Introduction
सिंथेटिक कोशिका के आकार, विशाल unilamellar पुटिकाओं (GUVs) का निर्माण अलग सेलुलर प्रक्रियाओं की इन विट्रो पुनर्निर्माण में दिलचस्पी बढ़ रही है एक कृत्रिम कोशिका की तरह प्रणाली 1,2 की पीढ़ी के लिए एक रूपरेखा बनाने के लिए की है। जबकि लिपिड झिल्ली की रचना GUVs प्राकृतिक, जैविक झिल्लियों के उत्कृष्ट mimics हैं, वे पर्यावरण के उतार चढ़ाव के खिलाफ अस्थिर कर रहे हैं और एक काफी कम शैल्फ जीवन है। इन सीमाओं के कारण, amphiphilic copolymers ब्लॉक बहुलक पुटिकाओं, या polymersomes फार्म के लिए लिपिड mimics के रूप में इस्तेमाल किया गया है। 8 - इस संदर्भ में, polymersomes उनकी वृद्धि की स्थिरता 3, रासायनिक बहुमुखी प्रतिभा 4,5 और परिवर्तनीय शारीरिक लक्षण 6 के कारण biomimetic सेल प्रणाली के विकास में फायदेमंद हैं।
मौजूदा तरीकों के लिए फार्म का विशाल आकार polymersomes शामिल electroformation 9 और templated पुनर्जलीकरण 10, w के दोनोंhich समय लेने वाली है, श्रम प्रधान, आवश्यकता होती है विशेष उपकरण हैं और बरकरार विशाल polymersomes की कम पैदावार का उत्पादन। एक साधारण जेल की मदद से पुनर्जलीकरण विधि हाल ही में लिपिड GUVs 11 के उत्पादन के लिए विकसित किया गया था। यहाँ, हम अलग-अलग बहुलक रचनाओं के साथ विशाल polymersomes, नियंत्रित आकार, और विभिन्न बफर रचनाओं में बनाने के लिए जेल की मदद से पुनर्जलीकरण तकनीक पर आधारित एक फिल्म का वर्णन है।
संक्षेप में, 1% w / मानक डीएनए जेल वैद्युतकणसंचलन agarose फिल्मों वी एक गिलास coverslip पर निर्जलित हैं। पॉलिमर क्लोरोफॉर्म में तैयार समाधान तो सूखे चूर्ण agarose फिल्म भर में फैल गया है और लुप्त हो जाना करने के लिए अनुमति दी जाती है। पूरा विलायक हटाने के बाद, बहुलक फिल्मों मध्यम हीटिंग (40-70 डिग्री सेल्सियस) और विशाल (> 4 माइक्रोन) आकार polymersomes 30 मिनट के भीतर का गठन कर रहे हैं के साथ चुनाव के बफर में rehydrated रहे हैं। इस विधि को तेजी से पूरी तरह से बरकरार है, अच्छी तरह से बनाई polymersomes के सैकड़ों मानक प्रयोगशाला के उपकरण और reagen का उपयोग कर उत्पादन करता हैकम से कम कीमत पर टीएस।
चित्रा 1. योजनाबद्ध जेल की मदद से पुनर्जलीकरण विधि का चित्रण है। एक diblock copolymer की रचना की विशालकाय polymersomes पुनर्जलीकरण की ~ 30 मिनट के बाद बनते हैं। हाइड्रोफिलिक ब्लॉक मैजेंटा में चिह्नित है और हाइड्रोफोबिक ब्लॉक हरे रंग में चिह्नित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
1. पॉलिमर और agarose तैयारी
नोट: दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट इस प्रोटोकॉल भर में हर समय पहना जाना चाहिए। सुरक्षा काले चश्मे वैसे ही किसी भी कार्बनिक विलायक या संभव splashing के साथ किसी भी कदम के साथ काम करने के दौरान आवश्यक हैं।
- क्लोरोफॉर्म में बहुलक का एक 5 मिलीग्राम / एमएल समाधान तैयार है। बी पाली (butadiene) (पीईओ-प्रवासी भारतीय दिवस, ईओ 22 -BD 37) एक कांच की शीशी और चक्कर आने के लिए पूरी तरह से भंग करने के लिए diblock copolymer - ठोस पाली (एथिलीन ऑक्साइड) के 5 मिलीग्राम क्लोरोफॉर्म के 1 मिलीलीटर जोड़ें। एक रासायनिक धूआं हुड में क्लोरोफॉर्म का उपयोग कर सभी चरणों का प्रदर्शन।
- 99.5% मोल लेबल हटाया गया बहुलक में 0.5% मोल अंतिम एकाग्रता में एक fluorescently लेबल लिपिड (खरीदी पहले से ही क्लोरोफॉर्म में भंग) में मिलाएं।
- उदाहरण के लिए, पिपेट ~ 0 के अंतिम एकाग्रता के लिए 997.58 μl पीईओ-प्रवासी भारतीय दिवस, ईओ क्लोरोफॉर्म में 22 -BD 37 बहुलक (2,950 Daltons की आणविक वजन के साथ) में क्लोरोफॉर्म में एक 1 मिलीग्राम / एमएल fluorescently लेबल लिपिड के 12 μl।5 मोल% लेबल लिपिड मिलाया और 99.5% मोल बहुलक।
- -20 डिग्री सेल्सियस पर एक क्लोरोफॉर्म प्रतिरोधी ढक्कन के साथ एक airtight शीशी में स्टोर समाधान। शीशी किनारे पर लपेटें प्लंबर टेप जहां शीशी पर ढक्कन शिकंजा और शीशी पर ढक्कन सुरक्षित है। ढक्कन के बाहर पर प्लंबर टेप का एक टुकड़ा लपेटें और अंत में कम से कम वाष्पीकरण सुनिश्चित करने के लिए टेप के बाहर पर Parafilm लपेटो।
- एक 250 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में 50 मिलीलीटर पानी (या 50 मिलीलीटर 100 मिमी सूक्रोज) में 0.5 मिलीग्राम मानक agarose मिश्रण से एक डब्ल्यू 1% / वी agarose समाधान करें। ~ 1 मिनट के लिए एक मानक माइक्रोवेव में agarose समाधान उबाल लें (या पूरी तरह से जब तक के रूप में समाधान के समाशोधन द्वारा नोट भंग)।
नोट: agarose समाधान, ठंडा करने के कुछ ही मिनटों के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है या जमना करने की अनुमति दी संग्रहीत और एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर फिर से पिघल।
2. Agarose फिल्म तैयारी
- एक 1000 μl विंदुक टिप clogging रोकने के लिए के बंद अंत कट। कटौती टिप का उपयोग करना, पिपेट 3एक 25 मिमी वर्ग कांच निर्माता से सीधे coverslip पर पिघल agarose समाधान के 00 μl।
- agarose ~ बयान 65-75 डिग्री सेल्सियस से पहले शांत करने की अनुमति। agarose भी शांत है, तो यह प्रसार की प्रक्रिया के दौरान सतह पर पेड़ों का झुरमुट के लिए शुरू हो जाएगा। इसके विपरीत, यदि agarose भी गर्म है, इसे और अधिक करने के लिए सतह agarose पालन करने के प्रसार की आवश्यकता होगी।
- सिर्फ दस्ताने उंगलियों के साथ coverslip के किनारे पकड़ो और समान रूप से coverslip की सतह भर में agarose प्रसार करने के लिए एक और 1,000 μl विंदुक टिप की लंबी बढ़त का उपयोग करें। आगे और पीछे coverslip भर में जब तक agarose पूरी तरह से पालन करता है और coverslip शामिल किया गया विंदुक टिप ले जाएँ।
- agarose का सामना करना पड़ के साथ Parafilm के एक टुकड़े पर agarose लेपित coverslip रखें। एक बार coverslips की वांछित संख्या में लिपटे रहे हैं, कम से कम 1 घंटे के लिए सतह पर agarose निर्जलीकरण के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में coverslips के साथ Parafilm जगह है।
नोट: निर्जलीकरणagarose के दृश्य परत के लापता होने से निर्धारित होता है; coverslip फ्लैट और साफ दिखना चाहिए। एक बार पूरी तरह से फिल्मों निर्जलित रहे हैं, दुकान agarose सतह एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक पेट्री डिश में सामना करना पड़ के साथ coverslips।
3. पॉलिमर फिल्म निर्माण
- पिपेट 30 μl agarose फिल्म पर बहुलक समाधान तैयार किया।
- सिर्फ दस्ताने उंगलियों के साथ coverslip के किनारे पकड़ो और एक परिपत्र गति का उपयोग फैल रहा agarose फिल्मों भर में समाधान प्रसार करने के लिए एक 18 जी सुई की लंबी बढ़त का उपयोग करें। फैल रहा जारी रखें जब तक समाधान सुखाया जाता है।
नोट: सुई के तेज अंत से सावधान रहें। - कम से कम 1 घंटे के लिए (लेबल लिपिड की photobleaching रोकने के लिए) सामना करना पड़ रहा एक प्लास्टिक पेट्री डिश बहुलक पक्ष में बहुलक फिल्मों प्लेस और एक मानक घर निर्वात एल्यूमीनियम पन्नी में कवर desiccator में पेट्री डिश में डाल पूरी तरह से किसी भी अवशिष्ट विलायक हटा दें।
4. पोल का गठनymersomes
- एक coverwell पालन करना, या तो एक घर में बने polydimethylsiloxane (PDMS) अच्छी तरह से (बीच की ~ 1 सेमी व्यास के साथ ठीक PDMS की एक ~ 0.5 सेमी मोटी ब्लॉक बाहर मुक्का मारा) या एक व्यावसायिक रूप से coverslip बहुलक फिल्म के साथ लेपित करने के लिए अच्छी तरह से उपलब्ध है। बहुलक सामना करना पड़ रहा है जब तक एक तंग सील coverwell और coverslip के बीच बनाई है साथ बहुलक लेपित coverslip पर धीरे coverwell दबाएँ। भी मुश्किल प्रेस और coverslip तोड़ने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
- 200-500 μl पुनर्जलीकरण समाधान (पानी ठीक है, लेकिन buffers या मीडिया की एक सरणी भी काम करता है) चैम्बर में जोड़ें (पुनर्जलीकरण मात्रा coverwell पालन के आकार पर निर्भर करता है)।
- पुनर्जलीकरण समाधान के वाष्पीकरण कम करने के लिए एक आर्द्रता चैम्बर बनाएँ। एक गिलास पेट्री डिश के किनारों के साथ एक लुढ़का, गीला Kimwipe रखें। पालन coverwell साथ बहुलक फिल्म नमी कक्ष में रखें और एक ढक्कन के साथ कवर किया। photobleaching कम से कम करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ पेट्री डिश को कवर किया। जगहएक गर्म थाली पर पेट्री डिश में कम से कम 30 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है।
- पुटिकाओं का गठन (चित्रा 5) के आकार को धुन करने के लिए 24-70 डिग्री सेल्सियस से पुनर्जलीकरण के दौरान गर्म थाली के तापमान को समायोजित करें। 70 डिग्री सेल्सियस इसलिए सावधानी से किया जाना चाहिए जब इस तापमान से परे आगे बढ़ने से agarose की टी मीटर के पास है।
Photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली के द्वारा Polymersomes 5. विशेषता (FRAP)
- coverwell सीधे इमेजिंग के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप से पालन के साथ coverslip ले जाएँ।
- बहुलक समाधान में शामिल फ्लोरोसेंट लिपिड पर आधारित उपयुक्त फिल्टर सेट का चयन करें। के लिए rhodamine- लेबल लिपिड बहुलक समाधान में डाल दिया गया है, एक 560/25 एनएम उत्तेजना फिल्टर और एक 607/36 एनएम उत्सर्जन फिल्टर, या तुलनीय फिल्टर सेट का उपयोग करें।
- coverslip जहां polymersomes पालन किया जाएगा के ऊपर की सतह पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक 100X तेल उद्देश्य का प्रयोग करें। polymersomes विशेष रूप से कर रहे हैंबड़े (> 20 माइक्रोन) या यदि बहुलक फिल्म भी मोटी है, एक कम बिजली उद्देश्य (जैसे, 40X) बेहतर polymersomes कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
- प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग polymersomes को पहचानें। एक व्यास> 5 माइक्रोन के साथ विशेषता खोखले, गोलाकार पुटिका द्वारा polymersomes को पहचानें।
- एक समायोज्य कंडेनसर युक्त एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर (FRAP) photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली का उपयोग झिल्ली तरलता की विशेषताएँ। पक्षपाती प्रकृति और substrates पर polymersomes की तंग पैकिंग के कारण, polymersomes की स्वाभाविक गति सीमित है, FRAP इमेजिंग गुणवत्ता बढ़ रही है।
- ब्याज की polymersome पर खुर्दबीन ध्यान दें। एक छोटे से क्षेत्र को कंडेनसर बंद करो और यह सुनिश्चित करें कि एक polymersome के किनारे ब्याज की इमेजिंग क्षेत्र के भीतर है।
- कैमरा जोखिम बढ़ाने के लिए और सुनिश्चित करें कि सभी तटस्थ घनत्व फिल्टर हटा रहे हैं प्रभावी ढंग से ब्याज के क्षेत्र photobleach करने के लिए। झिल्ली फ्लोरिडा की अनुमति दें तीव्रता uorescence 30-60 सेकंड के लिए या जब तक प्रतिदीप्ति तीव्रता में काफी कमी आई है photobleach करने के लिए।
- दीपक को बंद कर दें और पूरी तरह से कंडेनसर खुला। जोखिम शुरू सेटिंग्स को वापस कम होती है और तुरंत 3 मिनट के लिए छवियों हर 30 सेकंड पर कब्जा करने लगते हैं।
- गणना झिल्ली प्रसार मानक तरीकों का उपयोग कर 12 गुणांक। प्रक्षालित क्षेत्र 3-5 मिनट के भीतर प्रतिदीप्ति तीव्रता आएगा, तो यह इंगित करता है कि झिल्ली तरल पदार्थ है।
6. Polymersome आकार विशेषता
चित्रा 6 इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग polymersomes के आकार के विश्लेषण के लिए प्रक्रिया। कदम-दर-कदम कैसे पुटिकाओं गठन के व्यास को मापने के लिए पर निर्देश। उपयोगकर्ता में इस्तेमाल माइक्रोस्कोप के पिक्सल / माइक्रोन अंशांकन इकाइयों पता होना चाहिए।ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर 13 में polymersomes का अधिग्रहण कर लिया छवियों को खोलें।
- विश्लेषण ड्रॉप डाउन बॉक्स और क्लिक "सेट पैमाने 'पर क्लिक करके छवि के लिए पैमाने पर सेट करें।
- माइक्रोस्कोप मानक तरीकों का उपयोग कर (यानी, एक माइक्रोमीटर) के लिए बड़े पैमाने जांचना।
- अंशांकन इकाइयों में भरें और क्लिक करें "ठीक है"।
- लाइन उपकरण बॉक्स पर क्लिक करें और एक लाइन एक पुटिका के व्यास में फैले आकर्षित।
- विश्लेषण ड्रॉप डाउन बॉक्स पर क्लिक करके और "उपाय" पर क्लिक करके लंबाई माप ले लीजिए।
- उपरोक्त प्रक्रिया और प्रत्येक नए माप माप डेटा खिड़की करने के लिए जोड़ दिया जाएगा निम्न अलग-अलग पुटिकाओं को मापने के लिए आगे बढ़ें।
- प्रेस "Ctrl + डी" प्रत्येक लाइन ड्राइंग और लंबाई मापने लाइन पर तैयार की छाप के बादछवि यह आसान ट्रैक करने के लिए जो पुटिकाओं विश्लेषण किया गया है बना रही है।
Representative Results
Polymersomes प्रक्रिया (चित्रा 1) और आम प्रयोगशाला के उपकरण चित्रा 2 में दिखाया गया है ऊपर उल्लिखित का उपयोग का गठन किया गया। Polymersomes विआयनीकृत पानी (चित्रा 3) के साथ rehydrated और एक 100X तेल उद्देश्य का उपयोग epifluorescence में एक औंधा माइक्रोस्कोप पर imaged थे। ध्यान दें कि यदि polymersomes दिखाई नहीं कर रहे हैं, वे आकार भी एक 100X तेल उद्देश्य के साथ कब्जा करने के लिए बड़े पैमाने पर गठन हो सकता है; एक कम बिजली उद्देश्य बजाय प्रयोग किया जा करना पड़ सकता है। जेल की मदद से पुनर्जलीकरण का उपयोग कर के लाभ में से एक पुनर्जलीकरण समाधान की एक किस्म में polymersomes के गठन की बहुमुखी प्रतिभा है। Polymersomes सफलतापूर्वक विआयनीकृत पानी, एक पूर्ण स्तनधारी सेल संस्कृति के माध्यम से, सूक्रोज समाधान और दो physiologically प्रासंगिक बफर समाधान (फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) या Tris बफर खारा (टीबीएस)) के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया में गठन किया गया। मानक शर्तों के तहत (पुनर्जलीकरण1 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस) पर पानी के साथ, अधिक से अधिक ~ 70 से polymersomes आम तौर पर प्रति दृश्य के 40 x 40 माइक्रोन 2 क्षेत्र में पाया जाता है। जबकि polymersomes की सतह उत्पादन समरूप नहीं है, वहाँ इस प्रतिनिधि उपज के साथ देखने के क्षेत्रों के दर्जनों रहे हैं। इसके अलावा, polymersomes कम से कम 24 घंटे के लिए समाधान में स्थिर थे।
Polymersomes आकार आसानी से अलग तापमान पर बहुलक फिल्मों rehydrating से परिचित था। आरटी पर विआयनीकृत पानी में गठित Polymersomes 2.9 ± 0.7 माइक्रोन के एक औसत व्यास था। पुनर्जलीकरण के दौरान तापमान बढ़ जाती है, polymersomes का औसत आकार भी (तालिका 1) बढ़ जाती है। उच्च तापमान (> 60 डिग्री सेल्सियस), polymersomes आकार के साथ का गठन भी अधिक से अधिक से अधिक 100 माइक्रोन (चित्रा 5) पर।
सभी छवि प्रसंस्करण खुला स्रोत सॉफ्टवेयर इमेजिंग (चित्रा 6) का उपयोग कर पूरा किया गया।एकत्र छवियों सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में खोला गया था। calibrated पिक्सेल आकार निर्धारित पैमाने बॉक्स में दर्ज किया गया था। लाइन उपकरण का उपयोग, लाइनों व्यास भर में तैयार किया गया। बाद प्रत्येक व्यक्ति रेखा तैयार की गई थी, calibrated लंबाई मापी और परिणाम बॉक्स में जोड़ा गया था। डेटा तो विकल्प (जैसे, एक्सेल, चश्मे, उत्पत्ति, आदि) के गणितीय सॉफ्टवेयर में प्लॉट किया जा सकता
। चित्रा 2. आम और सस्ती प्रयोगशाला सामग्री polymersomes के गठन के लिए आवश्यक आवश्यक वस्तुओं का चित्र हैं: Parafilm, एक 18.5 जी सुई, क्लोरोफॉर्म या अन्य उपयुक्त विलायक में बहुलक, एक 1000 μl विंदुक टिप, एक Erlenmeyer फ्लास्क, चिमटी, agarose, 25 मिमी वर्ग coverslips, PDMS इमेजिंग कुओं और एक गिलास पेट्री डिश। के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।
चित्रा 3. जेल की मदद से पुनर्जलीकरण विधि के चित्र। Agarose भंग एक 25 मिमी वर्ग coverslip पर जब तक एक भी फिल्म कोट पूरे coverslip फैला हुआ है। Coverslips तो एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में डाल रहे हैं और फिल्म निर्जलित है। एक बहुलक समाधान निर्जलित agarose फिल्म पर जमा है और एक परिपत्र गति में एक सुई का उपयोग फैला हुआ है। coverslip तो जगह है एक desiccator हे / एन पूरी तरह से किसी भी विलायक अवशेषों लुप्त हो जाना। अंत में, और इमेजिंग कक्ष सब्सट्रेट का पालन किया है और पॉलिमर 40 डिग्री सेल्सियस polymersomes के गठन के लिए अनुमति देने के लिए कम से कम 25 मिनट पर पसंद के समाधान के साथ rehydrated और एक पेट्री डिश में रखा जाता है। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें चित्रा। >
चित्रा 4. Polymersomes अलग buffers की एक किस्म में बना सकते हैं। पीईओ-पीबीडी बहुलक फिल्मों 1 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर संकेत बफर के साथ rehydrated थे। स्केल बार = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5. पुनर्जलीकरण के दौरान तापमान में वृद्धि polymersomes का आकार बढ़ जाता है। संकेत दिया पुनर्जलीकरण तापमान पर पानी में गठित polymersomes के प्रतिनिधि epifluorescence छवियों। बड़ा polymersomes में तापमान परिणाम बढ़ रही है। स्केल बार 10 माइक्रोन =।_blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| तापमान (डिग्री सेल्सियस) | औसत आकार (माइक्रोन) |
| 24 | 2.93 ± 0.7 |
| 40 | 5.76 ± 2.5 |
| 50 | 6.65 ± 2.4 |
| 60 | 11.46 ± 5.8 |
| 70 | 14.04 ± 7.0 |
तालिका 1. अलग तापमान हालत गणना की गई अनुसार पानी में 100 से अधिक polymersomes के लिए वृद्धि की polymersome आकार में पुनर्जलीकरण परिणाम के दौरान तापमान बढ़ रही है। औसत व्यास और यहाँ चित्रित कर रहे हैं। त्रुटि मानक विचलन है।
Discussion
Polymersomes व्यापक रूप से जैविक झिल्ली mimics के रूप में पता लगाया जा रहा है। पॉलिमर के मजबूत और बहुमुखी गुण उन्हें व्यापक रूप से झिल्ली functionalization, दीर्घायु और देखते जवाबदेही की आवश्यकता होती है पढ़ाई के लिए आकर्षक बनाते हैं। विशाल आकार polymersomes 9,10 (> 4 माइक्रोन) के गठन के लिए पारंपरिक तरीकों श्रम प्रधान हैं और महंगी और विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। यहाँ, हम पहली बार, मानक सस्ती प्रयोगशाला अभिकर्मकों और उपकरणों का उपयोग कर विशाल आकार polymersomes के गठन के लिए एक तेजी से, बहुमुखी और मजबूत विधि के लिए उपस्थित थे।
जेल की मदद से पुनर्जलीकरण का प्रयोग, unilamellar polymersomes तेजी से गठन किया जा सकता है (<30 मिनट), पुनर्जलीकरण समाधान (सेल संस्कृति मीडिया सहित) की एक किस्म में और विभिन्न पॉलिमर की एक किस्म के साथ (नहीं दिखाया डेटा)। multilamellar या विषम पुटिकाओं के गठन इस तकनीक का उपयोग नहीं मनाया गया। बी पाली (- इस काम के दौरान, हम पाली (एथिलीन ऑक्साइड) का इस्तेमाल कियाbutadiene) (पीईओ-प्रवासी भारतीय दिवस, ईओ 22 -BD 37) तटस्थ diblock copolymer। कई अलग अलग बहुलक रचनाओं (आरोप लगाया diblock copolymers सहित) अच्छी तरह से इस विधि (नहीं दिखाया गया है) का उपयोग कर काम करते हैं। हालांकि, कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध triblock copolymers और उच्च आणविक भार diblock सहपॉलिमरों (~> 5000 Daltons) अलग polymersomes फार्म नहीं है। इस पांडुलिपि में प्रयोगों के सभी के लिए, लेबल लिपिड की एक कम एकाग्रता दृश्य प्रयोजनों के लिए ही बहुलक समाधान में डाल दिया गया था। दृश्य के लिए अन्य तरीकों, पॉलिमर सीधे एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ क्रियाशील सहित भी इस्तेमाल किया जा सकता है। Polymersomes इसी तरह, उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ imaged किया जा सकता है, हालांकि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी अधिक से अधिक संकल्प प्रदान करता है।
प्रोटोकॉल के अधिकांश आम तौर पर मामूली संशोधनों के परिणाम को बदल नहीं है। उदाहरण के लिए, बहुलक समाधान coverslips पर फैल की एकाग्रता में छोटे मतभेदों बहुलक एफ के गठन को बदल नहीं हैइल्म का गठन किया। जबकि पूरा एकाग्रता रेंज निर्धारित नहीं किया गया था, polymersome गठन सफलतापूर्वक बहुलक फिल्म सांद्रता (जैसे, 1-10 मिलीग्राम / एमएल) की एक बड़ी रेंज के साथ हो जाएगा। हालांकि, वहाँ कुछ प्रोटोकॉल परिवर्तन है कि नकारात्मक polymersome गठन को प्रभावित कर रहे हैं। सबसे उल्लेखनीय polymersomes के बहुत गरीब गठन में उस दौर कांच coverslips (वर्ग) के बजाय परिणाम है। हम बहुत भी कांच जो वास्तव में polymersomes के गठन hinders पर agarose की कोट करने के लिए इस विशेषता।
इस तकनीक की सबसे उल्लेखनीय चुनौतियों में से एक एक उच्च उपज के साथ सतह से polymersomes ठीक करने की क्षमता है। वहाँ कुछ मामलों में जो मूल सतह से polymersomes हटाने फायदेमंद हो सकता है। निर्जलित बहुलक फिल्म से उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति, व्यक्तिगत polymersomes हटाने और उन्हें पालन coverslips साफ करने के लिए इमेजिंग गुणवत्ता और लक्षण वर्णन में वृद्धि होगी (गड्ड के कारणFRAP विश्लेषण के दौरान cularly)। एक विंदुक टिप, जिसमें अंत कट गया है सतह से polymersomes desorb होगा (हालांकि बरामद पुटिकाओं की संख्या मूल का गठन उन लोगों की तुलना में काफी कम है) के साथ इस, कोमल pipetting ऐसा करने के लिए। Polymersomes पर फिर संशोधित coverslip सतहों रखा जा सकता है, polymersome नई coverslip के साथ बातचीत करने की इजाजत दी। आमतौर पर, तटस्थ पीईओ-पीबीडी polymersomes के लिए, ओजोन के साथ इलाज coverslips 15 मिनट के लिए polymersomes इमेजिंग के लिए सतह से नीचे गिर करने के लिए अनुमति देते हैं। विभिन्न सतह संशोधन अलग polymersome रचनाओं (जैसे, नकारात्मक या सकारात्मक पॉलिमर चार्ज) के लिए आवश्यक है।
अधिकांश इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सामग्री सफलतापूर्वक संग्रहीत और सप्ताह के दिनों के लिए उपयोग किया जाता है। जम agarose reboiled और पुन: उपयोग किया जब तक agarose उबलते के बाद भी समुच्चय है शुरू होता है, या जम agarose सूखी शुरू होता जा सकता है। सूखे agarose फिल्मों के साथ coverslips संग्रहित किया जा सकता है और उपयोगअनिश्चित काल के लिए डी (जैसे, महीने)। बहुलक क्लोरोफॉर्म में भंग कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। एक बार जब बहुलक फिल्म agarose फिल्मों पर सूख जाता है, हालांकि, फिल्मों घर वैक्यूम के तहत संग्रहीत और प्रयोग की जाने वाली दो सप्ताह (लंबी अवधि के भंडारण सीधे निर्धारित नहीं किया गया था के भीतर की जरूरत है, लेकिन वहाँ बहुलक फिल्मों से अधिक उम्र के दो से गठित polymersomes में नजर मतभेद हैं सप्ताह)।
यहाँ प्रस्तुत जेल की मदद से पुनर्जलीकरण प्रोटोकॉल का उपयोग करना, समान रूप से आकार polymersomes के सैकड़ों मानक उपकरण और सस्ती प्रयोगशाला अभिकर्मकों का उपयोग श्रम के कुछ ही घंटों के साथ तेजी से बनते हैं। इसके अलावा, polymersomes शारीरिक बफर समाधान की एक किस्म में और विभिन्न बहुलक रचनाओं (नहीं दिखाया गया है) से गठित किया जा सकता है। विधि के लिए मामूली परिवर्तन नकारात्मक, polymersomes के गठन को बदल नहीं है के साथ वैज्ञानिकों के प्रतिपादन जेल की मदद से पुनर्जलीकरण एक बहुमुखी और सुलभ तकनीक तकनीकी ई बदलतीxpertise।
आसानी से कोशिकाओं के आकार पैमाने पर विशाल polymersomes बनाने की क्षमता कृत्रिम कोशिका-तरह सिस्टम के निर्माण के लिए आवश्यक है। जेल की मदद से पुनर्जलीकरण के उपयोग और बहुमुखी प्रतिभा की आसानी इन polymersomes बनाने के लिए मजबूत सेल झिल्ली mimics के निर्माण के लिए biomimetic क्षेत्र में एक बड़ी उन्नति प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, इस तकनीक का उपयोग, विभिन्न intracellular घटकों, सेल झिल्ली प्रोटीन और झिल्ली परिवहन प्रोटीन का समावेश के साथ बहुलक का functionalization, के encapsulation के लिए रणनीति बस कुछ ही नाम के लिए, polymersome आधारित कृत्रिम कोशिकाओं का निर्माण करने के लिए बनाया जा सकता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 ml Erlenmeyer flask | VWR | 89000-360 | |
| 18 guage needle | VWR | BD-305196 | |
| 25 mm square coverslips | VWR | 48366-089 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | A standard agarose for DNA gel electrophoresis |
| Chloroform | Sigma | 288306-2L | |
| Commerical coverwell | Electron Microscopy Sciences | 70336 | Press-to-Seal Silicone Isolators |
| Fiji Image Analysis Software | ImageJ | Free Download: http://fiji.sc/Fiji | |
| Glass vial with Teflon Lid | VWR | 66009-556 | 1.9 ml capacity, case of 144 |
| Liss-rhodamine B PE Lipid | Avanti Polar Lipids | 810150C | 1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | 10.2 cm x 38.1 m |
| poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940) | Polymer Source | P2904-BdEO | http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf |
| Pastic Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
| Teflon tape | VWR | 300001-057 | 1/2" width |
References
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Paxton, W., Bouxsein, N. F., Henderson, I., Gomez, A., Bachand, G. Dynamic Assembly of Polymer Nanotube Networks via Kinesin Powered Microtubule Filaments. Nanoscale. , (2015).
- Bermudez, H., Brannan, A. K., Hammer, D. a, Bates, F. S., Discher, D. E. Molecular weight dependence of polymersome membrane structure, elasticity, and stability. Macromolecules. 35 (21), 8203-8208 (2002).
- Amos, R. C., Nazemi, A., Bonduelle, C. V., Gillies, E. R. Tuning polymersome surfaces: functionalization with dendritic groups. Soft Matter. 8 (21), 5947-5958 (2012).
- Egli, S., et al. Biocompatible functionalization of polymersome surfaces: A new approach to surface immobilization and cell targeting using polymersomes. J. Am. Chem. Soc. 133 (12), 4476-4483 (2011).
- Kim, K. T., Cornelissen, J. J. L. M., Nolte, R. J. M., Van Hest, J. C. M. A polymersome nanoreactor with controllable permeability induced by stimuli-responsive block copolymers. Adv. Mater. 21 (27), 2787-2791 (2009).
- Paxton, W. F., Price, D., Richardson, N. J. Hydroxide ion flux and pH-gradient driven ester hydrolysis in polymer vesicle reactors. Soft Matter. 9, 11295-11302 (2013).
- Henderson, I. M., Paxton, W. F. Salt, shake, fuse - Giant hybrid polymer/lipid vesicles through mechanically activated fusion. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (13), 3372-3376 (2014).
- Discher, B. M. Polymersomes: Tough Vesicles Made from Diblock Copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
- Howse, J. R., et al. Templated formation of giant polymer vesicles with controlled size distributions. Nat Mat. 8 (6), 507-511 (2009).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J. Am. Chem. Soc. , 1-24 (2009).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat meth. 9 (7), 676-682 (2012).
