजाइन की VLP डिजाइन, संश्लेषण, और शुद्धि योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व: (ए) 293T कोशिकाओं में तीन plasmids के सह अभिकर्मक द्वारा कई संरचनात्मक प्रोटीन की सह अभिव्यक्ति , (बी) के एक जीन कैसेट 293T कोशिकाओं में एक भी प्लाज्मिड में इनकोडिंग, और (सी) पुनः संयोजक baculovirus एन्कोडिंग CHIK संरचनात्मक प्रोटीन से संरचनात्मक प्रोटीन की अभिव्यक्ति निलंबन में उच्च घनत्व सेल के विकास को बढ़ावा देने के लिए स्पिनर बोतल में Sf9 कोशिकाओं सुसंस्कृत संक्रमित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । VLPs, सेल संस्कृति मीडिया से काटा जाता सेल मलबे के स्पष्ट किया, और एक 20% ग्लिसरॉल गद्दी पर ultracentrifugation द्वारा अवसादन के माध्यम से गैर-कणों से अलग कर दिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


। चित्रा 2: H3 VLPs का उदाहरण hemagglutination परख एक पारंपरिक hemagglutination परख H3N2 VLP और अपनी इसी स्पष्ट किया सतह पर तैरनेवाला के एक प्रतिनिधि नमूने पर प्रदर्शन किया गया था; H3N2 हा परख लाल रक्त कोशिकाओं या गिनी पिग लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग 0.8% तुर्की किया जा सकता है (नहीं दिखाया गया है)। कुल प्रोटीन सामग्री शुद्ध VLP पर मानक बीसीए परख का उपयोग कर अनुमान लगाया गया है और प्रदर्शन किया या स्पष्ट किया सतह पर तैरनेवाला के लिए सिफारिश नहीं की गई थी। एलिसा शुद्ध VLP पर प्रदर्शन किया गया था और हा सामग्री ज्ञात एकाग्रता की एक पुनः संयोजक हा मानक का उपयोग कर अनुमान लगाया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: पूर्व H3 VLPs। एक एलिसा थाली में H3 सामग्री की मात्रा का ठहराव के लिए पर्याप्त H3 एलिसा ज्ञात एकाग्रता की एक पुनः संयोजक हा मानक के धारावाहिक dilutions और पतला H3N2 VLP नमूने विभिन्न हा दृश्यों (नमूने 1-9) से उत्पन्न के साथ लेपित किया गया था। 492 एनएम (ओवर ड्राफ्ट) पर प्राप्त ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों के लिए मानक की एकाग्रता (माइक्रोग्राम / μl) correlating, सांद्रता एक्स-मूल्य है कि मानक वक्र के रैखिक भाग intersects बात का अनुमान लगाना द्वारा प्राप्त कर रहे हैं। पुनः संयोजक हा मानक और अज्ञात नमूनों की dilutions कुओं ए और बी या सी और डी में क्रमश: दो प्रतियों में भरी हुई थी। VLP नमूना के अंतिम एकाग्रता VLP नमूना के कमजोर पड़ने के पहलू से एकाग्रता गुणा करके निर्धारित किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4041 / 54041fig4.jpg "/>
चित्रा 4: हा-VLPs के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी चुप-कोर का उपयोग कर शुद्ध इन्फ्लूएंजा हा VLPs के प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि।। VLPs हा के साथ लेपित गोलाकार कणों में इकट्ठा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हम ऊपर वर्णित तकनीकों का इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक व्यक्त करने और SVPs और विभिन्न रोगजनकों के लिए कई संरचनात्मक प्रोटीन से बना VLPs शुद्ध करने के लिए। सामान्य में, हम स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग हमारे VLPs उत्पन्न करते हैं। हालांकि, हमारे हाथों में, स्तनधारी सेल ली गई CHIK VLP पैदावार कम थे। CHIK VLP उपज अधिक मजबूत जब एक पुनः संयोजक baculovirus-कीट सेल प्रणाली का उपयोग किया गया था। सामान्य तौर पर, baculovirus-कीट सेल प्रणाली है, जबकि नियंत्रण में पुनः संयोजक प्रोटीन है, जो उच्च सेल घनत्व विदेशी जीनों की अभिव्यक्ति के उच्च स्तर के लिए, और यह भी कारण है कि बनाम टिशू कल्चर बोतल स्पिनर बोतल में संवर्धित किया जा सकता से हो सकता है की उच्च मात्रा उपज 16 baculovirus polyhedrin प्रमोटर की। हालांकि, baculovirus का उपयोग करने का एक नुकसान VLP तैयारी में baculovirus की उपस्थिति है, जो सहायक गतिविधि है, और टीका में तिरछा प्रतिरक्षात्मक परिणाम अध्ययन 17 हम भी इन्फ्लूएंजा वी की उपज में परिवर्तनशीलता पाया हैइस्तेमाल किया हा और एनए संयोजन पर निर्भर करता है एलपी; H3N2 VLP2 अपेक्षाकृत कम कुशल संभावित VLP विधानसभा या NA-अनुकूलता 15 के कारण H3N2 VLP1 की तुलना में कम था उपज है, और आगे की जांच की बात है। डीएनए निर्माणों और अभिकर्मक अनुपात की अनुकूलन इष्टतम VLP पैदावार सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम रहते हैं। हम एक स्तनधारी वेक्टर pTR600 हमारे स्तनधारी आधारित VLPs के बीच लगातार उपयोग करें, क्योंकि अभिव्यक्ति आम तौर पर कुशल है और subcloning कई प्रतिबंध एंजाइमों के साथ सुविधाजनक है चुना। plasmids के अनुपात VLP पैदावार में सुधार करने के लिए उपयोगकर्ता की जरूरतों के लिए समायोजित किया जा सकता है। हालांकि, के रूप में चर्चा की, स्तनधारी VLP उत्पादन की वर्तमान सीमाओं अभिकर्मक की लागत और वर्तमान टिशू कल्चर बोतल में सेल के विकास क्षमता के साथ रहते हैं। हालांकि इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन नहीं, तो हम ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में VLPs के अतिरिक्त सफल उत्पादन मनाया है जब मीडिया एफआइआर के बाद नए सिरे से विकास मीडिया (जैसे, OptiMEM) के साथ मंगाया हैटी 72 घंटा फसल और एक अतिरिक्त 72 घंटे के बाद VLPs के बाद संग्रह है, हालांकि पैदावार थोड़ा के रूप में VLPs का पहला संग्रह की तुलना में कम किया जा सकता है।

हम या तो कीट या स्तनधारी सेल संस्कृतियों में वायरल संरचनात्मक प्रोटीन व्यक्त ultracentrifugation द्वारा अर्द्ध शुद्धि के लिए सतह पर तैरनेवाला में VLPs को रिहा करने के लिए एक प्रक्रिया का प्रदर्शन। एस वी पी / VLPs प्रतिजन immunoassays और टीकाकरण के अध्ययन में उपयोग के लिए आम तौर पर स्थिर रहे हैं और कम सुरक्षा खतरों मुद्रा के रूप में वायरल कणों, विशेष रूप से चुनिंदा एजेंट या उच्च रोगज़नक़ एवियन इन्फ्लूएंजा (HPAI) तनाव 8,18, जो जैव सुरक्षा स्तर की आवश्यकता के लिए जीने की तुलना 3 (बीएसएल 3) प्रयोगशाला परिस्थितियों 19। VLP उत्पादन अपेक्षाकृत सरल है और अक्सर कणों कि देशी वायरल संरचनात्मक प्रोटीन, नहीं विशेष रूप से विकृत रेखीय epitopes के खिलाफ हासिल एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है अर्जित करता है। VLPs प्रतिजन के लिए विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया जानने के लिए एक उपयोगी मंच के रूप में सेवा करते हैं और हो सकता हैटीके के विकास में एक होनहार उम्मीदवार हो।

इस प्रोटोकॉल स्तनधारी प्रणाली में वायरल जीन transfecting के लिए दो दृष्टिकोण को दर्शाता है। इस उदाहरण में, दो इन्फ्लूएंजा जीन, हा और एनए, एचआईवी चुप साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट हैं एक VLP एक ढकोसला आंतरिक कोर है कि, हा और एनए के साथ सतह पर इकट्ठे उत्पन्न करते हैं। के बजाय चुप इन्फ्लूएंजा मैट्रिक्स 1 (एम 1) के प्रतिस्थापन ऐसे आरएसवी एफ और संभवतः दूसरों के रूप में असंबंधित वायरल ग्लाइकोप्रोटीन, साथ चुप-आधारित VLPs के लचीलेपन को दर्शाता है। वैकल्पिक रूप से, CHIKV के संश्लेषण के एक संरचनात्मक जीन कैसेट, जो एस वी पी आत्म विधानसभा के लिए आवश्यक घटकों को व्यक्त करता है, CHIKV ई सी प्रोटीन से बना एक केंद्र की सतह पर प्रस्तुत प्रोटीन के साथ इस्तेमाल करता है। इन दो दृष्टिकोणों VLP संश्लेषण, जो ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से इकट्ठा करने के लिए कम से कम संरचनात्मक वायरल प्रोटीन की आवश्यकता के लचीलेपन का प्रदर्शन।

अंत में, जब तक हम सामान्य प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि रेसुल प्रस्तुतअभिव्यक्ति और H3N2, आरएसवी, DENV, और CHIKV की शुद्धि के लिए टीएस, इन प्रक्रियाओं के अन्य वायरल प्रोटीन का उपयोग VLPs की पीढ़ी के लिए आसानी से उत्तरदायी हैं। इन प्रक्रियाओं को सफलतापूर्वक एच 1, H5, और H7 वायरस सहित अन्य इन्फ्लूएंजा वायरस उपप्रकार की पीढ़ी में हमारे समूह द्वारा इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, एकल प्लाज्मिड, पी आर एम / ई DENV SVPs की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया डिजाइन flavivirus परिवार के अन्य सदस्यों को बताया कि पश्चिम नील नदी और जापानी इन्सेफेलाइटिस वायरस शामिल करने के लिए SVPs की पीढ़ी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसी तरह, CHIK VLP उत्पादन के तरीकों वेनेजुएला, पूर्व, पश्चिम और इक्वाइन इन्सेफेलाइटिस वायरस सहित Togaviridae परिवार के अन्य सदस्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम रॉस प्रयोगशाला है जो अधिक से अधिक दक्षता और पैदावार के लिए प्रोटोकॉल का अनुकूलन में मदद मिली है की पूर्व सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
DMEM Cellgro 10-013
Lipofectamine Life Technologies L3000075 Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I Life Technologies 31985062
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Life Technologies 10359-016
Cimarec I 6 multipoint stirrer plate ThermoFisher Scientific 50094596
Polyclear ultracentrifuge tubes Seton 7025 Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
Phosphate citrate buffer Sigma P4922
o-phenylenediamine dihydrochloride  Sigma P8287
0.22 μm vacuum filter top (500 ml) Nalgene 569-0020
Glycerol Sigma G5516
H2SO4 Sigma 339741 
Sf-900 II SFM ThermoFisher Scientific 10902-096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
  2. Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
  3. Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
  4. Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
  5. Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
  6. Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
  7. Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
  8. Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
  9. Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
  10. Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
  11. Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
  12. Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
  13. Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
  14. Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
  15. Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
  16. Jarvis, D. L. Methods in Enzymology. 463, Academic Press. 191-222 (2009).
  17. Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
  18. Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
  19. Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).

Tags

चिकित्सा अंक 112 वायरस की तरह कण subviral कण स्तनधारी अभिव्यक्ति कीट अभिव्यक्ति baculovirus वैक्सीन डिजाइन
अभिव्यक्ति और टीकाकरण के लिए वायरस कणों की तरह की शुद्धि
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross,… More

Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J. Vis. Exp. (112), e54041, doi:10.3791/54041 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter