Summary
Här presenterar vi ett protokoll för syntes av virusliknande partiklar med hjälp av antingen baculovirus eller däggdjursexpressionssystem, och ultracentrifuge rening. Detta mycket anpassningsbar metod används för att identifiera virala antigener som vaccin mål på ett säkert och flexibelt sätt.
Abstract
Virusliknande partiklar (VLP) och subvirala partiklar (direktörerna) är ett alternativ till viralt vaccin design som erbjuder fördelarna med ökad biosäkerhet och stabilitet över användningen av levande patogener. Icke-infektiös och självsamlande, VLP används för att presentera strukturella proteiner som immunogener, förbi behovet av levande patogener eller rekombinanta virusvektorer för antigenleverans. I den här artikeln visar vi de olika stadierna av VLP design och utveckling för framtida tillämpningar inom preklinisk djurförsök. Förfarandet innefattar följande steg: val av antigen, uttryck av antigen i cellinje val, rening av VLP / direktörerna och kvantifiering för antigen dosering. Vi visar användning av både däggdjurs- och insektscellinjer för uttryckning av våra antigener och visa hur metoder skiljer sig i utbyte. Den metod som presenteras kan tillämpas på en mängd olika patogener och kan åstadkommas genom att ersätta antigenerna med immunogen structural proteiner av användarens mikroorganismen av intresse. VLP och direktörerna hjälpa till med antigen karakterisering och urval av de bästa vaccinkandidater.
Introduction
Virusliknande partiklar (VLP) är en godkänd teknik för mänsklig vaccination. Faktum är att vissa av de mer contemporarily licensierade vacciner, inklusive humant papillomvirus (HPV) och hepatit Β (HepΒ) vacciner använder detta tillvägagångssätt. VLP bildas av strukturproteiner kan självorganisering. De monterade partiklarna härma virus morfologier, men kan inte infektera eller replikera eftersom de saknar virala genom. VLP kan uttryckas och renas från ett antal prokaryota och eukaryota system. En genomgång av litteraturen visar att olika uttryckssystem används på följande priser: bakterier - 28%, jäst - 20%, växt - 9%, insekt - 28%, och däggdjurs - 15% 1. Notera är HPV-vacciner baserade på L1 kapsidproteinet produceras i jäst (Gardasil) eller i ett insektscellsystem (Cervarix) 2. HepΒ vacciner, Recombivax och Engerix-Β, är också produceras i jäst, och är sammansatta av HepΒ ytantigen 3, 4.
Vi använder däggdjurs- och insektscellexpressionssystem för att producera VLP som kräver samexpression av multipla strukturella proteiner för montering. Vårt arbete är inriktat på design, produktion och rening av VLP-baserade vacciner mot humana patogener: influensavirus, respiratoriskt syncytialvirus (RSV), denguevirus (DENV), och chikungunyaen virus (CHIKV). Våra metoder är tillräckligt flexibla för att medge samuttryck av de multipla strukturproteiner från flera expressionsplasmider, eller en enda expressionsplasmid (Figur 1). Tidigare har vi producerat och renat H5N1 VLP sammansatta från samexpression av plasmider som kodar influensa hemagglutinin (HA), neuraminidas (NA), och matrisen (M1) i humana embryonala njur 293T-celler 5,6. Generna kodon-optimerad för uttryck i däggdjursceller och klonades i pTR600, en eukaryot expressionsvektor innehållande de cytomegalovirus omedelbar-tidig promotor plus intron A för att initiera transcription av eukaryota skär och bovint tillväxthormon polyadenyleringssignal för terminering av transkription 7. Ett liknande tillvägagångssätt med hjälp av tre-plasmiden samexpression av HA, NA (figur 1A) och en alternativ viral matrisprotein, HIV Gag p55, användes för generering av mänskligt säsongsinfluensa subtyp H3N2 VLP i denna studie och har visat sig generera VLP av liknande storlek som partiklar influensa 8. Även influensavacciner övervägande framkalla anti-HA-antikroppar, tillsättning av influensa neuraminidas förmedlar sialidasaktivitet att möjliggöra VLP spirande från transfekterade celler 9 och även medföra ytterligare immunogena mål. För att producera RSV VLP, vi valde också den obesläktade kärnan av HIV Gag att utforma prototypiska vacciner som uppvisar uteslutande RSV ytglykoproteiner att ytterligare demonstrera flexibiliteten hos VLP bildning med användning av HIV Gag, såsom tidigare beskrivits, och som kännetecknas av elektronmikroskopi 6,10. andrahar tidigare visat att VLP presenterar RSV glykoproteiner kan monteras med hjälp av olika virala komponenter från Newcastlesjuka-virus (NDV) 11, och influensa matris 12. Fullängds ytglykoprotein sekvenser användes i denna studie att behålla nativa konformationer som kan vara nödvändiga för funktionell receptorbindning och antikroppsanalys erkännande genom enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA).
Våra exempel för användning av enstaka plasmid expressionssystem för att generera partiklar är DENV och CHIKV. I fallet med DENV, kan vi producera subvirala partiklar (direktörerna) med ingen kapsid i 293T-celler från en enda plasmid innehållande en prM / E-strukturgenen expressionskassett 13. Termen SVP används för att beteckna att det saknas en kärna eller kapsidprotein vid montering av virala strukturella proteiner. CHIK VLP kan också framställas med användning av en enda plasmid innehållande en CHIKV strukturell gen kassett, som kodar för kapsid-och höljesproteiner, eller i insect celler genom infektering med ett rekombinant baculovirus som kodar för samma strukturella genkassetten optimerad för insektscelluttryck (Figur 1B - C).
Slutresultatet av uttrycket tillvägagångssätt diskuteras ovan är frisättningen av VLP in i cellodlingsmedium som sedan kan renas via ultracentrifugering genom en glycerolkudde 20%. I denna rapport presenterar vi metoder för att uttrycka och rena dessa VLP från däggdjurs- och insektscellsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mammalian Expression System för generering av influensa H3N2 VLP
- Subklon viral strukturella glykoproteiner hemagglutinin (HA), neuraminidas (NA), och humant immunbristvirus (HIV) Gag p55 i eukaryota expressionsvektorer, såsom tidigare beskrivits pTR600. 7
- Amplifiera DNA i kemiskt kompetenta Escherichia coli (t.ex., DH5a) och isolera transfektion-grade plasmid med användning av en plasmid-reningskit enligt tillverkarens instruktioner. Mängden DNA är beroende av avkastningen och användarens behov.
- Upprätthålla däggdjurscellinje, 293T, i tillväxtmedier innehållande 10% fetalt bovin serum (FBS) vid 37 ° C med 5% CO2 i en fuktad inkubator.
- Odla celler på så sätt att en T-150 vävnadsodlingskolv innehåller 45-75 x 10 6 celler per kolv, så att kolven erhåller fullständig cellvidhäftning och 85-95% cellsammanflytning med följande dag. Inspektera celler under mikroskop för önskad confluency.
Notera: Hög celldensitet typiskt rekommenderas för att ge optimal proteinuttryck med minimal cytotoxicitet när man använder kommersiella transfektionsreagens emellertid över confluency kan resultera i ackumulering av cellulärt avfall biprodukter och minska cellviabiliteten. - På dagen för transfektion, förbereda liposom och DNA-blandningen enligt tillverkarens rekommendationer och transfektera DNA-celler med en DNA-komposition av 1: 1: 2 av HA: NA: Gag med en total DNA-mängd av 40 | j, g per T-150 kolv. Späd DNA- och liposomlösningar i serumfritt transfektion medier utan antibiotika, så att varje kolv innehåller en total volym av 20-30 ml.
Observera: Förhållandet mellan genkonstrukt kan kräva användar optimering. Även om inte visat här, har en liknande transfektion förfarande utförts med respiratoriskt syncytialvirus (RSV) F och HIV Gag vid ett 1: 1-förhållande. För DENV och CHIKV enda expressionsplasmider, totalt 20 mikrogram av DNA per T-150-kolv används för optimal eXpression. DNA: transfektionsreagens förhållanden är användar optimeras. Använd rekommenderade transfektion mediet baserat på transfektion metod, det vill säga polykatjoniska lipid transfektioner rekommenderar minskning eller frånvaro av fetalt bovinserum således media kan kompletteras med tillväxthormoner och spårämnen för att stödja tillväxten i frånvaro av serum. - Retur kolvar till 37 ° C med 5% CO2 inkubator. För en volym av 200 ml, använd 9 T-150-kolvar. Cellerna hålls i transfektion odlingsmedium till dagen för VLP skörd.
- Skörd odlingssupernatant från celler efter 72-96 timmar efter transfektion, beroende på antigen, eller när cellviabiliteten har minskat till 70-80%, vilket uppskattades genom mikroskopisk undersökning. Överför supernatanten till 50 ml koniska rör och centrifugera cellerna ner vid 500 x g under 5 min vid 4 ° C för att pelletera cellrester.
Obs: Byte av tre dagars supernatant med färska förvärmda, serumfritt transfektion media till vidhäftande celler kommer yielda andra mycket VLP med liknande eller något lägre avkastning och bör optimeras av användaren. - Pool supernatanten och filtrera genom ett 0,22 um por membran före sedimentation via ultracentrifugering.
- Testa hemagglutination aktiviteten hos HA-uttryck VLP av standard hemagglutineringsanalys 14 användning av 0,8% kalkon eller däggdjurs röda blodkroppar eller fortsätta med antigen-specifik ELISA. Se Figur 2 för representativa resultat.
2. CHIK VLP Expression Använda Baculovirus / insektscellsystem
- Generera rekombinanta baculovirus som uttrycker Chikungunya virus kapsid och höljesproteiner (C-E3-E2-6K-E1) från S-27-stammen med hjälp av en kommersiell baculovirusexpressionssystem.
- Kultur Spodoptera frugiperda Sf9-celler i serumfritt Sf9 tillväxtmedium med 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin vid 28 ° C. Använd 3-5 x 10 5 c / ml för att initiera spinner flaskkulturer för suspension celltillväxt. Passage rutinmässigt när de når celltätheter av 2-4 x 10 6 c / ml (var 3-4 dagar).
- Kultur Sf9-celler i suspension i spinnerflaskor med omrörning vid 130 rpm på en multi omrörare plattsystem. För korrekt luftning, underhålla kulturvolymer på inte mer än hälften av volymen av spinnerkolven.
- För expression av CHIK VLP, infektera Sf9-celler vid en densitet av 2 x 10 6 celler / ml med rekombinant baculovirus vid en multiplicitet av infektion av 1 och återgå till 28 ° C inkubator. Typiskt, infektera en eller två spinnerkolvar, innehållande 250 ml Sf9-celler.
Obs: Även om vi inte använder den här metoden kan Sf9-celler odlas i skakkolvar vid 28 ° C med hjälp av en shaker plattform. - Skörd odlingarna efter 72-96 h efter infektion, eller då cellviabiliteten har sjunkit till 70 till 80% enligt bestämning med trypanblåexklusion enligt tillverkarens protokoll.
Obs: Cellerna fortsätter att föröka sig medan infekterade och det finnsen ~ 80% viabilitet i Sf9 odlingar infekterade med rekombinanta CHIK VLP baculovirus vid 3 dagar efter infektion (dpi). Bakulovirus-infekterade celler är större i utseende. Morfologi kan också ändras från runda till ovala. I sena stadier av baculovirus infektioner, började cellerna att lysera. - Överför kulturer direkt från suspensionskultur i 50 ml koniska rör och snurra celler nedåt på 500 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
- Samla supernatanterna och filtrera genom ett 0,22 um por membran före sedimentation via ultracentrifugering.
3. Sedimente / Rening av VLP / direktörerna
- Sterilisera 25 mm x 89 mm öppen ovan ultracentrifugrör med 70% etanol i biosäkerhet huva. Se till att etanolen har torkat bort före användning.
- Fyll på upp till 32 ml av supernatanten i ett rent rör. En minimal volym av 25 ml rekommenderas för att förhindra kollaps och skador otillräckligt fyllda ultracentrifugrör.
- låg bakom noggrant supernatanter with steril 3 ml 20% glycerol i PBS (volym / volym). Se till att rören är balanserade.
- Centrifugering vid 135.000 xg under 4 h vid 4 ° C.
- Aspirera supernatanten säkerställer pelleten inte rubba från röret.
- Resuspendera sedimente VLP vid botten av rören med sterilt PBS genom kraftig pipettering upp och ned. Mängden PBS som behövs för att resuspendera VLP beror på VLP totala proteinutbyte och efterföljande tillämpningar. Typiskt, resuspendera varje VLP pelleten i åtminstone 100 l.
- Förvara proverna 4 ° C för korttidslagring och -80 ° C lagring för långtidsförvaring.
4. Fastställande proteinutbyten och specifikt antigen Avkastningen
- Bestäm den totala proteinhalten med hjälp av en kommersiell protein kvantifiering metod, såsom BCA-analys enligt tillverkarens protokoll.
- För att bedöma specifika antigeninnehåll, utföra direkta enzymkopplad immunsorbentanalys (ELISA) genom att belägga serieutspädningar av standardantigenet och 2-51; g totalt proteinprovet på en ELISA 96-brunnars flatbottnad platta.
- Följa med antigenspecifika antikroppar för att sondera närvaron av antigenerna på plattan och använda konventionella ELISA-utveckling substrat för att producera detekterbar absorbans för mikroplattläsare. Se Figur 2 för representativa resultat av HA och ELISA-analys för ett prov HA-uttryck VLP; många kombinationer av HA och NA är möjligen men avkastningen kan skilja på HA-NA kompatibilitet 15.
Obs: Antigen-specifika antikroppar har variabla affiniteter och det rekommenderas att endpoint-utspädning antikroppstitrering bestämmas innan du utför VLP kvantifiering. Kommersiella antikroppar skall ha ordinerat koncentrations- eller utspädningsintervall för användning i ELISA, liksom föreslagna protokoll.
- Följa med antigenspecifika antikroppar för att sondera närvaron av antigenerna på plattan och använda konventionella ELISA-utveckling substrat för att producera detekterbar absorbans för mikroplattläsare. Se Figur 2 för representativa resultat av HA och ELISA-analys för ett prov HA-uttryck VLP; många kombinationer av HA och NA är möjligen men avkastningen kan skilja på HA-NA kompatibilitet 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VLP avkastningen var variabel genom virusantigen konstruktion design. I detta protokoll har vi visat användning av insekts- och däggdjursceller för produktion av SVP eller VLP i supernatanten och rening genom ultracentrifugering. Fyra subtyper av DENV prM / E strukturella genuttryck kassetter användes för att konstruera de versioner av DENV direktörerna (avgränsade som 1-4) i tabell 1 och visar ett område mellan 1,1 till 2,6 mg totalt protein i 0,6 ml volymer. För VLP som kräver en tre genkonstruktioner, fann vi optimerade DNA-transfektion förhållandet 1: 1: 2 för HA: NA: Gag respektive syntetisera influensa VLP; i motsats härtill en enda plasmid som uttrycker multipla Chikungunya virala proteiner var lämplig för generering av rekombinanta baculoviruset och däggdjurs CHIK VLP. Dessutom är en dubbel-plasmid transfektion förfarande också möjligt med däggdjursceller, som till exempel med RSV F och Gag transfekterade på en 1: 1-förhållande, och ger approxifär 0,01 mg / ml av totalt cellkultur supernatant. Såsom visas i Tabell 1, kan CHIK SVP utbyte från Sf9-celler variera mellan 0,008-0,016 mg totalt protein / ml supernatant volym medan produktionen genom däggdjurs 293T ger en 10-faldig reduktion av protein. Mellan de två versionerna av H3N2 VLP användning av olika vildtyp, fullängds HA plasmider, H3N2 VLP Prov 2 hade en reducerad utbytet av både totalt protein och specifik HA-innehåll. Andra provet VLP HA kvantiteter visas i figurerna 2 och 3 och illustrerar hur HA och ELISA används för att uppskatta innehållet ytan på VLP. Som med en konventionell direkt ELISA-metoden, är en standardkurva genereras med användning av kända koncentrationer av ett rekombinant HA för att jämföra ELISA-reaktivitet till prov H3 VLP laddades på en ELISA-platta. ELISA eller liknande immunanalys rekommenderas för kvantifiering av VLP som har lätt tillgängliga monoklonala antikroppar med känd korsreaktivitet till en väl bevarad epitopes, men kanske inte är tillgängliga för alla antigener. RSV F är väl kännetecknas därför en ELISA med användning av monoklonal anti-RSV F-antikroppen är också för kvantifiering av ytan F på pellet RSV F VLP. Förutom antigen funktionalitet och antigenigenkänning genom specifika antikroppar, kan VLP-beredningar vara strukturellt bedömas genom elektronmikroskopi. Figur 4 är en representativ bild som visar att HA (Gag-kärna) influensa VLP är uttrycktes framgångsrikt, monteras, och renas såsom VLP.
| Beskrivning | Kultur Vol (ml) | skörd a | Total volym | Totalt protein Utbyte (mg) | Utbyte (mg) / vol (ml) | Specifik antigeninnehåll |
| DENV1 SVP | 293T186 | 4 d | 0,6 ml | 1,115 | 0,006 | nd |
| DENV2 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 ml | 2,5 | 0,0134 | nd |
| DENV3 SVP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 ml | 1,536 | 0,0083 | nd |
| DENV4 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 ml | 2,613 | 0,014 | nd |
| CHIK VLP | Sf9 / 186 | 3 dpi | 0,6 ml | 1,503 | 0,0081 | nd |
| CHIK VLP | Sf9 / 500 | 4 dpi | 2,0 ml | 8,276 | 0,0166 | nd |
| CHIK VLP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 ml | 0,296 | 0,0016 | nd |
| H3N2 VLP 1 | 293T /216 | 3 d | 0,6 ml | 1,25 | 0,0058 | 1,9 mikrogram HA / l |
| H3N2 VLP 2 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 0,956 | 0,0044 | 0,96 mikrogram HA / l |
| H3N2 VLP 3 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 1,6 | 0,0074 | 1,2 mikrogram HA / l |
| H3N2 VLP 4 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 1,54 | 0,0071 | 0,98 mikrogram HA / l |
| RSV F VLP | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 2,3 | 0,0106 | 0,15 mikrogram RSV F / l |
| en d = dagar efter transfektion, dpi = dagar efter infektion | ||||||
Tabell 1: subvirala och v irus liknande partikel utbyten genom konstruktionen. Representativa data för VLP volymer, är den totala proteinutbytet (bestämt genom konventionell BCA-analys) eller specifikt antigen (bestämd med ELISA) visas bland en mängd olika SVP / VLP konstruktioner. Avkastningen varierar på grund av skillnader i SVP / VLP montering och celltyp, och maximala utbyten kan kräva användar optimering. De olika versionerna av antingen DENV1-4 variera beroende på serotyp, medan CHIK VLP använda samma sekvens men förberedelserna skiljer sig antingen volym eller cellodlings typ. De olika versionerna av H3N2 VLP (1-4) uttrycker fyra unika HA-sekvenser som delar en HA-specifik ELISA reaktiva epitopen och samuttrycktes med samma NA och Gag kärna. RSV F VLP, som genereras från en dual-plasmid transfektion av RSV F och Gag, syntetiserades och RSV F-halten approximeras med användning av RSV F-specifik ELISA-analys.
.jpg "/>
Figur 1:. Approach - VLP design, syntes och rening Schematisk representation av plasmid genen mönster för expression av virala strukturella proteiner som kommer att bilda VLP: (A) samuttryck av multipla strukturella proteiner genom sam-transfektion av tre plasmider i 293T-celler , (B) expression av strukturella proteiner från en enda gen kassett kodas i en enda plasmid i 293T-celler, och (C) rekombinant baculovirus som kodar CHIK strukturella proteiner används för att infektera Sf9-celler odlade i spinnerflaskor för att främja hög densitet celltillväxt i suspension . VLP skördas från cellkulturmedia, klar av cellrester, och separeras från icke-partiklar via sedimentering genom ultracentrifugering på en glycerolkudde 20%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 2: Exempel hemagglutineringsanalys av H3 VLP En konventionell hemagglutination analys utfördes på ett representativt urval av H3N2 VLP och dess motsvarande klarnade supernatanten; H3N2 HA-analys kan utföras med användning 0,8% kalkon röda blodkroppar eller marsvin röda blodkroppar (ej visat). Totalt proteininnehåll beräknas med hjälp av standard BCA-analys på det renade VLP och utfördes inte eller rekommenderas för klarnade supernatanten. ELISA utfördes på det renade VLP och HA innehåll uppskattades med hjälp av en rekombinant HA standard med känd koncentration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ex gott H3 ELISA för kvantifiering av H3 innehåll i H3 VLP. En ELISA-platta belades med serieutspädningar av en rekombinant HA standard med känd koncentration och utspädda H3N2 VLP prover som genereras från olika HA-sekvenser (prov 1-9). Korrelering av den koncentration (pg / il) av standard som de optiska densitetsvärdena som erhölls vid 492 nm (OD), är koncentrationer erhålles genom att härleda x-värde som skär den linjära delen av standardkurvan. Utspädningar av rekombinanta HA standard och okända prov laddades i två exemplar brunnar A & B eller C & D, respektive. Den slutliga koncentrationen av VLP provet bestäms genom att multiplicera koncentrationen av utspädningsfaktorn för VLP provet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4041 / 54041fig4.jpg "/>
Figur 4: Elektronmikroskopi av HA-VLP med hjälp av Gag-core representant elektronmikroskopbild av renat influensa HA VLP.. VLP montera in sfäriska partiklar belagda med HA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har använt den teknik som beskrivs ovan för att framgångsrikt uttrycka och rena direktörerna och VLP sammansatta av flera strukturella proteiner för olika patogener. I allmänhet använder vi däggdjursexpressionssystem för att generera våra VLP. Men i våra händer, som härrör från däggdjur-cell Chik VLP avkastningen var låg. CHIK VLP Utbytet var mer robust när man använder ett rekombinant baculovirus-insektscellsystem. I allmänhet, baculovirus-insektscellsystem ger större mängder av rekombinanta proteiner, som kan bli följden av de högre celltätheter som kan odlas i spinnerflaskor kontra vävnadsodlingskolvar, och även på grund av hög nivå av uttryck av främmande gener medan under kontroll av bakulovirus polyhedrinpromotorn. 16 emellertid är en nackdel med att använda baculovirus själva närvaron av baculovirus i VLP-preparat, som har adjuvansaktivitet, och skeva immunologiska resultat i vaccinstudier 17 Vi fann också variabiliteten i ett utbyte av influensa VLP beroende på HA och NA kombinationer som används; H3N2 VLP2 hade relativt reducerad avkastning jämfört med H3N2 VLP1, eventuellt på grund av mindre effektiv VLP montering eller NA-kompatibilitet 15 och återstår att utredas vidare. Optimering av DNA-konstruktioner och transfektion förhållanden förblir avgörande steg för att säkerställa optimala VLP avkastning. Vi valde att använda en däggdjursvektor pTR600 konsekvent bland våra däggdjursbaserade VLP eftersom uttryck är generellt effektiv och subkloning är bekvämt med flera restriktionsenzymer. Förhållanden av plasmider kan justeras för användarens behov att förbättra VLP avkastning. Men som diskuterats nuvarande begränsningar av däggdjurs VLP produktion kvar med kostnaden för transfektion och celltillväxtkapacitet i nuvarande vävnadsodlingsflaskor. Även om det inte utförs i detta protokoll, har vi observerat ytterligare framgångsrik produktion av VLP i transfekterade celler när media fylls med färskt tillväxtmedier (t.ex. OptiMEM) efter granarnat 72 timmar skörd och efterföljande insamlingen av VLP efter ytterligare 72 timmar, även om avkastningen kan vara något reducerad jämfört med den första samlingen av VLP.
Vi visar ett förfarande för att uttrycka virala strukturella proteiner i antingen insekts- eller däggdjurscellkulturer för att frigöra VLP i supernatanten för semi-rening genom ultracentrifugering. SVP / VLP är i allmänhet stabila för användning i antigenimmun och vaccinationsstudier, och utgör färre säkerhets hot jämfört med levande viruspartiklar, i synnerhet för utvalda medel eller hög patogen fågelinfluensa (HPAI) stammar 8,18, som kräver biosäkerhetsnivå 3 (BSL-3) laboratorieförhållanden 19. VLP produktion är relativt enkel och ofta ger partiklar, som kan kännas igen av antikroppar som framkallats mot nativa virala strukturella proteiner, inte uteslutande denaturerade linjära epitoper. VLP fungera som en användbar plattform för att framkalla specifika immunsvar mot antigenet och kanvara en lovande kandidat i vaccinutveckling.
Detta protokoll visar två metoder för transfektion virala gener i däggdjurssystem. I denna illustration, två influensagener, HA och NA samtransfekteras med HIV Gag att generera en VLP som har en Gag inre kärna, med HA och NA monteras på ytan. Substitution av Gag istället för influensa Matrix 1 (M1) visar flexibiliteten hos Gag-baserade VLP med obesläktade virala glykoproteiner, såsom RSV F och potentiellt andra. Alternativt syntesen av CHIKV utnyttjar en strukturell gen kassett, vilken uttrycker nödvändiga komponenter för SVP självmontering, med CHIKV E-proteiner som presenteras på ytan av ett centrum som består av C-protein. Dessa två tillvägagångssätt visar flexibiliteten i VLP syntes, som kräver minimalt strukturella virusproteiner att montera från transfekterade celler.
Slutligen, medan vi presenterade allmänna protokoll och representativ results för uttryck och rening av H3N2, RSV, DENV och CHIKV dessa förfaranden är lätt mottagliga för generering av VLP som använder andra virala proteiner. Dessa förfaranden har med framgång använts av vår grupp i genereringen av andra influensavirus subtyper inklusive H1, H5 och H7-virus. Dessutom enda plasmid, prM / E-utförande används för generering av DENV direktörerna kan anpassas för generering av direktörerna för andra medlemmar av Flavivirus familjen som inkluderar West Nile och japanska encefalitvirus. På samma sätt kan metoder för CHIK VLP produktion användas för andra medlemmar av familjen Togaviridae, däribland venezuelansk, öst och väst hästencefalitvirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill erkänna tidigare medlemmar av Ross lab som har bidragit till att optimera protokollet för maximal effektivitet och avkastning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 ml) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
References
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
- Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
- Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
- Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
- Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
- Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
- Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
- Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
- Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
- Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
- Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
- Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
- Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
- Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
- Jarvis, D. L. Methods in Enzymology. 463, Academic Press. 191-222 (2009).
- Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
- Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
- Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).
