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Biology

Expresión y purificación de partículas similares al virus para la Vacunación

Published: June 2, 2016 doi: 10.3791/54041
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Vaccines and Immunology, Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia

Summary

A continuación, se presenta un protocolo para la síntesis de partículas similares a virus, ya sea utilizando baculovirus o sistemas de expresión de mamíferos, y la purificación ultracentrifugación. Este enfoque altamente adaptable se usa para identificar antígenos virales como objetivos de vacunas de una manera segura y flexible.

Abstract

partículas similares a virus (VLP) y partículas subvirales (SVPs) son un enfoque alternativo para el diseño de vacunas viral que ofrece las ventajas de una mayor seguridad de la biotecnología y la estabilidad en el uso de patógenos vivos. No infecciosas y auto-ensamblaje, las VLP se utilizan para presentar proteínas estructurales como inmunógenos, evitando la necesidad de patógenos vivos o vectores virales recombinantes para la administración de antígenos. En este artículo, nos demuestran las distintas fases de diseño y desarrollo de VLP para futuras aplicaciones en las pruebas con animales preclínicos. El procedimiento incluye las siguientes etapas: selección de antígeno, la expresión de antígeno en la línea celular de elección, la purificación de VLP / SVPs, y cuantificación para la dosificación de antígeno. Demostramos uso de ambas líneas celulares de mamíferos e insectos para la expresión de nuestros antígenos y demostrar cómo las metodologías difieren en el rendimiento. La metodología presentada se puede aplicar a una variedad de patógenos y se puede lograr mediante la sustitución de los antígenos con str inmunogénicauctural proteínas de microorganismos de interés del usuario. VLP y SVP ayudan con la caracterización de antígenos y la selección de los mejores candidatos a vacuna.

Introduction

partículas similares a virus (VLP) son una tecnología aprobada para la vacunación humana. De hecho, algunas de las vacunas más contemporáneamente con licencia, incluyendo el virus del papiloma humano (VPH) y la hepatitis Β (HepΒ) vacunas emplean este enfoque. VLP se forman a partir de proteínas estructurales capaces de auto-ensamblaje. Las partículas ensambladas imitan morfologías virales, pero no pueden infectar o replicarse porque carecen de los genomas virales. VLPs pueden ser expresados ​​y purificados a partir de una serie de sistemas procariotas y eucariotas. Una revisión de la literatura reveló que los diferentes sistemas de expresión se emplean en los porcentajes siguientes: - 28% de bacterias, levaduras - 20%, planta - 9%, insectos - 28%, y de mamíferos - 15% 1. De nota, vacunas contra el VPH a base de proteína de la cápside L1 se producen en levadura (Gardasil) o en un sistema de células de insecto (Cervarix) 2. Vacunas HepΒ, Recombivax y Engerix-Β, también se producen en la levadura, y se componen de HepΒ antígeno de superficie de 3, 4.

Utilizamos sistemas de expresión de células de mamíferos y de insectos para producir VLPs que requieren co-expresión de múltiples proteínas estructurales para el montaje. Nuestro trabajo se centra en el diseño, producción, y las vacunas basadas en VLP de purificación contra los patógenos humanos: virus de la influenza, virus sincitial respiratorio (VSR), el virus del dengue (DENV), y el virus Chikungunya (CHIKV). Nuestros métodos son lo suficientemente flexibles para permitir la co-expresión de las múltiples proteínas estructurales de múltiples plásmidos de expresión, o un solo plásmido de expresión (Figura 1). Anteriormente, hemos producido y purificado H5N1 VLPs ensambla a partir de la co-expresión de plásmidos que codifican hemaglutinina de la gripe (HA), neuraminidasa (NA), y la matriz (M1) en las células 293T de riñón embrionario humano 5,6. Los genes fueron optimizados codón para la expresión en células de mamífero y se clonaron en pTR600, un vector de expresión eucariota que contiene el promotor de citomegalovirus temprano inmediato promotor más INTRON A para iniciar transcRiption de insertos eucariotas y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino para la terminación de la transcripción 7. Un enfoque similar utilizando los tres plásmido co-expresión de HA, NA (Figura 1A) y una proteína de matriz viral alternativa, el VIH Gag p55, se utilizó para la generación de subtipo gripe estacional humana H3N2 VLPs en este estudio y se ha demostrado para generar VLP de tamaño similar como partículas de influenza 8. Aunque las vacunas de la gripe predominantemente provocar anticuerpos anti-HA, la adición de neuraminidasa de la gripe media la actividad de sialidasa para permitir VLP en ciernes a partir de células transfectadas 9 y también presentan objetivos inmunogénicos adicionales. Para producir RSV VLP, también seleccionamos el núcleo sin relación de Gag del VIH para diseñar vacunas prototípicas que presentan glicoproteínas de superficie exclusivamente RSV para demostrar aún más la flexibilidad de la formación de VLP utilizando Gag del VIH, como se ha descrito y caracterizado por microscopía electrónica de 6,10 previamente. Otroshan demostrado previamente que las VLP de la presentación de glicoproteínas del RSV pueden ser ensamblados utilizando diversos componentes virales de virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) 11, y la matriz de influenza 12. secuencias glicoproteína de superficie de larga duración se utilizaron en este estudio para retener conformaciones nativas que pueden ser necesarios para la unión al receptor funcional y ensayo de reconocimiento de anticuerpos a través de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

Nuestros ejemplos para el uso de sistemas de expresión de plásmidos individuales para generar partículas son DENV y CHIKV. En el caso de DENV, podemos producir partículas subvirales (SVPs) sin cápside en células 293T de un único plásmido que contiene un casete de expresión / E gen estructural prM 13. El término SVP se utiliza para denotar la falta de una proteína de la cápside del núcleo o en el ensamblaje de las proteínas estructurales virales. CHIK VLPs también se puede producir utilizando un único plásmido que contiene un casete CHIKV gen estructural, la codificación de la cápsida y la envoltura proteínas, o en icélulas NSECT por infectar con un baculovirus recombinante que codifica el mismo casete del gen estructural optimizado para la expresión de células de insecto (Figura 1B - C).

El resultado final de la expresión enfoques analizados anteriormente es la liberación de VLPs en medio de cultivo celular que a continuación se puede purificar a través de ultracentrifugación a través de un cojín de glicerol 20%. En este informe, se presentan métodos para expresar y purificar estas VLP de sistemas de células de mamíferos e insectos.

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Protocol

1. Sistema de expresión de mamífero para la Generación de la influenza H3N2 VLP

  1. Subclón viral estructural glicoproteínas hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) p55 Gag en vectores de expresión eucariotas, tales como pTR600 anteriormente descrito. 7
  2. Amplificar el ADN en Escherichia coli químicamente competente (por ejemplo, DH5a) y aislar el plásmido de transfección grado utilizando un kit de purificación de plásmido según las instrucciones del fabricante. Cantidad de ADN es dependiente sobre el rendimiento y las necesidades del usuario.
  3. Mantener línea celular de mamífero, 293T, en medio de crecimiento que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) a 37 ° C con 5% de CO2 en un incubador humidificado.
  4. Se cultivan las células de tal manera que un matraz de cultivo tisular T-150 contiene 45-75 x 10 6 células por matraz de tal manera que matraz obtiene adherencia de las células completa y 85-95% de confluencia celular por el día siguiente. Inspeccionar las células bajo el microscopio para Conflu deseadarencia.
    Nota: alta densidad celular se recomienda típicamente para producir la expresión de proteína óptima con citotoxicidad mínima cuando el uso de reactivos de transfección comerciales sin embargo un exceso de confluencia puede resultar en acumulación de desechos celulares subproductos y reducir la viabilidad celular.
  5. En el día de la transfección, preparar liposomas y mezcla de ADN según las recomendaciones del fabricante y transfectar células de ADN con una composición de ADN de 1: 1: 2 de HA: NA: Gag con una cantidad de ADN total de 40 g por T-150 matraz. Las soluciones diluidas de ADN y liposomas en el medio de transfección libre de suero sin antibióticos de tal manera que cada matraz contiene un volumen total de 20-30 ml.
    Nota: Índice de construcciones de genes puede requerir la optimización de usuario. Aunque no se ha demostrado aquí, un procedimiento de transfección similar se ha realizado con el virus sincitial respiratorio (RSV) F y Gag del VIH en una relación 1: 1. Para DENV y CHIKV plásmidos de expresión única, con un total de 20 g de ADN por cada frasco T-150 se utilizan para una óptima correoXpression. ADN: transfección proporciones de reactivos están optimizados usuario. Uso recomendado medio de transfección basado en el método de transfección, es decir, las transfecciones de lípidos policatiónicos recomiendan reducción o ausencia de suero bovino fetal por lo tanto medios se puede suplementar con hormonas de crecimiento y oligoelementos para apoyar el crecimiento en ausencia de suero.
  6. Volver a matraces de 37 ° C con 5% de CO2. Para un volumen de 200 ml, utilice 9 T-150 frascos. Las células se mantienen en medio de cultivo de la transfección hasta el día de la cosecha VLP.
  7. sobrenadante de cultivo de la cosecha de las células después de 72 a 96 horas después de la transfección en función de antígeno, o cuando la viabilidad celular se ha reducido a 70 a 80%, como se estimó por inspección microscópica. Transferir el sobrenadante a tubos de 50 ml cónicos y girar las células hacia abajo a 500 x g durante 5 min a 4 ° C para sedimentar los restos celulares.
    Nota: el reemplazo de 3 días con sobrenadante fresco precalentado, el medio de transfección libre de suero de células adherentes se yielda segundo lote de las VLP con un rendimiento similar o ligeramente reducida y debe ser optimizado por el usuario.
  8. sobrenadante piscina y filtrar a través de una membrana de 0,22 micras de poro antes de la sedimentación mediante ultracentrifugación.
  9. Prueba de la actividad de hemoaglutinación de las VLP HA-expresan por ensayo de hemaglutinación estándar 14 utilizando 0,8% de pavo o de glóbulos rojos de mamíferos o proceder con ELISA específico de antígeno. Vea la Figura 2 para resultados representativos.

2. CHIK VLP expresión usando sistema de baculovirus / células de insecto

  1. Generar baculovirus recombinantes que expresan la cápside del virus Chikungunya y proteínas de la envoltura (C-E3-E2-6K-E1) a partir de la cepa S-27 usando un sistema de expresión de baculovirus comercial.
  2. Células Sf9 Cultura Spodoptera frugiperda Sf9 en medio de crecimiento libre de suero con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina a 28 ° C. Utilice 3-5 x 10 5 c / ml para iniciar cultivos en matraces spinner para suspensel crecimiento de células de iones. Pasaje de forma rutinaria cuando se alcanzan densidades de células de 2-4 x 10 6 c / ml (cada 3-4 días).
  3. células de cultivo Sf9 en suspensión en matraces de agitación con agitación a 130 rpm en un sistema de placa agitador multipunto. Para la correcta aireación, mantener volúmenes de cultivo en no más de la mitad del volumen del matraz de agitación.
  4. Para la expresión de CHIK VLPs, infectar células Sf9 a una densidad de 2 x 10 6 células / ml con el baculovirus recombinante a una multiplicidad de infección de 1 y volver a 28 ° C incubadora. Por lo general, infectar a una o dos matraces de agitación, que contienen 250 ml de células Sf9.
    Nota: Mientras que no usamos este método, las células Sf9 pueden cultivarse en matraces de agitación a 28 ° C utilizando una plataforma de agitación.
  5. cultivos de cosecha después de 72-96 horas después de la infección, o cuando la viabilidad celular se ha reducido a un 70-80%, determinada por exclusión de azul de tripano según el protocolo del fabricante.
    Nota: Las células continúan proliferando mientras infectado y no hayLa viabilidad de ~ 80% en cultivos de SF9 infectadas con baculovirus recombinantes CHIK VLP a los 3 días post-infección (dpi). Las células infectadas con baculovirus son más grandes en apariencia. Morfología también puede cambiar de redonda a oblonga. A finales de etapas de infecciones de baculovirus, las células comenzaron a lisar.
  6. culturas de transferencia directamente del cultivo en suspensión en 50 ml tubos cónicos y spin las celdas hacia abajo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
  7. Recoger los sobrenadantes y se filtra a través de una membrana de 0,22 micras de poro antes de la sedimentación mediante ultracentrifugación.

3. Sedimentación / Purificación de VLP / SVPs

  1. Esterilizar con techo abierto tubos de ultracentrífuga de 25 mm x 89 mm con etanol al 70% en la campana de bioseguridad. Asegúrese de que el etanol se haya secado antes de su uso.
  2. Cargar un máximo de 32 ml de sobrenadante en un tubo limpio. Se recomienda un volumen mínimo de 25 ml para evitar el colapso y el daño de los tubos de ultracentrífuga llenos inadecuadamente.
  3. Con cuidado subyacer sobrenadantes ingenioh estéril de glicerol 3 ml 20% en PBS (v / v). Asegúrese de que los tubos están equilibrados.
  4. Giran a 135.000 xg durante 4 horas a 4 ° C.
  5. Aspirar el sobrenadante, lo que garantiza la pastilla no se desplace desde el tubo.
  6. Volver a suspender las VLP sedimenta en la parte inferior de los tubos con PBS estéril pipeteando enérgicamente arriba y hacia abajo. La cantidad de PBS necesario para volver a suspender las VLP depende de la producción de proteína total de VLP y aplicaciones posteriores. Típicamente, resuspender cada pellet VLP en por lo menos 100 l.
  7. Almacenar las muestras 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo y de almacenamiento -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo.

4. La determinación de los rendimientos de proteínas y rendimientos antígeno específico

  1. Determinar el contenido de proteína total usando un método de cuantificación de proteínas comercial, como el ensayo de BCA según el protocolo del fabricante.
  2. Para evaluar el contenido de antígeno específico, realice ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima directo (ELISA) mediante el recubrimiento de diluciones seriadas de antígeno estándar y 2-51; g de muestra de proteína total a una placa de 96 pocillos de fondo plano ELISA.
    1. Siga con anticuerpos específicos de antígeno para investigar la presencia de los antígenos en la placa y el uso de sustratos de desarrollo ELISA convencionales para producir absorbancia detectable para lector de microplacas. Vea la Figura 2 para los resultados representativos de ensayo de HA y ELISA para una muestra de HA-expresión de VLP; muchas combinaciones de HA y NA son, posiblemente, pero los rendimientos pueden diferir de la compatibilidad HA-NA 15.
      Nota: anticuerpos antígeno-específicos tienen afinidades variables y se recomienda que la dilución de punto final-titulación de anticuerpos se determinará antes de realizar la cuantificación de VLP. anticuerpos comerciales tendrán de concentración o dilución rangos sugeridos para su uso en ELISA, así como los protocolos sugeridos.

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Representative Results

los rendimientos de VLP fueron variables de diseño de construcción de antígeno viral. En este protocolo, hemos demostrado el uso de células de insecto y de mamífero para la producción de SVP o VLPs en el sobrenadante y la purificación por ultracentrifugación. Cuatro subtipos de DENV prM / E gen estructural casetes de expresión se utilizaron para construir las versiones de DENV SVPs (demarcadas como 1-4) en la Tabla 1 y demuestran un rango entre 1.1 a 2.6 mg de proteína total en 0,6 ml volúmenes. Para VLP que requieren un período de tres construcciones de genes, encontramos la relación de transfección de ADN optimizada de 1: 1: 2 para HA: NA: Gag, respectivamente, para sintetizar las VLP de la gripe; por el contrario, un solo plásmido que expresa múltiples proteínas virales chikungunya era adecuado para la generación de baculovirus recombinante y de mamífero CHIK VLP. Además, un procedimiento de transfección de doble plásmido también es posible con células de mamíferos, como tal, con RSV F y Gag transfectadas en una relación 1: 1, y produce aproximadamente 0,01 mg / ml de sobrenadante de cultivo de células totales. Como se muestra en la Tabla 1, CHIK rendimiento SVP a partir de células Sf9 puede oscilar entre 0,008 a 0,016 mg de proteína total / ml de volumen de sobrenadante, mientras que la producción a través de mamífero 293T produce una reducción de 10 veces de la proteína. Entre las dos versiones de H3N2 VLP utilizando diferentes de tipo salvaje, de larga duración en los plásmidos de HA, la VLP Muestra H3N2 2 tuvo un rendimiento reducido de ambas proteínas totales y el contenido específico de HA. La otra muestra de VLP cantidades de HA se muestran en las figuras 2 y 3 ilustran cómo y HA y ELISA se utilizan para estimar el contenido de la superficie de las VLPs. Al igual que con un método ELISA directo convencional, una curva estándar se genera utilizando concentraciones conocidas de un HA recombinante para comparar la reactividad ELISA para muestrear H3 VLPs cargó en una placa de ELISA. ELISA o inmunoensayo similares se recomiendan para la cuantificación de las VLP que tienen anticuerpos monoclonales fácilmente disponibles con reactividad cruzada conocida a un Epit bien conservadoOPES, pero puede no estar disponible para todos los antígenos. RSV F está bien caracterizada, por lo tanto, un ELISA usando el anticuerpo anti-RSV F monoclonal también es aplicable para la cuantificación de la superficie F de RSV F granulado VLPs. Además de la funcionalidad antígeno y el reconocimiento de antígenos por anticuerpos específicos, preparaciones de VLP pueden evaluarse estructuralmente por microscopía electrónica. Figura 4 es una imagen representativa que muestra que HA (Gag-básicos) VLPs de la gripe se expresan con éxito, ensamblado, y se purificó como VLPs.

Descripción Cultura Vol (ml) cosecha de una Volumen total Rendimiento Proteína total (mg) Rendimiento (mg) / Vol (ml) El contenido específico de antígeno
SVP DENV1 293T186 4 d 0,6 ml 1.115 0,006 Dakota del Norte
SVP DENV2 293T / 186 4 d 0,6 ml 2.5 0,0134 Dakota del Norte
SVP DENV3 293T / 186 3 d 0,6 ml 1.536 0,0083 Dakota del Norte
SVP DENV4 293T / 186 4 d 0,6 ml 2.613 0,014 Dakota del Norte
CHIK VLP Sf9 / 186 3 dpi 0,6 ml 1.503 0,0081 Dakota del Norte
CHIK VLP Sf9 / 500 4 dpi 2,0 ml 8.276 0,0166 Dakota del Norte
CHIK VLP 293T / 186 3 d 0,6 ml 0,296 0,0016 Dakota del Norte
H3N2 VLP 1 293T /216 3 d 0,6 ml 1.25 0,0058 1,9 g HA / l
H3N2 VLP 2 293T / 216 3 d 0,6 ml 0,956 0.0044 0,96 g HA / l
H3N2 VLP 3 293T / 216 3 d 0,6 ml 1.6 0,0074 1,2 g HA / l
H3N2 VLP 4 293T / 216 3 d 0,6 ml 1.54 0.0071 0,98 g HA / l
F del VRS VLP 293T / 216 3 d 0,6 ml 2.3 0.0106 0,15 g F de RSV / l
una d = días después de la transfección, dpi = días después de la infección

Tabla 1: subviral y v los rendimientos de partículas irus-como por constructo. Los datos representativos de los volúmenes de VLP, el rendimiento total de proteína (determinado por ensayo BCA convencional) o contenido de antígeno específico (determinado por ELISA) se muestra entre una variedad de construcciones de SVP / VLP. Los rendimientos son variables debido a la diferencia en el montaje SVP / VLP y tipo de células, y los máximos rendimientos pueden requerir optimización usuario. Las diversas versiones de cualquiera DENV1-4 difieren según el serotipo, mientras que el CHIK VLP usar la misma secuencia pero los preparativos se diferencian en el volumen o el tipo de cultivo celular. Las diferentes versiones de H3N2 VLP (1-4) expresan cuatro secuencias únicas de HA que comparten un epítopo reactivo específico de HA ELISA y se co-expresan con el mismo núcleo de NA y de la mordaza. El RSV F VLP, que se genera a partir de una transfección de doble plásmido de RSV F y Gag, se sintetizó y el contenido de RSV F se aproximó utilizando el ensayo ELISA específico de RSV F.

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Figura 1:. Approach - VLP diseño, síntesis, y purificación Representación esquemática de diseños de genes de plásmido para la expresión de proteínas estructurales virales que formará VLPs: (A) co-expresión de múltiples proteínas estructurales por co-transfección de tres plásmidos en células 293T , (B) expresión de proteínas estructurales de un solo casete del gen codificado en un único plásmido en células 293T, y (C) baculovirus recombinante que codifica proteínas estructurales CHIK se utiliza para infectar células Sf9 cultivadas en matraces de agitación para promover el crecimiento de células de alta densidad en suspensión . Las VLP se recogen del medio de cultivo celular, aclarado de los restos celulares, y se separan de los no-partículas a través de la sedimentación por ultracentrifugación en un cojín de glicerol al 20%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


. Figura 2: ensayo de hemaglutinación Ejemplo de H3 VLPs Un ensayo de hemaglutinación convencional se realizó en una muestra representativa de VLP H3N2 y su correspondiente sobrenadante clarificado; ensayo H3N2 HA se puede realizar utilizando 0,8% de pavo células rojas de la sangre o conejillo de indias glóbulos rojos (no mostrado). El contenido total de proteína se estimó utilizando el ensayo BCA de serie en el VLP purificado y no se ha realizado o recomendado para sobrenadante clarificado. ELISA se realizó en la VLP purificada y contenido de HA se estimó utilizando un estándar de HA recombinante de concentración conocida. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Ex amplio H3 ELISA para la cuantificación del contenido de H3 en placa H3 VLPs. Un ELISA se revistió con diluciones en serie de un estándar de HA recombinante de concentración conocida y muestras diluidas H3N2 VLP generados a partir de diferentes secuencias de HA (Muestras 1-9). La correlación de la concentración (g / l) de la norma a los valores de densidad óptica obtenidos a 492 nm (OD), las concentraciones se obtienen deduciendo el valor de x que intersecta la porción lineal de la curva estándar. Las diluciones de los estándares y muestras desconocidas HA recombinante se cargaron por duplicado en los pocillos A y B o C y D, respectivamente. La concentración final de la muestra VLP se determina multiplicando la concentración por el factor de dilución de la muestra de VLP. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: La microscopia electrónica de HA-VLP utilizando Gag-core imagen de microscopía electrónica Representante de la gripe HA purificada VLP.. VLP se ensamblan para formar partículas esféricas recubiertas de HA. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hemos utilizado las técnicas descritas anteriormente con éxito para expresar y purificar SVPs y VLP compuestas de múltiples proteínas estructurales de diversos patógenos. En general, se utilizan sistemas de expresión de mamífero para generar nuestros VLP. Sin embargo, en nuestras manos, las células derivadas de mamíferos rendimientos VLP CHIK eran bajos. rendimiento VLP CHIK era más robusto cuando se utiliza un sistema de células de insectos baculovirus recombinante. En general, baculovirus de insectos sistemas de células producen mayores cantidades de proteínas recombinantes, que pueden resultar de las densidades de células superiores que pueden ser cultivadas en matraces de agitación frente a matraces de cultivo de tejidos, y también debido a alto nivel de expresión de genes extraños, mientras que bajo el control del promotor de polihedrina de baculovirus. 16 Sin embargo, una desventaja del uso de baculovirus es la misma presencia de baculovirus en preparaciones de VLP, que tiene actividad adyuvante, y los resultados inmunológicos asimetría en la vacuna estudios 17 también se encontró la variabilidad en el rendimiento de la influenza VLPs dependiendo de las combinaciones de HA y NA utilizados; H3N2 VLP2 había reducido en comparación con el rendimiento relativamente H3N2 VLP1, posiblemente debido al montaje de VLP menos eficiente o NA-15 y la compatibilidad queda por investigarse más a fondo. Optimización de las construcciones de ADN y las proporciones de transfección permanecen pasos críticos para asegurar rendimientos de VLP óptimos. Hemos optado por utilizar un vector de mamífero pTR600 constantemente entre nuestros VLP basadas en mamíferos porque la expresión es generalmente eficaz y subclonación es práctica y dispone de múltiples enzimas de restricción. Las relaciones de los plásmidos se pueden ajustar para las necesidades del usuario para mejorar los rendimientos de VLP. Sin embargo, como se ha discutido, las limitaciones actuales de la producción de VLP de mamíferos siguen siendo con el costo de la transfección y la capacidad de crecimiento de células en matraces de cultivo de tejidos actuales. Aunque no se realiza en este protocolo, se ha observado la producción exitosa adicional de VLP en células transfectadas cuando los medios se repone con medio de crecimiento fresco (por ejemplo, OptiMEM) después de los abetost cosecha 72 horas y la posterior recogida de las VLP después de una 72 hr adicional, aunque los rendimientos pueden estar ligeramente reducida en comparación con la primera colección de VLPs.

Se demuestra un procedimiento para la expresión de proteínas estructurales virales, ya sea en cultivos de células de insecto o de mamífero para liberar VLPs en el sobrenadante para semi-purificación por ultracentrifugación. Los SVP / VLP son generalmente estables para su uso en inmunoensayos de antígenos y estudios de vacunación, y suponen un menor número de amenazas de seguridad en comparación a vivir partículas virales, en particular para agentes selectos o de alta patógeno de la gripe aviar (IAAP) 8,18 cepas, las cuales requieren de bioseguridad de nivel 3 condiciones (BSL-3) de laboratorio 19. la producción de VLP es relativamente simple y a menudo produce partículas que pueden ser reconocidos por anticuerpos generados contra las proteínas estructurales virales nativas, no exclusivamente epítopos lineales desnaturalizados. VLP servir como una plataforma útil para provocar respuestas inmunes específicas para el antígeno y mayoser un candidato prometedor en el desarrollo de vacunas.

Este protocolo demuestra dos enfoques para la transfección de genes virales en el sistema de mamífero. En esta ilustración, dos genes de la gripe, HA y NA, se co-transfectaron con la Gag del VIH para generar una VLP que tiene un núcleo interno de la mordaza, con HA y NA montados en la superficie. La sustitución de la mordaza en lugar de la matriz de influenza 1 (M1) demuestra la flexibilidad de las VLP basadas en la mordaza con glicoproteínas virales no relacionadas, como la proteína F del VRS y potencialmente otros. Alternativamente, la síntesis de CHIKV utiliza un casete del gen estructural, que expresa los componentes necesarios para SVP auto-ensamblaje, con proteínas CHIKV E presentados en la superficie de un centro integrado de la proteína C. Estos dos enfoques demuestran la flexibilidad de la síntesis de VLP, que requiere las proteínas virales estructurales mínimas de montar a partir de células transfectadas.

Finalmente, si bien hemos presentado los protocolos generales y Resul representantets para la expresión y purificación de H3N2, RSV, DENV, y CHIKV, estos procedimientos son fácilmente susceptibles para la generación de las VLP utilizando otras proteínas virales. Estos procedimientos han sido utilizados con éxito por nuestro grupo en la generación de otros subtipos de virus de la influenza, incluyendo H1, H5 y H7. Por otra parte, el único plásmido, diseño prM / E utilizado para la generación de DENV SVPs puede ser adaptado para la generación de SVPs para otros miembros de la familia Flavivirus que incluyen Nilo Occidental y virus de la encefalitis japonesa. Del mismo modo, los métodos de producción de VLP CHIK pueden ser utilizados para otros miembros de la familia Togaviridae, incluyendo el de Venezuela, Este, y virus de la encefalitis equina del oeste.

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Disclosures

Los autores tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Deseamos reconocer a los miembros anteriores del laboratorio de Ross que han ayudado a optimizar el protocolo para la máxima eficiencia y rendimiento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163
DMEM Cellgro 10-013
Lipofectamine Life Technologies L3000075 Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I Life Technologies 31985062
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Life Technologies 10359-016
Cimarec I 6 multipoint stirrer plate ThermoFisher Scientific 50094596
Polyclear ultracentrifuge tubes Seton 7025 Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
Phosphate citrate buffer Sigma P4922
o-phenylenediamine dihydrochloride  Sigma P8287
0.22 μm vacuum filter top (500 ml) Nalgene 569-0020
Glycerol Sigma G5516
H2SO4 Sigma 339741 
Sf-900 II SFM ThermoFisher Scientific 10902-096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
  2. Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
  3. Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
  4. Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
  5. Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
  6. Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
  7. Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
  8. Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
  9. Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
  10. Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
  11. Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
  12. Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
  13. Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
  14. Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
  15. Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
  16. Jarvis, D. L. Methods in Enzymology. 463, Academic Press. 191-222 (2009).
  17. Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
  18. Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
  19. Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).

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Expresión y purificación de partículas similares al virus para la Vacunación
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Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J. Vis. Exp. (112), e54041, doi:10.3791/54041 (2016).

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