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Immunology and Infection

RNA精製は、細胞内から成長します doi: 10.3791/54044 Published: June 4, 2016

Introduction

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細胞内細菌性病原体─感染症とヒト宿主の内部細胞を増殖し、再生することができるの原因となる細菌は─世界の主要な健康問題5です。侵入し、哺乳動物細胞内で複製するには、細胞内病原体は、洗練された病原性のメカニズムと要因を取得しています。これらのメカニズムは、疾患を引き起こす能力の基本であるが、我々は彼らの規制とダイナミクスについて少し知っています。液体培地中で増殖させた細菌の遺伝子発現プロファイルは、宿主細胞内の実際の環境を反映していないので、それらの細胞内ニッチで増殖した細菌のトランスクリプトーム解析の必要性が高まっています。このような分析は、ホストによってトリガーした特定の細菌の適応の解読を可能にし、治療設計のための新しいターゲットを識別するのに役立ちます。哺乳動物のRNAがでによって細菌RNAを上回っているため、細胞内で増殖させた細菌のトランスクリプトーム解析は非常に困難です少なくとも10倍。本稿では、我々は、マウスマクロファージ細胞内で成長しているリステリア菌の細菌から細菌RNAを単離するための実験方法を説明します。抽出されたRNAは、RT-PCR、RNA-のSeq、マイクロアレイおよび他のハイブリダイゼーションに基づく技術のような転写分析の様々な技術によって、病原性細菌の細胞内の適応と毒性メカニズムを研究するために使用することができます。

リステリア菌は、ヒトのリステリア症の原因物質で、主に免疫無防備状態の個体、高齢者や妊娠中の女性6をターゲット臨床症状を伴う疾患です。それ 7を研究する宿主-病原体相互作用でモデルとして何十年も使用されてきた哺乳動物細胞の広い配列に侵入グラム陽性の通性細胞内病原体です。侵略の際に、それはトンにエスケープする必要があり、そこから液胞または(食細胞の場合)ファゴソームに最初に存在します彼は、複製するために細胞質ゾルをホストします。いくつかの病原性因子は、エスケープ処理、主に細孔形成溶血素、リステリオリシンO(LLO)および2つの追加のホスホリパーゼ8を媒介することが示されています。細胞質ゾル中の細菌は細胞内のアクチンフィラメント上で自分自身を推進すると( 図1)細胞から細胞へ拡散するためにホストアクチン重合の機械を使用しています。 L.のすべての主要な病原性因子侵入に関与モノサイトゲネス 、細胞内生存および複製、マスター病原性転写調節因子、PRFAによって活性化される。8-10。

この10年間、私たちと他の人が行ったいくつかの研究は、正常宿主細胞2,11-15内部の細胞内で増殖させた細菌のトランスクリプトーム解析のための方法を適用しています。 diffeによる細菌RNAの1)選択的濃縮および2)RNA単離:二つの主要なアプローチが基づいているホスト-RNAから細菌RNAを分離するために使用されますrential細胞溶解。最初のアプローチは、(市販のキットを用いて、例えば)は、哺乳動物RNA分子または細菌転写配列(SCOTS)11を選択的に捕獲する全RNA抽出物のサブトラクティブハイブリダイゼーションに依存しています。第二のアプローチは、細菌細胞が無傷のままで宿主細胞が溶解された細菌宿主細胞の示差溶解に依存します。バクテリア細胞は、次いで、通常、遠心分離によって、宿主細胞溶解物から分離され、そしてRNAは、標準的な技術を使用して抽出されます。このアプローチを使用して主な問題は、一緒に完全な細菌を、宿主細胞の核は、したがって、RNA調製物はまだ、哺乳類RNAを含んでも単離されていることです。この問題を克服する一つの方法は、この手順は、通常、抽出中の遺伝子発現プロファイルの変化の懸念を高める時間を要するものの、分画遠心法を用いて、宿主細胞の核から無傷の細菌を分離することです。本稿では、改善されたと迅速なBAを提示します細胞差動溶解アプローチに基づいているcteria RNA抽出プロトコル。まず、L.モノサイトゲネス感染マクロファージ細胞を冷水で溶解します。次に、マクロファージ核を短時間の遠心分離によって除去され、無傷の細菌が急速にそのRNAからの細菌の核酸のホットフェノールSDS抽出を使用して単離し、フィルター上に収集されます。

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Protocol

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注:全実験の間に、マクロファージ細胞を、5%CO 2、強制空気インキュベーター中で37℃でインキュベートされ、唯一のクラスII生物学的安全キャビネット内で実施される実験操作、インキュベーターから取り出し。 L.での作業モノサイトゲネス細菌は生物学的安全性レベル2規則に従っています。

1.細胞の調製および細菌感染(1日目および2)

  1. 1日目
    1. 30ミリリットルBMDM +ペニシリン-ストレプトマイシンメディア( 表2)145 mmディッシュ上にシード2.0×10 7骨髄由来マクロファージ細胞(BMDM)。各細菌株のシード3のプレートを分析します。 5%CO 2、強制空気インキュベーター中で37℃で一晩インキュベートします。
    2. 野生型(WT)L.の一晩の細菌培養を開始モノサイトゲネスは、標準的なインキュベーター中で30℃でのブレインハートインフュージョン(BHI)培地10mlに10403S株。場所培養管を振盪せずに斜め。注意:これらの成長条件は、効率的な感染を促進鞭毛遺伝子の発現をアップレギュレートします。
  2. 2日目
    1. 37℃でのプレ暖かいBMDMの(ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質なし)培地( 表2)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)。
    2. 抗生物質を除去するために、予め温めておいたPBS 25mlで二回マクロファージ単層を洗浄します。 30ミリリットルの新鮮なBMDM培地を追加します。
    3. 、1分間> 14,000×gで細菌を遠心分離し、上清を廃棄し、ピペッティングによりPBS 1.5 ml中に静かに細菌を再懸濁することにより、PBSで一晩細菌培養の1.5ミリリットルを洗います。二回繰り返します。
    4. 野生型L.の洗浄一晩培養物0.5mlで各マクロファージプレートに感染モノサイトゲネス 。複数のプレートを使用している場合は、15分間隔で各プレートに感染します。この時間間隔は、感染の終了時に個別に各プレートを収穫できるようになります。
      注意:感染の多重度(MOI)を連続希釈をめっきすることによってアッセイされます細菌培養物のSはBHI寒天プレート上での感染のために使用し、37℃でのプレートの24時間のインキュベーション後にコロニー形成単位(CFU)をカウントします。 WT L.の0.5ミリリットルを使用して、 モノサイトゲネスは、〜100のMOIで10403S結果(マクロファージ細胞当たり100細菌CFU)を株。細胞内増殖に欠陥細菌の変異体を分析する場合、より高いMOIを考慮すべきです。
    5. 37℃で0.5時間インキュベーションした後、付着していない細菌を除去するために、PBSで2回感染した細胞を洗浄し、30ミリリットル予め温めておいたBMDM媒体を追加します。付着した細菌は、次の0.5時間の間に内部化されます。
    6. 細胞外細菌を殺すために:(50μg/ mlの最終濃度に達するように千1)1時間後の感染では、ゲンタマイシンの30μlを添加します。
    7. 真空出口ポートを備えた液体回収フラスコにフィルタヘッドを配置することによって、フィルタ装置を組み立てます。そして、シリンダー漏斗に続くフィルタヘッド、上のフィルター(0.45μm)を配置し、金属Cと異なる部分を確保ランプ。氷のように冷たいRNaseフリー水を準備します。
    8. 次のように感染した細胞から6時間感染後、収穫菌で。各プレートは個別に扱います。
      注:通常、L.モノサイトゲネスは、マクロファージ細胞における感染の6時間の間に成長の1-ログを完了します。短い潜伏期間がかなり低い細菌負荷につながる可能性がありながら、より長いインキュベーションは、細菌異常増殖およびマクロファージの細胞死につながる可能性があります。 MOI感染の時間は、最適条件に到達するために変更することができます。
      1. PBSで1回に感染した細胞を洗浄。マクロファージ細胞を溶解させ、氷冷のRNaseフリー水20ミリリットルを追加します。セルスクレーパーを使用して、迅速しかし慎重にプレートから細胞をこすり取ります。
      2. 50ミリリットルコニカルチューブに溶解した細胞を収集します。 30秒間ボルテックス。 4℃で3分間、800×gで遠心分離します。
      3. 真空システムを使用してフィルタ装置を介して上清を渡します。ピンセットを使用して15mlのCONIに転送迅速フィルタロールとCALチューブ。液体窒素中でフィルタを使用してチューブをスナップ凍結。
      4. 1.2.7で説明したように、次のサンプルのための新しいフィルターでろ過装置を組み立てます。
      5. 次の日のために-80℃で凍結したフィルタを格納します。あるいは、核酸抽出に直接進みます。

2.核酸抽出(3日目)

注:ドラフト内でフェノール及びクロロホルムソリューションですべての操作を実行します。

  1. 酸性フェノールの1ミックス:クロロホルム、各サンプルの400μlの1を準備します。別々のチューブに混合し、その後吸引により得られた水層を撤回。 10%SDSを40μlのを追加します。
  2. 冷たいそれらを保つために氷の上にフィルタ収容管を解凍します。各フィルタを含むチューブに酢酸EDTA(AE)のバッファ( 表2)の650μlを添加します。
  3. 可能な限り迅速に次の手順を実行します。
    1. 積極的にそのようにフィルタを含むチューブをボルテックスフィルタは、管の周囲に案内いたしますと、バッファは完全にフィルターを洗うこと。常に氷上に戻ってそれを置くことによって、チューブの寒さを保ちます。注:反転しながら、さらに、完全にオフフィルタ細菌を洗浄するために、チューブをボルテックスする必要があるかもしれません。
    2. すべてのチューブのために繰り返します。スピンダウンするまもなく懸濁液(120×gで1分間)プロセスの終了時に有用であり得ます。
  4. SDSおよびフェノール/クロロホルムミックス(2.1で調製した)含む1.5 mlマイクロチューブに細菌含有緩衝液を移します。すべてのチューブのために繰り返します。フィルターから残った液を得るために再びチューブを含むフィルター(120×gで1分間)をスピンする必要があるかもしれません。
  5. マルチチューブボルテックスデバイス内のすべての1.5ミリリットルチューブを置き、10分間フルスピードでボルテックス。
  6. 10分間65℃のヒートブロック中で管をインキュベートします。 5分間最大速度で遠心分離(> 14,000 XG)。
  7. 各トンから水層(約400μl)を転送3 M酢酸ナトリウム(pH 5.2)1.0 mlで100%エタノールの40μLを含む新しい1.5mlチューブにUBE。徹底的に各チューブをボルテックス。
    注:グリコーゲンを沈殿ペレットの可視化を向上させるために、この段階で添加することができます。
  8. 1時間-80℃でサンプルをインキュベートします。また、Cで一晩-20℃でサンプルをインキュベートします。そして、最大速度(> 14,000 XG)で20分間4℃でサンプルを遠心します。
  9. 慎重に各チューブからのエタノール(上層)を吸引します。徹底的に各サンプルと渦に500μlの冷70%エタノールを追加します。最高速度(> 1 4000 XG)で20分間4℃で遠心分離します。
  10. 慎重に各チューブからエタノールを吸引します。加熱なしで真空蒸着装置を用いて約2分間のサンプルを乾燥させます。サンプルを過乾燥させないでください。
  11. 各サンプルに25μlのRNaseフリー水を追加します。 20分間室温でインキュベートします。慎重にボルテックスとスピンダウン。
  12. T中のRNA濃度を測定微量紫外可視分光光度計を使用して彼のサンプル。 1μgのプレート当たりの核酸 - 約0.5を抽出することを期待しています。
    注:技術的反復は、この段階で組み合わせることができます。

3. DNアーゼ治療

  1. マイクロチューブ内の表1に従って反応を設定します。 45分間37℃でインキュベートします。最大速度で2分間遠心分離することにより、450μlのRNaseフリー水とフェノール-クロロホルム- IAAミックス( 表2)500μlの、別々の相を追加します(> 14,000 XG)。
  2. 新しいチューブに水層を移し、500μlのクロロホルム- IAAミックス( 表2)を追加 、最大速度で2分間の遠心分離によって渦と別々の相(> 14,000 XG)。
  3. 新しいチューブに水層を移し、エタノール1mlの3 M酢酸ナトリウム(pH5.2)の50μLを加えます。渦。
    注:グリコーゲンを沈殿ペレットの可視化を向上させるために、この段階で添加することができます。
  4. 慎重に各チューブからエタノールを吸引します。徹底的に各サンプルと渦に500μlの冷70%エタノールを追加します。最高速度で20分間4℃で遠心分離します。慎重に各チューブからエタノールを吸引します。
  5. 加熱なしで真空蒸着装置を用いて約2分間のサンプルを乾燥させます。サンプルを過乾燥させないでください。
  6. 室温、ボルテックス、およびスピンダウンで2分間インキュベートし、RNaseフリー水12μlのを追加します。サンプルは、精製されたRNAが含まれている氷の上に保管してください。あるいは、0.1mMのEDTAまたはTE緩衝液(10mMのTris、1mMのEDTA)を用いてRNaseを含まないH 2 O中のRNAを溶かします。
  7. 微量紫外可視分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。 (技術的反復を併用した場合)、サンプルあたりのRNAの〜100 ngのを期待しています。
    注:このプロトコルに従って抽出したRNAは、foのに適しています多数の技術によりR遺伝子の転写解析。我々は通常、Lを研究するためにRT-qPCR分析を採用しますマクロファージ細胞1-4の感染の間に遺伝子転写をモノサイトゲネス

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Representative Results

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モデルシステムは、 図1に示され、L.に感染したマクロファージ細胞を含みますマクロファージ細胞質ゾル中で複製モノサイトゲネス菌 、。 図2は実験スキームを表す。 図3は、WT L.中の病原性遺伝子のようなRT-qPCR分析の典型的な結果を表します豊富な実験室培地BHIの成長と比較して、マクロファージの成長をモノサイトゲネス 。結果は、L 2つの主要な病原性因子の転写レベルを示しますモノサイトゲネス;たhly LLO毒素をコードし、actAのは、ロバストマクロファージの感染時に誘導されるアクチンアセンブリのタンパク質をコードします。

図1
1:L.の一般的な概要 私のようなライフスタイルを モノサイトゲネスntracellular病原体。L.モノサイトゲネスは、食細胞が細菌を貪食のに対し、非食細胞への積極的な内在化を誘導するインターナと呼ばれる特殊なタンパク質を発現させることにより、宿主細胞に侵入します。侵攻の際、L.モノサイトゲネスは、最初 、それが急速に主にリステリオリシンO毒素(LLO)を使用して逃げるからエンドソーム/ファゴソーム胞内に見出されます。 L.サイトゾル宿主細胞内モノサイトゲネスは急速に複製し、そのActAタンパク質を介してアクチンベースの運動性を使用して、細胞から細胞へ広がります。すべての上記の病原性因子は、マスター病原性アクチベーター、PRFAによって規制されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:経験を表現するフローダイアグラムerimental手順。主な手順は、感染細胞の溶解、宿主細胞の核および細菌細胞の分離およびRNA単離が含まれます。重要なステップが示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
3:L. 中の病原性遺伝子の転写解析 L.中のモノサイトゲネス 細胞内増殖。 たhly遺伝子 (LLOをコードする)の転写解析およびactA遺伝子の6時間後のマクロファージ細胞におけるモノサイトゲネス 10403S細胞内増殖は、RT-qPCR分析を使用して、BHI培地中で指数増殖中にそれらのレベルと比較して感染を投稿してください。転写レベルは、相対、相対量(RQ)として表現さ​​れますBHI中で成長中の転写レベルへ。転写レベルは、参照遺伝子として、16S rRNAのレベルに正規化しました。データは3の独立した生物学的反復を表す(N = 3)です。エラーバーは95%信頼区間を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

RNA (44μLの最大容量で)2μgのまで
10倍のDNaseバッファー 5μlの
RNaseフリー水 50μlの総容量に対する完全な
DNアーゼ 1μlの(1単位)

表1:DNアーゼ反応プロトコール。

1. 500mLのBMDM +ペニシリン - ストレプトマイシンメディア(フィルター滅菌):
DMEM 235ミリリットル
FBS(54℃で不活性化30分) 100ミリリットル
M-CSF(L-929馴化培地)19 150ミリリットル
グルタミン 5ミリリットル
ピルビン酸ナトリウム 5ミリリットル
βメルカプトエタノール 0.5ミリリットル
ペニシリン/ストレプトマイシン 5ミリリットル
合計 500ミリリットル
2. 500ミリリットルBMDM(フィルター滅菌):
DMEM 235ミリリットル
FBS(54℃で不活性化30分) 100ミリリットル
M-CSF(L-929馴化培地)19 150ミリリットル
グルタミン 5ミリリットル
ピルビン酸ナトリウム 5ミリリットル
βメルカプトエタノール 0.5ミリリットル
合計 500ミリリットル
3. AEバッファ
NaOAc pHは5.2 50 mMの
EDTA 10 mMの
RNaseフリー水
4.フェノール-クロロホルム- IAA
フェノール 25ミリリットル
クロロホルム 24ミリリットル
イソアミルアルコール 1ミリリットル
5.クロロホルム- IAA
クロロホルム 24ミリリットル
イソアミルアルコール 1ミリリットル

表2:メディアとバッファのレシピ。

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Discussion

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ここで説明するプロトコルは、Lからの細菌RNAの単離のために最適化された方法を表しマクロファージ細胞において細胞内で増殖する細菌をモノサイトゲネス 。このプロトコルは、細胞微分溶解に基づいており、細菌RNAの濃縮のための2つの主要なステップ含んでいる:遠心分離を用いてマクロファージ核沈殿、濾過による細菌の迅速な収集を。これらのステップは、標準のRNA抽出手順が続きます。このプロトコルは、リステリアRNAの精製を記載しているが、それは容易に他の細菌性病原体に改変することができます。この方法は、転写解析のためにRNAの精製に焦点を当てているが、そのホストからの細胞内増殖する細菌を分離するために使用される原理は、例えば、DNA、タンパク質、細胞壁などの他の細菌成分の精製にも適用することができる、 などのようなゲノムおよび生化学的分析は、細胞内病原体の理解と特徴付けを提供するであろうライフサイクル感染の過程。

全細菌RNAの〜100 ngのプロシージャの結果。 RNAの収率は比較的低いが、それらは、RT-qPCRを、RNA-のSeqと現代のハイブリダイゼーションに基づく技術などの複数の技術を用いて遺伝子転写の下流の分析に適しています。 RNAの収量を向上させるために、可能なのRNase汚染を避けるために、新鮮な細菌接種だけでなく、新鮮なフェノール溶液ヌクレアーゼフリー水および緩衝液を使用することをお勧めします。収穫した細菌や単離されたRNAは、常に抽出プロセスの間、氷上に保持する必要があります。感染時間は、生物学的問題に応じて調整し、生物を研究することができます。 RNAの量を増加させるために、実験は、各サンプル当たりの感染プレートを含むようにスケールアップすることができます。

このような実験を行う主な関心事は、採取工程の間に細菌の転写プロファイルを変更する危険性です。ほとんどのbacterIAコールドショックストレス応答を活性化することにより、低温に応答し、従って細菌の収穫は、可能な限り迅速に行われるべきです。試薬や機器は、事前に準備する必要があり、各試料を別々に扱われるべきです。最も重要なステップは、直ちに液体窒素中でフィルタを含む細菌を凍結することです。そうしないと、飛躍的に単離されたRNAの品質を低下させることができます。このプロトコールにおける別の重要なステップは、核酸の比較的少量のエタノール沈殿です。特別な注意は目に見えない核酸ペレットを破壊しないように注意すべきです。グリコーゲンは、これらのステップの間にペレットの可視化を向上させるために、沈殿溶液に添加することができます。

いくつかのその後の用途のために、 例えば、RT-qPCRのは、DNAを除去することが重要です。 DNアーゼトン以下の核酸の合計量の5倍 - 私たちは日常的に、3の還元をDNase処理の効率を監視しませんがreatmentは、効率的なDNアーゼ処理を示します。注目すべきは、RNAサンプルからDNAを除去するための任意の市販の技術またはキットが好適です。さらに、そのような実行のない逆転写と試料と精度管理試料を用いて、このような用途で有益です。

ここで説明されたプロトコルの主な制限は、全RNA約100 ngの抽出されたRNAの比較的少量です。したがって、この技術は、RNAのマイクログラムを必要とするようなノーザンブロット分析のような古典的なハイブリダイゼーション技術、適していません

RNAシーケンシング(ディープRNA-seqの)における最近の技術進歩は、「デュアルRNA-seqの「16-18という名前のメソッドを、そのRNAを分離する必要なしに、一緒に細菌性病原体と哺乳動物宿主転写プロファイルの両方の分析を可能にします。デュアルRNA-seqの分析は、宿主 - 病原体相互作用を研究する上で理想的ではあるが、それは非常にexpensivですeと、頻繁に使用することはできません。感染細胞における細菌のRNA含有量が特に低いため、十分な細菌も最新シークエンシング・プラットフォームによって提供される高リード深さ、効果的な遺伝子発現解析のために読み出し取得することは極めて困難で高価です。このアプローチの追加の欠点は、遺伝子発現の偏った結果につながる可能性がRNAまたはcDNA増幅工程、の頻繁な使用です。ここで紹介する方法は、得られた情報と費用対効果の間の妥協を提供しています。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Listeria monocytogenes 10403S 20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice 21
H2O, RNAse free Thermo Scientific 10977-015 DEPC-treated water can be used
DMEM Gibco 41965039
Glutamine Gibco 25030081
Sodium pyruvate Gibco 11360-088
β-Mercaptoethanol Gibco 31350010
Pen/Strep Gibco 15140-122
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397
FBS Gibco 10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS Sigma-Aldrich D8537
Brain heart infusion (BHI) Merckmillipore 1104930500
Phenol saturated pH 4.3 Fisher BP1751I-400
Chloroform Fisher BP1145-1
Iso-amyl alcohol Sigma-Aldrich W205702
Sodium acetate Sigma-Aldrich W302406
EDTA Sigma-Aldrich EDS
DNaseI Fermentas EN0521
SDS 10% Sigma-Aldrich L4522
Ethanol absolute Merck Millipore 1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubator Thermo Scientific Model 3111
Cell scrapers Nunc 179693
Kontes glass holder for 45 mm filters Fisher K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm Merck Millipore HAWP04700
SpeedVac system Thermo Scientific SPD131DDA
Vortex-Genie 2 Scientific Industries Model G560E
NanoDrop Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes Greiner 639 160
1.7 ml tubes, RNase-free Axygen MCT-175-C
30 °C incubator Thermo Scientific
65 °C heat block Thermo Scientific
4 °C table centrifuge Eppendorf 5417R
Sterile pipettes, 25 ml Greiner
Falcon tubes, 50 ml Greiner
Liquid nitrogen

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References

  1. Lobel, L., et al. The metabolic regulator CodY links Listeria monocytogenes metabolism to virulence by directly activating the virulence regulatory gene prfA. Mol Microbiol. (2014).
  2. Lobel, L., Sigal, N., Borovok, I., Ruppin, E., Herskovits, A. A. Integrative genomic analysis identifies isoleucine and CodY as regulators of Listeria monocytogenes virulence. PLoS Genet. 8 , e1002887 (2012).
  3. Kaplan Zeevi, M., et al. Listeria monocytogenes multidrug resistance transporters and cyclic di-AMP, which contribute to type I interferon induction, play a role in cell wall stress. J Bacteriol. 195, 5250-5261 (2013).
  4. Rabinovich, L., Sigal, N., Borovok, I., Nir-Paz, R., Herskovits, A. A. Prophage excision activates Listeria competence genes that promote phagosomal escape and virulence. Cell. 150, 792-802 (2012).
  5. World Health Organization WHO. http://www.who.int/en/ (2005).
  6. Swaminathan, B., Gerner-Smidt, P. The epidemiology of human listeriosis. Microbes Infect. 9, 1236-1243 (2007).
  7. Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
  8. Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Molecular determinants of listeria monocytogenes virulence. Ann Rev Microbiol. 58, 587-610 (2004).
  9. Portnoy, D. A., Auerbuch, V., Glomski, I. J. The cell biology of Listeria monocytogenes infection: the intersection of bacterial pathogenesis and cell-mediated immunity. J Cell Biol. 158, 409-414 (2002).
  10. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 7, 623-628 (2009).
  11. Graham, J. E., Clark-Curtiss, J. E. Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 11554-11559 (1999).
  12. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  13. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J Exp Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Albrecht, M., Sharma, C. M., Reinhardt, R., Vogel, J., Rudel, T. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 868-877 (2010).
  15. La, M. V., Raoult, D., Renesto, P. Regulation of whole bacterial pathogen transcription within infected hosts. FEMS Microbiol Rev. 32, 440-460 (2008).
  16. Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10, 618-630 (2012).
  17. Rienksma, R. A., et al. Comprehensive insights into transcriptional adaptation of intracellular mycobacteria by microbe-enriched dual RNA sequencing. BMC Genomics. 16, 34 (2015).
  18. Afonso-Grunz, F., et al. Dual 3'Seq using deepSuperSAGE uncovers transcriptomes of interacting Salmonella enterica Typhimurium and human host cells. BMC Genomics. 16, 323 (2015).
  19. Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. J Immunol Methods. 184, 281-283 (1995).
  20. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5, e00969-e900914 (2014).
  21. Celada, A., Gray, P. W., Rinderknecht, E., Schreiber, R. D. Evidence for a gamma-interferon receptor that regulates macrophage tumoricidal activity. J Exp Med. 160, 55-74 (1984).
RNA精製は、細胞内から成長します<em&gt;リステリア菌</em&gt;マクロファージ細胞で
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Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).More

Sigal, N., Pasechnek, A., Herskovits, A. A. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (112), e54044, doi:10.3791/54044 (2016).

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