Introduction
مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا ─ البكتيريا المسببة للأمراض المعدية وقادرة على النمو والتكاثر داخل الخلايا الجنود البشري ─ لا مشكلة صحية رئيسية في جميع أنحاء العالم 5. غزو وتكرار داخل الخلية الثديية، وقد اكتسبت مسببات الأمراض داخل الخلايا آليات الفوعة متطورة والعوامل. في حين أن هذه الآليات الأساسية إلى القدرة على التسبب في المرض، ونحن لا نعرف إلا القليل عن تنظيم وديناميتها. منذ ملامح التعبير الجيني من البكتيريا نما في وسائل الإعلام السائل لا تعكس البيئة الفعلية داخل الخلايا المضيفة، هناك حاجة متزايدة لTranscriptome على تحليل البكتيريا نما في منافذها داخل الخلايا. وهذه التحليلات تمكين فك رموز من التعديلات البكتيرية المحددة الناجمة عن المضيف، وسوف تساعد على تحديد أهداف جديدة للتصميم العلاجية. تحليل Transcriptome على من البكتيريا نما داخل الخلية التي تشكل تحديا كبيرا منذ RNA الثدييات يفوق عدد الجيش الملكي النيبالي البكتيرية التي كتبها فيلا يقل عن عشرة أضعاف. في هذا المخطوط، وصفنا طريقة تجريبية لعزل الحمض النووي الريبي البكتيرية من الليستيريا المستوحدة نمو البكتيريا داخل خلايا البلاعم الفئران. الحمض النووي الريبي المستخرج يمكن استخدامها لدراسة التعديلات داخل الخلايا وآليات الفوعة من البكتيريا المسببة للأمراض من خلال تقنيات مختلفة من التحليل النسخ، مثل RT-PCR، RNA تسلسل، ميكروأري وغيرها من التكنولوجيات التهجين مقرها.
اللستيريا L. هي العامل المسبب لداء الليستريات في البشر، وهو مرض مع المظاهر السريرية تستهدف في المقام الأول الأفراد المناعة والمسنين والنساء الحوامل 6. هذا هو الممرض داخل الخلايا الاختياري موجبة الجرام أن يغزو مجموعة واسعة من خلايا الثدييات التي استخدمت لعقود نموذجا في التفاعلات المضيف الممرض يدرس 7. على الغزو، ويقيم في البداية في فجوة أو يبلوع (في حالة الخلايا البلعمية)، والتي يجب أن الهروب إلى رانه استضافة العصارة الخلوية الخلية من أجل تكرار. وقد تبين أن عدة عوامل الفوعة للتوسط في عملية الهروب، وعلى رأسها ما يسمى بحالة دموية تشكيل المسام، Listeriolysin O (LLO) واثنين من فوسفوليباز إضافية 8. في العصارة الخلوية للبكتيريا تستخدم المضيف الآلات الأكتين البلمرة لدفع أنفسهم على خيوط الأكتين داخل الخلية وتنتقل من خلية إلى أخرى (الشكل 1). كلها عوامل الفوعة الرئيسية للL. اللستيريا المشاركة في الغزو، والبقاء داخل الخلايا وتكرارها، وتفعيلها من خلال النسخ المنظم الفوعة الماجستير، PrfA. 8-10.
في العقد الماضي، العديد من الدراسات التي أجريت من قبل الولايات المتحدة وآخرون أساليب تحليل Transcriptome على من البكتيريا نما داخل الخلية تطبيقها بنجاح داخل الخلايا المضيفة 2،11-15. وتستخدم نهجين رئيسيين لفصل الحمض النووي الريبي البكتيرية من المضيف الحمض النووي الريبي والتي تقوم على: 1) إثراء الانتقائي من الحمض النووي الريبي البكتيرية و2) عزل الحمض النووي الريبي عن طريق زراعية مختلفةتحلل الخلية rential. يعتمد الأسلوب الأول على التهجين مطروح من إجمالي مقتطفات الحمض النووي الريبي لجزيئات الحمض النووي الريبي الثدييات (على سبيل المثال باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا) أو التقاط الانتقائي للتسلسل كتب البكتيرية (الاسكتلنديين) 11. ويعتمد النهج الثاني على تحلل التفاضلية من البكتيريا والخلايا المضيفة، التي يتم فيها هي lysed الخلايا المضيفة بينما تبقى الخلايا البكتيرية سليمة. ثم يتم فصل الخلايا البكتيرية من المحللة الخلية المضيفة، عادة عن طريق الطرد المركزي، ويتم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام التقنيات القياسية. المشكلة الرئيسية باستخدام هذا النهج هو الذي جنبا إلى جنب مع البكتيريا سليمة، يتم عزل الخلايا المضيفة أيضا نوى، وبالتالي فإن الاستعدادات الحمض النووي الريبي لا تزال تحتوي على الحمض النووي الريبي الثدييات. طريقة واحدة للتغلب على هذه المشكلة هي فصل البكتيريا سليمة من نوى الخلايا المضيفة باستخدام الطرد المركزي التفاضلي، رغم أن هذا الإجراء عادة ما يستغرق وقت رفع قلق من التغيرات في الجينات الشخصية التعبير أثناء الاستخراج. في هذه الورقة نقدم لبا تحسين والسريعبروتوكول استخراج cteria RNA، الذي يقوم على نهج تحلل الخلية التفاضلية. أولا، L. وهي lysed اللستيريا إصابة خلايا البلاعم مع الماء البارد. وبعد ذلك، تتم إزالة النوى بلعم بواسطة الطرد المركزي وجيزة والبكتيريا سليمة يتم جمع بسرعة على مرشحات، والتي من الحمض النووي الريبي المعزولة من خلال استخراج الفينول SDS الساخن من الأحماض النووية البكتيرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: خلال التجربة بأكملها، يتم تحضين خلايا البلاعم عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة الهواء القسري واتخاذها للخروج من الحاضنة فقط عن التلاعب التجريبية، التي تتم في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية. العمل مع L. بكتيريا الليستريا هي وفقا لمستوى السلامة البيولوجية 2 اللوائح.
1. خلية التحضير والعدوى البكتيرية (يوم 1 و 2)
- اليوم 1
- البذور نخاع 2.0 × 10 7 العظام الخلايا المشتقة من البلاعم (BMDM) على طبق 145 ملم في 30 مل BMDM + القلم بكتيريا وسائل الإعلام (الجدول 2). البذور 3 لوحات لكل سلالة بكتيرية ليتم تحليلها. احتضان ليلا 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة القسري في الهواء.
- بدء ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها من النوع البري (WT) L. المستوحدة 10403S السلالة في 10 مل من القلب الدماغ ضخ (BHI) المتوسطة، عند 30 درجة مئوية في حاضنة القياسية. أنابيب مكان ثقافة مائلة دون أن تهتز. ملاحظة:هذه الشروط نمو يصل تنظيم التعبير عن الجينات سياط، وهو ما يعزز العدوى كفاءة.
- يوم 2
- المتوسطة قبل الدافئة BMDM (بدون المضادات الحيوية القلم بكتيريا) (الجدول 2) والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) عند 37 درجة مئوية.
- غسل أحادي الطبقة بلعم مرتين مع 25 مل من قبل تحسنت برنامج تلفزيوني لإزالة المضادات الحيوية. إضافة 30 مل الطازجة BMDM المتوسطة.
- غسل 1.5 مل من ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها مع برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي البكتيريا في> 14000 x ج لمدة 1 دقيقة، ونبذ طاف، وإعادة التعليق البكتيريا بلطف في 1.5 مل من برنامج تلفزيوني قبل pipetting. كرر مرتين.
- تصيب كل لوحة بلعم مع 0.5 مل من الثقافة بين عشية وضحاها غسلها من النوع البري L. الليستريا. في حالة استخدام لوحات متعددة، ويصيب كل لوحة 15 دقيقة بعيدا. وهذا الفاصل الزمني تمكين حصاد كل لوحة على حدة في نهاية العدوى.
ملاحظة: يتم يعاير وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من خلال طلاء التخفيف المتسلسلالصورة من ثقافة البكتيرية المستخدمة للعدوى على لوحات BHI أجار والفرز مستعمرة (كفو) بعد 24 ساعة حضانة لوحات عند 37 درجة مئوية. باستخدام 0.5 مل من WT L. اللستيريا سلالة النتائج 10403S في وزارة الداخلية من ~ 100 (100 البكتيريا كفو لكل خلية بلعم). عند تحليل المسوخ البكتيرية معيبة في نمو الخلايا، ينبغي النظر في وزارة الداخلية أعلى. - بعد 0.5 حضانة ساعة على 37 درجة مئوية، وغسل الخلايا المصابة مرتين مع برنامج تلفزيوني، لإزالة البكتيريا غير مرتبط، وإضافة 30 مل قبل تحسنت BMDM المتوسطة. والبكتيريا تعلق استيعاب خلال ساعة 0.5 المقبلة.
- في 1 ساعة بعد الإصابة، إضافة 30 ميكرولتر من الجنتاميسين (1: 1000 لتصل إلى تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل) لقتل البكتيريا خارج الخلوي.
- تجميع جهاز فلتر عن طريق وضع رأس المرشح على قارورة السائل جمع مع منفذ فراغ منفذ. ثم وضع فلتر (0.45 ميكرون) على رأس المرشح، تليها قمع اسطوانة وتأمين مناطق مختلفة مع معدن جمصباح. تحضير الماء ريبونوكلياز خالية من الجليد الباردة.
- في 6 ساعة بعد العدوى والبكتيريا الحصاد من الخلايا المصابة كما يلي. علاج كل لوحة على حدة.
ملاحظة: عادة، L. اللستيريا يكمل 1-سجل النمو خلال 6 ساعات من العدوى في خلايا البلاعم. حضانات أطول يمكن أن يؤدي إلى فرط نمو جرثومي وموت الخلايا في الضامة، في حين فترات حضانة أقصر يمكن أن يؤدي إلى الحمل البكتيري أقل من ذلك بكثير. وزارة الداخلية والوقت من العدوى يمكن تعديلها للوصول إلى أفضل الظروف.- غسل الخلايا المصابة مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة. إضافة 20 مل من الماء ريبونوكلياز خالية من الجليد البارد لليز خلايا البلاعم. استخدام مكشطة الخلية، كشط الخلايا قبالة اللوحة بسرعة ولكن بعناية.
- جمع الخلايا هي lysed إلى أنبوب مخروطي 50 مل. دوامة لمدة 30 ثانية. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
- تمرير طاف من خلال جهاز تصفية باستخدام نظام فراغ. باستخدام الملقط، ولفة من مرشح وبسرعة نقلها إلى 15 مل المخروطأنبوب كال. الأداة الإضافية تجميد أنابيب مع المرشحات في النيتروجين السائل.
- تجميع جهاز الترشيح مع فلتر جديد للعينة القادمة، كما هو موضح في 1.2.7.
- تخزين مرشحات المجمدة في -80 درجة مئوية لليوم التالي. بدلا من ذلك، انتقل مباشرة إلى استخلاص الحمض النووي.
2. الأحماض النووية استخراج (يوم 3)
ملاحظة: تنفيذ كافة التلاعب مع حلول الفينول والكلوروفورم في غطاء الدخان.
- إعداد 1: مزيج 1 من الفينول المحمضة: الكلوروفورم، 400 ميكرولتر لكل عينة. خلط في أنابيب منفصلة، ثم سحب الطبقة المائية الناجم عن الطموح. إضافة 40 ميكرولتر من 10٪ SDS.
- ذوبان الجليد الأنابيب التي تحتوي على فلتر على الجليد للحفاظ على البرودة. إلى كل أنبوب يحتوي على فلتر إضافة 650 ميكرولتر من EDTA-خلات (AE) العازلة (الجدول 2).
- قم بالخطوات التالية في أقرب وقت ممكن.
- دوامة بقوة الأنبوب الذي يحتوي على فلتر لذلكأن المرشح يخفق إلى المحيط الخارجي للأنبوب وعازلة يغسل تماما التصفية. احتفظ البرد أنبوب عن طريق وضعه مرة أخرى على الجليد. ملاحظة: قد يكون من الضروري بالإضافة إلى دوامة أنبوب بينما مقلوب لغسل بالكامل البكتيريا قبالة التصفية.
- أكرر للجميع الأنابيب. قد يكون من المفيد أن تدور إلى أسفل التعليق قريبا (1 دقيقة في 120 x ج) في نهاية العملية.
- نقل المخزن المؤقت البكتيريا التي تحتوي على أنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على SDS ومزيج الفينول / الكلوروفورم (كما أعد 2.1). أكرر للجميع الأنابيب. قد يكون من الضروري أن تدور التصفية التي تحتوي على أنابيب (1 دقيقة في 120 x ج) مرة أخرى للحصول عازلة المتبقي من التصفية.
- ضع كل 1.5 مل الأنابيب في جهاز دوامة متعددة أنبوب، ودوامة بأقصى سرعة لمدة 10 دقيقة.
- احتضان الأنابيب في C كتلة الحرارة 65 درجة لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة (> 14000 x ج) لمدة 5 دقائق.
- نقل الطبقة المائية (حوالي 400 ميكرولتر) من كل رأوبي إلى أنبوب 1.5 مل جديدة تحتوي على 40 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) والايثانول 1.0 مل من 100٪. دوامة كل أنبوب دقيق.
ملاحظة: الجليكوجين يمكن أن تضاف إلى هذه الخطوة لتحسين التصور من بيليه عجل. - احتضان هذه العينات في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بدلا من ذلك، احتضان العينات عند -20 درجة مئوية خلال الليل. ثم، الطرد المركزي العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على السرعة القصوى (> 14000 x ج).
- نضح بعناية قبالة الإيثانول (الطبقة العليا) من كل أنبوب. إضافة 500 ميكرولتر الباردة الايثانول 70٪ لكل عينة ودوامة تماما. الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على السرعة القصوى (> 1 4000 x ج).
- نضح بعناية قبالة الإيثانول من كل أنبوب. تجفيف العينات لحوالي 2 دقيقة باستخدام المبخر فراغ دون تدفئة. لا تبالغ في تجفيف العينات.
- إضافة 25 ميكرولتر المياه خالية من ريبونوكلياز لكل عينة. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعناية وتدور الدوامة إلى أسفل.
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي في تيانه عينات باستخدام microvolume أشعة فوق البنفسجية فيس معمل. نتوقع أن استخراج حوالي 0،5-1 ميكروغرام من الأحماض النووية لكل لوحة.
ملاحظة: مكررات التقنية يمكن الجمع في هذه المرحلة.
3. الدناز العلاج
- إعداد رد فعل وفقا للجدول 1 في أنبوب microfuge. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. إضافة 450 ميكرولتر المياه خالية من ريبونوكلياز و 500 ميكرولتر من الفينول كلوروفورم-IAA مزيج (الجدول 2)، مراحل منفصلة بواسطة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة على السرعة القصوى (> 14000 x ج).
- نقل الطبقة المائية لأنبوب جديد وإضافة 500 ميكرولتر الكلوروفورم-IAA مزيج (الجدول 2)، ودوامة مراحل منفصلة من 2 دقيقة الطرد المركزي في السرعة القصوى (> 14000 x ج).
- نقل الطبقة المائية لأنبوب جديد وإضافة 1 مل من الايثانول و 50 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2). دوامة.
ملاحظة: الجليكوجين يمكن أن تضاف إلى هذه الخطوة لتحسين التصور من بيليه عجل. - نضح بعناية قبالة الإيثانول من كل أنبوب. إضافة 500 ميكرولتر الباردة الايثانول 70٪ لكل عينة ودوامة تماما. الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على السرعة القصوى. نضح بعناية قبالة الإيثانول من كل أنبوب.
- تجفيف العينات لحوالي 2 دقيقة باستخدام المبخر فراغ دون تدفئة. لا تبالغ في تجفيف العينات.
- إضافة 12 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه، واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، دوامة، وتدور باستمرار. العينات تحتوي على الحمض النووي الريبي النقى الاحتفاظ بها على الجليد. بدلا من ذلك، حل الحمض النووي الريبي في ريبونوكلياز خالية H 2 O مع 0.1 ملي EDTA أو TE العازلة (10 ملي تريس، 1 ملم EDTA).
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام microvolume أشعة فوق البنفسجية فيس معمل. نتوقع ~ 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لكل عينة (إذا كان يتم الجمع بين مكررات التقنية).
ملاحظة: استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لهذا البروتوكول هو مناسبة FOص تحليل النسخ الجيني بواسطة تقنيات متعددة. ونحن عادة استخدام تحليل RT-QPCR لدراسة L. المستوحدة النسخ الجيني خلال العدوى من خلايا البلاعم 1-4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد في النظام النموذجي في الشكل (1) ويشمل خلايا البلاعم المصابين L. المستوحدة البكتيريا، التي تكرار في العصارة الخلوية بلعم الشكل 2 يمثل المخطط التجريبي الشكل 3 يمثل نتائج نموذجية من هذا التحليل RT-QPCR الجينات الفوعة خلال WT L. المستوحدة النمو في الضامة بالمقارنة مع النمو في غني المتوسطة مختبر BHI. وأظهرت النتائج أن مستويات نسخ من اثنين من عوامل الفوعة الرئيسية للL. الليستريا. ترميز HLY LLO السموم واكتا ترميز الأكتين البروتين التجمع، والتي يسببها بقوة على إصابة الضامة.
الشكل 1: لمحة عامة عن L. المستوحدة لايف ستايل على شكل Intracellular مسببات الأمراض. L. اللستيريا يغزو الخلايا المضيفة معربا عن بروتينات متخصصة تسمى internalins التي تحفز على استيعاب نشط في الخلايا غير البلعمية، في حين أن الخلايا البلعمية يبلعم البكتيريا. على الغزو، L. وجدت اللستيريا في البداية داخل فجوة الاندوسوم / يبلوع من الذي يهرب بسرعة معتمدين بالدرجة الأولى على السم listeriolysin O (LLO). داخل الخلية المضيفة العصارة الخلوية L. اللستيريا يعيد بسرعة، وينتشر من خلية إلى أخرى باستخدام الحركة القائمة على الأكتين عن طريق بروتين ناقل لها. وينظم كل عوامل الفوعة ذكره المنشط الفوعة الماجستير، PrfA. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط تدفق تمثيل إكسبالإجراءات erimental. وتشمل الخطوات الرئيسية تحلل الخلايا المصابة، والفصل بين أنوية الخلايا المضيفة وخلايا البكتيريا وعزل الحمض النووي الريبي. الخطوات الحاسمة موضحة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل النسخ من الجينات الفوعة خلال L. اللستيريا بين الخلايا النمو. تحليل النسخ من الجينات HLY (ترميز LLO) والجينات ACTA خلال L. اللستيريا 10403S نمو الخلايا في خلايا البلاعم في 6 ساعات بعد الإصابة بالمقارنة مع مستوياتها خلال النمو المتسارع في BHI المتوسطة باستخدام تحليل RT-QPCR. وتتمثل مستويات النسخ والكمية النسبية (RQ)، نسبةإلى المستويات النسخ خلال النمو في BHI. وكانت مستويات النسخ تطبيع إلى مستويات 16S الريباسي باسم الجينات المرجعية. البيانات هي ممثل من 3 يكرر البيولوجية المستقلة (N = 3). أشرطة الخطأ تمثل فاصل الثقة 95٪. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| RNA | لتصل إلى 2 ميكروغرام (في حجم أقصى 44 ميكرولتر) |
| عازلة 10X الدناز | 5 ميكرولتر |
| المياه خالية من ريبونوكلياز | كاملة إلى 50 ميكرولتر اجمالى حجم |
| الدناز | 1 ميكرولتر (1 وحدة) |
الجدول 1: الدناز بروتوكول رد الفعل.
| 1. 500 مل BMDوسائل الإعلام M + القلم بكتيريا (تصفية تعقيمها): | |
| DMEM | 235 مل |
| FBS (المعطل مدة 30 دقيقة في 54 ° C) | 100 مل |
| M-CSF (L-929 مكيفة متوسطة) 19 | 150 مل |
| الجلوتامين | 5 مل |
| البيروفات الصوديوم | 5 مل |
| بيتا المركابتويثانول | 0.5 مل |
| البنسلين / الستربتوميسين | 5 مل |
| مجموع | 500 مل |
| 2. 500 مل BMDM (تصفية تعقيمها): | |
| DMEM | 235 مل |
| FBS (المعطل مدة 30 دقيقة في 54 ° C) | 100 مل |
| M-CSF (L-929 مكيفة متوسطة) 19 | 150 مل td> |
| الجلوتامين | 5 مل |
| البيروفات الصوديوم | 5 مل |
| بيتا المركابتويثانول | 0.5 مل |
| مجموع | 500 مل |
| 3. عازلة AE | |
| NaOAc درجة الحموضة 5.2 | 50 ملي |
| EDTA | 10 ملي |
| المياه خالية من ريبونوكلياز | |
| 4. الفينول كلوروفورم-IAA | |
| الفينول | 25 مل |
| الكلوروفورم | 24 مل |
| ايزو الأميل الكحول | 1 مل |
| 5. الكلوروفورم-IAA | |
| الكلوروفورم | 24 مل |
| ايزو الأميل الكحول | 1 مل |
= "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الجدول 2: وصفات من وسائل الإعلام والمخازن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول صفها هنا يمثل طريقة الأمثل لعزل الحمض النووي الريبي البكتيرية من L. المستوحدة نمو البكتيريا داخل الخلية في خلايا البلاعم. ويستند هذا البروتوكول على تحلل الخلية التفاضلية وتضم اثنين من الخطوات الرئيسية لتخصيب اليورانيوم من الحمض النووي الريبي البكتيرية: بلعم الترسيب نوى باستخدام الطرد المركزي ومجموعة السريع للبكتيريا عن طريق الترشيح. يتم اتباع هذه الخطوات عن طريق إجراء استخراج الحمض النووي الريبي القياسية. بينما يصف هذا البروتوكول تنقية من الحمض النووي الريبي ليستري، ويمكن تعديلها بسهولة لمسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. على الرغم من أن أسلوب يركز على تنقية من الحمض النووي الريبي لتحليل النسخي، ومبدأ تستخدم لفصل نمو البكتيريا داخل الخلية من مضيفه يمكن أن تطبق أيضا لتنقية مكونات بكتيرية أخرى، مثل الحمض النووي والبروتينات والجدار الخلوي، الخ هذه الجينومية و أن التحليلات الكيميائية الحيوية توفير فهم أفضل وتوصيف العوامل المسببة للأمراض الخلايادورة الحياة أثناء العدوى.
تؤدي هذه الممارسة إلى ~ 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع البكتيرية. على الرغم من أن عائدات RNA منخفضة نسبيا، فهي مناسبة لتحليل المصب من النسخ الجيني باستخدام تقنيات متعددة، مثل RT-QPCR، RNA تسلسل والتكنولوجيات الحديثة التهجين مقرها. لتحسين المحاصيل RNA، فمن المستحسن استخدام اللقاح جديدة البكتيرية، وكذلك حل الفينول nuclease خالية من المياه العذبة ومخازن لتجنب التلوث ريبونوكلياز الممكنة. البكتيريا حصادها والحمض النووي الريبي معزولة يجب أن أبقى دائما على الجليد أثناء عملية الاستخراج. الساعة العدوى يمكن تعديلها حسب هذه المسألة البيولوجية ودراستها للكائن الحي. لزيادة كميات من الحمض النووي الريبي، وتجربة يمكن زيادتها لتشمل المزيد من لوحات العدوى في كل عينة.
مصدر القلق الرئيسي عند تنفيذ هذه التجربة هي مخاطر تغيير الوضع نسخ من البكتيريا خلال الخطوات الحصاد. معظم bacterالجيش العراقي الرد على درجات الحرارة الباردة من خلال تفعيل استجابات التوتر صدمة الباردة، ويجب أن يتم تنفيذ الحصاد وبالتالي البكتيرية في أسرع وقت ممكن. وينبغي إعداد الكواشف والمعدات في وقت مبكر، وينبغي أن يعامل كل عينة على حدة. الخطوة الأكثر أهمية هو تجميد فورا البكتيريا التي تحتوي على فلتر في النيتروجين السائل. الفشل في القيام بذلك قد يقلل بشكل كبير نوعية الحمض النووي الريبي معزولة. خطوة حاسمة أخرى في هذا البروتوكول هو هطول الأمطار الإيثانول من كميات صغيرة نسبيا من الأحماض النووية. وينبغي إيلاء عناية اضافية عدم تعطيل غير مرئية الأحماض النووية بيليه. ويمكن أن يضاف الجليكوجين إلى حل هطول الأمطار لتحسين التصور من بيليه خلال هذه الخطوات.
بالنسبة لبعض التطبيقات اللاحقة، على سبيل المثال، RT-QPCR، وإزالة الحمض النووي أمر بالغ الأهمية. على الرغم من أننا لا نرصد بشكل روتيني كفاءة العلاج الدناز، والحد من 3-5 أضعاف في المبلغ الإجمالي من الأحماض النووية التالية الدناز رreatment إرشادية للعلاج الدناز فعالة. وتجدر الإشارة، أي تقنية متاحة تجاريا أو عدة لإزالة الحمض النووي من عينات الحمض النووي الريبي مناسبة. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام عينات مراقبة الجودة، مثل عينة مع عدم وجود النسخ العكسي يؤديها، هو مفيد في مثل هذه التطبيقات.
العيوب الرئيسية للبروتوكول وصفها هنا هو كمية قليلة نسبيا من الحمض النووي الريبي المستخرج، وهي عبارة عن 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع. وهكذا، هذه التقنية ليست مناسبة لتقنيات التهجين الكلاسيكية، مثل تحليل لطخة الشمالي، والتي تتطلب ميكروغرام من الحمض النووي الريبي.
التقدم التكنولوجي الحديث في تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA عميق وما يليها) يمكن تحليل كل من العوامل المسببة للأمراض البكتيرية والثدييات ملامح النسخ المضيف معا، دون الحاجة إلى فصل الرنا، وأسلوب يسمى 'الحمض النووي الريبي وما يليها المزدوج "16-18. على الرغم من أن تحليل الحمض النووي الريبي وما يليها ثنائي مثالي في دراسة التفاعل المضيف الممرض، فمن مكلفه جداه والتي لا يمكن استخدامها في كثير من الأحيان. لأن محتوى الحمض النووي الريبي البكتيرية في الخلايا المصابة منخفضة بشكل خاص، فإنه من الصعب للغاية ومكلفة للحصول على ما يكفي من بكتيريا يقرأ لتحليل الفعال التعبير الجيني، حتى مع عمق قراءة عالية توفرها منصات التسلسل الجديدة. لكن هناك عائقا إضافيا لهذا النهج هو الاستخدام المتكرر للخطوة RNA أو كدنا] التضخيم، مما قد يؤدي إلى نتائج متحيزة في التعبير الجيني. الطريقة المعروضة هنا يقدم حلا وسطا بين المعلومات التي تم الحصول عليها والفعالية من حيث التكلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Listeria monocytogenes 10403S | 20 | ||
| Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice | 21 | ||
| H2O, RNAse free | Thermo Scientific | 10977-015 | DEPC-treated water can be used |
| DMEM | Gibco | 41965039 | |
| Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-088 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Brain heart infusion (BHI) | Merckmillipore | 1104930500 | |
| Phenol saturated pH 4.3 | Fisher | BP1751I-400 | |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Iso-amyl alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | W302406 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| DNaseI | Fermentas | EN0521 | |
| SDS 10% | Sigma-Aldrich | L4522 | |
| Ethanol absolute | Merck Millipore | 1070174000 | |
| 37 °C, 5% CO2 forced-air incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Cell scrapers | Nunc | 179693 | |
| Kontes glass holder for 45 mm filters | Fisher | K953755-0045 | |
| MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm | Merck Millipore | HAWP04700 | |
| SpeedVac system | Thermo Scientific | SPD131DDA | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | Model G560E | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ||
| 145 mm cell culture dishes | Greiner | 639 160 | |
| 1.7 ml tubes, RNase-free | Axygen | MCT-175-C | |
| 30 °C incubator | Thermo Scientific | ||
| 65 °C heat block | Thermo Scientific | ||
| 4 °C table centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Sterile pipettes, 25 ml | Greiner | ||
| Falcon tubes, 50 ml | Greiner | ||
| Liquid nitrogen |
References
- Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. , (2014).
- Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
- Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
- Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
- World Health Organization WHO. , http://www.who.int/en/ (2005).
- Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
- Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
- Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
- Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
- Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
- Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
- Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
- Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
- La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
- Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
- Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
- Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
