Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

RNA Oprensning fra Intracellulært Grown doi: 10.3791/54044 Published: June 4, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Intracellulære bakterielle patogener ─ bakterier, der forårsager smitsomme sygdomme og stand til at vokse og reproducere i celler af humane værter ─ er et stort sundhedsproblem bekymring i hele verden 5. At invadere og formere sig i en pattedyrcelle, har intracellulære patogener erhvervet sofistikerede virulens mekanismer og faktorer. Mens disse mekanismer er afgørende for evnen til at forårsage en sygdom, vi ved lidt om deres regulering og dynamik. Da genekspressionsprofiler af bakterier dyrket i flydende medier ikke afspejler det faktiske miljø i værtsceller, er der et stigende behov for transkriptom analyser af bakterier dyrket i deres intracellulære nicher. Sådanne analyser vil gøre det muligt tydningen af ​​specifikke bakterielle tilpasninger udløst af værten og vil bidrage til at identificere nye mål for terapeutisk design. Transkriptom analyse af intracellulært dyrkede bakterier er yderst udfordrende, da pattedyr-RNA-overtal bakteriel RNA ved påmindst ti gange. I dette manuskript, beskriver vi en eksperimentel metode til isolering bakteriel RNA fra Listeria monocytogenes vokser inde murine makrofagceller. Den ekstraherede RNA kan bruges til at studere intracellulære tilpasninger og virulens mekanismer patogene bakterier ved forskellige teknikker for transkription analyse, såsom RT-PCR, RNA-Seq, microarray og andre hybridiseringsbetingelser baserede teknologier.

L. monocytogenes er det agens af listeriose hos mennesker, en sygdom med kliniske manifestationer rettet primært immunkompromitterede personer, ældre og gravide kvinder 6. Det er en Gram-positive fakultativ intracellulær patogen, der invaderer en bred vifte af pattedyrceller, der er blevet anvendt i årtier som en model i vært-patogen interaktioner studerer 7. Ved invasion, den befinder sig indledningsvis i en vacuolen eller en fagosomet (i tilfælde af fagocytiske celler), hvoraf det skal undslippe ind than vært cellecytosolen for at replikere. Adskillige virulensfaktorer er blevet vist at mediere escape proces, primært det poredannende hæmolysin, listeriolysin O (LLO) og to yderligere phospholipaser 8. I cytosolen bakterierne anvender værten actinpolymerisation maskiner til at drive sig selv på actinfilamenter i cellen og at sprede sig fra celle til celle (Figur 1). Alle større virulensfaktorer L. monocytogenes involveret i invasion, intracellulær overlevelse og replikation, aktiveres af master virulens transskription regulator, PrfA. 8-10.

I det sidste årti, flere undersøgelser foretaget af os og andre har med held anvendt metoder til transkriptom analyse af intracellulært dyrkede bakterier inde værtsceller 2,11-15. Der benyttes to hovedfremgangsmåder til at adskille bakteriel RNA fra vært-RNA, som er baseret på: 1) Selektiv berigelse af bakteriel RNA og 2) RNA isolering ved diffedifferentielle cellelyse. Den første metode bygger på subtraktiv hybridisering af total RNA ekstrakter til pattedyr-RNA-molekyler (for eksempel ved anvendelse af kommercielt tilgængelige kits) eller selektiv indfangning af bakterielle transskriberede sekvenser (skotsk) 11. Den anden tilgang er baseret på differentiel lyse af bakterier og værtsceller, i hvilke værtscellerne lyseres mens bakterieceller forbliver intakte. Bakterieceller separeres derefter fra værtscellen lysatet, normalt ved centrifugering, og RNA ekstraheres ved anvendelse af standardteknikker. Hovedproblemet ved hjælp af denne metode er, at sammen med de intakte bakterier, værtsceller kerner også isoleret, således RNA præparater stadig indeholder mammal RNA. En måde at overvinde dette problem er at adskille intakte bakterier fra værtsceller kerner ved anvendelse af differentiel centrifugering, selvom denne procedure normalt tager tid at hæve bekymring af ændringer i genekspression profil under ekstraktion. I denne afhandling præsenterer vi en forbedret og hurtig bacteria RNA ekstraktion protokol, som er baseret på forskellen cellelysis tilgang. Første, L. monocytogenes inficerede makrofagceller lyseres med koldt vand. Dernæst makrofag kerner fjernet ved en kort centrifugering og intakte bakterier hurtigt opsamlet på filtre, hvorfra RNA isoleres under anvendelse af varm phenol-SDS ekstraktion af bakterielle nukleinsyrer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bemærk: Under hele eksperimentet makrofagceller inkuberet ved 37 ° C i en 5% CO2 tvungen luft inkubatoren og taget ud af inkubatoren kun til forsøg manipulationer, som udføres i et klasse II biologisk sikkerhedsskab. Arbejde med L. monocytogenes-bakterier er i henhold til biologisk sikkerhedsniveau 2 regler.

1. Cell Forberedelse og bakteriel infektion (dag 1 og 2)

  1. dag 1
    1. Seed 2,0 x 10 7 knoglemarvsceller afledte makrofagceller (BMDM) på en 145 mm skål i 30 ml BMDM + Pen-Strep medier (tabel 2). Seed 3 plader for hver bakteriestamme, der skal analyseres. Inkuber natten over ved 37 ° C i en 5% CO2 tvungen luftcirkulation inkubator.
    2. Start en overnatning bakteriekultur af vildtype (WT) L. monocytogenes strain 10403S i 10 ml hjerne-hjerte-infusion (BHI) -medium ved 30 ° C i en standard inkubator. Sted dyrkningsrør hælder uden omrystning. Note:Disse vækstbetingelser opregulere ekspressionen af ​​flagel-gener, som fremmer effektiv infektion.
  2. dag 2
    1. Pre-varm BMDM medium (uden Pen-Strep-antibiotika) (tabel 2) og phosphatbufret saltvand (PBS) ved 37 ° C.
    2. Vask makrofag monolag to gange med 25 ml forvarmet PBS for at fjerne antibiotika. Tilføj 30 ml frisk BMDM medium.
    3. Vask 1,5 ml natten bakteriekultur med PBS ved centrifugering bakterier ved> 14.000 xg i 1 min, kassere supernatanten, og opblandes bakterier forsigtigt i 1,5 ml PBS ved pipettering. Gentag to gange.
    4. Inficere hver makrofag plade med 0,5 ml af en vasket overnatskultur af vildtype L. monocytogenes. Hvis der anvendes flere plader, inficere hver plade 15 min fra hinanden. Dette tidsinterval vil gøre det muligt at høste hver plade individuelt ved slutningen af ​​infektionen.
      Bemærk: infektionsmultiplicitet (MOI) analyseres ved udpladning seriefortyndings bakteriekultur anvendt til infektion på BHI-agarplader og tælle kolonidannende enheder (CFU) efter 24 timers inkubation af pladerne ved 37 ° C. Anvendelse af 0,5 ml WT L. monocytogenes stamme 10403S resulterer i en MOI på ~ 100 (100 bakterier CFU pr makrofag celle). Ved analyse af bakterielle mutanter defekte i intracellulær vækst, bør en højere MOI overvejes.
    5. Efter 0,5 timers inkubation ved 37 ° C, vaskes de inficerede celler to gange med PBS for at fjerne ubundne bakterier, og der tilsættes 30 ml forvarmet BMDM medium. Vedhæftede bakterier vil internalisere under næste 0,5 time.
    6. Efter 1 time efter infektion, tilsættes 30 pi gentamicin (1: 1.000 for at nå en slutkoncentration på 50 ug / ml) for at dræbe ekstracellulære bakterier.
    7. Saml filterapparat ved at placere et filter hoved på en indsamling flydende kolbe med et vakuum udløbsport. Derefter anbringes et filter (0,45 um) på et filter head, efterfulgt af en cylinder tragt og fastgør de forskellige dele med en metal clampe. Forbered iskold RNase-frit vand.
    8. Ved 6 timer efter infektion, høst bakterier fra inficerede celler som følger. Behandl hver plade individuelt.
      Bemærk: Normalt L. monocytogenes fuldender en-log over vækst i 6 timer for infektion i makrofagceller. Længere inkubationer kan resultere i bakteriel overvækst og celledød af makrofager, mens kortere inkubationsperioder kan medføre betydeligt lavere bakterielle belastninger. MOI og infektionstidspunktet kan modificeres til at nå optimale betingelser.
      1. Vask inficerede celler med PBS én gang. Der tilsættes 20 ml iskold RNase-frit vand til at lysere makrofagceller. Ved hjælp af en celleskraber, skrab cellerne fra pladen hurtigt men grundigt.
      2. Indsamle lyserede celler til en 50 ml konisk rør. Vortex i 30 sek. Centrifuger ved 800 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
      3. Passere supernatanten gennem filteret under anvendelse af et vakuumsystem. Ved hjælp af en pincet, rul filteret og hurtigt overføre det til en 15 ml CONIcal rør. Snap-fryse rørene med filtrene i flydende nitrogen.
      4. Saml filtreringsapparat med et nyt filter til den næste prøve, som beskrevet i 1.2.7.
      5. Opbevar de frosne filtre ved -80 ° C til næste dag. Alternativt, gå direkte til nukleinsyre ekstraktion.

2. Nucleic Acids Extraction (Dag 3)

Bemærk: Udfør alle manipulationer med phenol og chloroform løsninger i et stinkskab.

  1. Forbered en 1: 1 blanding af syrnet phenol: chloroform, 400 pi for hver prøve. Bland i separate rør, og derefter trække det resulterende vandige fase ved aspiration. Tilsæt 40 ​​pi 10% SDS.
  2. Optø filteret-holdige rør på is for at holde dem kolde. Til hvert filter-holdige rør tilsættes 650 pi acetat-EDTA (AE) buffer (tabel 2).
  3. Udfør følgende trin så hurtigt som muligt.
    1. Energisk vortexes rør indeholdende filteret såat filteret piskeris til periferien af ​​røret og bufferen fuldt vasker filteret. Hold altid røret kulde ved at placere det tilbage på is. Bemærk: Det kan være nødvendigt yderligere vortex rør, medens inverteret til fuldt vaske bakterierne af filteret.
    2. Gentag for alle rør. Det kan være nyttigt at spin-ned suspensionen kort (1 min ved 120 x g) i slutningen af ​​processen.
  4. Overfør bakterier-holdige puffer til et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende SDS og phenol / chloroform-blanding (som fremstillet i 2.1). Gentag for alle rør. Det kan være nødvendigt at dreje filteret holdige rør (1 min ved 120 xg) igen for at få tilbageværende buffer fra filteret.
  5. Læg alle de 1,5 ml rør i en multi-rør vortex-enhed, og vortex ved fuld hastighed i 10 min.
  6. Inkubér rørene i et 65 ° C varmeblok i 10 minutter. Centrifugeres ved maksimal hastighed (> 14.000 xg) i 5 min.
  7. Overfør det vandige lag (ca. 400 pi) fra hver tUbe til et nyt 1,5 ml rør indeholdende 40 pi 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 1,0 ml 100% ethanol. Vortex hvert rør grundigt.
    Bemærk: Glycogen på dette trin kan tilsættes for at forbedre visualisering af det udfældede pellet.
  8. Inkuber prøverne ved -80 ° C i 1 time. Alternativt inkuberes prøverne ved -20 ° C natten over. Derefter centrifugeres prøverne ved 4 ° C i 20 minutter ved maksimal hastighed (> 14.000 xg).
  9. Forsigtigt aspireres fra ethanol (øvre lag) fra hvert rør. Der tilsættes 500 pi kold 70% ethanol til hver prøve og vortex grundigt. Der centrifugeres ved 4 ° C i 20 minutter ved maksimal hastighed (> 1 4.000 xg).
  10. Forsigtigt aspireres fra ethanol fra hvert rør. Tør prøverne i ca. 2 min ved anvendelse af en vakuum fordamper med ingen varme. Må ikke over-tør prøverne.
  11. Tilsæt 25 pi RNase-frit vand til hver prøve. Der inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter. Omhyggeligt vortex og spin-ned.
  12. Mål koncentrationen RNA i than prøver under anvendelse en microvolume UV-Vis spektrofotometer. Forvente at udtrække ca. 0,5 - 1 ug af nukleinsyrer per plade.
    Bemærk: Tekniske gentagelser kan kombineres på dette stadium.

3. DNase Behandling

  1. Oprette reaktionen ifølge tabel 1 i et mikrofugerør. Der inkuberes ved 37 ° C i 45 minutter. Tilføj 450 pi RNase-frit vand og 500 pi phenol-chloroform-IAA mix (tabel 2), separate faser ved centrifugering i 2 min ved maksimal hastighed (> 14.000 xg).
  2. Overfør det vandige lag til et nyt rør, og der tilsættes 500 pi chloroform-IAA mix (tabel 2), vortex og separate faser ved 2 min centrifugering ved maksimal hastighed (> 14.000 xg).
  3. Overfør det vandige lag til et nyt rør, og der tilsættes 1 ml ethanol og 50 pi 3 M natriumacetat (pH 5,2). Vortex.
    Bemærk: Glycogen på dette trin kan tilsættes for at forbedre visualisering af det udfældede pellet.
  4. Forsigtigt aspireres fra ethanol fra hvert rør. Der tilsættes 500 pi kold 70% ethanol til hver prøve og vortex grundigt. Der centrifugeres ved 4 ° C i 20 minutter ved maksimal hastighed. Forsigtigt aspireres fra ethanol fra hvert rør.
  5. Tør prøverne i ca. 2 min ved anvendelse af en vakuum fordamper med ingen varme. Må ikke over-tør prøverne.
  6. Tilsættes 12 pi RNase-frit vand, inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur, vortex, og spin-ned. Prøverne indeholder renset RNA, holde dem på is. Alternativt opløses RNA i RNase-fri H2O med 0,1 mM EDTA eller TE-buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA).
  7. Mål RNA-koncentrationer under anvendelse af en microvolume UV-Vis spektrofotometer. Forvente ~ 100 ng RNA pr prøven (hvis tekniske gentagelser kombineres).
    Bemærk: RNA ekstraheres efter denne protokol er velegnet for gentransskription analyse af flere teknikker. Vi anvender sædvanligvis RT-qPCR analyse til at studere L. monocytogenes gentransskription under infektion af makrofagceller 1-4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Modellen er vist i figur 1 og indbefatter makrofag celler inficeret med L. monocytogenes bakterier, der kopierer i makrofag cytosolen. Figur 2 repræsenterer forsøgsordningen. Figur 3 repræsenterer typiske resultater af en sådan RT-qPCR-analyse af virulensgener under WT L. monocytogenes vækst i makrofager i forhold til væksten i rigt laboratorium medium BHI. Resultaterne viser transkriptionsniveauer af to vigtige virulensfaktorer L. monocytogenes; Hly koder LLO toksin og Acta koder actin samling protein, som er robust induceres ved infektion af makrofager.

figur 1
Figur 1: Generel oversigt over L. monocytogenes Livsstil som en Intracellular patogen. L. monocytogenes invaderer værtsceller ved ekspression specialiserede proteiner betegnet internalins der inducerer aktiv internalisering til ikke-fagocytiske celler, hvorimod fagocytceller fagocytere bakterierne. Ved invasion, L. monocytogenes indledningsvis findes i et endosom / fagosom vacuole hvorfra det hurtigt undslipper hjælp primært listeriolysin O toksin (LLO). I værtscellen cytosolen L. monocytogenes replikerer hurtigt, og spreder sig fra celle til celle ved hjælp actin baseret motilitet via sin Acta protein. Alle nævnte virulensfaktorer er reguleret af skibsføreren virulens aktivator, PrfA. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: En diagram, der viser Experimental Procedure. De vigtigste skridt omfatter lyse af inficerede celler, adskillelse af værtsceller kerner og bakterier celler og RNA isolation. Kritiske trin er illustreret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Transskription Analyse af virulens gener under L. monocytogenes Intracellulær vækst. Transskription analyse af hly genet (der koder LLO) og Acta genet under L. monocytogenes 10403S intracellulær vækst i makrofagceller 6 timer efter infektion sammenlignet med deres niveauer under eksponentiel vækst i BHI medium ved anvendelse af RT-qPCR analyse. Transskription niveauer er repræsenteret som relativ mængde (RQ), relativetil transcriptionsniveauerne under vækst i BHI. Transskription niveauer var normaliseret til niveauerne af 16S rRNA som reference gen. Dataene repræsenterer 3 uafhængige biologiske gentagelser (n = 3). Fejl søjler repræsenterer 95% konfidensinterval. Klik her for at se en større version af dette tal.

RNA op til 2 mg (i max volumen på 44 pi)
10x DNase buffer 5 pi
RNase-frit vand komplet til 50 pi samlet volumen
DNAse 1 pi (1 enhed)

Tabel 1: DNase Reaction protokol.

1. 500 ml BMDM + Pen-Strep medier (filtersteriliseret):
DMEM 235 ml
FBS (inaktiveret 30 min ved 54 ° C) 100 ml
M-CSF (L-929 konditioneret medium) 19 150 ml
glutamin 5 ml
natriumpyruvat 5 ml
p-mercaptoethanol 0,5 ml
Penicillin / streptomycin 5 ml
Total 500 ml
2. 500 ml BMDM (filtersteriliseret):
DMEM 235 ml
FBS (inaktiveret 30 min ved 54 ° C) 100 ml
M-CSF (L-929 konditioneret medium) 19 150 ml
glutamin 5 ml
natriumpyruvat 5 ml
p-mercaptoethanol 0,5 ml
Total 500 ml
3. AE buffer
NaOAc pH 5,2 50 mM
EDTA 10 mM
RNase-frit vand
4. phenol-chloroform-IAA
Phenol 25 ml
chloroform 24 ml
Iso-amylalkohol 1 ml
5. chloroform-IAA
chloroform 24 ml
Iso-amylalkohol 1 ml

Tabel 2: Opskrifter af medier og buffere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollen beskrevet her repræsenterer en optimeret fremgangsmåde til isolering af bakteriel RNA fra L. monocytogenes bakterier vokser intracellulært i makrofagceller. Denne protokol er baseret på differentiel cellelysering og omfatter to vigtige skridt for berigelse af bakteriel RNA: makrofag kerner sedimentation ved hjælp af centrifugering og en hurtig samling af bakterier ved filtrering. Disse trin efterfølges af en standard RNA-ekstraktion procedure. Mens denne protokol beskriver oprensning af listerial RNA, kan det let modificeres til andre bakterielle patogener. Selvom fremgangsmåden fokuserer på rensning af RNA til transkriptionel analyse kan princippet anvendes til at adskille de intracellulært voksende bakterier fra sin vært også anvendes til oprensning af andre bakterielle komponenter, såsom DNA, proteiner, celle-væg, etc. Sådanne genomiske og biokemiske analyser ville give en bedre forståelse og karakterisering af det intracellulære patogenlivscyklus under infektion.

Proceduren resulterer i ~ 100 ng af totalt bakterielt RNA. Selvom RNA udbytter er relativt lave, de er egnede til nedstrøms analyser af gentranskription ved hjælp af flere teknikker, såsom RT-qPCR, RNA-Seq og moderne hybridiseringsbetingelser baserede teknologier. For at forbedre RNA udbytter, anbefales det at bruge friske bakterielle inoculums, samt frisk phenol løsning nuklease-frit vand og buffere for at undgå mulige RNase forureninger. Høstede bakterier og isolerede RNA bør altid holdes på is under udpakningen. Infektionen kan justeres afhængigt af den biologiske spørgsmål og organismen undersøgt. For at øge mængden af ​​RNA, kan eksperimentet skaleres op til at omfatte flere infektion plader per hver prøve.

Den største bekymring, når der udføres et sådant eksperiment er risikoen for at ændre transkriptionen profil af bakterierne under høst trin. De fleste Bacteria reagere på kolde temperaturer ved at aktivere kuldechok stressreaktioner, og bør udføres så hurtigt som muligt og således bakteriel høst. Reagenser og udstyr skal forberedes i god tid, og hver prøve bør behandles særskilt. Det mest kritiske trin er for straks at standse filter-holdige bakterier i flydende nitrogen. I modsat fald kan dramatisk reducere kvaliteten af ​​det isolerede RNA. Et andet afgørende skridt i denne protokol er den ethanoludfældning af de relativt små mængder af nukleinsyrer. bør der udvises ekstra omhu for ikke at forstyrre den usynlige nukleinsyrer pellet. Glycogen kan tilsættes til udfældning løsning til at forbedre visualisering af pelleten under disse trin.

For nogle efterfølgende ansøgninger, f.eks RT-qPCR, fjerne DNA er kritisk. Selvom vi ikke rutinemæssigt overvåge effektiviteten af ​​DNase-behandling, en reduktion på 3 - 5 gange i den totale mængde af nukleinsyrer efter DNase tEHANDLING indikerer effektiv DNase-behandling. Notatet enhver kommercielt tilgængelige teknik eller kit til DNA fjernelse fra RNA-prøver er egnet. Desuden, ved hjælp af kontrolprøver kvalitet, såsom en prøve uden revers transkription udført, er fordelagtig ved sådanne anvendelser.

En væsentlig begrænsning af protokollen beskrevet her er den relativt lave mængde RNA ekstraheret, hvilket er omkring 100 ng totalt RNA. Således er denne teknik ikke egnet til klassiske hybridiseringsteknikker, såsom Northern blot-analyse, som kræver mikrogram RNA.

Den nylige teknologiske fremskridt i RNA-sekventering (dyb RNA-seq) muliggør analysen af både det bakterielle patogen og pattedyrværten transskriptionsprofiler sammen, uden behov for at adskille deres RNA'er, en fremgangsmåde kaldet 'dual RNA-seq' 16-18. Selvom dobbelt RNA-seq analyse er ideel i at studere vært-patogen interaktion, er det meget expensive og kan ikke bruges ofte. Fordi bakterie-RNA-indhold i inficerede celler er særlig lav, er det yderst vanskeligt og dyrt at få nok bakterielle læser for en effektiv genekspression analyse, selv med den høje læse dybde billede efter nyeste sekventering platforme. En yderligere ulempe ved denne fremgangsmåde er den hyppige brug af et RNA eller cDNA amplifikationstrin, hvilket kan føre til skæve resultater for genekspression. Metoden præsenteres her tilbyder et kompromis mellem oplysninger og omkostningseffektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Listeria monocytogenes 10403S 20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice 21
H2O, RNAse free Thermo Scientific 10977-015 DEPC-treated water can be used
DMEM Gibco 41965039
Glutamine Gibco 25030081
Sodium pyruvate Gibco 11360-088
β-Mercaptoethanol Gibco 31350010
Pen/Strep Gibco 15140-122
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
FBS Gibco 10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS Sigma-Aldrich D8537
Brain heart infusion (BHI) Merckmillipore 1104930500
Phenol saturated pH 4.3 Fisher BP1751I-400
Chloroform Fisher BP1145-1
Iso-amyl alcohol Sigma-Aldrich W205702
Sodium acetate Sigma-Aldrich W302406
EDTA Sigma-Aldrich EDS
DNaseI Fermentas EN0521
SDS 10% Sigma-Aldrich L4522
Ethanol absolute Merck Millipore 1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubator Thermo Scientific Model 3111
Cell scrapers Nunc 179693
Kontes glass holder for 45 mm filters Fisher K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm Merck Millipore HAWP04700
SpeedVac system Thermo Scientific SPD131DDA
Vortex-Genie 2 Scientific Industries Model G560E
NanoDrop Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes Greiner 639 160
1.7 ml tubes, RNase-free Axygen MCT-175-C
30 °C incubator Thermo Scientific
65 °C heat block Thermo Scientific
4 °C table centrifuge Eppendorf 5417R
Sterile pipettes, 25 ml Greiner
Falcon tubes, 50 ml Greiner
Liquid nitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. (2014).
  2. Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
  3. Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
  4. Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
  5. World Health Organization WHO. http://www.who.int/en/ (2005).
  6. Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
  7. Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
  8. Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
  9. Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
  10. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
  11. Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
  12. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  13. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
  15. La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
  16. Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
  17. Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
  18. Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
  19. Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
  20. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
  21. Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
RNA Oprensning fra Intracellulært Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I makrofagceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).More

Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter