Summary
ここでは、バキュロウイルスまたは哺乳動物発現系、および超遠心分離精製のいずれかを使用してウイルス様粒子を合成するためのプロトコルを提示します。この高度にカスタマイズ可能なアプローチは、安全かつ柔軟な方法で、ワクチン標的としてウイルス抗原を同定するために使用されます。
Abstract
ウイルス様粒子（VLP）およびサブウイルス粒子（のSVP）は、ライブ病原体の使用よりも増加した生物学的安全性と安定性の利点を提供するウイルスワクチン設計の代替的なアプローチです。非感染性および自己集合、VLPは、ライブの病原体または抗原の送達のための組換えウイルスベクターの必要性を迂回し、免疫原としての構造タンパク質を提示するために使用されます。この記事では、前臨床動物試験で将来のアプリケーションのためのVLPの設計と開発のさまざまな段階を示しています。抗原の選択、選択、VLPを/のSVPの精製、および抗原投与のための定量化の細胞株における抗原の発現：手順は、以下の段階を含んでいます。私たちは、抗原の発現のための両方の哺乳動物および昆虫細胞株の使用を実証し、方法論は収量が異なる方法を示しています。提示された方法論は、様々な病原体に適用することができるし、免疫原性STRで抗原を置換することによって達成することができます興味のあるユーザーの微生物のucturalタンパク質。 VLPおよびのSVPは最高のワクチン候補の抗原の特徴付けおよび選択を支援します。
Introduction
ウイルス様粒子（VLP）は、ヒトのワクチン接種のために承認された技術です。実際には、ヒトパピローマウイルス（HPV）を含む多くの現代的なライセンスワクチンの一部及び肝炎Β（HepΒ）ワクチンは、このアプローチを採用します。 VLPは自己集合することが可能な構造タンパク質から形成されます。組み立てられた粒子は、ウイルスの形態を模倣するが、彼らはウイルスゲノムを欠くので感染または複製することはできません。 VLPは、発現され、原核生物および真核生物系の数から精製することができます。 - 28％、酵母- 20％、植物- 9％、昆虫- 28％、および哺乳動物- 15％1細菌：文献のレビューは、異なった発現系は、以下のレートで使用されていることを明らかにしました。注目すべきは、L1カプシドタンパク質に基づくHPVワクチンは、酵母（ガーダシル）または昆虫細胞システム（サーバリックス）2で製造されます。 HepΒワクチン、RecombivaxとENGERIX-Βは、また、酵母で生産されており、HepΒ表面抗原3で構成されています、4。
我々は、アセンブリのための複数の構造タンパク質の同時発現を必要とするのVLPを産生する哺乳動物および昆虫細胞発現系を使用します。インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、デング熱ウイルス（DENV）、およびチクングニアウイルス（CHIKV）：私たちの仕事は、人間の病原体に対する設計、生産、および精製VLPに基づくワクチンに焦点を当てています。我々の方法は、複数の発現プラスミドからの複数の構造タンパク質、または単一の発現プラスミド（ 図1）の共発現を可能にするために十分に柔軟です。以前、我々は、製造および精製H5N1 VLPは、インフルエンザ赤血球凝集素（HA）、ノイラミニダーゼ（NA）、及びヒト胚性腎臓293T細胞におけるマトリックス（M1）5,6をコードするプラスミドとの共発現から組み立て。遺伝子は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化さpTR600、transcを開始するためのサイトメガロウイルス初期プロモータープラスイントロンAを含む真核細胞発現ベクターにクローニングしました。真核生物の挿入と転写7の終結のためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルのription。 HA、NA（ 図1A）および代替ウイルスマトリックスタンパク質、HIVのGag P55、の三プラスミドの同時発現を用いて同様のアプローチがこの研究にヒト季節性インフルエンザ亜型H3N2 VLPの生成に使用し、生成することが示されていますインフルエンザ粒子8と同様のサイズのVLPを。インフルエンザワクチンは、主に抗HA抗体を誘発するが、インフルエンザノイラミニダーゼの添加は、トランスフェクトされた細胞9も存在する追加の免疫原性標的から出芽VLPを可能にするためにシアリダーゼ活性を媒介します。 RSVのVLPを生成するために、我々はまた、先に説明し、電子顕微鏡6,10によって特徴付けられるように、さらに、HIVギャグを使用して、VLP形成の柔軟性を実証するために排他的にRSV表面糖タンパク質を提示原型ワクチンを設計するHIVのGagの無関係なコアを選択しました。他人以前それはRSV糖タンパク質は、ニューカッスル病ウイルス（NDV）11、およびインフルエンザマトリックス12から種々のウイルス成分を用いて組み立てることができる提示するVLPを示しています。全長表面糖タンパク質配列は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を介して機能的受容体結合および抗体認識のアッセイのために必要とすることができる天然のコンホメーションを維持するために、この研究において使用しました。
粒子を生成するために単一のプラスミド発現系を使用するための私達の例としては、DENVおよびCHIKVあります。 DENVのケースでは、我々は、PRM / E構造遺伝子発現カセット13を含む単一プラスミドからの293T細胞における無カプシドとサブウイルス粒子（のSVP）を生成することができます。用語SVPは、ウイルス構造タンパク質のアセンブリにおいて、コアまたはカプシドタンパク質の欠如を示すために使用されます。 CHIK VLPはまた、カプシドおよびエンベロープタンパク質をコードする、またはIで、CHIKV構造遺伝子カセットを含む単一プラスミドを用いて製造することができます昆虫細胞発現（ - C 図1B）のために最適化された同じ構造遺伝子カセットをコードする組換えバキュロウイルスに感染させることによってnsect細胞。
上述の式アプローチの最終結果は、その後、20％のグリセロールクッションを介して超遠心によって精製することができる細胞培養培地中にVLPを放出します。本稿では、哺乳動物および昆虫細胞系からこれらのVLPを発現し、精製する方法を提示します。
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Protocol
インフルエンザH3N2 VLPの生成1.哺乳動物発現系
- サブクローン例えば前述のpTR600のような真核生物発現ベクター内へのウイルス構造糖タンパク質ヘマグルチニン（HA）、ノイラミニダーゼ（NA）、およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）のGag P55 7
- 化学的にコンピテントな大腸菌（ 例えば 、DH5α）でDNAを増幅し当たり、製造業者の指示としてプラスミド精製キットを用いてトランスフェクショングレードのプラスミドを単離します。 DNAの量は、収率及びユーザのニーズに依存しています。
- 加湿インキュベーター中5％CO 2で37℃で10％胎児ウシ血清（FBS）を含む増殖培地中で、哺乳動物細胞株、293Tを維持します。
- T-150組織培養フラスコは、フラスコには、次の日までに完全な細胞接着と百分の85から95までの細胞集密度を取得するように、フラスコ当たり45から75×10 6個の細胞を含むように細胞を増殖させます。希望conflu用顕微鏡下で細胞を検査ency。
注：高細胞密度は、典型的には、しかしながら過剰コンフルエント副産物細胞廃棄物の蓄積をもたらし、細胞生存率を減少させることができる商業的なトランスフェクション試薬を使用した場合、最小限の細胞毒性で最適なタンパク質の発現を得るために推奨されます。 - トランスフェクションの日に、製造業者の推奨に従ってリポソームとDNAの混合物を準備し、1のDNA組成物とDNA細胞をトランスフェクション：HAの2：1 NA：T-150フラスコあたり40μgの総DNA量とギャグ。各フラスコに20〜30 mlで全容積を含むように、抗生物質を含まない無血清トランスフェクション培地中でDNAとリポソーム溶液を希釈します。
注：遺伝子構築物の比率は、ユーザーの最適化を必要とし得ます。 1比：ここで実証されていないが、同様のトランスフェクション手順は、1で呼吸器合胞体ウイルス（RSV）FとHIV GAGと行われています。 DENVとCHIKV単一の発現プラスミドを、T-150フラスコあたりのDNAの20μgの合計に最適な電子のために使用されていますXPRESSION。 DNA：トランスフェクション試薬の比をユーザに最適化されています。使用はすなわち 、トランスフェクション法に基づくトランスフェクション培地を推奨、ポリカチオン性脂質トランスフェクションは、メディアが成長ホルモンを補充し、血清の非存在下での成長をサポートするために、微量元素することができるこのようにウシ胎児血清の減少または不在をお勧めします。 - 5％CO 2インキュベーターで37℃にフラスコを返します。 200ミリリットルの容量については、9 T-150フラスコを使用しています。細胞は、VLPの収穫日までトランスフェクション培地中で維持されています。
- 収穫培養抗原に応じて72〜96時間後、トランスフェクション後の細胞からの上清、またはときに、顕微鏡検査によって推定されるように、細胞生存率は70〜80％に減少しました。転送50mlコニカルチューブに上清とは、細胞破片をペレット化し、4℃で5分間、500×gで細胞をスピンダウン。
注：付着細胞への新鮮予め温め、無血清トランスフェクション培地で3日間の上澄み液の交換はyielます類似またはわずかに低下し収率でVLPのダ第2のロットは、ユーザーが最適化されるべきです。 - 超遠心分離を介して、沈降前に0.22μmの細孔膜を通じたプール上清およびフィルタ。
- 0.8％の七面鳥または哺乳動物の赤血球を使用して、標準的な血球凝集アッセイ14によるHA発現VLPの赤血球凝集活性を試験または抗原特異的ELISAを進めます。代表的な結果については、 図2を参照してください。
バキュロウイルス/昆虫細胞系を用いて2 CHIK VLP式
- 商業バキュロウイルス発現系を用いて、S-27株からチクングニアウイルスのカプシドおよびエンベロープタンパク質（C-E3-E2-6K-E1）を発現する組換えバキュロウイルスを生成します。
- 28℃で100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンを有する無血清Sf9細胞増殖培地中で培養スポドプテラ・フルギペルダ Sf9細胞。 suspens用スピナーフラスコ培養を開始するために3-5×10 5 C / mlで使用しイオンの細胞増殖。日常の通路彼らは2-4×10 6 C / mlの（3〜4日毎）の細胞密度に達します。
- スピナーフラスコ中の懸濁液中の培養Sf9細胞マルチスターラープレートシステム上で130rpmで撹拌しながら。適切な通気のために、スピナーフラスコの半分以下音量で培養容量を維持します。
- CHIK VLPの発現のために、1の感染多重度で組換えバキュロウイルスで、2×10 6細胞/ mlの密度で、Sf9細胞を感染し、28℃のインキュベーターに戻します。典型的には250mlのSf9細胞を含む1つまたは2つのスピナーフラスコを感染させます。
注：私たちは、このメソッドを使用していないが、Sf9細胞をシェーカープラットフォームを使用して28℃で振盪フラスコ中で培養することができます。 - 製造業者のプロトコルに従ってトリパンブルー排除によって決定されるように細胞生存率が70〜80％に減少した72〜96時間の感染後、または後に収穫培養。
注：細胞は、感染しながら増殖し続けるとがあります3日、感染後に組換えCHIK VLPをバキュロウイルスに感染したSf9培養における〜80％の生存率（解像度）。バキュロウイルス感染細胞は、外観が大きくなっています。形態はまた、長楕円形をラウンドから変更されることがあります。バキュロウイルス感染の後期段階では、細胞が溶解し始めました。 - 円錐管50ミリリットルに懸濁培養から直接文化を移し、4℃で5分間、500×gで細胞をスピンダウン。
- 上清を収集し、超遠心分離を介して沈降する前に、0.22μmの細孔膜でろ過します。
VLP /のSVPの3沈降/精製
- バイオセーフティーフード内で70％エタノール、25ミリメートル×89ミリメートルオープントップの超遠心管を滅菌します。エタノールを使用する前にオフに乾燥していることを確認します。
- きれいなチューブに上清の32ミリリットルまでロードします。 25ミリリットルの最小容量は崩壊し、不十分満たされた超遠心管の損傷を防止することをお勧めします。
- 慎重下敷き上清ウィットPBS中のH無菌3 mlの20％グリセロール（v / v）です。チューブがバランスしていることを確認してください。
- 4℃で4時間、135,000×gでスピン。
- ペレットがチューブから外れるません確実に上清を吸引し、。
- 再懸濁を激しくピペッティングにより滅菌PBSでチューブの底にVLPのを沈降させました。 PBSの量は、VLPは、VLP総タンパク質収量と下流のアプリケーションに依存して再懸濁する必要がありました。一般的に、少なくとも100μlの各VLPペレットを再懸濁します。
- 短期記憶および長期保存のために-80℃で貯蔵のためにストアサンプル4°C。
4.タンパク質収率および特異抗原の収量を決定します
- 製造業者のプロトコルに従って、このようなBCAアッセイなどの市販のタンパク質定量法を用いて、総タンパク質含有量を決定します。
- 特定の抗原含量を評価するために、標準的な抗原及び2-5の連続希釈液を塗布して直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を行います1; ELISA 96ウェル平底プレートへの総タンパク質試料のG。
- プレート上の抗原の存在を探索し、マイクロプレートリーダーのための検出可能な吸光度を産生するために、従来のELISAの開発の基板を使用する抗原特異的な抗体を用いて、次のとおり。 VLPを、HAを発現するサンプルのHAおよびELISAアッセイの代表的な結果については、 図2を参照してください。 HAとNAの多くの組み合わせは、おそらくですが、収量はHA-NAの互換性15時に異なる場合があります。
注：抗原特異的抗体は、可変の親和性を持って、抗体の終点希釈滴定は、VLPの定量化を行う前に決定されることが推奨されます。市販の抗体は、濃度または希釈範囲ELISAで使用するための、ならびに提案したプロトコルを提案しているでしょう。
- プレート上の抗原の存在を探索し、マイクロプレートリーダーのための検出可能な吸光度を産生するために、従来のELISAの開発の基板を使用する抗原特異的な抗体を用いて、次のとおり。 VLPを、HAを発現するサンプルのHAおよびELISAアッセイの代表的な結果については、 図2を参照してください。 HAとNAの多くの組み合わせは、おそらくですが、収量はHA-NAの互換性15時に異なる場合があります。
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Representative Results
VLPの収量は、ウイルス抗原構造物の設計によってばらつきがありました。このプロトコルでは、我々は、超遠心分離によって上清中のSVPまたはVLPの産生および精製のための昆虫および哺乳動物細胞を使用することを実証しました。 DENVのprM / E構造遺伝子発現カセットの4つのサブタイプは、 表1の（1-4として画定）DENVのSVPのバージョンを構築する0.6 mlの体積中の総タンパク質の1.1から2.6ミリグラムの範囲を示すために使用されました。インフルエンザVLPをを合成するために、それぞれギャグ;：HAのための2：1：NA 3遺伝子構築を必要とするVLPのために、我々は1の最適化されたDNAトランスフェクション率を発見しました対照的に、複数のチクングニアウイルスタンパク質を発現する単一プラスミドは、組換えバキュロウイルスおよび哺乳動物CHIK VLPを生成するための適切でした。 RSV FおよびGagこのような1でトランスフェクトされたように加え、デュアルプラスミドトランスフェクション法は、哺乳動物細胞でも可能である：1の比、及びapproxi得総細胞培養上清のmatelyは0.01mg / mlです。 表1に示されるように 、哺乳動物293Tを介して生産は、タンパク質の10倍の減少をもたらし、一方、Sf9細胞からCHIKのSVPの収量は、上清の体積の0.008から0.016 mgの総タンパク/ mlの間の範囲であり得ます。異なる野生型、完全長HAプラスミドを用いて、H3N2 VLPの2つのバージョン間、H3N2 VLPのサンプル2は、総タンパク質および特定のHA含量の両方の収率低下していました。他のサンプルVLPのHA量は、 図2および図 3に示され、HA及びELISAがVLPの表面上の内容を推定するために使用される方法を示しています。従来の直接ELISA法のように、標準曲線をELISAプレートにロードH3のVLPをサンプリングするためのELISA反応性を比較するために、組換えHAの既知の濃度を用いて生成されます。 ELISAまたは同様の免疫測定法は、よく保存EPITに既知の交差反応性を有する容易に入手可能なモノクローナル抗体を持っているVLPの定量化のために推奨されていますOPESが、すべての抗原に対して使用できない場合があります。 RSV Fしたがって、ELISAは、モノクローナル抗RSV F抗体を用いて、十分に特徴付けられ、またペレット化RSV FのVLPの表面Fの定量化のために適用可能です。特異的抗体による抗原の機能および抗原認識に加えて、VLP調製物は、構造的に、電子顕微鏡によって評価することができる。 図4は、HA（GAGコア）インフルエンザVLPをが正常に発現組み立て、そしてたVLPように精製されていることを示す代表的な画像です。
| 説明 | 文化巻（ミリリットル） | ハーベストA | 全容積 | 総タンパク質収量（mg）を | 収量（ミリグラム）/容量（ml）を | 特定の抗原含量 |
| DENV1のSVP | 293T186 | 4日間 | 0.6メートルリットル | 1.115 | 0.006 | ND |
| DENV2のSVP | 293T / 186 | 4日間 | 0.6ミリリットル | 2.5 | 0.0134 | ND |
| DENV3のSVP | 293T / 186 | 3 D | 0.6ミリリットル | 1.536 | 0.0083 | ND |
| DENV4のSVP | 293T / 186 | 4日間 | 0.6ミリリットル | 2.613 | 0.014 | ND |
| CHIK VLP | Sf9 / 186 | 3解像度 | 0.6ミリリットル | 1.503 | 0.0081 | ND |
| CHIK VLP | Sf9 / 500 | 4解像度 | 2.0ミリリットル | 8.276 | 0.0166 | ND |
| CHIK VLP | 293T / 186 | 3 D | 0.6ミリリットル | 0.296 | 0.0016 | ND |
| H3N2 VLP 1 | 293T /216 | 3 D | 0.6ミリリットル | 1.25 | 0.0058 | 1.9μgのHA /μlの |
| H3N2 VLP 2 | 293T / 216 | 3 D | 0.6ミリリットル | 0.956 | 0.0044 | 0.96μgのHA /μlの |
| H3N2 VLP 3 | 293T / 216 | 3 D | 0.6ミリリットル | 1.6 | 0.0074 | 1.2μgのHA /μlの |
| H3N2 VLP 4 | 293T / 216 | 3 D | 0.6ミリリットル | 1.54 | 0.0071 | 0.98μgのHA /μlの |
| RSV F VLP | 293T / 216 | 3 D | 0.6ミリリットル | 2.3 | 0.0106 | 0.15μgのRSV F /μlの |
| d =日、トランスフェクション後、解像度=日後に感染 | ||||||
表1：サブウイルスとv構築物によってirus様粒子の収量。VLPボリュームの代表的なデータは、（従来のBCAアッセイにより決定される）総タンパク質収率又は（ELISAによって決定される）特定の抗原含量は、SVP / VLP構築物の種々の中に示されています。収量起因SVP / VLPアセンブリ及び細胞型の違いに可変であり、最大収率は、ユーザーの最適化を必要とし得ます。 CHIK VLPは同じシーケンスを使用していますが、準備がボリュームまたは細胞培養型のいずれかで異なっている間のいずれかDENV1-4のさまざまなバージョンは、血清型に応じて異なります。 H3N2 VLPの（1-4）のさまざまなバージョンは、HA特異的ELISA反応性のエピトープを共有する4つの異なるHA配列を発現し、同じNAおよびGagコアと共発現させました。 RSV FおよびGagのデュアルプラスミドトランスフェクションから生成されたRSV F VLPは、合成し、RSVのF含有量は、RSV F特異的ELISAアッセイを用いて近似しました。
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図1：アプローチ-のVLPを形成するウイルス構造タンパク質の発現のためのプラスミドの遺伝子設計のVLPの設計、合成および精製模式図（A）293T細胞における3つのプラスミドの同時トランスフェクションすることにより、複数の構造タンパク質の同時発現、293T細胞において単一のプラスミドにコードされた単一の遺伝子カセットからの構造タンパク質の（B）式、及び（C）は、組換えバキュロウイルスをコードCHIK構造タンパク質は、懸濁液中の高密度の細胞増殖を促進するためにスピナーフラスコ中で培養したSf9細胞を感染させるために使用され。 VLPのは、細胞の破片を明らかにし、細胞培養培地から回収し、20％グリセロールのクッションの上に超遠心分離により沈降を経由して非粒子から分離されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：H3 VLPの例赤血球凝集アッセイ 、従来の血球凝集アッセイはH3N2 VLPとそれに対応する清澄化上清の代表的なサンプルで実施しました;。 H3N2 HAアッセイは、0.8％シチメンチョウ赤血球またはモルモット赤血球（図示せず）を用いて行うことができます。総タンパク質含量は、精製VLPに標準BCAアッセイを用いて推定されると明らかにした上清に対して実行または推奨されませんでした。 ELISAは、精製VLPで行われたとHA含量は、既知濃度の組換えHA標準を用いて推定した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：例 H3のVLP。アンELISAプレートにおけるH3量の定量化のための十分なH3 ELISAは、異なるHA配列（試料1-9）から生成された既知濃度の組換えHAスタンダードの連続希釈液と希釈されたH3N2 VLP試料を塗布しました。 492ナノメートル（OD）で得られた光学濃度値の標準の濃度（μgの/μl）を関連付ける、濃度は標準曲線の直線部分と交差するx値を推測することによって得られます。組換えHA標準および未知試料の希釈液を、それぞれのウェルA＆BやC＆Dで二重にロードしました。 VLPサンプルの最終濃度は、VLPサンプルの希釈倍率によって濃度を乗じて決定される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図4：ギャグコアを使用したHA-VLPの電子顕微鏡精製されたインフルエンザHA VLPの代表的電子顕微鏡像。 VLPは、HAで被覆された球状粒子に集合。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
我々は成功し、様々な病原体のための複数の構造タンパク質で構成のSVPとのVLPを発現し、精製するために、上述の技術を使用しています。一般的に、我々は我々のVLPを生成するために、哺乳動物発現系を使用しています。しかし、私たちの手で、哺乳動物細胞は、CHIKのVLPの収量が低かった派生しました。組換えバキュロウイルス - 昆虫細胞系を使用する場合CHIKのVLP収率はより堅牢でした。一般的に、バキュロウイルス - 昆虫細胞系は、一方の制御下で、また、外来遺伝子の発現の高いレベルに組織培養フラスコ対スピナーフラスコで培養することができる、より高い細胞密度に起因し得る組換えタンパク質の高い量を得ますバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの。16しかし、バキュロウイルスを使用することの欠点は、アジュバント活性を有するVLP調製物中のバキュロウイルスの存在そのもの、およびワクチンにおけるスキュー免疫学的結果は、我々はまた、インフルエンザVの収量の変動を発見した17の研究であります使用HAとNAの組み合わせに応じてのLP。 H3N2 VLP2は比較的潜在的により効率の低いVLPのアセンブリまたはNA-互換性15に、H3N2電圧VLp1に比べて収量が減少し、さらに調査されないままでいました。 DNA構築物およびトランスフェクション比の最適化は、最適なVLPの収量を確保するための重要なステップのまま。私たちは、式は、一般的に効率的であるとサブクローニングは、複数の制限酵素で便利であるため、常に私たちの哺乳類ベースのVLPのうち、哺乳動物のベクトルpTR600を使用することにしました。プラスミドの比率は、VLP収率を改善するために、ユーザの要件に調整することができます。論じたようしかし、哺乳類のVLP産生の現在の制限は、トランスフェクションのコスト及び現在の組織培養フラスコ中の細胞増殖能に残ります。このプロトコルで行われていないが、メディアがモミ後に新鮮な増殖培地（ 例えば 、OptiMEM中）で補充されたときに、我々はトランスフェクトした細胞におけるVLPの追加に成功し生産を観察していますトン72時間の収穫と追加の72時間後のVLPのその後の収集、収量はややVLPの最初のコレクションと比較して減少してもよいです。
我々は、超遠心分離によって、半精製のために上清中のVLPを放出するか、昆虫または哺乳動物細胞培養物中のウイルス構造タンパク質を発現するための手順を示します。 SVP / VLPは、抗原の免疫アッセイおよびワクチン接種の研究で使用するための、一般的に安定であり、比較して特に選択薬や高病原体鳥インフルエンザ（HPAI）のために、ウイルス粒子を生きるために、より少ない安全上の脅威をもたらすバイオセーフティレベルを必要とする8,18を 、株3（BSL-3）実験室条件19。 VLPの製造は、比較的単純であり、多くの場合、天然のウイルス構造タンパク質、排他的ではない変性線状エピトープに対して誘発される抗体によって認識することができる粒子を与えます。 VLPは、抗原に対する特異的免疫応答を誘発するために有用なプラットフォームとして機能してもよいですワクチン開発における有望な候補です。
このプロトコルは、哺乳動物系におけるウイルス遺伝子をトランスフェクトするための2つのアプローチを示しています。この図では、2種のインフルエンザ遺伝子、HAおよびNAは、HAおよびNAは、表面上に組み立てられて、ギャグ内部コアを有するVLPを生成するために、HIVのGagと同時トランスフェクトします。ギャグの代わりにインフルエンザマトリックス1（M1）の置換は、RSV Fおよび潜在的に他の人のような無関係のウイルス糖タンパク質、とギャグベースのVLPの柔軟性を示しています。あるいは、CHIKVの合成は、Cタンパク質からなる中央の表面上に提示CHIKVのEタンパク質と、SVPの自己組織化のために必要な成分を発現する構造遺伝子カセットを利用します。これらの2つのアプローチは、トランスフェクトされた細胞から組み立てるために最小限の構造的ウイルスタンパク質を必要とするVLPの合成の柔軟性を示します。
最後に、我々は一般的なプロトコルと代表resulを提示しながら、H3N2、RSV、DENV、およびCHIKVの発現および精製のためのTSは、これらの手順は、他のウイルスタンパク質を使用して、VLPの世代のために容易に適しています。これらの手順が正常H1、H5、およびH7ウイルスを含む他のインフルエンザウイルスサブタイプの生成において、当社グループが使用されています。また、単一のプラスミドは、DENVのSVPの生成に使用されるのprM / E設計は西ナイルおよび日本脳炎ウイルスを含むフラビウイルスファミリーの他のメンバーのためのSVPを生成するために適合させることができます。同様に、CHIK VLP産生の方法は、ベネズエラ、東部および西部ウマ脳炎ウイルスを含むトガウイルス科ファミリーの他のメンバーのために使用することができます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、最大効率や歩留まりのためのプロトコルを最適化する助けたロスラボの前にメンバーを承認したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 ml) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
References
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