Summary
Здесь мы приводим протокол для синтеза вирусоподобных частиц, используя либо бакуловируса или системы экспрессии млекопитающих и очистки ультрацентрифугирования. Этот высоко настраиваемый подход используется для выявления вирусных антигенов в качестве мишеней вакцины в безопасной и гибкой основе.
Abstract
Вирусоподобные частицы (VLP) и субвирусного частицы (СВП) являются альтернативный подход к вирусным конструкции вакцины, которая предлагает преимущества повышенной биологической безопасности и стабильности по сравнению с использованием живых микроорганизмов. Неинфекционные и самосборки, VLPs используются, чтобы представить структурные белки в качестве иммуногенов, обходя потребность живых патогенов или рекомбинантных вирусных векторов для доставки антигена. В этой статье мы покажем различные стадии проектирования и разработки VLP для будущих применений в доклинических испытаний на животных. Процедура включает в себя следующие этапы: выбор антигена, экспрессию антигена в клеточной линии выбора, очистки VLPs / СВП и количественному отношению к антигену дозирования. Показано использование обеих клеточных линий млекопитающих и насекомых для экспрессии наших антигенов и продемонстрировать, как методологии отличаются доходности. Методология, представленная может применяться к различным патогенам и может быть достигнуто путем замены антигенов с иммуногенной улuctural белки микроорганизмов пользователя интерес. VLPs и СВП помочь с антигенной характеризации и отбора лучших вакцин-кандидатов.
Introduction
Вирусные частицы (VLP) являются утвержденной технологии для вакцинации человека. На самом деле, некоторые из более современно лицензированных вакцин, в том числе вируса папилломы человека (ВПЧ) и гепатита В (HepΒ) вакцины используют этот подход. VLPs образуются из структурных белков, способных к самоорганизации. Собранные частицы имитируют вирусные морфологию, но не может инфицировать или репликации, поскольку они испытывают недостаток в вирусных геномов. VLP, может быть экспрессирован и очищен от ряда прокариотических и эукариотических систем. Обзор литературы показал , что различные системы экспрессии используются в следующих размерах: бактерии - 28%, дрожжи - 20%, завод - 9%, насекомых - 28%, а у млекопитающих - 15% 1. Следует отметить, что вакцины против ВПЧ на основе капсидного белка L1 продуцируются в дрожжах (Гардасил) или в системе клеток насекомых (Церварикс) 2. Вакцины HepΒ, Recombivax и Engerix-Β, также производятся в дрожжах, и состоят из HepΒ поверхностного антигена 3, 4.
Мы используем системы экспрессии клеток млекопитающих и насекомых для производства VLPs, требующих совместного экспрессию нескольких структурных белков для сборки. Наша работа сосредоточена на разработке, производстве и очистки VLP на основе вакцин против патогенов человека: вирус гриппа, респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус денге (DENV), и вирус чикунгуньи (CHIKV). Наши методы являются достаточно гибкими , чтобы обеспечить коэкспрессией многочисленных структурных белков из нескольких плазмид экспрессии, или одной плазмиды экспрессии (рисунок 1). Ранее мы получали и очищали вирус H5N1 VLPs собранный из коэкспрессией плазмид , кодирующих гемагглютинин гриппа (HA), нейраминидаза (NA) и матрица (M1) в эмбриональной почки человека 293Т 5,6. Гены оптимизированными в отношении кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих, и клонировали в pTR600, эукариотической вектор экспрессии, содержащий промотор цитомегаловируса немедленного раннего промотора плюс Интрон А для инициирования TransCription эукариотических вставок и бычий сигнал полиаденилирования гормона роста для прекращения транскрипции 7. Аналогичный подход с использованием трех плазмидной коэкспрессии HA, NA (рис 1А) и альтернативного вирусного белка матрикса, ВИЧ Gag p55, был использован для генерации человеческого подтипа сезонного гриппа H3N2 VLPs в данном исследовании , и было показано , для генерации VLPs такого же размера , как частицы гриппа 8. Хотя вакцины против гриппа преимущественно вызывают анти-HA антитела, добавление нейраминидазы вируса гриппа посредничает сиалидазу активность , чтобы позволить VLP многообещающий из трансфецированных клеток 9 , а также представить дополнительные иммуногенных целей. Для получения RSV VLPs, мы также выбрали неродственного ядро ВИЧ Gag для разработки прототипические вакцин , которые представляют исключительно RSV поверхностных гликопротеинов для дальнейшей демонстрации гибкости формирования VLP с использованием ВИЧ - Gag, как описано выше , и характеризуется с помощью электронной микроскопии 6,10. другиеРанее было показано , что VLP , представляя RSV гликопротеины могут быть собраны с использованием различных вирусных компонентов от вируса болезни Ньюкасла (NDV) 11 и матрицы 12 гриппа. гликопротеин последовательности поверхности Полноразмерные были использованы в этом исследовании, чтобы сохранить нативные конформации, которые могут быть необходимы для функционального связывания рецептора и анализа распознавания антител с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Наши примеры использования отдельных систем плазмида экспрессии для получения частиц являются DENV и CHIKV. В случае DENV, мы можем производить субвирусного частицы (СВП) без капсида в клетках 293Т из одной плазмиды , содержащей кассету экспрессии PRM / Е структурный ген 13. Термин SVP используется для обозначения отсутствия белка ядра или капсида в сборке вирусных структурных белков. CHIK VLP, также могут быть получены с помощью одной плазмиды, содержащей CHIKV структурный ген кассетные, кодирующий капсида и белки оболочки, или в Insect клетки путем инфицирования рекомбинантным бакуловирусом , кодирующей тот же структурный ген , кассету , оптимизированные для экспрессии клеток насекомых (Фиг.1В - C).
Конечный результат выражения рассмотренных выше подходов является высвобождение VLPs в среду для культивирования клеток, которые затем могут быть очищены с помощью ультрацентрифугирования через 20% глицерина демпфировать. В этом отчете мы представляем методы, чтобы выразить и очистить эти VLPs от клеточных систем млекопитающих и насекомых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. млекопитающим Expression System для генерации гриппа H3N2 VLP
- Подклон вирусные структурные гликопротеины гемагглютинин (НА), нейраминидаза (NA), и вирус иммунодефицита человека Затычка р55 (ВИЧ) в эукариотические экспрессирующие векторы, такие , как описано ранее pTR600. 7
- Amplify ДНК в химически компетентной Escherichia coli (например, DH5 & alpha ; ) и изолировать плазмиды трансфекции класса с использованием набора для очистки плазмидной в соответствии с инструкциями изготовителя. Количество ДНК зависит от урожайности и потребностей пользователей.
- Поддержание линии клеток млекопитающих, 293T, в питательной среды , содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , при температуре 37 ° С с 5% CO 2 в увлажненном инкубаторе.
- Рост клеток таким образом, что Т-150 тканевой культуры флакон содержит 45-75 х 10 6 клеток на колбу таким образом, что колба получает полную приверженность клеток и 85-95% слитности клеток на следующий день. Проверьте клетки под микроскопом для желаемого confluобразность.
Примечание: Высокая плотность клеток, как правило, рекомендуется, чтобы получить оптимальную экспрессию белка с минимальным цитотоксичности при использовании коммерческих реагентов трансфекции Однако чрезмерно сплошности может привести к накоплению клеточных отходов побочных продуктов и снижают жизнеспособность клеток. - В день трансфекции готовят липосом и смесь ДНК в соответствии с рекомендациями производителя и трансфекции клеток ДНК с композицией ДНК 1: 1: 2 ГА: NA: Gag с общим количеством ДНК 40 мкг на Т-150 колбу. Развести ДНК и липосомных растворов в не содержащей сыворотки среде без трансфекции антибиотиков, таких, что каждый флакон содержит общий объем 20-30 мл.
Примечание: Коэффициент генных конструкций может потребовать оптимизации пользователя. Хотя это и не как здесь было показано, аналогичная процедура трансфекции была выполнена с респираторно-синцитиальный вирус (RSV) F и ВИЧ Gag в соотношении 1: 1. Для одного плазмид экспрессии DenV и CHIKV, в общей сложности 20 мкг ДНК на Т-150 колбы используются для оптимального еXpression. ДНК: трансфекцией отношения реагентов оптимизированы для пользователей. Используйте рекомендуемые трансфекции среду на основе метода трансфекции, т.е. поликатионные липидные трансфекцию рекомендуют снижение или отсутствие сыворотки плода коровы , таким образом , средства массовой информации , могут быть дополнены гормонов роста и микроэлементов для поддержания роста в отсутствие сыворотки. - Возвращение колб до 37 ° С с 5% СО 2 инкубатора. Для получения объема 200 мл, используют 9 колбах Т-150. Клетки не поддерживаются в трансфекции культуральной среде до дня урожая VLP.
- Урожай супернатант культуры из клеток после 72-96 ч после трансфекции в зависимости от антигена, или когда жизнеспособность клеток снизилась до 70-80%, по оценкам микроскопического обследования. Передача супернатант в 50 мл конические пробирки и спина клетки вниз при 500 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С, чтобы осадить клеточный дебрис.
Примечание: Замена 3 дня супернатанта со свежим подогретого бессывороточной трансфекции СМИ к прилипшие клетки будут yielда второй много VLPs с аналогичной или слегка пониженным выходом и должен быть оптимизирован пользователем. - Бассейн супернатант и фильтруют через 0,22 мкм поры мембраны перед осаждением посредством ультрацентрифугирования.
- Проверьте гемагглютинации активность HA-экспрессирующих VLPs с помощью стандартных гемагглютинации анализа 14 с использованием 0,8% индейки или млекопитающих красных кровяных клеток или продолжить антиген-специфического ELISA. На рисунке 2 репрезентативных результатов.
2. CHIK VLP Expression Использование элементной системы бакуловируса / насекомых
- Генерирование рекомбинантного бакуловируса, выражающие вирус чикунгуньи капсида и белки оболочки (C-E3-E2-6K-E1) от S-27 штамма с использованием коммерческой системы бакуловируса экспрессии.
- Культура Spodoptera frugiperda Sf9 клеток в бессывороточной среде для роста sF9 со 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 28 ° С. Используйте 3-5 × 10 5 копий / мл , чтобы начать вращающаяся колба культур для suspensрост клеток ионов. Прохождение обычно , когда они достигают плотности клеток от 2-4 х 10 6 копий / мл (каждые 3-4 дня).
- Культура Sf9 клетки в суспензии в колбах с центрифужных перемешивании со скоростью 130 оборотов в минуту в системе многоточечной мешалка пластины. Для правильной аэрации, сохранить объемы культуры на уровне не более половины объема вращающуюся колбу.
- Для экспрессии CHIK VLPs, инфицировать клетки Sf9 при плотности 2 х 10 6 клеток / мл с рекомбинантным бакуловирусом при множественности инфекции 1 и вернуться к 28 ° C инкубаторе. Как правило, заражает один или два вращающихся колбах, содержащих 250 мл клеток Sf9.
Примечание: В то время как мы не используем этот метод, Sf9 клетки могут быть выращены в шейкер колбах при 28 ° С с использованием шейкера платформы. - Урожай культур после 72-96 ч после инфицирования, или когда жизнеспособность клеток снизилась до 70-80%, как определено трипанового синего в соответствии с протоколом производителя.
Примечание: Клетки продолжают размножаться в то время как зараженный и естьжизнеспособность ~ 80% в Sf9 культурах, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом VLP CHIK на 3-й день после заражения (точек на дюйм). Инфицированных бакуловирусом клетки больше по внешнему виду. Морфология также может меняться от раунда к продолговатые. В конце-стадии бакуловирусом инфекций, клетки стали лизировать. - Передача культуры непосредственно из культуральной суспензии в 50 мл конические пробирки и спин клетки вниз при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
- Собирают супернатанты и фильтруют через 0,22 мкм пор мембрану перед тем осаждения с помощью ультрацентрифугирования.
3. Осаждение / Очистка VLP / СВП
- Стерилизовать 25 мм х 89 мм с открытым верхом Ультрацентрифуга трубы с 70% этанола в биологической безопасности капюшоном. Убедитесь, что этанол высохла перед использованием.
- Нагрузка до 32 мл супернатанта в чистую пробирку. Минимальный объем 25 мл, рекомендуется, чтобы предотвратить коллапс и повреждение недостаточно заполненных Ультрацентрифуга трубок.
- Тщательно подкладывать супернатанты остроумиеч стерильный 3 мл 20% глицерина в PBS (об / об). Убедитесь, что трубки сбалансированы.
- Спин в 135000 мкг в течение 4 ч при 4 ° С.
- Отберите супернатант, обеспечивая осадок не выбивать из трубки.
- Ресуспендируют осаждали VLPs на дне пробирки стерильной PBS энергично пипетированием вверх и вниз. Количество PBS требуется для ресуспендирования VLP, зависит от того, VLP общий выход белка и последующих применений. Как правило, каждый ресуспендируют осадок в VLP, по меньшей мере 100 мкл.
- Образцы Хранить 4 ° C для кратковременного хранения и хранения -80 ° C для длительного хранения.
4. Определение протеина урожайностью и специфического антигена Урожайность
- Определить общее содержание белка с использованием коммерческого способа Количественную оценку белка, такие как BCA анализа в соответствии с протоколом производителя.
- Для оценки конкретного содержания антигена, выполняют прямую иммуноферментного анализа (ELISA) путем нанесения серийных разведений стандартного антигена и 2-51; г общего образца белка на ИФА 96-луночных плоскодонных пластины.
- Последующие с антиген-специфических антител, чтобы исследовать на наличие антигенов на пластине и использовать традиционные основания разработки ELISA для производства обнаруживаемыми абсорбцию для микропланшет-ридером. На рисунке 2 репрезентативных результатов HA и ELISA анализа для образца HA-VLP , выражающей; многие комбинации HA и NA являются , возможно , но выходы могут отличаться от совместимости HA-NA 15.
Примечание: Антиген-специфические антитела имеют вариабельные сродства и рекомендуется, чтобы конечная точка разведения титрование антител определяется перед выполнением VLP количественной оценки. Коммерческие антитела Предложили концентрации или разбавления диапазоны для использования в ELISA, а также предлагаемые протоколы.
- Последующие с антиген-специфических антител, чтобы исследовать на наличие антигенов на пластине и использовать традиционные основания разработки ELISA для производства обнаруживаемыми абсорбцию для микропланшет-ридером. На рисунке 2 репрезентативных результатов HA и ELISA анализа для образца HA-VLP , выражающей; многие комбинации HA и NA являются , возможно , но выходы могут отличаться от совместимости HA-NA 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
выходы VLP были переменными с помощью вирусного антигена дизайн конструкции. В этом протоколе, мы продемонстрировали использование насекомых и млекопитающих клеток для производства СВП или VLPs в супернатанте и очистки с помощью ультрацентрифугирования. Четыре подтипа DENV PRM / E кассет экспрессии структурного гена были использованы для создания версии DenV СВП (разграниченные , как 1-4) в таблице 1 и демонстрируют диапазон между 1.1-2.6 мг общего белка в 0,6 мл объемах. Для VLPs, которые требуют три генные конструкции, мы обнаружили, оптимизированное соотношение трансфекции ДНК 1: 1: 2 для HA: NA: Gag соответственно синтезировать VLPs гриппа; в отличие от этого, одна плазмида экспрессирующих множественные Чикунгунья, вирусные белки, была адекватной для генерирования рекомбинантного бакуловируса и млекопитающих CHIK VLP. Кроме того, процедура трансфекции двойного плазмида также возможно с клетками млекопитающих, в том, как такие РСВ F и Gag, трансфицированных в соотношении 1: 1, и дает прибли-зительно 0,01 мг / мл общего супернатанта культуры клеток. Как показано в таблице 1, CHIK СВП выход из клеток Sf9 , может находиться в диапазоне между 0.008-0.016 мг общего белка / мл объема супернатанта, в то время как производство через 293T млекопитающих дает 10-кратное уменьшение белка. Между двумя версиями H3N2 VLPs с использованием различных дикого типа, полнометражные HA плазмид, то H3N2 VLP Образец 2 имел уменьшенный выход как общего белка и конкретного содержания HA. Другой образец VLP HA величины показаны на рисунках 2 и 3 и показывают , как HA и ELISA используются для оценки содержания поверхности на VLPs. Как и в случае обычного прямого метода ELISA, стандартная кривая генерируется с использованием известных концентраций рекомбинантного HA для сравнения ELISA реактивности к образцу Н3 VLP, наносили на пластину ELISA. ELISA или аналогичные иммунологический рекомендуются для количественного определения VLP, которые имеют легкодоступных моноклональные антитела с известными к перекрестной реактивности хорошо сохранившегося epitOpes, но не могут быть доступны для всех антигенов. RSV F хорошо характеризуется, следовательно, ELISA с использованием моноклональных анти-RSV F антитела также применимо для количественного определения поверхности F на гранулированной RSV F VLPs. В дополнение к функциональности антигенов, способных распознавать антигены специфическими антителами, VLP препараты могут быть структурно оценены с помощью электронной микроскопии. Фиг.4 представляет собой изображение , показывающее представитель , что ГК (ГАГ-ядро) VLPs гриппа успешно экспрессированы, собран и очищен , как VLPs.
| Описание | Культура Vol (мл) | урожай | Общий объем | Общий выход белка (мг) | Выход (мг) / объем (мл) | Конкретное содержание антигена |
| DENV1 SVP | 293T186 | 4 d | 0,6 мL | 1,115 | 0.006 | й |
| DENV2 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 мл | 2.5 | 0,0134 | й |
| DENV3 SVP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 мл | 1,536 | 0,0083 | й |
| DENV4 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 мл | 2,613 | 0,014 | й |
| CHIK VLP | Sf9 / 186 | 3 точек на дюйм | 0,6 мл | 1.503 | 0,0081 | й |
| CHIK VLP | Sf9 / 500 | 4 точек на дюйм | 2,0 мл | 8,276 | 0,0166 | й |
| CHIK VLP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 мл | 0,296 | 0,0016 | й |
| H3N2 VLP 1 | 293T /216 | 3 d | 0,6 мл | 1,25 | 0,0058 | 1,9 мкг HA / мкл |
| H3N2 VLP 2 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 мл | 0,956 | 0,0044 | 0,96 мкг HA / мкл |
| H3N2 VLP 3 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 мл | 1.6 | 0,0074 | 1,2 мкг HA / мкл |
| H3N2 VLP 4 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 мл | 1,54 | 0,0071 | 0,98 мкг HA / мкл |
| RSV F VLP | 293T / 216 | 3 d | 0,6 мл | 2.3 | 0,0106 | 0,15 мкг РСВ F / мкл |
| Д = дней после трансфекции = дней дюйм после заражения | ||||||
Таблица 1: субвирусного и v ирус подобные выходы частиц по конструкции. Представительные данные объемов VLP, общий выход белка (определяется с помощью обычного анализа BCA) или конкретное содержание антигена (определяется ELISA) показан среди множества SVP / VLP конструкций. Урожайность меняется из-за разницы в SVP сборки / VLP и типа клеток, а также максимальные выходы могут потребовать оптимизации пользователя. Различные варианты либо DENV1-4 различаются в зависимости от серотипа, в то время как CHIK VLP, используют ту же последовательность, но препараты различаются в любом объеме или типа клеточной культуры. Различные версии H3N2 VLPs (1-4) выражают четыре уникальных последовательностей HA, которые разделяют HA-специфический ELISA реактивную эпитоп и были экспрессируется совместно с тем же ядром НС и Gag. РСВ F VLP, которая генерируется из двойного плазмиды трансфекции РСВ F и Gag, был синтезирован и РСВ F содержание аппроксимировалась использованием РСВ F специфический ELISA анализ.
.jpg "/>
Рисунок 1:. Подход - VLP , дизайн, синтез и очистка Схематическое изображение конструкции гена плазмида для экспрессии вирусных структурных белков , которые будут образовывать VLPs: (А) совместная экспрессия нескольких структурных белков путем котрансфекции трех плазмид в клетках 293Т , (в) экспрессию структурных белков из одного гена кассетой , закодированной в одной плазмиды в клетках 293Т и (с) , рекомбинантный бакуловирус кодирования CHIK структурные белки используют для инфицирования Sf9 клетки , культивированные в центрифужных колбах для стимуляции роста клеток высокой плотности в виде суспензии , В VLPs собирают из среды для культивирования клеток, выясненных клеточного мусора, и отделен от не-частиц с помощью осаждения с помощью ультрацентрифугирования на 20% глицерина демпфировать. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
. Рисунок 2: Пример гемагглютинации анализ Н3 VLPs Обычный анализ гемагглютинации проводили на репрезентативной выборки H3N2 VLP и соответствующего осветленного супернатанта; H3N2 HA анализ может быть выполнен с использованием 0,8% индейка эритроциты и морских свинок красных кровяных клеток (не показано). Общее содержание белка оценивали с помощью стандартного анализа BCA на очищенном VLP и не проводили и не рекомендуется для осветленной надосадочной жидкости. ELISA проводили на очищенном VLP и содержание HA оценивали с использованием рекомбинантного стандарта HA известной концентрации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Ex обильный Н3 ИФА для количественного определения содержания H3 в Н3 VLPs. ИФА планшет покрывали с серийными разведениями рекомбинантного стандарта HA известной концентрации и разведенных образцов H3N2 VLP , полученных из различных последовательностей , HA (Образцы 1-9). Корреляция концентрации (мкг / мкл) стандарта до значений оптической плотности, полученных при 492 нм (OD), концентрации получаются путем выводя значения Х, пересекающую линейной части калибровочной кривой. Разведения рекомбинантных HA стандартных и неизвестных образцов были загружены в двух экземплярах в скважинах & B или C & D, соответственно. Конечная концентрация образца VLP определяется путем умножения концентрации на коэффициент разбавления образца VLP. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
4041 / 54041fig4.jpg "/>
Рисунок 4: Электронная микроскопия HA-VLPs использованием Gag-жильный представитель электронной микроскопии образ очищенного гриппа HA VLPs.. VLPs собираются в сферические частицы , покрытые HA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы использовали методы, описанные выше, чтобы успешно экспрессировать и очистить СВП и VLPs, состоящие из нескольких структурных белков для различных патогенов. В общем, мы используем системы экспрессии в клетках млекопитающих, чтобы произвести наши VLPs. Тем не менее, в наших руках, млекопитающее-клеток, полученную урожайность VLP CHIK были низкими. CHIK выход VLP был более устойчивым при использовании рекомбинантного бакуловируса насекомых клеточной системы. В общем, бакуловирус-системы клеток насекомых, дают более высокие количества рекомбинантных белков, которые могут возникнуть в результате более высоких плотностях клеток, которые могут быть культивированы в центрифужных колбах в сравнении с культурой ткани колбах, а также в связи с высоким уровнем экспрессии чужеродных генов в то время как под контролем бакуловирусного промотора полиэдрина. 16 Тем не менее, недостаток использования бакуловирус само присутствие бакуловирусом в VLP препаратов, которая имеет адъювантной активностью, и косые иммунологические результаты в вакцине из исследований , 17 Мы также обнаружили , изменчивость урожайности гриппа VДолгоиграющие в зависимости от комбинаций НА и NA, используемых; H3N2 VLP2 была относительно снижена доходность по сравнению с H3N2 VLP1, потенциально за счет менее эффективной сборки VLP или NA-15 совместимости и остается в дальнейшем исследовании. Оптимизация конструкций ДНК и коэффициентов трансфекции остаются важные шаги для обеспечения оптимальной урожайности VLP. Мы решили использовать млекопитающим вектор pTR600 последовательно среди наших VLPs млекопитающих на основе, так как выражение, как правило, эффективным и субклонирования удобно с несколькими ферментами рестрикции. Коэффициенты плазмид может быть скорректирована с учетом требований пользователя для повышения урожайности VLP. Тем не менее, как обсуждалось, текущие ограничения производства VLP млекопитающих остаются со стоимостью трансфекцией и способность роста клеток, в текущих тканевых культуральных колбах. Хотя это и не выполняются в этом протоколе, мы наблюдали дополнительное успешное производство VLPs в трансфицированных клетках , когда носитель пополняется свежей ростовой средой (например, OptiMEM) после того, как пихтт урожая 72 ч и последующего сбора VLPs после дополнительных 72 ч, хотя урожайность может быть несколько снижена по сравнению с первым сборником VLPs.
Показана процедура экспрессии вирусных структурных белков в или насекомых или млекопитающих клеточных культур для освобождения VLPs в супернатанте для полуприцепа очистки с помощью ультрацентрифугирования. СВП / VLPs обычно стабильны для использования в антиген иммуноанализа и исследований по вакцинации, и создают меньше угроз безопасности по сравнению с живых вирусных частиц, в частности , для некоторых агентов или высокого патогенного птичьего гриппа (HPAI) штаммов 8,18, которые требуют уровень биологической безопасности 3 (BSL-3) лабораторные условия 19. производство VLP является относительно простым и часто дает частицы, которые могут быть признаны антителами против вызываемых носителями вирусных структурных белков, а не исключительно денатурированных линейными эпитопами. VLPs служить полезной платформой для выявляя специфические иммунные реакции на антиген и можетбыть перспективным кандидатом в разработке вакцин.
Этот протокол демонстрирует два подхода к трансфекцию вирусных генов в системе млекопитающих. На этой иллюстрации, два гена гриппа, HA и NA, котрансфицируют с ВИЧ Gag, чтобы создать VLP, который имеет Gag внутренний стержень, с HA и NA собраны на поверхности. Замена Gag вместо гриппа Матрица 1 (M1) демонстрирует гибкость VLPs Gag основе с неродственных вирусных гликопротеинов, таких как РСВ F и потенциально других. В качестве альтернативы, синтез CHIKV использует структурный ген, кассету, выражающее необходимые компоненты для SVP самосборки, с CHIKV Е белков, представленных на поверхности центра, состоящего из протеина С. Эти два подхода демонстрируют гибкость синтеза VLP, которая требует минимальных структурных вирусных белков, чтобы собрать из трансфицированных клеток.
И, наконец, в то время как мы представили общие протоколы и представительный РесулТ.С. для экспрессии и очистки H3N2, RSV, DENV и CHIKV, эти процедуры легко поддаются для генерации VLPs с использованием других вирусных белков. Эти процедуры были успешно использованы нашей группой в генерации других подтипов вируса гриппа, в том числе H1, Н5 и Н7 вирусов. Кроме того, единственная плазмида, дизайн PRM / E используется для генерации DENV СВП может быть адаптирована для генерации СВП для других членов семьи флавивирусов, которые включают Западного Нила и японского энцефалита. Аналогичным образом, способы производства VLP CHIK могут быть использованы для других членов семьи Togaviridae, в том числе Венесуэлы, Восточной и Западной лошадиного вируса энцефалита.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотим отметить предыдущие члены лаборатории Росса, которые помогли оптимизировать протокол для максимальной эффективности и доходности.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 ml) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
References
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
- Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
- Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
- Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
- Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
- Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
- Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
- Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
- Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
- Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
- Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
- Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
- Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
- Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
- Jarvis, D. L. Methods in Enzymology. 463, Academic Press. 191-222 (2009).
- Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
- Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
- Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).
