Abstract
Il potere della genetica Drosophila viene sempre applicato a problemi di segnalazione ormonale e il metabolismo e allo sviluppo di modelli di malattie umane in questo organismo. metodi sensibili per la misurazione di parametri quali i tassi metabolici sono necessari per guidare la comprensione della fisiologia e malattie in piccoli animali come la mosca della frutta. Il metodo descritto qui valuta l'ossidazione del combustibile in un piccolo numero di mosche adulte alimentati alimenti contenenti tracce di 14 substrati C-etichettato come il glucosio o acidi grassi. Dopo il periodo di alimentazione ed eventuali manipolazioni sperimentali aggiuntivi, mosche vengono trasferiti tubi corti ricoperte con rete, che vengono poi inseriti in flaconcini di vetro contenenti carta da filtro KOH-saturo che trappole esalato, radiomarcato CO 2 generato dalla ossidazione di substrati radiomarcati come bicarbonato di potassio, KHCO 3. Questo bicarbonato radiomarcato è misurato mediante conteggio a scintillazione. Questo è aqapproccio quantitative, riproducibile e semplice per lo studio dell'ossidazione del carburante. L'utilizzo del glucosio radioattivo, acidi grassi, o aminoacidi permette di determinare il contributo di queste diverse fonti di combustibile per il metabolismo energetico, in condizioni diverse, come l'alimentazione e il digiuno e in diversi background genetico. Ciò integra altri approcci utilizzati per misurare in vivo il metabolismo energetico e dovrebbe favorire la comprensione della regolazione metabolica.
Introduction
Il lavoro nella organismo modello Drosophila melanogaster ha contribuito notevolmente alla comprensione dei principi genetici, processi di sviluppo, la crescita, l'invecchiamento, il comportamento, l'immunità e malattia umana 1,2. Una miriade di approcci biologici genetici e cellulari in Drosophila ha guidato i progressi in questi settori. Tuttavia, lo studio del metabolismo in drosofila ha sviluppato più lentamente, dovuto in gran parte alla difficoltà nel misurare parametri metabolici in un piccolo animale simile. L'interesse ad utilizzare Drosophila come modello per lo studio di malattie umane come il diabete e per la comprensione dei contributi del metabolismo alla crescita e varie patologie ha spinto il settore a sviluppare e adattare le tecniche metabolici per questo organismo 3,4.
metodi affidabili sono ora disponibili per la misurazione di una serie di parametri metabolici nel mosca della frutta. Ad esempio, è semplice valutare l'assunzione di cibo
La misurazione della produzione totale di CO 2, soprattutto quando accoppiato con la misurazione del consumo di O 2, fornisce informazioni preziose metabolismo energetico di tutto il corpo. Tuttavia, questa misura non identificare la sostanza nutritiva viene ossidato per l'adenosina trifosfato (ATP) di produzione. Tre classi principali di nutrienti possono entrare nel ciclo dell'acido citrico a seguito della conversione di acetil-CoA: carboidrati, acidi grassi e proteine. Glucosio-6-fosfato, derivato dal glucosio dietetico o glicogeno immagazzinato, può essere convertito in piruvato che è decarbossilata dal piruvato deidrogenasi per formare acetil CoA. Ripartizione degli acidi grassi derivati dalla dieta o da trigliceridi memorizzati da rendimenti ß-ossidazione acetil-CoA che poi entra nel ciclo dell'acido citrico. Finalmente, Una maggioranza di aminoacidi può entrare nel ciclo dell'acido citrico seguente conversione piruvato, acetil CoA o acido citrico intermedi del ciclo come alfa-chetoglutarato.
contributo specifico-Nutrient al metabolismo energetico durante condizioni basali e stimolate può essere monitorato mediante l'uso di traccianti radioattivi. Il protocollo presentato qui è adattato per l'uso in Drosophila da un protocollo utilizzato per valutare l'ossidazione nelle cellule in coltura 12,13. In questo approccio, i moscerini della frutta sono alimentati 14 substrati C-radioattivo metaboliche (carboidrati, acidi grassi, o aminoacidi) nella dieta per un breve (ore) o lunghe (giorni) di impulso, inseguiti sul cibo senza etichetta, e quindi esposti a un camera contenente idrossido di potassio (KOH) carta da filtro saturi per intrappolare CO espirata 2 come bicarbonato. bicarbonato radioattivo può essere quantificato dal conteggio a scintillazione. Le differenze di radiomarcato-produzione di CO 2 tra esperimentoAl gruppi di linea possono riflettere uso di combustibili diversi per la produzione di ATP nel corso di un prolungato differenze veloci o intrinseche nel metabolismo di carburante tra genotipi, per esempio.
Protocol
1. Preparazione di Fly alimentari contenenti radioattivo metaboliche Substrati
- In una provetta per microcentrifuga, mescolare 1 - 2 pCi substrato radioattivo (D- [6- 14 C]-glucosio, D [1- 14 C]-glucosio o acido -palmitic [1- 14 C], 40 - 60 mCi / mmol) con 15 microlitri FD & C No. 1 blu colorante alimentare e H 2 O di eguagliare un volume totale di 25 microlitri.
ATTENZIONE: Carbonio-14 è un beta emettitore a bassa energia ed ha un breve intervallo in aria. Tuttavia, fare attenzione per evitare fuoriuscita di molecole radioattivi o ingestione accidentale dallo sperimentatore. Vola fiale alimentari ribaltano facilmente; essere sicuri di ospitarli in un contenitore che li impediscono di ribaltamento, soprattutto quando radiomarcato è in forma liquida (punto 1.2) o in alimenti solidificata (passo 1,4). Le mosche che vengono alimentati o sono stati alimentati substrati radioattivi inizierà a espirare piccole quantità di CO 2 radioattivo. Queste mosche devono essere conservati in scatole acriliche in cappe di aspirazione, e un piccolo piatto di KOH can essere impostato nella casella per uso come scrubber CO 2. - Pipettare tutto il substrato radiomarcato e miscela colorante blu sul fondo di una fiala cibo mosca vuoto (altezza: 9.4 cm, larghezza: 2,2 cm).
- standard di calore volare cibo in un forno a microonde fino a quando il cibo è solo liquefatto (15 - 20 secondi a livello di potenza alto per un flaconcino contenente 10 ml di cibo).
- Aggiungere alimentare 975 ml fuso al substrato radiomarcato / blu mix colorante e rapidamente turbinare, il monitoraggio uniformità del colore blu, per garantire la completa miscelazione.
- Lasciare cibo per raffreddare e solidificare completamente a temperatura ambiente per 20 - 30 min.
2. alimentazione Substrati marcata radioattivamente metabolico per mosche adulte di frutta
- Anestetizzare mosche adulte utilizzando un'apparecchiatura anestetizzante CO 2 composto da polietilene porosa fusa a base acrilica e collegato ad un serbatoio di CO 2 con un regolatore di pressione. Flusso di CO 2 nell'apparecchio anestetizzante a 5 l / min.
- Trasferimento anestetizzared vola a flaconi contenenti radioattivi, alimentare blu-tinto (n = 15 - 30 mosche per flaconcino). fiale Cap con un tappo di gomma piuma, e riposare orizzontalmente fino mosche svegliano. fiale trasferirla in un contenitore con coperchio in acrilico (180 cm x 180 cm x 240 cm di altezza).
- Per l'alimentazione a breve termine, di fame mosche per 18 - 24 ore prima di trasferire le mosche al cibo radioattivo per un 2 -. Step di alimentazione 3 ore T ha fame passaggio è importante perché le mosche Fed non mangiano in modo affidabile una nuova fonte di cibo presentato a loro . Per l'alimentazione a lungo termine nel corso di 5 - 7 giorni mosche non devono essere fame, ma lo sperimentatore devono monitorare il contenuto di acqua del cibo radiomarcato nei flaconcini mosche sono alloggiati e utilizzare un ago e siringa per aggiungere acqua per fiale con cibo secco.
- Trasferimento vola al cibo senza etichetta "battere" loro in un nuovo flacone. Un periodo di caccia iniziale di 2 - 4 ore permette mosche per pulire le particelle di cibo radioattivi dalle loro cuticole e permette la digestione di radiomarcatocibo ed restante nell'intestino. Monitorare i progressi del cibo attraverso l'intestino mediante ispezione visiva delle mosche per cercare addome blu.
- Successivamente, il trasferimento vola a diversi tipi di alimenti (12 - 24 ore sul cibo standard o 1% agar per la misurazione degli effetti di nutriti rispetto digiuno sulla respirazione) o temperatura ambiente (12-96 ore a 18 C o C per 30 genetica manipolazioni utilizzando GAL80 sensibile alla temperatura (GAL80 ts), per esempio).
Nota: La durata di questo periodo di chase varierà con l'essere eseguito l'esperimento. Per esempio, può essere necessario un inseguimento a 96 ore a 30 C in esperimenti usando GAL80 ts al fine di attivare completamente l'espressione del transgene GAL4-dipendente.
3. Preparazione della CO 2 -Collection Apparatus
- Assemblare materiali per la costruzione di "volare baccelli", tubi di maglia-capped che conterranno le mosche etichettati con acido e tha C-palmitico 14 C-glucosio o 14t rimarrà aperto all'atmosfera. Tagliare la parte superiore di 50 mm da 12 mm tubi di polipropilene x 75 mm, lasciando, tubi tondi fondo 25 mm a lungo. Preparare 35 mm x 35 mm piazze di 130 micron rete di nylon. Inoltre, ottenere nastro trasparente in un erogatore del nastro.
- Assemblare materiali per i CO 2 apparati -Collection. Per ogni pod volano, montare un flaconcino da 20 ml di vetro scintillazione, un tappo superiore in gomma con foro eccentrico, un centro ben essere inserito attraverso il foro nel tappo superiore, grado GF / carta da filtro in microfibra di vetro B (diametro 2,1 centimetri cerchio, 1 pori micron). carta da filtro GF / B viene utilizzato per la sua elevata resistenza a umido e capacità di carico.
- Preparare 5% KOH fresco il giorno di utilizzo. Appena prima del punto 3.4, piegare e posizionare la carta circolare filtro GF / B verso il centro e che è filettata attraverso il foro del tappo di gomma superiore e saturare con 100 ml di 5% KOH. Fare riferimento alla Figura 1.
- Dopo l'incubazione (s) su supporti senza etichetta, unanesthetize vola con CO 2. Spazzola vola nel tubo di taglio in polipropilene, tappo con rete di nylon, e utilizzare il nastro trasparente per aderire mesh tubo. Lavorare velocemente per evitare di mosche risveglio e fuggire prima che la rete è stata apposta in modo sicuro al tubo. Un numero uguale di linea dovrebbe essere usato in ogni pod fly per un particolare esperimento; 10 - 20 mosche per volare pod producono sufficiente radiomarcato-CO 2 per la misura dal conteggio per scintillazione (passo 4.1 sotto).
- Trasferire il pod volo per un 20 ml in vetro scintillazione flaconcino. Tappare la fiala di vetro con il tappo superiore di gomma in possesso di un centro ben contenente carta da filtro GF / B KOH-saturo. Piegare la larghezza superiore del tappo superiore in gomma sul bordo della fiala di vetro scintillazione. Fare riferimento alla Figura 1.
- fiale di vetro set contenente le mosche in un coperchio, il contenitore acrilico, e incubare per periodi di tempo variabili (da 2 a 12 ore funziona bene).
4. Analisi dei risultati
- AAlla fine dell'incubazione, fiale di vetro Uncap e carta da filtro GF / B KOH satura trasferimento ad una plastica fiala di scintillazione 6 ml contenente 4 ml di scintillazione cocktail.
- Se necessario, bloccare mosche in baccelli volare sul ghiaccio secco e conservare a -80 ° C per la determinazione successiva di substrati memorizzati. Si noti che questi campioni sono radioattivi e devono essere memorizzati conseguenza.
- Preparare ulteriori fiale di scintillazione: uno contenente carta da filtro / B GF non utilizzati per servire come sfondo e uno a due altri contenenti 0,1 - 0,5 pCi substrato radioattivo per determinare cpm / uCi.
- Misurare CPM per ogni campione utilizzando un contatore a scintillazione secondo il protocollo del produttore.
- Calcolare pmol 14 CO 2 / cpm e 14 pmol di CO 2 per volare all'ora. Sottrarre il CPM di fondo dal valore CPM per ogni campione. Dai dati substrato radioattivi pulito, calcolare il cpm / pCi di campione di fondo corretta contato.
- Usa ilfornito dal produttore attività specifica e concentrazione radiochimica del substrato radiomarcata (per esempio, 50 pCi / mol e 0,1 pCi / ml, rispettivamente) per calcolare pmol / cpm. Utilizzare questo fattore per convertire i dati fly pod sfondo con correzione da cpm 14 CO 2 / campione pmol 14 CO 2 / campione. Poi dividere per il numero di mosche e il numero di ore nel contenitore mosca.
Representative Results
La quantità di esalato e intrappolati CO 2 radiomarcato che viene prodotto dal metabolismo di un substrato radioattivo dovrebbe correlare con il numero di mosche in un baccello mosca così come la quantità di tempo gli animali trascorrono nell'apparato raccolta CO 2. Per verificare ciò, le mosche che sono stati a digiuno per 18 ore sono stati alimentati con acido palmitico radioattivo (0,02 pCi / cibo ml) per 2 ore e poi testato per radioattivo produzione di CO 2 in gruppi di 12 o 25 animali per 3 o 6 incubazione hr. La quantità di CO 2 prodotta da 25 mosche era quasi il doppio della quantità prodotta da 12 mosche, e l'importo per ogni gruppo ha raddoppiato quando il tempo di incubazione è stata aumentata da 3 ore a 6 ore (Figura 2A). Il pmol 14 CO 2 / fly / ora era quasi equivalente in ciascun gruppo.
Il digiuno stimola la ripartizione degli acidi grassi per ß Ossidazione; quindi produzione di CO 2 da ossidazione degli acidi grassi dovrebbe essere elevata in animali a digiuno rispetto agli animali alimentati. Per determinare se questo fosse il caso, a 18 ore a digiuno mosche sono stati alimentati con acido palmitico radioattivo per 2 ore. Seguendo questo impulso alimentazione breve, mosche sono stati divisi in due gruppi e trasferiti al cibo fly non marcato o 1% agar per 3 ore e poi trasferite per volare cialde per 2 ore. In due esperimenti separati, le mosche inseguito su agar prodotta CO significativamente più radioattivo 2 rispetto alle mosche inseguito sul cibo (Figura 2B), indicando che l'ossidazione ß è stata aumentata negli animali a digiuno.
Figura 1. L'apparecchio per la raccolta espirato radiomarcata CO 2.
Mosche che hanno consumato substrati metabolici radioattivi sonoinseriti in un "fly pod" (FP), un tubo di cutoff centrifuga ridotta con rete (M). Il pod mosca viene inserito in un 20 ml di vetro scintillazione fiala e ricoperto con un tappo superiore in gomma (S) contenente un foro eccentrico, attraverso il quale è posto un pozzetto centrale (CW) che contiene carta da filtro GF / B saturato con 100 microlitri 5% KOH. Espirato CO 2 reagisce con il KOH ed è intrappolato sulla carta filtro come bicarbonato. Intrappolato, CO 2 radioattivo può essere quantificata mediante conteggio a scintillazione della carta da filtro saturo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. 14 CO 2 Correlates di produzione con il tempo e il numero di mosche in unFly Pod e risponde a Fed e digiunato condizioni.
(A) La quantità di 14 CO 2 prodotta in mosche alimentato palmitato radiomarcato è correlato al numero di mosche testati (n = 12 (bar aperto) o 25 (bar chiusi)) e il tempo trascorso in un baccello mosca (3 o 6 ore ). Su una base per-fly, mosche prodotte 0.99, 1.13, 1.10 e 1.01 pmol 14 CO 2 / h (dati elencati nello stesso ordine da sinistra a destra come dati del grafico).
(B) le mosche che sono stati cacciati su agar ossidata più radioattivo palmitato di mosche che sono stati cacciati sul cibo. I dati provengono da due esperimenti e sono segnalati come mezzi deviazione standard, n = 16 - 17 mosche / gruppo (esperimento 1); n = 10 mosche / gruppo (esperimento 2). * P = 0.017, test t. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per misurare l'ossidazione di substrati specifici radiomarcati in adulti Drosophila melanogaster. Questa tecnica è semplice, quantitativa, riproducibile e sensibile, e integra metodi esistenti che misurano produzione totale di CO 2 e il consumo di O 2 in quanto può essere utilizzato per identificare la sostanza nutriente (s) essendo ossidato per la produzione di ATP.
Misurazione della CO 2 liberata dalla ossidazione di substrati specifici radiomarcati utilizzando il metodo qui descritto è complementare a tecniche che misurano produzione totale di CO 2. Totale produzione di CO 2 (V CO2) permette di stimare il tasso metabolico e, quando è noto consumo totale O 2 (V O2), il tasso metabolico può essere calcolato e la fonte di combustibile per l'ossidazione può essere stimato sulla base del rapporto di scambio respiratorio (V CO2 / V O2 = RER). quandoi carboidrati sono il substrato esclusiva, RER = 1, ma quando gli acidi grassi sono la fonte esclusiva, RER = 0.7, a causa della stechiometria delle reazioni di glucosio e ossidazione dei lipidi. In assenza di apparecchiature per misurare il consumo di ossigeno in Drosophila 14, il combustibile ossidativo non può essere identificato. Tuttavia, mediante l'etichettatura vola con tracce di un substrato radioattivo o l'altro e tassi di misura di radioattivo produzione di CO 2, si possono trarre conclusioni circa la capacità delle mosche di ossidare un determinato substrato in diversi momenti durante uno stimolo o sugli effetti di un data mutazione sul ossidazione del combustibile.
Ci sono un certo numero di passaggi critici in questo protocollo. In primo luogo, si deve prestare attenzione quando si usano materiali radioattivi per evitare fuoriuscite e la contaminazione delle aree di ricerca. In secondo luogo, quando anestetizzare le mosche durante le fasi 2.1 e 3.4, lo sperimentatore dovrebbe lavorare velocemente per evitare gli effetti di una prolungata CO 2l'esposizione sul metabolismo e sul comportamento. Un gruppo di 20 mosche può essere anestetizzato e trasferito in un nuovo flacone o in un baccello mosca in 20 secondi o meno. Quando trasferito da un apparecchio di anestesia in una fiala di cibo, il flaconcino deve essere riposato su un lato per evitare che le mosche anestetizzati di rimanere bloccati sulla superficie alimentare. Quando mosche sono cibo radioattivo nutriti nel corso di diversi giorni come al punto 2.2, lo sperimentatore deve assicurare che il cibo non si secchi in linea sono sensibili alla disidratazione.
La FED o digiuno prima dell'etichettatura, la scelta dell'etichetta, la lunghezza del tempo di etichettatura, il periodo di tempo nel contenitore mosca, e il metodo di anestesia sono parametri che possono essere sottoposti a guasti e modifica quando si utilizza questa tecnica. In primo luogo, vola sottoposti a periodi di etichettatura brevi (2-3 hr) è improbabile che consumano quantità significative di cibo radioattivo a meno sottoposto ad un periodo di digiuno in anticipo. In secondo luogo, la scelta dell'etichetta cun effetto le conclusioni si è in grado di disegnare su fenotipi metabolici. Ad esempio, la produzione di CO 2 radioattivo da D- [1- 14 C]-glucosio può riflettere ossidazione attraverso il ciclo dell'acido citrico o lo shunt del fosfato pentoso, mentre radioattivo produzione di CO 2 da D- [6- 14 C]-glucosio riflette l'ossidazione attraverso il ciclo dell'acido citrico solo 12,15,16. Alimentazione mosche con un tracciante radiomarcato per un amminoacido essenziale 17,18 sarebbe una buona strategia per valutare ossidazione degli aminoacidi derivati dalle proteine. Infine, i periodi di etichettatura lunghi con glucosio radioattivo anche aumentare la possibilità di costituzione di questo precursore in altre classi di molecole, come i trigliceridi 19 e aminoacidi come alanina, che interconverts facilmente con piruvato. Questo può essere valutata misurando la radioattività incorporata in queste diverse classi di molecole 6. rad Infatti, coorti separate di mosche possono essere alimentatisubstrati iolabeled nello stesso modo e poi utilizzato per esperimenti di volo POD o misurazione del radiomarcato che viene memorizzato e rimane in glicogeno e trigliceridi nel nutriti e digiunato condizioni 6, per esempio. Un'altra strategia è quella di utilizzare i periodi di breve etichettatura che potrebbero rivelare l'ossidazione delle sostanze nutrienti nella dieta radiomarcati se stessi e non le forme di questi nutrienti di stoccaggio. In terzo luogo, è anche possibile che due gruppi di mosche potrebbero avere tassi identici di 14 CO 2 produzione di un determinato periodo di tempo, ma velocità molto diverse inizialmente. Pertanto, variando la quantità di tempo che vola passare nel contenitore volo può essere un parametro importante per alterare nel valutare variazione fenotipica. Infine, questo protocollo prevede l'utilizzo di un breve periodo di CO 2 anestesia quando mettendo linea nell'apparato fly pod. È possibile che le anestesia CO 2 possono influenzare la funzione metabolica nel corso dell'esperimento fly pod. Un supplente unAPPROCCIO è quello di utilizzare l'anestesia azoto che non influenza il tasso metabolico 20.
Come con qualsiasi tecnica che misura un sistema complesso come l'ossidazione del combustibile e il ritmo metabolico, il metodo qui descritto ha limitazioni. Innanzitutto, è possibile che vola in diversi gruppi potrebbero consumare diverse quantità di cibo radiomarcato e quindi sarebbe entrare nella fase di raccolta CO 2 del test con diverse quantità di partenza di substrato. Questo può essere controllato per qualche misura eseguendo l'esperimento con campioni di grandi dimensioni e alimentando mosche in massa. Per periodi brevi di etichettatura, mosche con simili coraggio di colore blu avranno consumato radiomarcato e può essere portato avanti alla porzione caccia dell'esperimento. La quantità di prodotto radiomarcato rimanente in un gruppo di mosche può essere misurato al termine dell'esperimento e in coorti separate di mosche dopo la fine del periodo di alimentazione e chase iniziale. In secondo luogo, i livelli di attività tragruppi di mosche in baccelli mosca possono essere diverse. Questo dovrà essere determinato sperimentalmente e presi in considerazione quando si interpretano i dati. Terzo, questa tecnica non misura CO 2 produzione totale, solo la produzione di uno specifico elemento nutritivo o il modulo di memorizzazione (s) di tale nutriente. Questo protocollo non è un sostituto per ma invece è complementare alle misure di VCO 2 perché fornisce informazioni diverse e supplementari.
Il metodo qui descritto misure espirata, CO 2 radioattivo che è un prodotto di ossidazione di tracce di specifici substrati metabolici. Variando l'etichetta utilizzata - glucosio, acidi grassi, o aminoacidi - si può progettare esperimenti sempre più sofisticati per valutare i contributi di diversi substrati per il metabolismo in diverse condizioni fisiologiche, come la fame e su diversi background genetico. Le future applicazioni di questa tecnica includono la misurazione di metabolism negli stadi larvali e pupe di sviluppo, due fasi del ciclo di vita Drosophila che sono caratterizzate da estremi rispettivamente stoccaggio nutrienti e ripartizione,.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PALMITIC ACID, [1-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC075H050UC | |
| GLUCOSE, D-[6-14C]-, 50 µCi | PerkinElmer | NEC045X050UC | |
| Glucose, D-[1-14C]-, 50µCi | PerkinElmer | NEC043X050UC | |
| Drosophila Vials, Narrow, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes, 12 x 75 mm | Fisher Scientific | 14-959AA | |
| Mesh, nitex nylon, 120 µm | Genesee Scientific | 57-102 | |
| 20 ml borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-15 | |
| Flask top stopper with off-center hole | Fisher Scientific | K882310-0000 | |
| Polypropylene center well | Fisher Scientific | K882320-0000 | |
| Whatman GF/B glass microfiber filter paper, circle, 2.1cm diameter | Fisher Scientific | 09-874-20 | |
| Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | |
| 6 ml Scintillation Vials with Push-On/Twist-Off Caps | National Diagnostics | SVC-06 |
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