Summary
Her presenterer vi en protokoll for syntetisering av viruslignende partikler ved bruk av enten baculovirus eller pattedyrekspresjonssystemer, og ultrasentrifugering rensing. Denne meget tilpass tilnærming blir brukt til å identifisere virale antigener som vaksine mål på en sikker og fleksibel måte.
Abstract
Viruslignende partikler (VLP) og subviral partikler (SVPs) er en alternativ tilnærming til virusvaksine design som gir fordelene av økt biosikkerhet og stabilitet over bruk av levende patogener. Ikke-smittsomme og selvsammen er VLP brukes til å presentere strukturelle proteiner som immunogener, utenom behovet for live patogener eller rekombinante virale vektorer for antigen levering. I denne artikkelen viser vi de ulike stadier av VLP design og utvikling for fremtidige applikasjoner i prekliniske dyreforsøk. Fremgangsmåten omfatter følgende trinn: valg av antigen, ekspresjon av antigenet på cellelinjen av valg, rensing av VLP / SVPs, og kvantifisering for antigen dosering. Vi demonstrerer bruk av både pattedyr- og insektcellelinjer for ekspresjon av de antigenene og vise hvordan metoder varierer i utbytte. Metodikken present kan gjelde for en rekke forskjellige patogener, og kan oppnås ved å erstatte de antigener med immunogent structural proteiner av brukerens mikroorganismen av interesse. VLP og SVPs bistå med antigen karakterisering og utvalg av de beste vaksinekandidater.
Introduction
Viruslignende partikler (VLP) er en godkjent teknologi for humant vaksinasjon. Faktisk, noen av de mer moderne design lisensierte vaksiner, inkludert humant papillomavirus (HPV) og hepatitt Β (HepΒ) vaksiner benytter denne tilnærmingen. VLP-er dannet av strukturelle proteiner som er i stand til selv-sammenstillingen. De sammensatte partikler ligne virale morfologi, men kan ikke infisere eller reprodusere fordi de mangler virale genomer. VLP kan uttrykkes og renses fra en rekke prokaryote og eukaryote systemer. En gjennomgang av litteraturen viser at ulike uttrykks systemer er ansatt med følgende satser: bakterier - 28%, gjær - 20%, anlegg - 9%, insekt - 28%, og pattedyr - 15% en. Av notatet, er HPV-vaksiner basert på L1 kapsid protein som produseres i gjær (Gardasil) eller i et insekt celle system (Cervarix) 2. HepΒ vaksiner, Recombivax og Engerix-Β, blir også produsert i gjær, og er sammensatt av HepΒ overflateantigen 3, 4.
Vi bruker pattedyr- og insektcelle-ekspresjonssystemer for å produsere VLP som krever ko-ekspresjon av flere strukturelle proteiner for montering. Vårt arbeid fokuserer på å designe, produsere og rensende VLP-baserte vaksiner mot menneskelige patogener: influensavirus, respiratorisk syncytialt virus (RSV), dengue virus (DENV), og chikungunya virus (CHIKV). Våre metoder er fleksibel nok til å tillate ko-ekspresjon av de flere strukturelle proteiner fra multiple ekspresjonsplasmider, eller et enkelt ekspresjonsplasmid (figur 1). Tidligere har vi produsert og renset H5N1 VLP samlet fra co-uttrykk av plasmider som koder influensa hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), og matrise (M1) i humane embryonale nyre 293T celler 5,6. Genene ble kodon-optimalisert for ekspresjon i pattedyrceller og klonet inn i pTR600, en eukaryot ekspresjonsvektor som inneholder cytomegalovirus-umiddelbar-tidlig promotor, pluss intron A for å initiere transcription av eukaryote innsatser og bovint veksthormon polyadenylering signal for terminering av transkripsjon 7. En lignende tilnærming ved hjelp av tre-plasmidet ko-ekspresjon av HA, NA (figur 1A) og en annen viral matriks-protein, HIV gag p55, ble benyttet for generering av human sesonginfluensa subtype H3N2 VLP i denne studien, og har vist seg å generere VLP av tilsvarende størrelse som influensa partikler 8. Selv om influensavaksiner overveiende fremkalle anti-HA-antistoffer, tilsetning av influensa-neuraminidase formidler sialidase-aktivitet for å muliggjøre VLP spirende fra transfekterte celler 9 og også presentere ytterligere immunogene mål. For å fremstille RSV-VLP, vi også valgt urelaterte kjerne av HIV Gag å utforme prototypiske vaksiner som presenterer utelukkende RSV overflate glykoproteiner for å ytterligere demonstrere fleksibilitet av VLP i formasjonen ved hjelp av HIV gag, som tidligere beskrevet og karakterisert ved elektronmikroskopi 6,10. andrehar tidligere vist at VLP presentere RSV-glykoproteiner kan settes sammen ved bruk av forskjellige virale komponenter fra Newcastle Disease Virus (NDV) 11, og influensa matrise 12. Full-lengde overflate-glykoprotein sekvenser ble anvendt i denne studien er å beholde innfødte konformasjoner som kan være nødvendige for funksjonell reseptor-binding og antistoffgjenkjenning assay ved enzymbundet immunosorbent assay (ELISA).
Våre eksempler på bruk av enkle plasmid ekspresjonssystemer å generere partikler er DENV og CHIKV. I tilfelle av DENV, kan vi produsere subviral partikler (SVPs) uten kapsid i 293T-celler fra et enkelt plasmid inneholdende et PRM / E-strukturgenet ekspresjonskassett 13. Uttrykket SVP brukes til å betegne mangelen på en kjerne eller kapsidprotein i monteringen av virale strukturelle proteiner. Chik VLP kan også produseres ved hjelp av et enkelt plasmid som inneholder et CHIKV strukturgenet kassett, koding kapsidbindende og konvolutt proteiner, eller jegnsect celler ved å infisere med et rekombinant baculovirus som koder for den samme strukturelle gen kassett som er optimalisert for insektcelle uttrykket (figur 1 B - C).
Sluttresultatet av uttrykket tilnærminger som er diskutert ovenfor er frigjøring av VLP inn i cellekulturmedium som kan deretter bli renset ved ultrasentrifugering gjennom en 20% glycerol pute. I denne rapporten presenterer vi metoder for å uttrykke og rense disse VLP fra pattedyr og insektcellesystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Pattedyr Expression System for generasjon av influensa H3N2 VLP
- Subklon viralt strukturelt glykoproteiner hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA) og humant immunsviktvirus (HIV) Gag p55 inn i eukaryote ekspresjonsvektorer, slik som tidligere beskrevet pTR600. 7
- Forsterke DNA i kjemisk kompetente Escherichia coli (f.eks DH5a) og isolere transfeksjon-grade plasmid ved hjelp av et plasmid rensing kit i henhold til produsentens anvisninger. Mengde DNA er avhengig av avkastning og brukerens behov.
- Opprettholde pattedyrcellelinje, 293T, i vekstmedier inneholdende 10% føtalt bovin serum (FBS) ved 37 ° C med 5% CO2 i en fuktig inkubator.
- Dyrke celler slik at en T-150 vevskulturkolbe inneholder 45-75 x 10 6 celler pr kolbe slik at kolben henter fullstendig cellene skulle vedhefte og 85-95% konfluens celle ved den følgende dag. Inspiser celler under mikroskop for ønsket conflusering.
Merk: høy celletetthet er vanligvis anbefalt for å gi optimal proteinekspresjon med minimal cytotoksisitet ved bruk av kommersielle transfeksjon reagenser imidlertid overflytning kan resultere i akkumulering av cellulært avfall biprodukter og redusere cellenes levedyktighet. - På dagen for transfeksjon, forberede liposomer og DNA blanding i henhold til produsentens anbefalinger og transfektere DNA-celler med et DNA-sammensetning av 1: 1: 2 av HA: NA: Gag med en total DNA mengde på 40 mikrogram per T-150 kolbe. Fortynn DNA og liposomoppløsninger i serum-fritt media transfeksjon uten antibiotika, slik at hver flaske inneholder et totalt volum på 20-30 ml.
Merk: Forholdet mellom genkonstruksjoner kan kreve bruker optimalisering. Selv om det ikke er vist her, har en lignende prosedyre transfeksjon utført med respiratorisk syncytialvirus (RSV) F og HIV Gag ved et 1: 1 forhold. For DENV og CHIKV enkelt ekspresjonsplasmider, totalt 20 ug DNA pr T-150 kolbe brukes for optimal eXpression. DNA: transfeksjon reagenvolumer forholdstall er bruker optimalisert. Bruk anbefalt transfeksjon medium basert på transfeksjon metode, dvs. polykationiske lipid trans anbefale reduksjon eller fravær av føtalt bovint serum således medier kan suppleres med veksthormoner og sporelementer for å understøtte vekst i fravær av serum. - Returner kolber til 37 ° C med 5% CO 2 inkubator. For et volum på 200 ml, bruke 9 T-150 kolber. Cellene er opprettholdt i transfeksjon kulturmediet til den dagen VLP innhøsting.
- Høste kultur supernatant fra celler etter 72-96 timer etter transfeksjon, avhengig av antigenet, eller når cellenes levedyktighet har sunket til 70-80%, som estimert ved mikroskopisk inspeksjon. Overføring supernatanten til 50 ml koniske rør og spinne cellene ned ved 500 x g i 5 min ved 4 ° C for å pelletere cellerester.
Merk: Utskifting av 3 dagers supernatanten med fersk forvarmet, serumfrie transfeksjon media til heftende celler vil yielda andre mye VLP med tilsvarende eller litt redusert utbyttet og skal være optimalisert av brukeren. - Basseng supernatanten og filtrer gjennom et 0,22 pm pore-membran før sedimentering gjennom ultrasentrifugering.
- Test hemaggluineringsaktiviteten av HA-VLP som uttrykker etter standard hemagglutinasjon assay 14 ved bruk av 0,8% kalkun eller pattedyr røde blodlegemer eller fortsette med antigen-spesifikk ELISA. Se figur 2 for representative resultater.
2. Chik VLP uttrykk med bruk Baculovirus / Insect Cell System
- Generer rekombinante baculovirus uttrykker chikungunya virus kapsid og kappeproteiner (C-E3-E2-6K-E1) fra S-27 belastning ved hjelp av et kommersielt baculovirus uttrykk systemet.
- Kultur Spodoptera frugiperda Sf9-celler i serumfritt Sf9 vekstmedium med 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin ved 28 ° C. Bruk 3-5 x 10 5 c / ml for å starte spinner kolbe kulturer for suspension cellevekst. Passasje rutinemessig når de når celletetthet på 2-4 x 10 6 c / ml (hver 3-4 dager).
- Kultur Sf9 celler i suspensjon i spinnerflasker under omrøring ved 130 rpm på en multirøre plate system. For riktig lufting, opprettholde kulturvolumer på ikke mer enn halvparten av volumet av det roterende kolbe.
- For ekspresjon av Chik VLP, infisere Sf9-celler ved en tetthet på 2 x 10 6 celler / ml med rekombinant baculovirus ved en multiplisitet av infeksjon av en og vende tilbake til 28 ° C inkubator. Typisk infisere en eller to spinnerflasker, som inneholder 250 ml Sf9-celler.
Merk: Selv om vi ikke bruker denne metoden, kan Sf9 celler dyrkes i risteflasker ved 28 ° C ved hjelp av en shaker plattform. - Høste kulturer etter 72-96 timer etter infeksjon, eller når cellenes levedyktighet har sunket til 70-80%, som bestemt ved trypanblått Utelukkelse i overensstemmelse med fabrikantens protokoll.
Merk: Cellene fortsetter å spre mens infisert, og det eren ~ 80% levedyktighet i Sf9 kulturer infisert med rekombinante Chik VLP baculovirus 3 dager etter smitte (dpi). Baculovirus-infiserte celler er større i utseende. Morfologi kan også endre seg fra runde til avlange. I sen-stadier av baculovirus infeksjoner, cellene begynte å lysere. - Overfør kulturer direkte fra suspensjonskultur i 50 ml koniske rør og ring cellene ned ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Samle supernatanter og filtrer gjennom et 0,22 pm pore-membran før sedimentering gjennom ultrasentrifugering.
3. Sedimentering / Rensing av VLP / SVPs
- Steriliser 25 mm x 89 mm open-top ultrasentrifuge rør med 70% etanol i biosikkerhet hette. Sørg for at etanol har tørket av før bruk.
- Legg i opptil 32 ml supernatant til et rent rør. En minimal volum på 25 ml er anbefalt for å hindre sammenbrudd og skader som er mangelfullt fylt ultrasentrifuge rør.
- Undertak nøye supernatanter viddh sterile 3 ml 20% glyserol i PBS (volum / volum). Sørg for at rørene er balansert.
- Spin på 135 000 xg i 4 timer ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten, slik pelleten ikke løsne fra tube.
- Resuspender sedimentert VLP ved bunnen av rørene med steril PBS ved kraftig pipettering opp og ned. Mengden av PBS som trengs for å resuspendere VLP avhenger av VLP totale proteinutbytte og nedstrøms applikasjoner. Typisk resuspender hver VLP pellet i minst 100 ul.
- Oppbevar prøver 4 ° C for kortsiktig lagring og -80 ° C lagring for langtidslagring.
4. Fastsettelse Protein Rentene og spesifikt antigen Rentene
- Bestem det totale proteininnholdet ved hjelp av en kommersiell protein kvantifisering metode, for eksempel BCA assay som per produsentens protokoll.
- For å vurdere spesifikt antigen innhold, utføre direkte enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) ved å belegge serielle fortynninger av standard antigen og 2-51; g av totalt protein prøven på en ELISA 96-brønners flatbunnet plate.
- Følge med antigen-spesifikke antistoffer for å undersøke tilstedeværelsen av antigenene på plate, og bruk av konvensjonelle ELISA utviklings substrater for å fremstille påvisbar absorbans for mikroplateleser. Se figur 2 for representative resultatene av HA og ELISA-analysen for et utvalg HA-uttrykke VLP; mange kombinasjoner av HA og NA er muligens men rentene kan variere på HA-NA-kompatibilitet 15.
Merk: Antigen-spesifikke antistoffer har variable affiniteter, og det anbefales at endepunktet fortynning titrering av antistoffer være bestemt før utføring VLP kvantifisering. Kommersielle antistoffer vil ha foreslåtte konsentrasjons eller tynning variere for bruk i ELISA, så vel som foreslåtte protokoller.
- Følge med antigen-spesifikke antistoffer for å undersøke tilstedeværelsen av antigenene på plate, og bruk av konvensjonelle ELISA utviklings substrater for å fremstille påvisbar absorbans for mikroplateleser. Se figur 2 for representative resultatene av HA og ELISA-analysen for et utvalg HA-uttrykke VLP; mange kombinasjoner av HA og NA er muligens men rentene kan variere på HA-NA-kompatibilitet 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VLP rentene var variabel ved virusantigen konstruere design. I denne protokoll har vi demonstrert bruk av insekt og pattedyrceller for produksjon av SVP eller VLP i supernatanten og rensing ved hjelp av ultrasentrifugering. Fire undertyper av DENV PRM / E-strukturgenet ekspresjonskassetter ble anvendt for å konstruere versjonene av DENV SVPs (avgrenset som 1-4) i tabell 1, og viser et område mellom 1,1 til 2,6 mg av totalt protein i 0,6 ml volumer. For VLP som krever en tre genkonstruksjoner, fant vi den optimaliserte DNA transfeksjon forholdet 1: 1: 2 for HA: NA: Gag henholdsvis å syntetisere influensa VLP; i motsetning til et enkelt plasmid som uttrykker flere Chikungunya virale proteiner var tilstrekkelig for dannelse av rekombinant baculovirus og pattedyr Chik VLP. I tillegg er en dual-plasmid transfeksjon prosedyre også mulig med pattedyrceller som for eksempel med RSV F og Gag transfekterte ved et 1: 1 forhold, og gir approxiinstans 0,01 mg / ml av total cellekultur supernatant. Som vist i tabell 1, kan Chik SVP utbytte fra Sf9-celler som varierer mellom 0,008 til 0,016 mg totalt protein / ml supernatant volum, mens produksjonen gjennom pattedyr 293T gir en 10 gangers reduksjon av protein. Mellom de to versjoner av H3N2 VLP-er ved hjelp av forskjellige villtype, full-lengde HA plasmider, den H3N2 VLP Prøve 2 hadde et redusert utbytte av både totalt protein og spesifikke HA-innhold. Andre eksempel VLP HA mengder er vist i figurene 2 og 3, og illustrerer hvordan HA og ELISA benyttes for å estimere overflate innhold på VLP. Som ved en konvensjonell direkte ELISA-metode, er en standardkurve dannet ved anvendelse av kjente konsentrasjoner av et rekombinant HA for å sammenligne ELISA reaktivitet å sample H3 VLP lastet på en ELISA-plate. ELISA eller lignende immunoassay er anbefalt for kvantifisering av VLP som har lett tilgjengelige monoklonale antistoffer med kjent kryssreaktivitet til en godt konservert epitopes, men er kanskje ikke tilgjengelig for alle antigener. RSV F er godt karakterisert, er derfor en ELISA ved anvendelse av monoklonalt anti-RSV F-antistoff kan også anvendes for kvantifisering av flaten F på pelletert RSV F-VLP. I tillegg til antigen-funksjonalitet og antigen gjenkjennelse av spesifikke antistoffer, kan VLP preparater være strukturelt bestemt ved elektronmikroskopi. Figur 4 er et representativt bilde som viser at HA (Gag-kjerne) influensa VLP-er vellykket uttrykt, monteres, og renset som VLP.
| Beskrivelse | Kultur Vol (ml) | harvest-en | total~~POS=TRUNC | Total Protein Yield (mg) | Utbytte (mg) / Vol (ml) | Spesifikt antigen innhold |
| DENV1 SVP | 293T186 | 4 d | 0,6 ml | 1,115 | 0,006 | nd |
| DENV2 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 ml | 2,5 | 0,0134 | nd |
| DENV3 SVP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 ml | 1,536 | 0,0083 | nd |
| DENV4 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 ml | 2,613 | 0,014 | nd |
| Chik VLP | Sf9 / 186 | 3 dpi | 0,6 ml | 1,503 | 0,0081 | nd |
| Chik VLP | Sf9 / 500 | 4 dpi | 2,0 ml | 8,276 | 0,0166 | nd |
| Chik VLP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 ml | 0,296 | 0,0016 | nd |
| H3N2 VLP 1 | 293T /216 | 3 d | 0,6 ml | 1,25 | 0,0058 | 1,9 mikrogram HA / mikroliter |
| H3N2 VLP 2 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 0,956 | 0,0044 | 0,96 mikrogram HA / mikroliter |
| H3N2 VLP 3 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 1.6 | 0,0074 | 1,2 mikrogram HA / mikroliter |
| H3N2 VLP 4 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 1,54 | 0,0071 | 0,98 mikrogram HA / mikroliter |
| RSV F VLP | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 2.3 | 0,0106 | 0,15 mikrogram RSV F / mikroliter |
| a d = dager etter transfeksjon, dpi = dager etter smitte | ||||||
Tabell 1: Subviral og v irus-lignende partikkel utbytter ved konstruksjonen. Representative data for VLP volumer, blir total proteinutbytte (bestemt ved konvensjonell BCA-analyse) eller spesifikt antigen innhold (bestemt ved hjelp av ELISA) er vist blant et utvalg av SVP / VLP konstruksjoner. Rentene er variable på grunn av forskjellen i SVP / VLP montering og celletype, og maksimale utbytter kan kreve bruker optimalisering. De ulike versjonene av enten DENV1-4 variere basert på serotype, mens Chik VLP bruke samme sekvens, men forberedelsene er forskjellige i enten volum eller cellekultur type. De ulike versjonene av H3N2 VLP (1-4) uttrykker fire unike HA sekvenser som deler en HA-spesifikke ELISA reaktiv epitop og ble co-uttrykkes med samme NA og Gag kjerne. RSV F-VLP, som er generert fra en dobbelt-plasmid transfeksjon av RSV F og Gag, ble syntetisert og RSV F-innholdet ble anslått ved bruk av RSV F-spesifikk ELISA-analysen.
.jpg "/>
Fig. 1: Approach - VLP konstruksjon, syntese og rensing Skjematisk representasjon av plasmid gene design for ekspresjon av virale strukturelle proteiner som danner VLP: (A) ko-ekspresjon av flere strukturelle proteiner ved ko-transfeksjon av tre plasmider i 293T-celler , (b) ekspresjon av strukturelle proteiner fra et enkelt gen kassett som er kodet i et enkelt plasmid i 293T-celler, og (C) rekombinant baculovirus-kodende Chik strukturelle proteiner blir brukt til å infisere Sf9-celler dyrket i spinnerflasker for å fremme høy tetthet cellevekst i suspensjon . De VLP er høstet fra celledyrkningsmedier, avklares av celleavfall, og atskilt fra ikke-partikler via sedimentering av ultrasentrifugering på en 20% glyserol pute. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: Eksempel hemaqqlutinering analyse av H3-VLP En konvensjonell hemagglutinasjon analyse ble utført på et representativt utvalg av H3N2 VLP og dens tilsvarende klarlagt supernatant; H3N2 HA-analyse kan utføres ved å bruke 0,8% kalkun røde blodceller eller marsvin røde blodlegemer (ikke vist). Totalt proteininnhold er beregnet ved hjelp av standard BCA analysen på den rensede VLP og ble ikke utført eller anbefalt for avklart supernatant. ELISA ble utført på den rensede VLP og HA innholdet ble estimert ved hjelp av en rekombinant HA standard med kjent konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Ex rikelig H3 ELISA for kvantifisering av H3-innhold i H3 VLP-er. En ELISA-plate ble belagt med seriefortynninger av en rekombinant HA standard av kjent konsentrasjon og fortynnede H3N2 VLP prøver som genereres fra forskjellige HA-sekvenser (prøve 1-9). Korrelere den konsentrasjon (ug / ul) av standarden til de optiske tetthetsverdier ble oppnådd ved 492 nm (OD), er konsentrasjoner oppnådd ved å utlede x-verdi som skjærer den lineære del av standardkurven. Fortynninger av rekombinante HA standard og ukjente prøvene ble lagt i duplikat i brønnene A & B eller C & D, henholdsvis. Den endelige konsentrasjonen av VLP prøve bestemmes ved å multiplisere konsentrasjonen av fortynningsfaktoren av VLP prøven. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4041 / 54041fig4.jpg "/>
Figur 4: Elektronmikroskopi av HA-VLP hjelp Gag-core Representant elektronmikroskopi bilde av renset influensa HA VLP.. VLP montere inn sfæriske partikler belagt med HA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har brukt de teknikkene som er beskrevet ovenfor for å lykkes uttrykke og rense SVPs og VLP sammensatt av flere strukturelle proteiner av ulike patogener. Vanligvis bruker vi pattedyrekspresjonssystemer å generere våre VLP. Men i våre hender, pattedyr-celle avledet Chik VLP rentene var lave. Chik VLP utbyttet var mer robust når du bruker en rekombinant baculovirus-insektcellesystem. Generelt baculovirus-insektcellesystemer gir høyere mengder av rekombinante proteiner, noe som kan resultere fra de høyere celletettheter som kan dyrkes i spinnerflasker versus vevskulturflasker, og også på grunn av høy grad av ekspresjon av fremmede gener mens under kontroll av baculovirus polyhedrin-promotor. 16 imidlertid er en ulempe ved bruk av baculovirus er selve tilstedeværelsen av baculovirus i VLP preparater, som har adjuvansaktivitet, og skew immunologiske resulterer i vaksine studier som 17 Vi har også funnet variasjon i utbyttet av influensa VLP avhengig av HA og NA kombinasjoner som brukes; H3N2 VLP2 hadde relativt redusert avkastning sammenlignet med H3N2 VLP1, potensielt på grunn av mindre effektiv VLP montering eller NA-kompatibilitet 15 og er fortsatt å bli undersøkt videre. Optimalisering av DNA-konstruksjoner og transfeksjonsteknologier prosenter forbli viktige skritt for å sikre optimale VLP avkastning. Vi har valgt å bruke et pattedyr vektor pTR600 konsekvent blant våre pattedyr-basert VLP fordi uttrykket er vanligvis effektiv og subkloning er praktisk med flere restriksjonsenzymer. Prosenter av plasmider kan justeres for brukerens behov for å forbedre VLP avkastning. Imidlertid, som omtalt, aktuelle begrensninger av pattedyr-VLP produksjon forbli med kostnaden for transfeksjon og cellevekstevnen i omløps vevskulturflasker. Selv om det ikke utført i denne protokollen, har vi observert ekstra vellykket produksjon av VLP i transfekterte celler når media fylles opp med friske vekstmedier (f.eks OptiMem) etter first 72 timer avling og påfølgende samling av VLP etter ytterligere 72 timer, selv om utbyttene kan være noe redusert i forhold til den første samlingen av VLP.
Vi demonstrerer en fremgangsmåte for å uttrykke virale strukturelle proteiner i enten insekt eller pattedyrcellekulturer for å frigjøre VLP i supernatanten for semi-rensing ved hjelp av ultrasentrifugering. SVP / VLP er generelt stabile for bruk i antigen immunologiske analyser og vaksinasjonsstudier, og utgjør færre sikkerhetstrusler i forhold til å leve viruspartikler, spesielt for utvalgte agenter eller high-patogen fugleinfluensa (HPAI) påkjenningen 8,18, som krever biosikkerhetsnivå 3 (BSL-3) laboratorieforhold 19. VLP produksjon er relativt enkle og ofte gir partikler som kan bli gjenkjent av antistoffer fremkalt mot innfødte virale strukturelle proteiner, ikke eksklusivt denaturert lineære epitoper. VLP tjene som en nyttig plattform for å utløse spesifikke immunresponser til antigenet og kanvære en lovende kandidat i vaksineutvikling.
Denne protokollen viser to fremgangsmåter for transfeksjon av virale gener i pattedyrsystemet. I denne illustrasjonen to influensa HA-gener, og NA, blir ko-transfektert med HIV Gag for å generere et VLP som har en Gag indre kjerne, med HA og NA montert på overflaten. Substitusjon av Gag i stedet for influensa matrise 1 (M1) viser fleksibiliteten av Gag-baserte VLP med ikke-relaterte virale glykoproteiner, slik som RSV F og potensielt andre. Alternativt kan syntesen av CHIKV benytter et strukturelt gen kassett, som uttrykker de nødvendige komponenter for SVP selvbygging, med CHIKV E proteiner presentert på overflaten av et sentrum som består av C-protein. Disse to fremgangsmåter viser fleksibiliteten av VLP syntese, noe som krever minimale strukturelle virusproteiner for å montere fra transfekterte celler.
Til slutt, mens vi presenterte generelle protokoller og representant results for uttrykk og rensing av H3N2, RSV, DENV, og CHIKV, disse prosedyrene er lett mottakelig for generering av VLP ved hjelp av andre virale proteiner. Disse prosedyrene har blitt brukt av vår gruppe i produksjon av andre influensavirus subtyper inkludert H1, H5 og H7 virus. Videre er enkelt plasmid, PRM / E utforming brukes for generering av DENV SVPs kan tilpasses for generering av SVPs for andre medlemmer av Flavivirus familien som inkluderer West Nile og japansk encefalitt virus. På samme måte kan metoder for Chik VLP produksjon brukes til andre medlemmer av Togaviridae familien, inkludert den venezuelanske, Øst og Vest equine encefalitt virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å erkjenne de tidligere medlemmene av Ross lab som har hjulpet optimalisere protokoll for maksimal effektivitet og avkastning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 ml) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
References
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
- Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
- Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
- Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
- Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
- Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
- Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
- Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
- Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
- Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
- Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
- Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
- Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
- Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
- Jarvis, D. L. Methods in Enzymology. 463, Academic Press. 191-222 (2009).
- Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
- Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
- Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).
