Abstract
O poder da genética de Drosophila está cada vez mais a ser aplicada a questões de sinalização hormonal e metabolismo e para o desenvolvimento de modelos de doenças humanas neste organismo. métodos sensíveis para medições de parâmetros, tais como taxas metabólicas são necessários para impulsionar o entendimento da fisiologia e doenças em animais de pequeno porte, como a mosca da fruta. O método descrito aqui avalia oxidação do combustível, em pequenas quantidades de moscas adultas alimentadas com alimentos contendo quantidades vestigiais de 14 substratos marcados com C, tais como glucose ou ácido gordo. Após o período de alimentação e quaisquer manipulações experimentais adicionais, moscas são transferidos para tubos curtos tapados com malha, que são então colocados em frascos de vidro contendo papel de filtro de KOH-saturado que as armadilhas exalados, CO radiomarcado 2 gerado a partir da oxidação de substratos marcados radioactivamente como bicarbonato de potássio, KHCO3. Este bicarbonato radiomarcado é medida por contagem de cintilação. Este é aqabordagem quantitativa, reprodutível e simples para o estudo da oxidação do combustível. O uso de radiomarcado glicose, ácidos graxos ou aminoácidos permite a determinação da contribuição destas diferentes fontes de combustível para o metabolismo energético em condições diferentes, tais como alimentação e jejum e em diferentes origens genéticas. Isso complementa outras abordagens utilizadas para medir no metabolismo energético vivo e deve favorecer a compreensão da regulação metabólica.
Introduction
Trabalho no organismo modelo Drosophila melanogaster tem contribuído grandemente para a compreensão dos princípios genéticos, processos de desenvolvimento, crescimento, envelhecimento, comportamento, imunidade e doença humana 1,2. Uma miríade de abordagens biológicas genéticas e celulares em Drosophila tem impulsionado o progresso nestas áreas. No entanto, o estudo do metabolismo na mosca da fruta desenvolveu mais lentamente, devido em grande parte à dificuldade de medição de parâmetros metabólicos em um animal tão pequeno. O interesse em usar Drosophila como modelo para o estudo de doenças humanas, tais como diabetes e para a compreensão das contribuições do metabolismo ao crescimento e várias patologias tem empurrado o campo para desenvolver e adaptar técnicas metabólicas para este organismo 3,4.
métodos fiáveis estão agora disponíveis para a medição de um número de parâmetros metabólicos na mosca da fruta. Por exemplo, é muito simples para avaliar a ingestão de alimentos
A medição do total de produção de CO 2, especialmente quando combinada com medição do consumo de O 2, fornece informações valiosas sobre o metabolismo energético de todo o corpo. No entanto, esta medida não identifica o nutriente sendo oxidado para adenosina trifosfato de produção (ATP). Três classes principais de nutrientes pode entrar no ciclo do ácido cítrico após a conversão para acetil-CoA: hidratos de carbono, ácidos gordos e proteínas. Glicose-6-fosfato, derivado de glucose da dieta ou de glicogénio armazenado, pode ser convertida em piruvato que é descarboxilado pela desidrogenase piruvato para formar acetil-CoA. Composição de ácidos graxos derivados da dieta ou de triglicérides armazenados pelo rendimentos ß-oxidação acetil-CoA, que então entra no ciclo do ácido cítrico. Finalmente, A maioria dos aminoácidos pode entrar no ciclo do ácido cítrico após a conversão de piruvato, acetil-CoA ou ácido cítrico intermediários do ciclo, tais como alfa-cetoglutarato.
contribuição específica em nutrientes para o metabolismo de energia durante condições basais e estimuladas pode ser monitorizada através da utilização de marcadores radioactivos. O protocolo aqui apresentado é adaptado para uso em Drosophila a partir de um protocolo utilizado para avaliar a oxidação em células cultivadas em cultura 12,13. Nesta abordagem, as moscas da fruta são alimentados 14 substratos C-radiomarcado metabólicas (hidratos de carbono, ácidos gordos ou aminoácidos) na dieta de uma curta (horas) ou longos (dias) de pulso, perseguida em alimentos não marcada, e, em seguida, expostas a uma câmara contendo hidróxido de potássio (KOH) de papel de filtro saturados para capturar CO 2 exalado como bicarbonato. bicarbonato radiomarcado pode ser quantificada por contagem de cintilação. Diferenças na radiomarcado-produção de CO 2 entre experimentogrupos ao de moscas pode refletir uso de combustíveis diferentes para a produção de ATP ao longo de uma prolongada diferenças rápidos ou intrínsecas no metabolismo de combustível entre os genótipos, por exemplo.
Protocol
1. Preparação de Fly alimentares que contenham radiomarcadas metabólicas Substratos
- Num tubo de microcentrifuga, misturar 1-2 uCi substrato marcado radioactivamente (D- [6- 14 C] -glucose, D- [1- 14 C] -glucose ou [1- 14 C] ácido -palmitic, 40-60 mCi / mmol) com 15 ul de FD & amp; C No. 1 de corante alimentar azul e H 2 O para igualar um volume total de 25 ul.
CUIDADO: O carbono-14 é um emissor beta de baixa energia e tem um curto alcance no ar. No entanto, tome cuidado para evitar derramamento de moléculas radiomarcadas ou ingestão acidental pelo experimentador. Fly frascos de alimentos tombar facilmente; certifique-se de abrigá-los em um recipiente que vai impedi-los de inflexão, especialmente quando radiomarcador está em forma líquida (passo 1.2) ou em alimentos não solidificada (passo 1.4). Moscas que estão sendo alimentados ou foram alimentados substratos radiomarcados vai começar a exalar pequenas quantidades de CO 2 radiomarcado. Estas moscas devem ser mantidos em caixas de acrílico em exaustores, e um pequeno prato de KOH can ser definida na caixa para o uso como um purificador de CO 2. - Pipetar todo o substrato marcado radioactivamente e azul mistura corante para o fundo de um frasco vazio alimentar da mosca (altura: 9,4 cm, largura: 2,2 cm).
- padrão de calor voar comida em um forno de microondas até que o alimento é apenas liquefeito (15-20 seg a nível de alta potência para um frasco contendo 10 ml de alimento).
- Adicionar alimentos 975 ul fundido ao substrato radiomarcado / azul mix corante e rapidamente redemoinho, monitorando a uniformidade da cor azul para assegurar a mistura completa.
- Permitir que o alimento para arrefecer e solidificar completamente à temperatura ambiente durante 20 - 30 min.
2. Alimentação Substratos Radiolabeled metabólicas ao moscas adultas fruta
- Anestesiar moscas adultas utilizando um aparelho de anestesia de CO 2 que consiste de polietileno poroso fundido com uma base acrílica e ligado a um tanque de CO 2 com um regulador de pressão. Fluxo de CO 2 para dentro do aparelho de anestesia em 5 L / min.
- transferência Anesthetized voa para frascos contendo radiomarcados, alimento azul-tingidas (n = 15 - 30 moscas por frasco). frascos de tampão com uma rolha de espuma, e descansar horizontalmente até moscas acordar. frascos de transferência para um recipiente de acrílico com tampa (180 cm x 180 cm x 240 cm de altura).
- Para a alimentação de curto prazo, fome moscas para 18 - 24 horas antes de transferir as moscas ao alimento radiomarcado para um 2 -. Passo de alimentação 3 horas T ele passo fome é importante porque moscas Fed não vai comer de forma confiável uma nova fonte de alimentos que lhes são apresentados . Para uma alimentação de longo termo ao longo de 5 - 7 dias, as moscas não necessitam de ser fome, mas o experimentador deve controlar o teor de água do alimento radiomarcado nos frascos moscas estão alojados dentro e usar uma agulha e seringa para adicionar água para frascos com alimentos secos.
- Transferência voa para alimentos não marcado por "tapping"-los em um novo frasco. Um período de corrida inicial de 2-4 horas permite moscas para limpar as partículas de alimento radiomarcado do seu cutículas e permite a digestão de radiomarcadorEd alimento remanescente no intestino. Monitorar o progresso do alimento através do intestino por inspeção visual de moscas para procurar abdomens azuis.
- Posteriormente, a transferência voa para diferentes tipos de alimentos (12 - 24 horas em alimentos padrão ou 1% agar para a medição dos efeitos das alimentado contra o jejum na respiração) ou temperatura ambiente (12 - 96 horas a 18 C ou 30 ° C para a genética manipulações usando GAL80 sensível à temperatura (ts GAL80), por exemplo).
Nota: A duração deste período irá variar de perseguição com a experiência sendo realizada. Por exemplo, pode ser necessária uma perseguição de 96 horas a 30 ° C em experimentos usando GAL80 ts, a fim de ativar totalmente a expressão do transgene GAL4-dependente.
3. Preparação do Dispositivo de CO 2 -Coleção
- Montar materiais para a construção de "voar" pods, tubos com tampa de malha que irão conter moscas marcadas com ácido C-palmítico 14 C-glicose ou 14 e that permanecerá aberta para a atmosfera. Cortar a parte superior 50 mm de 12 mm x 75 mm tubos de polipropileno, deixando 25, tubos de fundo redondo mm de comprimento. Preparar 35 mm x 35 mm quadrados de malha de nylon de 130 um. Além disso, obter a fita transparente em um dispensador de fita.
- Montar materiais para os aparelhos -collection CO 2. Para cada mosca vagem, montar um frasco de 20 ml de vidro de cintilação, uma tampa superior de borracha com um orifício para fora do centro, um centro de poço a ser inserido através do orifício no topo rolha, GF grau / B papel de filtro de microfibra de vidro (2,1 cm de diâmetro círculo, uma poro). Papel de filtro GF / B é utilizado devido à sua elevada resistência mecânica em húmido e capacidade de carga elevada.
- Prepare a 5% de KOH fresco no dia da utilização. Apenas antes do passo 3.4, dobrar e colocar o papel de filtro GF / B circular no poço central que é enfiada através do orifício do topo rolha de borracha e saturar com 100 ul de 5% de KOH. Consulte a Figura 1.
- A seguir à incubação (s) em suportes não marcado, umanesthetize voa com CO 2. Escova voa para dentro do tubo de corte de polipropileno, tampa com malha de nylon, e use fita adesiva transparente para aderir malha para tubo. Trabalhar rapidamente para evitar moscas acordar e escapar antes que a malha foi solidamente fixados ao tubo. Um número igual de moscas deve ser utilizado em cada vagem mosca para uma experiência particular; 10 - 20 moscas por vagem mosca produzir suficiente radiomarcado-CO 2 para a medida por contagem de cintilação (passo 4.1 abaixo).
- Transferir o pod mosca a um frasco de 20 ml de cintilação de vidro. Tapar o frasco de vidro com a tampa de borracha superior segurando um centro de bem contendo papel de filtro GF / B KOH-saturada. Dobrar a largura superior da rolha de borracha superior sobre o bordo do frasco de vidro de cintilação. Consulte a Figura 1.
- frascos de vidro conjunto contendo moscas de pálpebras, recipiente de acrílico, e incubar durante vários períodos de tempo (2 a 12 h funciona bem).
4. Análise dos Resultados
- emno final da incubação, os frascos de vidro uncap, e de transferência de papel de filtro GF / B saturado de KOH para um frasco de cintilação de 6 ml contendo plástico de 4 ml de cocktail de cintilação.
- Se necessário, congelar moscas em vagens voar em gelo seco e armazenar a -80 ° C para posterior determinação de substratos armazenados. Note-se que estas amostras são radioactivos e deve ser armazenado em conformidade.
- Prepare frascos de cintilação adicionais: um contendo papel de filtro / B GF não utilizado para servir como pano de fundo e um ou dois outros contendo 0,1-0,5 uCi substrato radiomarcado para determinar cpm / uCi.
- Medir cpm para cada amostra utilizando um contador de cintilação de acordo com o protocolo do fabricante.
- Calcule pmol 14 CO 2 / cpm e pmol 14 CO 2 por mosca por hora. Subtrair a cpm de fundo a partir do valor de cpm para cada amostra. A partir dos dados de substratos radiomarcados puro, calcular o cpm / Ci de amostra com correção de fundo contados.
- Use oactividade específica e concentração radioquímica do substrato marcado radioactivamente (por exemplo, 50 uCi / umol e 0,1 jiCi / mL, respectivamente) para calcular pmol / cpm fornecido pelo fabricante. Utilize este fator para converter dados mosca pod corrigido-fundo de cpm 14 CO 2 / amostra para pmol 14 CO 2 / amostra. Em seguida, dividir pelo número de moscas e o número de horas no pod mosca.
Representative Results
A quantidade de exalado e preso CO 2 marcado radioactivamente que é produzido a partir do metabolismo de um substrato radioactivo deve correlacionar-se com o número de moscas no pod de mosca, bem como a quantidade de tempo que os animais passam no aparelho de recolha de CO 2. Para testar isto, as moscas que foram mantidos em jejum durante 18 horas foram alimentados com ácido palmítico marcado radioactivamente (0,02 uCi / ul comida) durante 2 horas e, em seguida, testados para a produção de CO 2 marcado radioactivamente em grupos de 12 ou 25 animais por 3 ou 6 incubações de RH. A quantidade de CO 2 produzido por 25 moscas foi quase o dobro da quantidade produzida por 12 moscas, ea quantidade para cada grupo dobrou quando o tempo de incubação foi aumentada de 3 horas a 6 horas (Figura 2A). O pmol 14 CO 2 / mosca / hr era quase equivalente em cada grupo.
O jejum estimula a decomposição de ácidos graxos por SS oxidation; Por conseguinte, a produção de CO2 a partir da oxidação de ácido gordo devem estar elevados em animais em jejum em comparação com os animais alimentados. Para determinar se este foi o caso, de 18 h de jejum moscas foram alimentados com ácido palmítico marcado radioactivamente, durante 2 h. Seguindo este pulso curto alimentação, moscas foram divididos em dois grupos e transferido para alimentos mosca não marcado ou agar a 1% durante 3 horas e, em seguida, transferidos para fazer vagens durante 2 h. Em duas experiências separadas, moscas perseguido em agar produziram significativamente mais CO 2 radiomarcado com moscas em comparação perseguido no alimento (Figura 2B), indicando que a oxidação SS foi aumentado nos animais em jejum.
Figura 1. O aparelho para a recolha exalado, Radiolabeled CO 2.
As moscas que foram consumidos substratos metabólicos são radiomarcadoscolocado numa "cápsula fly" (PF), um tubo de centrífuga tapado com corte de malha (M). O pod mosca é colocada num frasco de 20 ml de cintilação de vidro e tapou com uma rolha de borracha superior (S), que contém um orifício para fora do centro, através da qual é colocada uma cavidade central (CW), que contém papel de filtro GF / B saturado com 100 ul 5% de KOH. Exalado CO2 reage com o KOH e é preso no papel de filtro como bicarbonato. Sem saída, CO radiomarcado 2 pode ser quantificada por contagem de cintilação do papel de filtro saturado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. 14 CO 2 Correlações de Produção com o tempo e o número de moscas em umFly Pod e responde ao Fed e condições de jejum.
(A) A quantidade de 14 CO 2 produzido em moscas alimentadas palmitato radiomarcado correlaciona-se com o número de moscas testados (n = 12 (barras abertas) ou 25 (barras a cheio)) e o tempo gasto no pod de mosca (3 ou 6 h ). Em uma base per-fly, moscas produziu 0,99, 1,13, 1,10 e 1,01 pmol 14 CO 2 / hr (dados listados na mesma esquerda para a direita, como dados do gráfico).
(B) As moscas que foram perseguidos em agar oxidado mais radiomarcado palmitato de moscas que foram perseguidos em alimentos. Os dados são de duas experiências e são apresentadas como média desvio padrão, n = 16 - 17 moscas / grupo (experimento 1); n = 10 moscas / grupo (experimento 2). * P = 0,017, teste t de Student. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este protocolo descreve um método para medir a oxidação de substratos radiomarcados específicos em adulto de Drosophila melanogaster. Esta técnica é simples, quantitativo e reprodutível e sensível, e complementa os métodos existentes que medem de produção total de CO 2 e consumo de O 2, porque pode ser utilizado para identificar o nutriente (s) a ser oxidado para a produção de ATP.
Medição de CO 2 libertado a partir da oxidação de substratos radiomarcados específicos usando o método aqui descrito é complementar a técnicas que medem de produção total de CO 2. Total de produção de CO 2 (V CO2) permite estimar a taxa metabólica e, quando o consumo total de O2 (VO2) é conhecido, a taxa metabólica pode ser calculada e a fonte de combustível para a oxidação pode ser estimado com base na taxa de troca respiratória (V CO2 / O2 = V RER). Quandohidratos de carbono são o substrato exclusiva, RER = 1, mas quando os ácidos gordos são a fonte exclusiva, RER = 0,7, devido à estequiometria das reacções de glucose e oxidação de lípidos. Na ausência de equipamento para medir o consumo de oxigénio em Drosophila 14, a fonte de combustível não oxidativo pode ser identificado. No entanto, por meio de etiquetagem voa com quantidades vestigiais de um substracto radioactivo ou outro, e as taxas de medição de radiomarcado produção de CO 2, pode-se tirar conclusões sobre a capacidade de moscas para oxidar um determinado substrato em pontos de tempo diferentes durante um estímulo ou sobre os efeitos de uma dada mutação na oxidação do combustível.
Há uma série de passos críticos neste protocolo. Em primeiro lugar, deve ser tomado cuidado ao usar materiais radioativos para evitar vazamentos e contaminação de áreas de investigação. Segundo, quando anestesiar moscas durante os passos 2.1 e 3.4, o experimentador deve trabalhar rapidamente para evitar os efeitos de CO 2 prolongadoexposição sobre o metabolismo e o comportamento. Um grupo de 20 moscas podem ser anestesiados e transferidos para um novo frasco ou numa cápsula mosca em 20 segundos ou menos. Quando transferidos de um aparelho de anestesia para um tubo de alimentação, o frasco deve ficar em repouso no seu lado para evitar moscas anestesiadas de ficar presa sobre a superfície do alimento. Quando as moscas são alimentados com alimento radiomarcado ao longo de vários dias, como no passo 2.2, o experimentador que deve segurar a comida não seque como moscas são sensíveis à desidratação.
O alimentados ou em jejum antes da marcação, a escolha da etiqueta, o período de tempo de marcação, o comprimento de tempo no pod de mosca, e o método de anestesia são parâmetros que podem ser sujeitos a resolução de problemas e modificação quando se utiliza esta técnica. Em primeiro lugar, moscas submetido a períodos curtos de rotulagem (2-3 hr) é improvável que consomem quantidades significativas de alimento radiomarcado, a menos que submetidas a um período de jejum de antemão. Em segundo lugar, a escolha do marcador Cum efeito as conclusões um é capaz de desenhar sobre fenótipos metabólicos. Por exemplo, a produção de CO2 radiomarcado de D- [1- 14 C] -glucose pode reflectir a oxidação através do ciclo do ácido cítrico ou o shunt das pentoses fosfato, ao passo que a produção de CO2 radiomarcado de D- [6- 14 C] -glucose reflecte oxidação através do ciclo do ácido cítrico única 12,15,16. Alimentando moscas com um marcador marcado radioactivamente para um aminoácido essencial, 17,18 seria uma boa estratégia para avaliar a oxidação de aminoácidos derivados de proteínas. Finalmente, períodos longos de rotulagem com glucose radiomarcada também aumentar a possibilidade de incorporação deste precursor para outras classes de moléculas, tais como triglicéridos e 19 aminoácidos tais como alanina, que prontamente interconverts com piruvato. Isto pode ser avaliado por medição da radioactividade incorporada nestes diferentes classes de moléculas 6. Rad Com efeito, grupos separados de moscas pode ser alimentadoiolabeled substratos da mesma maneira e, em seguida, utilizados em experiências mosca vagem ou medição do marcador radioactivo que é armazenada e permanece em glicogénio e os triglicéridos em jejum e alimentados condições de 6, por exemplo. Outra estratégia é a utilização de períodos de curta de rotulagem que são susceptíveis de oxidação de revelar os nutrientes dietéticos radiomarcados si e não as formas de armazenamento desses nutrientes. Em terceiro lugar, é também possível que dois grupos de moscas pode ter as taxas idênticas de 14 CO 2 de produção ao longo de um determinado período de tempo, mas as taxas muito diferentes inicialmente. Por conseguinte, variando a quantidade de tempo que opera passar no pod de mosca pode ser um importante parâmetro a alterar quando se avalia variação fenotípica. Finalmente, este protocolo exige o uso de um curto período de CO 2 a anestesia ao colocar as moscas para o aparelho de mosca vagem. É possível que o CO 2 anestesia pode afectar a função metabólica sobre o decurso da experiência mosca vagem. Uma alternativa astratégia é usar anestesia azoto que não afeta a taxa metabólica 20.
Tal como acontece com qualquer técnica que mede um sistema tão complexo como a oxidação do combustível e a taxa metabólica, o método aqui descrito tem limitações. Em primeiro lugar, é possível que opera em diferentes grupos diferentes poderiam consomem quantidades de alimento radiomarcado e assim iria entrar na fase de recolha de CO 2 do ensaio com diferentes valores de partida de substrato. Isto pode ser controlado para, em certa medida, realizando a experiência com grandes tamanhos de amostra e pela alimentação de moscas em massa. Para períodos curtos de rotulagem, voa com tripas de cor azul semelhantes vão ter consumido o marcador radioactivo e pode ser transportado para a parte perseguição do experimento. A quantidade de marcador radioactivo remanescente em um grupo de moscas também pode ser medido no final da experiência e em coortes separadas de moscas, após o fim da alimentação e período de corrida inicial. Em segundo lugar, os níveis de atividade entregrupos de moscas nas vagens da mosca podem ser diferentes. Isso terá de ser determinada experimentalmente e tidas em conta na interpretação dos dados. Em terceiro lugar, esta técnica não mede total de produção de CO 2, apenas a produção de um nutriente na dieta específica ou a forma (s) de armazenamento desse nutriente. Este protocolo não é um substituto para, mas em vez disso é complementar à medição da VCO 2, pois fornece informações diferentes e adicionais.
O método descrito aqui mede exalado, CO 2 marcado radioactivamente que é um produto da oxidação de quantidades vestigiais de substratos metabólicos específicos. Variando o rótulo usado - glicose, ácidos graxos ou aminoácidos - pode-se projetar experimentos cada vez mais sofisticados para avaliar as contribuições de diferentes substratos para o metabolismo sob diferentes condições fisiológicas, tais como fome e em diferentes origens genéticas. futuras aplicações desta técnica incluem a medição da metabolism nas fases de larva e pupa de desenvolvimento, duas etapas do ciclo de vida Drosophila que são caracterizadas por extremos de armazenamento de nutrientes e discriminação, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12 x 75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20 ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | Fisher Scientific | 09-874-20 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6 ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
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