Summary
Burada, bakulovirüs ya da memeli sentezleme sistemleri ve ultrasantrifügasyon arıtma kullanarak virüs benzeri partiküller sentezlenmesi için bir protokol mevcut. Bu son derece özelleştirilebilir yaklaşım, güvenli ve esnek bir şekilde aşı hedefleri olarak viral antijenleri tanımlamak için kullanılır.
Abstract
Virüs benzeri partiküller (VLP'ler) ve subviral parçacıkları (SVPs) canlı patojenlerin kullanımı üzerinde artmış biyo-güvenlik ve kararlılık avantajlar sağlar viral aşı tasarımı için alternatif bir yaklaşım bulunmaktadır. Bulaşıcı olmayan ve kendi kendine montaj VLP'ler canlı patojenlerin veya antijen teslimat için rekombinant viral vektörler için ihtiyaç kalmaz, immünojen olarak yapısal proteinleri sunmak için kullanılır. Bu yazıda, klinik öncesi hayvan testleri gelecekteki uygulamalar için VLP tasarım ve geliştirme farklı aşamalarında göstermektedir. Prosedür, aşağıdaki aşamaları içerir: bir antijen dozu için antijenin bir seçim, seçim hücre hattı, VLPler / SVPs saflaştırılmasında antijenin ekspresyonunu ve miktar tayini. Biz antijenlerinin ifadesi için hem memeli ve böcek hücre çizgilerinin kullanımını göstermektedir ve metodolojileri verimle farklılık gösterilmektedir. sunulan yöntem patojenlerin için geçerli olabilir ve immünojenik str antijenleri değiştirilmesi ile elde edilebilirilgi kullanıcının mikroorganizma uctural proteinleri. VLP'ler ve SVPs antijen karakterizasyonu ve en iyi aşı adaylarının seçimi ile yardımcı olur.
Introduction
Virüs benzeri partiküller (VLP'ler), insan aşılama için onaylanmış bir teknolojidir. Aslında, insan papilloma virüsü (HPV) ve hepatit beta da dahil olmak üzere daha çağdaş lisanslı aşıların, bazı (HepΒ) aşılar bu yaklaşımı kullanır. VLP'ler kendini montaj yapabilen yapısal proteinlerden oluşur. monte parçacıklar viral morfolojileri taklit, ancak enfekte ya da viral genomları eksikliği nedeniyle çoğaltma yapamaz. VLP'ler ifade Prokaryotik ve ökaryotik sistemlerde bir dizi saflaştırılır. -% 28, maya -% 20, bitki -% 9, böcek -% 28, ve memeli -% 15 1 bakteri: literatürün gözden farklı ekspresyon sistemleri aşağıdaki oranlarda istihdam edildiği saptandı. Dikkat çekici bir şekilde, L1 kapsid proteini göre aşılar mayalar (Gardasil) 'de ya da bir böcek hücre sistemine (Cervarix) 2 üretilir. HepΒ aşılar Recombivax ve Engerix-Β da mayada üretilir ve HepΒ yüzey antijeninin 3 oluşmaktadır4.
Bu montaj için çok sayıda yapısal proteinlerin ko-ifadesini gerektiren VLP'lerini üretilmesi için, memeli ve böcek hücre ifade sistemlerini kullanır. grip virüsü, solunum sinsityal virüs (RSV), dang virüsü (DENV) ve chikungunya virüsü (CHIKV): Çalışmalarımız insan patojenlere karşı tasarımı, üretim ve arıtma VLP-bazlı aşılar üzerinde duruluyor. Bizim yöntemleri birden fazla ekspresyon plazmidleri birden fazla yapısal proteinlerin birlikte ekspresyonu ya da tek bir sentezleme plasmidi (Şekil 1) sağlamak için yeterince esnektir. Daha önce, üretilen ve saflaştırılmış H5N1 VLP'ler insan embriyonik böbrek 293T hücrelerinde 5,6 influenza hemaglutinini (HA), nöraminidaz (NA) ve matris (M + -1) kodlayan plasmidin birlikte ekspresyonundan toplandı. genler, memeli hücrelerinde ekspresyon için kodon-optimize edilmiş ve pTR600, transkripsivonel başlatmak için sitomegalovirüs hemen-erken promoteri artı intron A içeren bir ökaryotik ifade vektörüne klonlanmıştırÖkaryotik ekler ription ve transkripsiyon 7 sonlandırılması için sığır büyüme hormonu poliadenilasyon sinyali. HA, NA (Şekil 1A) ve alternatif bir viral matriks proteini, HIV gag p55, üç plazmid ko-ifadesini kullanan benzer bir yaklaşım, bu çalışmada, insan mevsimsel grip alt H3N2 VLP'lerin üretimi için kullanılmıştır ve elde gösterilmiştir grip parçacıklar 8 olarak benzer büyüklükteki VLP'ler. Influenza aşıları baskın anti-HA antikor ortaya rağmen, grip nöraminidaz eklenmesi transfekte edilmiş hücrelerin 9 ve ayrıca mevcut olmayan ilave imünojenik hedeflerden filizlenen VLP sağlamak için siyalidaz aktivitesi aracılık eder. RSV VLP'lerini üretmek için, aynı zamanda, daha önce tarif edilen ve elektron mikroskopi 6,10 ile karakterize edilen, ayrıca HIV gag ile VLP'lerin oluşumu esnekliğini göstermek için özel olarak RSV yüzeyi glikoproteinleri mevcut prototip aşı tasarım HIV gag ilgisiz bir çekirdek parçası seçilebilir. DiğerleriDaha önce RSV glikoproteinleri Newcastle hastalığı virüsü (NDV), 11 ve influenza matris 12 çeşitli viral bileşenler kullanılarak monte edilebilir sunulması VLP'ler göstermiştir. Tam uzunlukta yüzeyi glikoproteini sekansları, enzim-bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile işlevsel bir reseptör bağlanması ve antikor tanıma analizi için gerekli olabilir yerel konformasyonun korumak için bu çalışmada kullanılmıştır.
partikülleri oluşturmak için tekli plazmid sentezleme sistemlerinin kullanımı için örnekler DENV ve CHIKV bulunmaktadır. DENV durumunda, bir prM / e yapısal gen sentezleme kasetini 13 içeren tek bir plazmidden 293T hücrelerinde hiçbir kapsid ile subviral parçacıklar (SVPs) üretebilir. vadeli SVP viral yapısal proteinlerin mecliste bir çekirdek veya kapsid proteini eksikliği belirtmek için kullanılır. CHIK VLP'ler da CHIKV yapısal gen kaseti, kodlayan kapsid ve zarf proteinlerini içeren tek bir plazmid kullanılarak üretilebilir veya ibir rekombinan bakulovirüs böcek hücresi ekspresyon (- Cı Şekil 1B) için optimize aynı yapısal gen kasetinin kodlayan enfekte nsect hücreleri.
Yukarıda ele alındığı yaklaşımları ifade sonuç daha sonra% 20 gliserol tampon ile ultra-santrifüj yoluyla saflaştırılabilir hücre kültür ortamına VLPler sürüm. Bu yazıda, ifade ve memeli ve böcek hücre sistemleri bu VLP'lerini arındırmak için yöntemler sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Grip H3N2 VLP Üretimi 1. Memeli İfade Sistemi
- Alt klon, daha önce tarif edildiği pTR600 ökaryotik ekspresyon vektörleri, viral yapı glikoproteinlerin hemaglutinin (HA), nöraminidaz (NA) ve insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV) Gag P55. 7
- Kimyasal yetkili Escherichia coli (örneğin, DH5α) DNA yükseltmek ve üreticinin talimatlarına göre bir plazmid saflaştırma kiti kullanılarak transfeksiyon dereceli plazmid izole. DNA miktarı verim ve kullanıcının ihtiyaçlarına bağlıdır.
- Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde% 5 CO2 ile 37 ° C 'de% 10 fetal bovin serumu (FBS) içeren büyüme ortamı içinde bir memeli hücre çizgisi, 293T, koruyun.
- T-150 doku kültürü şişesi şişe aşağıdaki gün tam hücre yapışmasını ve% 85-95 hücre confluency elde şekilde şişeye başına 45-75 x 10 6 hücre içerecek şekilde hücreleri büyür. İstenilen conflu için mikroskop altında hücrelerin kontrol edinEnsi.
Not: Yüksek hücre yoğunluğu, tipik olarak, ancak aşırı konfluent yan ürünleri, hücresel atık birikim neden olur ve hücre canlılığı azaltabilir ticari transfeksiyon reaktifleri kullanarak minimum sitotoksik optimal protein elde etmek için önerilmektedir. - NA: 1: HA 2 transfeksiyon günde 1 DNA bileşimi DNA hücreleri, üreticinin tavsiyelerine uygun olarak lipozom ve DNA karışımı hazırlamak ve transfekte Gag T-150 şişesi başına 40 ug toplam DNA miktarı ile. Her şişe, 20-30 ml bir toplam hacme sahip olacak şekilde, antibiyotikler olmadan, serumsuz transfeksiyon ortamı DNA ve lipozom çözüm seyreltilir.
Not: gen yapılarının oranı kullanım optimizasyon gerektirebilir. : 1 oranında Burada gösterilen olmasına rağmen, benzer bir transfeksiyon prosedürü 1 solunum sinsitiyal virüsü (RSV) F ve HIV gag ile işlenmiştir. DENV ve CHIKV tek ekspresyon plazmidleri, T-150 şişesi başına DNA 20 ug toplam uygun e için kullanılanXPression. DNA: transfeksiyon reaktif oranlar kullanıcı optimize edilmiş. Kullanım transfeksiyon yöntemi, temel transfeksiyon ortamı önerilen örneğin polikatyonik lipid transfeksiyon ve böylece ortam hormonlu takviye edilebilir bir azalma ve cenin sığır serumu yokluğunu tavsiye ve serum olmadan büyümesini desteklemek için eser elementler. - % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de şişeler dönün. 200 ml'lik bir hacme için, 9 T-150 şişelerde. Hücreler VLP'ler hasat güne kadar transfeksiyon kültür ortamında tutulur.
- 72-96 saat sonrası transfeksiyon antijeni bağlı veya mikroskobik muayene ile tahmin edilen hücre canlılığı,% 70-80 düşmüştür zaman sonra hücrelerden Hasat kültür süpernatanı. Başına 50 ml konik tüp içine süpernatan ve hücre kalıntıları topak haline 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g hücreleri aşağı doğru döndürün.
Not: yiel olacak yapışık hücrelere taze, önceden ısıtılmış, serumsuz transfeksiyon ortamı ile 3 günlük yüzer değiştirilmesive benzer ya da biraz azaltılmış verim ile VLP'lerinin da ikinci çok kullanıcı tarafından optimize edilmelidir. - ultrasantrifüj yoluyla çökelme öncesi 0.22 um zar içinden Havuz süpernatan ve filtre.
- % 0.8 hindi ya da memeli kırmızı kan hücreleri kullanılarak standart himeglütinasyon denemesi 14 HA-ifade VLP'lerinin hemaglütinasyon aktivitesini test veya antijen spesifik ELISA ile devam edin. Temsilcisi sonuçları için Şekil 2'ye bakınız.
Bakulovirüs / Böcek Hücre Sisteminin Kullanılması 2. CHIK VLP İfade
- ticari bir bakulovirüs sentezleme sistemi kullanılarak S-27 suşu Chikungunya virüsü kapsidini ve zarf proteinleri (Cı-E3-E2-6K-E1) ifade eden yeniden birleştirici baculovirüs oluşturur.
- 28 ° C 'de 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile serumsuz Sf9 büyüme ortamında kültür Spodoptera frugiperda Sf9 hücreleri. Suspens için dönücü şişesi kültürleri başlatmak için 3-5 x 10 5 c / ml kullanınİyon hücre büyümesi. Passage rutin onlar 2-4 x 10 6 c / ml (her 3-4 gün) hücre yoğunlukları ulaştığınızda.
- Bir çok noktalı bir karıştırıcı plaka sistemi 130 rpm'de karıştırılarak döndürücü şişelere süspansiyon kültür Sf9 hücreleri. Doğru havalandırma için, dönen şişeden hiçbir yarısından fazlasını seste kültür hacimleri korumak.
- CHIK VLP'ler ekspresyonu için, 1 enfeksiyon çeşitliliğinde, rekombinan bakülovirüs ile 2 x 10 6 hücre / ml'lik bir yoğunlukta Sf9 hücreleri enfekte ve 28 ° C inkübatör geri dönün. Tipik haliyle, 250 mi Sf9 hücreleri ihtiva eden bir ya da iki döndürme şişeleri enfekte etmektedir.
Not: Bu yöntemi kullanmak yok iken, Sf9 hücreleri bir çalkalama platformu kullanarak 28 ° C'de çalkalama şişelerinde kültüre olabilir. - hücre canlılığı,% 70-80 düşmüştür zaman hasat kültürleri 72-96 st post-enfeksiyon sonrası veya üreticinin protokolüne göre mavi Tripan çıkışı ile belirlendiği gibi.
Not: Hücreler enfekte ise çoğalmaya devam var3 gün sonrası enfeksiyon (dpi) rekombinant CHIK VLP bakülovirüs ile enfekte edilmiş Sf9 kültürlerinde ~% 80 canlılığı. Bakulovirüs enfekte hücreler görünüş olarak daha büyüktür. Morfoloji da dikdörtgen için yuvarlak değişebilir. bakulovirüs enfeksiyonun geç aşamalarında, hücreler lize başladı. - şirketinden süspansiyon kültüründen 50 ml konik tüp içine, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de hücreleri aşağı spin Aktarım kültürleri.
- süpernatantlar toplamak ve Ultrasantrifügasyon yoluyla sedimantasyon önce 0.22 mikron gözenek zarından filtre.
VLP / SVPs 3. Çökelme / saflaştırma
- biyogüvenlik kaput içinde% 70 etanol ile 25 mm x 89 mm üstü açık ultrasantrifüjdeki tüpleri sterilize edin. Etanol kullanılmadan önce kurumadan emin olun.
- Temiz bir tüpe süpernatant 32 ml yükleyin. 25 ml minimal hacim çöküşü ve yetersiz dolu ultrasantrifüjdeki tüplerin zarar görmesini önlemek için tavsiye edilir.
- Dikkatle süpernatanlar zekâ altında yatanPBS h steril 3 ml% 20 gliserol (h / h). Emin tüpler dengeli olduğundan emin olun.
- 4 ° C'de 4 saat boyunca 135,000 x g'de dönerler.
- Süpernatant aspire, pelet sağlanması tüpten çıkarmak değildir.
- Süspanse şiddetle yukarı ve aşağı pipetleme steril PBS ile tüplerin alt kısmında VLP'lerini çöktürülür. PBS miktarı VLPler VLP toplam protein verimi ve alt uygulamalara bağlıdır tekrar süspansiyon gerekiyordu. Tipik olarak, en az 100 | il her VLP pelletini.
- Mağaza örnekleri, uzun süreli depolama için kısa süreli depolama ve -80 ° C'de saklama için 4 ° C.
4. Protein Miktarları ve Spesifik Antijen Verimini belirlenmesi
- Bu üreticinin protokolü doğrultusunda BCA deneyi olarak, ticari bir protein miktar yöntemi kullanılarak toplam protein içeriği belirlenir.
- spesifik antijen içeriği değerlendirmek için standart antijen ve 2-5 seri dilüsyonları kaplama doğrudan enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) yerine1 'dir; ELISA 96 gözlü düz tabanlı bir plakaya toplam protein örneğinin örn.
- plaka antijenlerinin varlığını araştırmak ve mikroplaka okuyucusu için tespit absorbans üretilmesi için geleneksel bir ELISA gelişimi alt tabakaların kullanımı, antijene spesifik antikorlar ile takip edin. VLP HA-eksprese eden bir örnek için HA ve ELISA deneyi için temsili sonuçlar için bkz Şekil 2; HA ve NA birçok kombinasyonları muhtemelen ama verimleri HA-NA uyumluluğu 15 üzerine farklı olabilir.
Not: Antijen spesifik antikorlar, değişken bir ilişki içindedir ve antikor son uç seyreltme titrasyon VLP ölçümü uygulamadan önce tespit edilmesi önerilmektedir. Ticari antikorlar ELISA'da kullanım için önerilen yoğunlaştırmadan veya seyreltmeden aralıkları, hem de önerilen protokoller vardır.
- plaka antijenlerinin varlığını araştırmak ve mikroplaka okuyucusu için tespit absorbans üretilmesi için geleneksel bir ELISA gelişimi alt tabakaların kullanımı, antijene spesifik antikorlar ile takip edin. VLP HA-eksprese eden bir örnek için HA ve ELISA deneyi için temsili sonuçlar için bkz Şekil 2; HA ve NA birçok kombinasyonları muhtemelen ama verimleri HA-NA uyumluluğu 15 üzerine farklı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VLP verimleri viral antijen yapısı tasarımı ile değişken idi. Bu protokol, ultra-santrifüj ile yüzer SVP ya da VLPler üretimi ve saflaştırılması için, böcek ve memeli hücreleri kullanımını göstermiştir. DENV prM / e yapısal gen sentezleme kasetleri dört alt tipi, Tablo 1 'de (1-4 olarak çizilmiş) DENV SVPs sürümlerini oluşturmak ve 0.6 ml hacim toplam proteinin 1,1-2,6 mg arasında bir aralığı göstermek için kullanılmıştır. HA için: 2: 1: Üç gen yapıları gerektiren VLP'ler için, 1 optimize edilmiş DNA transfeksiyon oranı bulunan NA: Gag, sırasıyla influenza VLP'lerini sentez; Bunun aksine, çok Chikungunya viral proteinleri ifade eden tek bir plazmid rekombinant bakulovirüsün ve memeli CHIK VLP oluşumu için yeterli. Buna ek olarak, bir çift plazmid transfeksiyon prosedürü 1 transfekte RSV F ve Gag gibi memeli hücreleri ile de mümkündür: 1 oranında ve approxi verirkalıntılarından 0.01 mg / toplam hücre kültürü süpernatanı mi. Tablo 1 'de gösterildiği gibi, memeli 293T yoluyla üretim proteinin bir 10 kat bir azalma elde edilir ise, Sf9 hücrelerinden CHIK SVP verimi, üst faz hacmi 0,008-0,016 mg toplam protein / ml arasında değişebilir. farklı vahşi tip, tam uzunlukta HA plazmidler kullanılarak H3N2 VLP'ler iki sürümü arasında, H3N2 VLP Örnek 2 toplam protein ve spesifik HA içeriğine hem daha düşük bir verim vardı. Diğer örnek VLP HA miktarları Şekil 2 ve 3'te gösterilmiştir ve HA ELISA VLP'ler yüzey içeriğini tahmin etmek için kullanılan nasıl göstermek vardır. bilinen bir doğrudan ELISA yöntemi ile olduğu gibi, standart bir eğri H3 VLP'ler bir ELISA plakasına yerleştirilir örnek ELISA reaktivitesi karşılaştırmak için bir yeniden birleştirici HA bilinen konsantrasyonları kullanılarak oluşturulur. ELISA ya da benzer immünolojik iyi korunmuş epit için bilinen çapraz reaktiflik hazır monoklonal antikorlar olması VLPler ölçümü için önerilmektedirOPes, ancak tüm antijenler için uygun olmayabilir. RSV F nedenle bir ELISA monoklonal anti-RSV F antikoru kullanılarak, iyi karakterize edilmiş, aynı zamanda topak RSV F VLP'ler yüzey F miktarının uygulanabilir almaktadır. Spesifik antikorların antijen özelliklerin ve antijen tanıma ek olarak, VLP preparasyonlar yapısal elektron mikroskobu ile tespit edilebilir. 4 HA (gag çekirdekli) influenza VLPler başarıyla eksprese monte ve VLPler olarak saflaştırılmış olduğunu gösteren temsili bir resimdir, Şekil.
| Açıklama | Kültür hacim (mi) | hasat | Toplam ses | Total Protein Verim (mg) | Verim: (mg) / hacim (mi) | Spesifik antijen içeriği |
| DENV1 SVP | 293T186 | 4 d | 0.6 ml | 1.115 | 0.006 | nd |
| DENV2 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0.6 mi | 2.5 | 0.0134 | nd |
| DENV3 SVP | 293T / 186 | 3 boyutlu | 0.6 mi | 1.536 | 0.0083 | nd |
| DENV4 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0.6 mi | 2,613 | 0.014 | nd |
| CHIK VLP | Sf9 / 186 | 3 dpi | 0.6 mi | 1.503 | 0.0081 | nd |
| CHIK VLP | Sf9 / 500 | 4 dpi | 2.0 mi | 8,276 | 0,0166 | nd |
| CHIK VLP | 293T / 186 | 3 boyutlu | 0.6 mi | 0.296 | 0.0016 | nd |
| H3N2 VLP 1 | 293T /216 | 3 boyutlu | 0.6 mi | 1.25 | 0.0058 | 1.9 ug HA / ml |
| H3N2 VLP 2 | 293T / 216 | 3 boyutlu | 0.6 mi | 0,956 | 0.0044 | 0.96 ug HA / ml |
| H3N2 VLP 3 | 293T / 216 | 3 boyutlu | 0.6 mi | 1.6 | 0,0074 | 1.2 ug HA / ml |
| H3N2 VLP 4 | 293T / 216 | 3 boyutlu | 0.6 mi | 1.54 | 0.0071 | 0.98 ug HA / ml |
| RSV F VLP | 293T / 216 | 3 boyutlu | 0.6 mi | 2.3 | 0.0106 | 0.15 ug RSV F / ul |
| a d = gün sonrası transfeksiyon, dpi = gün sonrası enfeksiyon | ||||||
Tablo 1: subviral ve v yapısıyla Irus benzeri partikül verimi. VLP'ler hacimlerinin Örnek verileri, (geleneksel bir BCA aracıyla) Toplam protein verimi ya da (ELISA ile belirlenir) belirli bir antijen içeriği SVP / VLP yapıları çeşitli arasında gösterilmiştir. Verim nedeniyle SVP / VLP montaj ve hücre tipinde farkı değişkendir ve maksimum verim kullanıcı optimizasyon gerektirebilir. CHIK VLP'ler aynı sırasını kullanmak ancak hazırlıklar hacmi veya hücre kültürü tipi ya farklılık ise ya DENV1-4 çeşitli versiyonları, serotip göre farklılık gösterir. H3N2 VLP'ler (1-4) farklı sürümleri bir HA-özel ELISA reaktif epitopu paylaştığı dört eşsiz HA dizileri üreteceği ve aynı NA ve gag iç kısım ile birlikte ifade edildi. RSV F ve GAG çift plazmid transfeksiyon oluşturulur RSV F VLP, sentezlendi ve RSV F içeriği RSV F spesifik bir ELISA deneyi kullanılarak yaklaşık olarak bulundu.
.jpg "/>
Şekil 1:. Yaklaşım - VLP'lerini oluşturacak Viral yapısal proteinler ekspresyonu için plazmid, gen tasarımları VLP tasarımı, sentezi ve saflaştırılması şematik temsili (A), 293T hücrelerinde üç plasmidin birlikte-transfeksiyonu ile birden fazla yapısal proteinlerin birlikte ifadesi, tek bir gen 293T hücrelerinde tek plazmid kodlanmış kaseti, ve (C) şifreleyen yeniden birleştirici bakülovirüs CHIK yapısal proteinler yapısal proteinleri (B) ekspresyon süspansiyon içinde yüksek yoğunluklu hücresi büyümesini teşvik etmek için döndürücü şişelere kültürlenen Sf9 hücreleri enfekte etmek için kullanılır . VLP'ler hücre enkaz açıklık, hücre kültür ortamından hasat ve% 20 gliserol yastık üzerinde Ultrasantrifügasyon ile sedimantasyon yoluyla olmayan parçacıklar ayrılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Şekil 2: H3 VLP'lerinin Örnek Hemaglutinasyon tahlil Geleneksel hemaglütinasyon deneyi H3N2 VLP ve karşılık gelen açıklık süpernatant temsil eden bir örnek üzerinde gerçekleştirilmiştir; H3N2 HA deney% 0.8 Türk kırmızısı, kan hücreleri ya da gine domuzu, kırmızı kan hücreleri kullanılarak yapılabilir (burada gösterilmemiştir). Toplam protein içeriği saflaştırılmış VLP standart BCA deneyi kullanılarak tahmin edilir ve yapılan ya da açıklık süpernatant için tavsiye değildi. ELISA saflaştırılmış VLP gerçekleştirildi ve HA içeriği bilinen konsantrasyonda bir rekombinant HA standardı kullanılarak tahmin edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Eski H3 VLP'ler. bir ELISA plakası, H3 içeriğinin ölçümü için yeterli H3 ELISA, farklı HA sekansları (Örnekler 1-9) elde edilen bilinen konsantrasyonda bir yeniden birleştirici HA standart seri seyreltmeleri ile seyreltildi H3N2 VLP örnekleri ile kaplanmıştır. 492 nm (OD) elde edilen optik yoğunluk değerleri standart konsantrasyonu (ug / ml) korele konsantrasyonları, standart eğrinin lineer kısmı kesişen X değeri deducing ile elde edilir. rekombinant HA standart ve bilinmeyen numunelerin çözeltiler kuyular A & B ya da sırasıyla C-Ge, kopya halinde yüklendi. VLP numunenin nihai konsantrasyonu VLP örnek seyreltme faktörü ile konsantrasyon çarpılarak belirlenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
4041 / 54041fig4.jpg "/>
Şekil 4: Gag çekirdekli kullanarak HA-VLP'lerinin elektron mikroskopisi saflaştırılmış grip HA VLP'ler Temsilcisi elektron mikroskobu görüntüsü.. VLP'ler HA ile kaplı küresel parçacıklar halinde bir araya getirin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz başarıyla SVPs ve çeşitli patojenler için birden fazla yapısal proteinlerden oluşan VLP'lerini ifade ve arındırmak için yukarıda açıklanan teknikler kullandık. Genel olarak, bizim VLP'lerini oluşturmak için memeli ifade sistemleri kullanırlar. Ancak, bizim elimizde, memeli hücre CHIK VLP verimleri düşük türetilmiş. Bir rekombinant bakülovirüs-böcek hücre sistemini kullanarak CHIK VLP verim daha güçlü oldu. Genel olarak, bakulovirüs, böcek hücre sistemleri, kontrol altında ve aynı zamanda bağlı yabancı genlerin sentezlenmesi yüksek düzeyde doku kültürü şişeleri karşı değiştirici şişelerinde kültürlenebilir yüksek hücre yoğunlukları kaynaklanabilecek rekombinant proteinlerin yüksek miktarda verim bakulovirüs polihedrin destekleyicinin. 16 Bununla birlikte, bakulovirüs kullanmanın bir dezavantajı, adjuvan aktiviteye sahip VLP preparatlarda bakulovirüs çok olması, ve aşı içerisinde eğim immünolojik sonuç Ayrıca grip V verimle değişkenlik 17 bulunan çalışmalarıdırkullanılan HA ve NA kombinasyonları bağlı LP; H3N2 VLP2 nispeten potansiyel nedeniyle daha az verimli VLP montaj veya NA-uyumluluk 15, H3N2 VLP1 kıyasla verim azalır ve daha fazla araştırılması gerekmektedir almıştı. DNA yapıları ve transfeksiyon oranları optimizasyonu optimum VLP verimi sağlamak için kritik adımlar kalır. Biz ifade genellikle verimli ve alt klonlama birden restriksiyon enzimleri ile uygun olduğundan sürekli bizim memeli tabanlı VLP'ler arasında bir memeli vektör pTR600 kullanmayı seçti. plasmidlerin Oranlar VLP verimlerini artırmak için kullanıcının ihtiyaçlarına göre ayarlanmış olabilir. tarif edildiği gibi, ancak, bir memeli VLP mevcut üretim sınırlamalar transfeksiyon maliyeti ile doku kültürü şişelerinde hücre büyüme kapasitesine sahip olmaya devam etmektedir. Bu protokolde yapılan olmasa da medya köknar sonra taze büyüme ortamı (örneğin, OptiMEM) ile doldurulan zaman, biz transfekte hücrelerde VLP'lerinin ek başarılı üretimi gözlemledimverim biraz VLPler birinci toplama kıyasla azaltılmış olmasına rağmen T 72 saat hasat ve ek 72 saat sonra, VLPler sonraki toplama.
Bu ultra-santrifüj ile yarı saflaştırılması için süpernatan içinde VLP'lerini serbest bırakmak için, böcek ya da memeli hücre kültürleri, ya viral yapısal proteinleri ifade etmek için bir prosedürü göstermektedir. SVP / VLPler antijen immunoassay ve aşılama çalışmaları, kullanım için genelde istikrarlı ve özellikle Biyogüvenlik Seviye gerektiren seçkin ajanların veya yüksek patojen kuş gribi (HPAI) 8,18 suşları, viral parçacıkların, yaşamak ile karşılaştırıldığında daha az güvenlik tehditleri poz 3 (BSL-3) laboratuvar koşulları 19. VLP'ler üretimi oldukça basittir ve genellikle doğal viral yapısal proteinleri değil, özel olarak denatüre edilmiş lineer epitoplara karşı verilen antikorlar tarafından tanınan edilebilir partiküller elde edilir. VLP'ler antijene özgü bağışıklık karşılıklarının ortaya çıkartılması için yararlı bir platform olarak ve aşağıdakileriaşı geliştirmede umut verici bir aday.
Bu protokol, memeli sisteminde viral genlerin transfekte etmek için iki yaklaşım gösterilmektedir. Bu çizimde, iki influenza genleri, HA ve NA, HA ve NA yüzeyinde monte edilmiş olarak, bir GAG iç çekirdeğe sahip bir VLP oluşturmak için HIV gag ile ko-transfekte edilmiştir. Gag yerine grip matris 1 (M + -1) ikame RSV F ve potansiyel olarak diğer olmayan viral glikoproteinler olan gag-bazlı VLPler esnekliğini göstermektedir. Seçenek olarak ise, CHIKV sentezi c proteini oluşan bir merkezi yüzeyinde bulunan CHIKV D proteinleri ile, SVP kendini montajı için gerekli bileşenleri ifade eden bir yapısal gen kaseti, kullanmaktadır. Bu iki yaklaşım transfekte hücrelerden bir araya minimal yapısal viral proteinleri gerektirir VLP sentezi, esnekliğini göstermektedir.
Son olarak, süre genel protokolleri ve temsili resul sunduH3N2, RSV, DENV ve CHIKV sentezlenmesi ve saflaştırılması için ts, bu işlemler diğer viral proteinleri kullanılarak VLP'lerin üretimi için kolay uygundurlar. Bu girişimlerin H1, H5, H7 ve virüsler de dahil olmak üzere, diğer grip virüsü alt tiplerinin üretimi bizim grubu ile kullanılmıştır. Ayrıca, tek bir plazmid, DENV SVPs üretimi için kullanılan prM / e tasarımı, Batı Nil ve Japon ensefalit virüsleri içerir Flavivirüs ailesinin diğer üyeleri için SVPs üretimi için adapte edilebilir. Benzer şekilde, CHIK VLP üretim metotları Venezüella, Doğu ve ekuin ensefalit Batı virüsler de dahil olmak üzere Togaviridae ailesinin diğer üyeleri için, kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz maksimum verimlilik ve verim için protokol optimize yardımcı olmuştur Ross laboratuar öncesinde üyelerini kabul etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 ml) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
References
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
- Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
- Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
- Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
- Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
- Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
- Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
- Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
- Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
- Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
- Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
- Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
- Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
- Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
- Jarvis, D. L. Methods in Enzymology. 463, Academic Press. 191-222 (2009).
- Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
- Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
- Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).
