Introduction
Hücre içi bakteriyel patojenler ─ bulaşıcı hastalıklar ve büyüyen insan konak iç hücrelerini üretebilen neden olan bakteriler ─ dünya çapında önemli bir sağlık sorunu 5 vardır. istila ve bir memeli hücre içinde çoğaltmak için, hücre içi patojenler sofistike virülans mekanizmaları ve faktörleri edindik. bu mekanizmalar bir hastalığa neden yeteneği temel olmakla birlikte, biz onların düzenlenmesi ve dinamikleri hakkında çok az şey biliyoruz. sıvı ortamda yetişen bakteri geni ekspresyonunun konak hücreleri içinde, gerçek bir ortam yansıtamıyacağından, hücre içi niş yetiştirilen bakteri analiz transcriptome için giderek artan bir ihtiyaç vardır. Bu tür analizler ev sahibi tarafından tetiklenen spesifik bakteriyel uyarlamalar deşifre sağlayacak ve tedavi tasarımı için yeni hedefler belirlemeye yardımcı olacaktır. memeli RNA da bakteriyel RNA sayıca üstün beri hücre yetiştirilen bakterilerin Transcriptome analizi son derece zorluen az on kat. Bu yazıda, fare makrofaj hücreleri içinde büyüyen Listeria monocytogenes bakterilerden bakteriyel RNA izole etmek için deneysel bir yöntem açıklanmaktadır. ekstre RNA, hücre içi uyarlama ve RT-PCR, RNA-DİZ, mikrodizi ve diğer melezleştirme tabanlı teknolojiler gibi transkripsiyon analizleri çeşitli tekniklerle, patojenik bakterilerin hastalık oluşturma mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.
L. monocytogenes insanlarda listeriosis etkeni öncelikle immün sistemi baskılanmış bireyler, yaşlılar ve hamile kadınlar 6 hedefleyen klinik bulgularla seyreden bir hastalıktır. O 7 çalışma evsahibi-patojen etkileşimlerinin bir model olarak yıllardır kullanılmaktadır memeli hücrelerinin geniş bir dizi işgal bir Gram-pozitif fakültatif hücre içi patojendir. istila etmesine, bu t kaçmasına gereken bir vakuol ya da (fagositik hücreler durumunda), bir fagozomun, başlangıçta bulunduğuo çoğaltmak için hücre sitoplazmada ev sahipliği. Muhtelif virülans faktörlerinin çıkış işlemi, temel olarak, gözenek-oluşturucu hemolisin, listeriolisin O (LLO) ve iki ek fosfolipazları 8 aracılık ettiği gösterilmiştir. Sitoplazmada bakteriler (Şekil 1) hücre içindeki aktin filamentler kendilerini itmek için ve hücreden hücreye yayılan konak aktin polimerizasyonu makineleri kullanıyoruz. L. Bütün büyük virulans faktörleri işgali, hücre içi yaşam ve çoğaltmaya katılan monocytogenes, ana virülans transkripsiyon regülatör PrfA. 8-10 aktive edilir.
Son on yılda, çeşitli çalışmalar bize tarafından yürütülen ve diğerleri başarıyla konakçı hücrelere 2,11-15 içinde hücre yetiştirilen bakterilerin transcriptome analizi için yöntemler uyguladınız. sorumluluk yönün bakteriyel RNA 1) seçici zenginleştirme ve 2) RNA izolasyonu: İki temel yaklaşım dayanmaktadır konak-RNA bakteriyel RNA ayırmak için kullanılırrential hücre parçalama. Birinci yaklaşım (ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak, örneğin), memeli RNA moleküllerinin toplam RNA özleri eksiltici hibridizasyon ve bakteriyel transkribe dizileri (SCOTS) 11 seçmeli tutma dayanır. İkinci yaklaşım, bakteriyel hücreler gibi kalır, ev sahibi hücrelerin lize olan bakteri ve konakçı hücreler, ayırıcı liziz dayanır. Bakteriyel hücreler daha sonra, genellikle santrifüjleme ile konakçı hücre lizatından ayrılır ve RNA, standart teknikler kullanılarak ekstre edilir. Bu yaklaşımı kullanarak, ana problem, sağlam bakteri konakçı hücreler çekirdekleri de izole ile birlikte, bu şekilde RNA preparatları de memeli RNA içeren bir. Bu sorunun üstesinden gelmenin bir yolu, bu prosedür genellikle çıkarma sırasında gen tanımlama profili değişikliklerin endişesini zaman alır ancak diferansiyel santrifüj kullanılarak konakçı hücreler çekirdeklerden sağlam bakteri ayırmaktır. Bu yazıda gelişmiş ve hızlı ba sunmakHücre diferansiyel parçalama yaklaşıma dayanmaktadır cteria RNA ekstraksiyon protokolü. İlk olarak, L. makrofaj hücreleri enfekte monocytogenes soğuk su ile lize edilmiştir. Daha sonra, makrofaj çekirdekler kısa bir santrifüjleme ile ayrılmış ve sağlam bakteri hızlı, RNA bakteriyel nükleik asitlerin sıcak fenol-SDS ekstraksiyonu kullanılarak izole edilir, filtre üzerinde toplanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: tüm deney sırasında, makrofaj hücreleri,% 5 CO2 basınçlı hava kuluçka makinesi içinde 37 ° C sıcaklıkta kuluçkaya yatırılır ve yalnızca bir sınıf biyolojik güvenlik kabininde yapıldığı deneysel manipülasyonlar için kuluçka alınır. L. ile çalışma monocytogenes bakteri biyolojik güvenlik seviyesine 2 düzenlemelerine göre olduğunu.
1. Hücre Hazırlama ve bakteri kökenli enfeksiyon (Gün 1 ve 2)
- 1.gün
- 30 mi BMDM + Pen-Strep ortamı (Tablo 2) ve 145 mm tabak Tohum 2.0 x 10 7, kemik iliği kaynaklı makrofaj hücreleri (BMDM). Bakteriyel suşların her biri için tohum 3 tabak analiz edilmesi. % 5 CO2 basınçlı hava kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
- Vahşi tip (WT) L. bir gece boyunca bakteri kültürü Başlangıç Standart bir inkübatörde 30 ° C'de, beyin kalp infüzyon (BHI) ortam 10 ml streyn monocytogenes 10403S. Yeri kültür tüpleri sallayarak olmadan eğimli. Not:Bu büyüme koşulları etkili bir şekilde enfeksiyonu teşvik flagella genlerin ekspresyonunu yukarı-regüle.
- 2. gün
- 37 ° C'de ön-Sıcak BMDM (Pen-Strep antibiyotiksiz) ortamı (Tablo 2) ve fosfat tamponlu tuz (PBS).
- antibiyotik kaldırmak için önceden ısıtılmış PBS, 25 ml ile iki kez makrofaj tek tabaka yıkayın. 30 ml taze BMDM orta ekleyin.
- 1 dakika boyunca> 14,000 xg'de santrifüj bakteri süpernatant atılması ve pipetleme PBS 1.5 ml yavaşça bakteri resuspending PBS ile gece boyunca bakteri kültürü 1.5 mL yıkanır. İki kez tekrarlayın.
- Vahşi tip L yıkanmış bir gece boyunca bir kültürü, 0.5 ml her makrofaj plaka Infect monocytogenes. Birden fazla plakaları kullanıyorsanız, ayrı her plaka 15 dakika bulaştırmak. Bu zaman aralığı enfeksiyonu sonunda tek tek her plaka hasat sağlayacaktır.
Not: enfeksiyon (MOI) seri seyreltme kaplama ile deneye tabi tutulurBakteri kültürünün s, 37 ° C'de plakalar 24 saat inkübe edildikten sonra, BHI agar plakaları ve sayma koloni oluşturan birim (CFU) ile enfeksiyonu için kullanılmıştır. WT L. 0.5 ml kullanılarak monocytogenes ~ 100 bir İçişleri Bakanlığı içinde 10403S sonuçlar (makrofaj hücre başına 100 bakteri CFU) süzün. hücre içi büyüme hatalı bakteriyel mutantlann analiz edildiğinde, daha yüksek bir MOI dikkate alınmalıdır. - 37 ° C'de 0.5 saat inkübe edildikten sonra, serbest bakterileri uzaklaştırmak için PBS ile iki kez enfekte hücreleri yıkayın ve 30 ml önceden ısıtılmış BMDM ortamı ilave edin. Ekli bakteriler sonraki 0.5 saat boyunca içselleştireceklerdir.
- hücre-dışı bakterileri öldürmek için: (50 ug / ml bir nihai konsantrasyon elde etmek 1000 1) 1 saat sonra enfeksiyondan, gentamisin 30 ul ekle.
- Bir vakum çıkış portu ile bir toplama sıvı şişesi üzerinde bir filtre kafasını koyarak filtre aparatı monte edin. Sonra silindir bir huni tarafından izlenen bir filtre kafasına bir filtre (0.45 um), koyun ve bir metal c farklı bölümlerini sabitleyinlamba. buz soğukluğunda RNaz içermeyen su hazırlayın.
- aşağıdaki şekilde enfekte olmuş hücrelerden 6 saat sonrası enfeksiyon, hasat bakterileri. tek tek her plaka davranın.
Not: Genellikle, L. monocytogenes makrofaj hücrelerinin enfeksiyon 6 saat boyunca büyüme 1-log tamamlar. kısa inkübasyon süreleri önemli ölçüde daha düşük bakteri yüklerini neden olabilir ise uzun inkubasyon, bakteriyel aşırı çoğalma ve makrofajların hücre ölümüne neden olabilir. MOI, enfeksiyon süresi optimal şartlara ulaşmak için değiştirilebilir.- bir kez PBS ile enfekte hücreleri yıkanır. makrofaj hücreleri lize etmek için buz-soğuğu RNaz içermeyen su 20 ml ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, hızlı ama dikkatli plaka kapalı hücreleri kazıyın.
- 50 ml konik tüp lize hücreleri toplamak. 30 saniye vorteksleyin. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 800 x g'de santrifüjleyin.
- bir vakum sistemi kullanılarak filtre aparatı ile süpernatant geçirin. coni ml filtre rulo ve hızlı bir şekilde 15 transfer, cımbız kullanarakcal tüp. sıvı azot içinde filtreler ile tüpler Yapış-dondurma.
- 1.2.7 de tarif edildiği gibi, aşağıdaki örnek için yeni bir filtre ile filtrasyon aparatı birleştirin.
- Bir sonraki gün için -80 ° C'de donduruldu filtreleri saklayın. Seçenek olarak ise, bir nükleik asit çıkarma, doğrudan devam edin.
2. Nükleik Asitler Ekstraksiyon (Gün 3)
Not: Bir çeker ocak içinde, fenol ve kloroform çözümler Bütün müdahaleler gerçekleştirin.
- 1 asidifiye fenol karışımı: kloroform, her bir örnek için 400 ul 1 hazırlayın. Ayrı tüplerde karıştırın ve daha sonra aspirasyon ile ortaya çıkan sulu tabaka çekilme. % 10 SDS, 40 ul ekle.
- Soğuk tutmak için buz üzerinde filtre içeren tüpler çözülme. Her bir filtre ihtiva eden bir tüpe asetat-EDTA (AE) tampon maddesi (Tablo 2) 650 ul ilave edin.
- mümkün olduğunca çabuk aşağıdaki adımları uygulayın.
- Şiddetle bu yüzden filtreyi içeren tüp vorteksFiltre tüpün çevresine whisks ve tampon tamamen filtreyi yıkar. Her zaman buz üzerinde geri koyarak tüp soğuk tutmak. Not: Tam filtre kapalı bakteri yıkamak için ters ise ayrıca tüp vorteks için gerekli olabilir.
- Tüm borular için tekrarlayın. Spin-aşağı kısa bir süre süspansiyon (120 xg'de 1 dakika) işlemi sonunda yararlı olabilir.
- SDS ve (2.1 hazırlandı) fenol / kloroform karışımı ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne bakteri içeren tampon aktarın. Tüm borular için tekrarlayın. Filtreden kalan tampon almak için tekrar filtre ihtiva eden tüpler (120 xg'de 1 dakika) döndürmek için gerekli olabilir.
- 10 dakika süre ile tam hızda her 1.5 mi, bir multi-tüp vorteks cihazı tüpler ve vorteks yerleştirin.
- 10 dakika boyunca 65 ° C ısıya bloğunda inkübe edin. 5 dakika boyunca maksimum hızda (> 14.000 xg) santrifüj.
- Her t sulu tabakayı (yaklaşık 400 ul) aktarın3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve 1.0 ml% 100 etanol içinde 40 ul ihtiva eden yeni bir 1.5 ml'lik tübe Ube. iyice her tüp Vortex.
Not: Glikojen çöktürülmüş pelet görselleştirme artırmak için bu aşamada ilave edilebilir. - 1 saat boyunca -80 ° C'de inkübe edin. Seçenek olarak ise, Cı gece boyunca -20 ° örnekleri inkübe edin. Daha sonra, en yüksek hızda (> 14,000 xg), 20 dakika boyunca 4 ° C 'de numuneler santrifüj.
- Dikkatle her tüpten etanol (üst katman) aspire. iyice her bir örnek ve vorteks 500 ul soğuk% 70 etanol ekleyin. maksimum hıza (> 1 4000 xg), 20 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüje.
- Dikkatle her tüpten etanol aspire. Resim ısı ile bir vakum buharlaştırıcı kullanılarak yaklaşık 2 dakika boyunca numune kurutun. numuneler aşırı kurutmayın.
- Her bir örnek için 25 mL RNaz içermeyen su ilave edilir. 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Dikkatle girdap ve spin-aşağı.
- t RNA konsantrasyonu ölçmekBir mikrohacim UV-Vis spektrofotometre kullanarak o örnekler. Plaka başına nükleik asitlerin 1 ug - yaklaşık 0.5 ayıklamak için bekliyoruz.
Not: teknik çoğaltır bu aşamada birleştirilebilir.
3. DNaz Tedavi
- Mikrofüj tüpüne Tablo 1 'e göre bir reaksiyon ayarlayın. 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 450 mL RNaz içermeyen su ve maksimum hızı (> 14,000 xg) 2 dakika süreyle santrifüjlenerek fenol-kloroform-IAA karışımı (Tablo 2), ayrı fazlar 500 ul ekle.
- Yeni bir tüpe Sulu tabaka transferi ve maksimum hızı (> 14,000 xg) 2 dakika santrifüjleme ile 500 ul kloroform-IAA karışımı (Tablo 2), girdap ve ayrı fazlar ekleyin.
- yeni bir tüpe Sulu tabaka transferi ve 1 mL etanol ve 3 M sodyum asetat (pH 5.2) 50 ul ekle. Vortex.
Not: Glikojen çöktürülmüş pelet görselleştirme artırmak için bu aşamada ilave edilebilir. - Dikkatle her tüpten etanol aspire. iyice her bir örnek ve vorteks 500 ul soğuk% 70 etanol ekleyin. en yüksek hızda 20 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüje. Dikkatle her tüpten etanol aspire.
- Resim ısı ile bir vakum buharlaştırıcı kullanılarak yaklaşık 2 dakika boyunca numune kurutun. numuneler aşırı kurutmayın.
- Oda sıcaklığına girdap ve dönme, yavaşlama, 2 dakika boyunca inkübe RNaz içermeyen su 12 ul ekle. Numuneler, saflaştırılmış RNA içeren buz üzerinde saklayın. Seçenek olarak ise, RNA çözülür RNase içermeyen H2O 0.1 mM EDTA ve TE tamponu (10 mM Tris, 1 mM EDTA) ile.
- Bir mikrohacim UV-Vis spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonları ölçün. (Teknik çoğaltır birleştirilir ise) numune başına RNA ~ 100 ng bekliyoruz.
Not: RNA çıkarılan bu protokole göre fo uygundurBirden tekniklerle r gen transkripsiyonu analizi. Biz genellikle L. incelemek için RT-qPCR analizi istihdam makrofaj hücreleri 1-4 enfeksiyon sırasında gen transkripsiyonunu monocytogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Model sistem, Şekil 1 'de gösterilen ve L ile enfekte makrofaj hücreleri içerir makrofaj sitozolde çoğaltmak bakterileri monocytogenes. 2 deney düzeni temsil Şekil. Şekil 3 WT L. sırasında virülans genlerinin RT-qPCR analizi tipik sonuçlarını temsil Zengin laboratuar ortamı BHI büyümeye kıyasla makrofajlar büyüme monocytogenes. Sonuçlar L. iki ana hastalık oluşturma faktörlerinin kopyalama seviyelerini göstermektedir monocytogenes; hly LLO toksini kodlayan actA sağlam makrofajların enfeksiyonu üzerine indüklenen aktin düzeneği proteinini kodlayan.
Şekil 1: L. Genel Bakış Bir I olarak Lifestyle monocytogenesntracellular Patojen. L. monocytogenes fagositik hücreler bakteriler fagosite ise, fagositik olmayan hücrelere, aktif içselleşmesini neden internalins olarak adlandırılan özel bir proteinleri ifade konakçı hücreleri işgal. Istila etmesine L. monocytogenes başlangıçta hızla öncelikle listeriolizin O toksin (LLO) kullanarak kaçar hangi bir endosome / fagosom vakuol içinde bulunur. L. sitosol konakçı hücre içinde monocytogenes hızlı çoğaltır, ve ActA proteini ile aktin göre motilite kullanarak hücreden hücreye yayılır. Bahsedilen tüm virülans faktörleri ana virülans aktivatörü, PrfA tarafından düzenlenmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Exp temsil A Akış Şemasıerimental Prosedür. temel adımlar enfekte hücrelerin lizizi, konakçı hücreler çekirdekleri ve bakteri hücreleri ve RNA izolasyonu ayrılmasını içerir. Kritik adımlar gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: L. sırasında Öldürücü genlerin transkripsiyonu Analizi L. monocytogenes sırasında hücre içi büyüme. hly geni (LLO kodlayan) transkripsiyonu analizi ve actA geninin 6 saat sonra makrofaj hücrelerinde monocytogenes 10403S hücre büyümesi RT-qPCR analizi kullanılarak BHI ortamı üstel büyüme sırasında seviyelerine kıyasla enfeksiyondan. Transkripsiyon seviyeleri görece miktarı (Rq), bağıl olarak temsil edilirBHI içinde büyüme sırasında transkripsiyon seviyeleri. Transkripsiyon seviyeleri referans geni gibi 16S rRNA düzeylerine normalleştirildi. Veri 3 bağımsız biyolojik tekrarlar (N = 3) temsilcisidir. Hata çubukları,% 95 güven aralığı temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| RNA | (44 ul maksimum hacim) 2 ug kadar |
| 10x DNaz tamponu | 5 ul |
| RNaz içermeyen su | 50 ul toplam hacim tam |
| DNAz | 1 ul (1 adet) |
Tablo 1: DNase Reaksiyon Protokolü.
| 1. 500 ml BMDM + Pen-Strep ortam (filtre ile sterilize): | |
| DMEM | 235 mi |
| FBS (54 ° C 'de durdurulmuş 30 dakika) | 100 mi |
| M-CSF (L-929 koşullu ortam) 19 | 150 mi |
| glutamin | 5 mi |
| sodyum piruvat | 5 mi |
| olan B-merkaptoetanol | 0.5 mi |
| Penisilin / Streptomisin | 5 mi |
| Genel Toplam | 500 mi |
| 2. 500 ml BMDM (filtre ile sterilize): | |
| DMEM | 235 mi |
| FBS (54 ° C 'de durdurulmuş 30 dakika) | 100 mi |
| M-CSF (L-929 koşullu ortam) 19 | 150 mi |
| glutamin | 5 mi |
| sodyum piruvat | 5 mi |
| olan B-merkaptoetanol | 0.5 mi |
| Genel Toplam | 500 mi |
| 3. AE tampon | |
| NaOAc pH 5.2 | 50 mM |
| EDTA | 10 mM |
| RNaz içermeyen su | |
| 4. fenol-kloroform-IAA | |
| Fenol | 25 mi |
| Kloroform | 24 mi |
| Iso-amil alkol | 1 mi |
| 5. kloroform-IAA | |
| Kloroform | 24 mi |
| Iso-amil alkol | 1 mi |
Tablo 2: Medya ve Tamponlar Tarifler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol L. bakteriyel RNA izolasyonu için optimize edilmiş bir yöntemle temsil makrofaj hücrelerinde hücre büyüyen bakterilerin monocytogenes. Bu protokol, hücre ayırıcı liziz göre ve bakteriyel RNA zenginleştirilmesi için iki ana adımları içerir: santrifüj ve süzme ile bakterilerin hızlı bir koleksiyonunu kullanarak makrofaj çekirdekler çöktürülür. Bu adımlar, standart RNA ekstraksiyon prosedürü izlemektedir. Bu protokol, Lısterıal RNA saflaştırma açıklanmış olsa da, kolayca diğer bakteriyel patojenlere değiştirilebilir. Yöntem, transkripsiyonel analizi için RNA saflaştırma üzerine odaklanmış olmakla beraber, bunun ev sahibi hücre içinde büyüyen bakteriler ayırmak için kullanılan ilke, vb DNA, protein, hücre duvarı, genomik ve benzeri gibi diğer bakteriyel bileşenler saflaştırılması için uygulanabilir biyokimyasal analizler hücre içi patojen daha iyi anlaşılmasını ve karakterizasyonu sağlayacakenfeksiyonun seyri sırasında yaşam döngüsü.
toplam bakteri RNA ~ 100 ng prosedürü ile sonuçlanır. RNA kazançları, nispeten düşük olmasına rağmen, bu tür, RT-qPCR RNA-DİZ modern melezleştirme tabanlı teknolojiler gibi birden çok teknikler kullanılarak gen transkripsiyonunun aşağı analizler için uygundur. RNA verim artırmak için, mümkün RNaz Bulaşmayı önlemek için taze bakteri inokulantlar yanı sıra taze fenol çözüm nükleaz içermeyen su ve tamponlar kullanılması tavsiye edilir. Hasat ve bakteriler RNA her çıkarma işlemi sırasında buz üzerinde tutulmalıdır. enfeksiyon süresi biyolojik soruya göre ayarlanır ve organizma ele alınabilir. RNA miktarlarını artırmak için, deney her numune başına daha fazla enfeksiyon plakaları dahil kadar ölçeklendirilebilir.
Böyle bir deneyi gerçekleştirmek ana endişe hasat adımları sırasında bakteri transkripsiyon profili değiştirerek riskidir. çoğu Bacteria soğuk şok stres yanıtlarını aktive ederek soğuğa tepki ve böylece bakteri hasat mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. Reaktifler ve cihazlar önceden hazırlanmış olmalıdır, ve her bir numune ayrıca tedavi edilmelidir. en önemli nokta, hemen sıvı azot içinde filtre içeren bakteri dondurma sağlamaktır. Aksi takdirde büyük ölçüde izole RNA kalitesini düşürebilir. Bu protokol bir diğer kritik adım nükleik asitlerin nispeten küçük miktarlarda etanol yağış olduğunu. Ekstra bakım görünmez nükleik asitler pelet bozmak için değil alınmalıdır. Glikojen Bu adımlar sırasında pelet görselleştirme geliştirmek için çökeltme çözeltisinin ilave edilebilir.
Bazı sonradan uygulamalar için, örneğin RT-qPCR DNA kaldırılması önemlidir. DNaz t aşağıdaki nükleik asitlerin toplam tutarı 5 kat - rutin DNaz tedavinin etkinliğini, 3 bir azalma izlemek olmasa dareatment etkin DNAz muamelesini göstergesidir. Dikkat çekici bir şekilde, RNA örnekleri DNA çıkarılması için herhangi bir ticari olarak temin edilebilir bir teknik ya da kit de uygundur. Buna ek olarak, bu tür yapılan herhangi bir ters transkripsiyon ile birlikte örnek olarak bir kalite kontrol örnekleri kullanarak, bu tür uygulamalarda faydalıdır.
Burada tarif edilen protokol önemli bir sınırlama, toplam RNA 100 ng ekstre RNA göreceli olarak düşük miktarda vardır. Bu nedenle, bu teknik, RNA mikrogram gerektiren örneğin, Northern blot analizi gibi klasik melezleştirme teknikleri için uygun değildir.
RNA sıralanması (derin RNA seq) son teknolojik ilerleme kendi RNA'lar ayırmak gerek, 'çift RNA seq' 16-18 adında bir yöntem olmadan, bakteriyel patojen ve birlikte memeli konak transkripsiyon profillerinin hem analizi sağlar. Çift RNA DİZİ analizi-konak etkileşimini incelemek ideal olmasına rağmen, çok expensiv olduğuE ve sık sık kullanılamaz. Enfekte hücrelerde bakteriyel RNA içeriği özellikle düşük olduğundan, yeterli bakteri hatta yeni sıralama platformları tarafından sağlanan yüksek okuma derinliği ile, etkin bir gen ekspresyon analizi için okur almak son derece zor ve pahalıdır. Bu yaklaşımın bir başka dezavantajı, gen ekspresyonunun yanlı sonuçlara neden olabilir, bir RNA ya da cDNA amplifikasyon adımı, sık kullanımıdır. Burada sunulan yöntem, elde edilen bilgi ve maliyet etkinliği arasında bir uzlaşma vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
| Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| DNaseI | Fermentas | EN0521 | |
| SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
| 37 °C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
| Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30 °C incubator | Thermo Scientific | ||
| 65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
| 4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
| Liquid nitrogen |
References
- Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. , (2014).
- Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
- Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
- Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
- World Health Organization WHO. , http://www.who.int/en/ (2005).
- Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
- Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
- Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
- Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
- Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
- Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
- La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
- Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
- Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
- Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
