Introduction
합성 셀 크기 거대 단일 층 소포 (GUVs)의 생성은 인공 세포 형 시스템 1,2- 생성하기위한 프레임 워크를 구축하는 다양한 세포 과정의 시험 관내 재구성에 대한 관심이 증가한다. 지질 막으로 구성 GUVs 자연, 생물 세포막의 우수한 모방 동안, 환경 변동에 대한 불안정하고 매우 짧은 수명을 가지고있다. 때문에 이러한 제한으로, 양친 성 블록 공중 합체는 중합체 소포 또는 polymersomes을 형성하는 지질 모방로서 사용되어왔다. 8 - 이러한 맥락에서,이 polymersomes 인해 증가 된 안정성 3 화학적 다양성 및 4,5- 수정 물리적 특성 6 생체 모방 전지 시스템의 발전에 유익하다.
현재의 방법은 거대한 크기의 polymersomes는 전기 주조 9 템플릿 재수 (10), w의 모두를 포함 형성HICH 시간이 많이 소요, 노동 집약적, 전문 필요 장비하고 그대로 거대한 polymersomes의 낮은 수율을 생산하고 있습니다. 간단한 겔 보조 재수 방법은 최근 지질 GUVs (11)의 생산을 위해 개발되었다. 여기서 우리는 거대한 변화 중합체 조성물에 polymersomes, 제어 크기 및 다양한 버퍼 조성물을 만드는 겔 보조 재수 기술의 적응을 설명합니다.
요약하면, 표준 DNA 겔 전기 영동 아가 필름 V / 1 % w 유리 커버 슬립 상 탈수. 클로로포름에서 제조 된 폴리머 솔루션은 다음 탈수 아가로 오스 필름에 걸쳐 확산과 증발 사용할 수 있습니다. 완전한 용매 제거 후, 폴리머 필름은 크기의 polymersomes 30 분 이내에 형성되는 적당한 가열 (40 ~ 70 °에 C) 및 대형 (> 4 μm의)와 선택의 버퍼에 재수된다. 이 방법은 신속하게 표준 실험실 장비 및 reagen를 사용하여 완전히 그대로, 잘 형성 polymersomes의 수백을 생산최소한의 비용으로 TS.
겔 - 보조 재수 방법을 묘사 한도 1 회로도. 디 블록 공중 합체로 이루어지는 거대 polymersomes는 재수 ~ 30 분 후 형성된다. 친수성 블록이 자홍색으로 표시되고, 소수성 블록이 녹색으로 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
1. 고분자 및 아가로 오스 준비
참고 : 장갑 및 실험실 코트는이 프로토콜을 통해 항상 착용해야합니다. 안전 고글은 마찬가지로 유기 용매 또는 가능한 튀는 어떤 단계와 작업시 필요합니다.
- 클로로포름 중합체의 5 ㎎ / ㎖ 솔루션을 준비합니다. B- 폴리 (부타디엔) (PEO-PBD, EO (22) -bd 37) 완전히 용해 유리 병 및 소용돌이에 디 블록 공중 합체 - 고체 폴리 (에틸렌 옥사이드)의 5 mg의 클로로포름 1 ML을 추가합니다. 화학 흄 후드에서 클로로포름을 사용하여 모든 단계를 수행합니다.
- 99.5 몰 %, 표지 된 중합체 0.5 몰 %의 최종 농도에서의 형광 표지 된 지질 (이미 구입 클로로포름)로 혼합한다.
- 예를 들어, 피펫 ~ 0의 최종 농도 997.58 μL PEO-PBD, EO (2950 달톤의 분자량을 가진)을 클로로포름 22 37 -bd 합체에 클로로포름에 1 ㎎ / ㎖ 형광 표지 된 지질의 12 μL.표지 된 지질을 혼합 5 몰 %, 99.5 몰 %의 중합체.
- -20 ° C에서 클로로포름 방지 뚜껑이 밀폐 된 유리 병에 보관 솔루션입니다. 유리 병 가장자리에 배관공 테이프를 감싸 어디 유리 병 위에 뚜껑 나사와 유리 병에 뚜껑을 고정합니다. 뚜껑의 외측에 배관공 테이프의 다른 부분을 감싸 최종적 최소 증착을 위해 테이프의 외측에 파라 필름을 랩.
- 250 ㎖의 삼각 플라스크에 50 ml의 물 (50 ml의 100 mM의 자당) 0.5 mg을 표준 아가로 오스를 혼합하여 1 % / V w 아가로 오스 솔루션을합니다. ~ 1 분을위한 표준 전자 렌지에 아가로 오스 솔루션을 끓여 (용액의 청산에 의해 지적으로 또는 완전히 될 때까지 용해).
주 : 아가로 오스 용액을 냉각 몇 분 후에 사용되거나 응고시켜 저장하고 동일한 절차를 사용하여 재 - 용융 될 수있다.
2. 아가로 오스 필름 제조
- 막힘을 방지하기 위해 1000 μL 피펫 팁 오프 끝을 잘라. 절단 팁을 사용하여, 피펫 (3)제조 업체에서 직접 25mm 정사각형 유리 커버 슬립 위에 녹은 아가로 오스 용액 00 μL.
- 아가로 오스는 ~ 65-75 ° C 이전에 증착하는 냉각 할 수 있습니다. 아가로 오스가 너무 낮 경우, 확산 과정에서 표면에 응집하기 시작한다. 아가로 오스가 너무 뜨거운 경우 반대로, 그것은 표면에 아가로 오스를 준수 확산 더 필요합니다.
- 장갑 낀 손가락으로 커버 슬립 단지 가장자리를 잡고 균일하게 커버 슬립의 표면을 가로 질러 아가로 오스를 확산하기 위해 다른 1,000 μL 피펫 팁의 긴 가장자리를 사용합니다. 아가로 오스가 완전히 준수하고, 커버 슬립을 커버 할 때까지 앞뒤로 coverslip에 걸쳐 피펫 팁을 이동합니다.
- 아가로 오스가 위로 향 파라 필름의 조각에 아가로 오스 - 코팅 커버 슬립을 놓습니다. 커버 슬립의 원하는 번호가 코팅되면, 적어도 1 시간 동안 표면에 아가 로스를 탈수 37 ° C의 배양기로 커버 슬립으로 파라 필름을 배치.
참고 : 탈수를아가의 보이는 층의 소멸에 의해 결정된다; 커버 슬립은 평평하고 분명 보일 것입니다. 영화가 완전히 탈수가되면, 저장소는 아가로 오스 표면은 일회용 플라스틱 페트리 접시에 향하게 된 커버.
3. 고분자 필름 형성
- 30 μL 피펫은 아가 필름 상에 고분자 용액을 준비했다.
- 장갑 낀 손가락으로 커버 슬립 단지 가장자리를 잡고 원형 확산 운동을 사용하여 아가로 오스 필름에 걸쳐 솔루션을 확산하기 위해 18 G 바늘의 긴 가장자리를 사용합니다. 용액이 증발 될 때까지 확산을 계속합니다.
참고 : 바늘의 날카로운 끝의주의하십시오. - 이 위를 향하도록 플라스틱 페트리 접시 폴리머 측의 폴리머 필름을 넣고 알루미늄 호일에 덮여 표준 집 진공 데시 케이 터에 페트리 접시를 넣어 완전히 잔류 용매를 제거하기 위해 적어도 1 시간 동안 (표지 지질의 광표백을 방지하기 위해).
폴 4. 형성ymersomes
- 하는 coverwell 부착하거나 홈 만든 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 웰 (중반의 1 ~ cm 직경 경화 PDMS의 ~ 0.5 cm 두께의 블록을 펀칭) 또는 중합체 필름으로 코팅 된 커버 슬립을 잘 시판. 꽉 밀봉이 coverwell와 커버 슬립 사이에 형성 될 때까지이 위를 향하도록 고분자 폴리머 코팅 커버 슬립에 부드럽게 coverwell를 누릅니다. 너무 세게 누르고 커버 슬립을 중단하지 않도록주의하십시오.
- 챔버에 200 ~ 500 ㎕의 수분 보충 용액 (물이 괜찮지 만, 버퍼 또는 매개체의 배열도 작동) 추가 (재수 볼륨을 부착 coverwell의 크기에 따라 달라집니다).
- 재수 용액의 증발을 감소시키는 습도 챔버를 만든다. 유리 페트리 접시의 가장자리를 따라 압연, 젖은 킴 와이프를 놓습니다. 습도 챔버에 부착 coverwell 가진 중합체 필름을 넣고 뚜껑 커버. 광표백을 최소화하기 위해 알루미늄 호일로 페트리 접시 커버. 장소핫 플레이트 상에 페트리 접시는 적어도 30 분 동안 40 ° C로 설정합니다.
- 조정 24-70 ℃ 내지 형성된 소포 (도 5)의 크기를 재수 동안 핫 플레이트의 온도를 조정한다. 주의 사용해야하므로,이 온도 이상으로의 진행시 70 ° C는 아가의 T m의 근처에있다.
광표백 후 형광 복구에 의해 Polymersomes 5. 특성 (FRAP)
- 이미징에 대한 거꾸로 현미경에 coverwell 직접 부착으로 커버 슬립을 이동합니다.
- 중합체 용액에 포함되는 형광 지질에 기초하여 적절한 필터 세트를 선택한다. 로다 민 - 표지 된 지질의 중합체 용액에 첨가 들어 25분의 560 nm의 여기 필터 및 36분의 607 nm의 방출 필터 또는 유사한 필터 세트를 사용한다.
- polymersomes이 부착되는 커버 슬립의 표면에 집중하는 100X 대물 오일을 사용한다. polymersomes 특히 경우큰 (> 20 μm의) 나 폴리머 필름이 너무 두꺼우면, 저전력 목적 (예를 들어, 40X)이 더 polymersomes를 시각화하는데 사용되어야한다.
- 형광 현미경을 사용하여 polymersomes을 확인합니다. 직경> 5 μm의와 특성 중공 구형 소포에 의해 polymersomes을 확인합니다.
- 가변 콘덴서를 포함하는 형광 현미경 (FRAP)을 photobleaching에 후 형광 복구를 사용하여 막 유동성을 특성화. 때문에 접착 특성과 기판에 polymersomes의 꽉 포장 때문에, polymersomes의 자연 운동은 FRAP 이미징 품질을 향상, 제한된다.
- 관심 polymersome에 현미경 초점을 맞 춥니 다. 작은 영역에 콘덴서를 닫고 polymersome의 가장자리 관심의 촬상 영역 내에 있는지 확인합니다.
- 카메라 노출을 증가시키고 모든 감광 필터가 효과적으로 관심 영역을 photobleach 제거되어 확인합니다. 막 FL 허용 30-60 초 또는 형광 강도가 현저하게 감소 할 때까지 photobleach 강도 uorescence.
- 램프를 끄고 완전히 콘덴서를 엽니 다. 시작 설정으로 다시 노출을 감소하고 3 분 동안 이미지마다 30 초를 캡처 즉시 시작합니다.
- 표준 방법 (12)를 사용하여 막 확산 계수를 계산합니다. 표백 부분은 3-5 분 이내에 형광 강도를 회복하면,이 막이 유체임을 나타낸다.
Polymersome 크기의 6 특성
. 이미징 소프트웨어를 사용하여 polymersomes의 크기 분석 6. 프로세스도 단계별 형성되는 소포의 직경을 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 사용자는 사용 된 현미경의 픽셀 / μm의에서 교정 장치를 알아야합니다.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 이미지 분석 소프트웨어 (13)에 polymersomes의 획득 된 이미지를 엽니 다.
- 다운 드롭 분석 상자와 클릭 "설정 규모"를 클릭하여 이미지의 크기를 설정합니다.
- 표준 방법을 사용하여 현미경 (즉, 마이크로 미터)에 스케일을 보정.
- 교정 단위로 입력하고 "확인"을 클릭합니다.
- 선 도구 상자를 클릭하고 소포의 직경에 걸친 선을 그립니다.
- 다운 드롭 분석 상자를 클릭하고 "측정"을 클릭하여 길이 측정을 수집합니다.
- 위의 절차 및 측정 데이터 창에 추가됩니다 각각의 새로운 측정 다음 개별 소포를 측정 계속합니다.
- 각 라인 드로잉과에 그려진 선을 각인하는 길이를 측정 한 후 보도는 "Ctrl 키 + D"이미지는 쉽게 소체 분석되었다를 추적 할 수있다.
Representative Results
Polymersomes는 (도 1)도 2에 도시 된 일반적인 실험 장비 위에서 설명한 절차를 이용하여 형성 하였다. Polymersomes 탈 이온수 (도 3)으로 재수 화 및 100X 오일 목적을 사용하여 표면 형광의 도립 현미경 영상화 하였다. polymersomes가 표시되지 않는 경우, 그들은이 100X 오일 목적으로 포착하기에 너무 큰 크기로 형성 할 수 있습니다; 낮은 전력 목적은 대신 사용할 필요가있다. 겔 - 보조 재수를 사용하는 장점 중 하나는 재수 솔루션의 다양한 polymersomes 형성의 다양성이다. Polymersomes 성공적 증류수 전체 포유류 세포 배양 배지,도 4에 도시 된 바와 같이 슈 크로스 용액 두 생리 관련 완충액 (인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 TBS 버퍼 (TBS))으로 형성되었다. 표준 조건 하에서 (재수1 시간 동안 40 ° C)에서 물을 큰 70 ~보다 polymersomes는 일반적으로 볼 때 40 × 40 μm의 2 필드마다 발견된다. polymersomes의 표면 생산이 균일 아니지만,이 대표 수율보기의 필드 수십있다. 또한, polymersomes는 최소 24 시간 동안 용액에서 안정.
Polymersomes 크기가 쉽게 다양한 온도에서 중합체 필름을 돌리는로 조정 하였다. RT에서 탈 이온수에 형성 Polymersomes 2.9 ± 0.7 ㎛의 평균 직경을 갖는다. 재수 화 동안 온도가 증가함에 따라 polymersomes의 평균 크기는 (표 1)를 증가시킨다. 높은 온도 (> 60 °에 C) 크기로 형성 polymersomes 더 큰 100 μm의 (그림 5)에서.
모든 화상 처리가 오픈 소스 이미징 소프트웨어 (도 6)를 사용하여 완성 하였다.수집 된 이미지는 소프트웨어 프로그램에 개방 하였다. 보정 된 화소 크기가 설정 크기 상자에 입력 하였다. 선 도구를 사용하여 선 직경에 걸쳐 그려진. 각각의 라인이 인출 된 후, 보정 된 길이를 측정하여 그 결과 상자에 넣었다. 데이터는 선택 (예를 들면, 엑셀, 프리즘, 원산지 등)의 수학적 소프트웨어로 나타내 어질 수있다
. polymersomes의 형성에 필요한 필요한 항목을 공통 저렴 실험실 재료의 그림 2. 그림은 다음과 같습니다 파라 필름, 클로로포름 또는 다른 적당한 용매에 18.5 G 바늘, 폴리머, 1,000 μL 피펫 팁, 삼각 플라스크, 핀셋, 아가로 오스, 25mm 사각형 커버 슬립, PDMS 이미징 우물과 유리 페트리 접시. 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
겔 보조 재수 방법 그림 3. 그림. 아가로 오스 용존는 더 필름 코팅 전체 커버 슬립까지 25mm 사각형 커버 슬립에 확산된다. 커버 슬립은 37 ° C 배양기에 넣고 필름은 탈수이다. 중합체 용액은 탈수 아가 필름 상에 증착 원 운동의 바늘을 사용하여 확산된다. 커버 슬립은 다음 데시 케이 터의 O에서 / N이 완전히 용매 잔류 물을 증발 장소입니다. 마지막으로, 및 이미징 챔버는 기판에 부착 및 폴리머는 40 ° C polymersomes의 형성을 허용하는 최소 25 분에서 선택의 용액으로 재수와 페트리 접시에 배치됩니다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림. >
도 4 Polymersomes 다른 다양한 버퍼에 형성 할 수있다. PEO-PBD 폴리머 필름을 1 시간 동안 40 ° C에서 지시 된 완충액으로 재수 화시켰다. 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
재수 화 동안 온도가 증가도 5는 polymersomes의 크기를 증가시킨다. 재수 표시된 온도에서 물에 형성 polymersomes의 대표적인 표면 형광 이미지. 큰 polymersomes의 온도 결과를 증가. 스케일 바는 10 μm의 =."_blank>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 온도 (° C) | 평균 크기 (μm의) |
| (24) | 2.93 ± 0.7 |
| (40) | 5.76 ± 2.5 |
| (50) | 6.65 ± 2.4 |
| (60) | 11.46 ± 5.8 |
| (70) | 14.04 ± 7.0 |
표 1 계산 된 상이한 온도 조건 당 물 100 이상 polymersomes 대한. 평균 직경을 증가 polymersome 크기 재수 결과 동안 승온 여기에 도시된다. 오류는 표준 편차이다.
Discussion
Polymersomes 널리 생물학적 막 모방으로 탐구되고있다. 폴리머의 강력하고 다양한 특성을 막 작용, 장수 및 튜닝 응답 성을 필요로하는 연구들이 널리 매력. 거대한 크기의 polymersomes 9,10 (> 4 μm의) 형성하기위한 전통적인 방법은 노동 집약적이고 고가의 전문 장비가 필요합니다. 여기서는 처음으로 저렴한 표준 실험실 시약 및 장치를 이용하여 대형 크기 polymersomes을 형성하는 신속한 다목적 강력한 방법에 대해 제시한다.
겔 - 보조 재수를 사용하여 단일 층 polymersomes 빠르게 형성 될 수있다 (<30 분) (세포 배양 배지를 포함) 재수 솔루션의 다양한 다른 중합체의 다양한 (데이터는 보이지 않음). 비대칭 다중 층 소포의 형성은이 기술을 이용하여 관찰되지 않았다. B- 폴리 (- 본 연구를 통하여, 우리는 폴리 (에틸렌 옥사이드)를 사용부타디엔) (PEO-PBD, EO 22 -bd 37) 중간 블록 공중 합체. (대전 디 블록 공중 합체를 포함하여) 다양한 중합체 조성물은 또한이 방법 (미도시)를 사용하여 작동한다. 그러나, 몇몇 시판되는 트리 블록 공중 합체 및 고 분자량의 블록 공중 합체 (~> 5000 달톤)의 구별 polymersomes을 형성하지 않는다. 이 원고의 모든 실험의 경우, 표지 된 지질의 저농도 시각화 목적만을위한 중합체 용액에 첨가 하였다. 직접 형광 염료로 작용 화 중합체를 포함하여 시각화하는 다른 방법도 사용될 수있다. 형광 현미경은 높은 해상도를 제공하지만 Polymersomes은 마찬가지로, 밝은 필드 현미경으로 이미지화 할 수있다.
프로토콜에 대부분 약간의 수정은 일반적으로 결과를 변경하지 않습니다. 예를 들어, 커버 슬립 상에 분산 중합체 용액의 농도의 작은 차이는 중합체 (F)의 형성을 변경하지ILM은 형성했다. 전체 농도 범위가 결정되지 않은 반면, polymersome 형성 성공적으로 중합체 필름의 농도 (예를 들어, 1-10 ㎎ / ㎖)의 넓은 범위에서 발생한다. 그러나 부정적인 polymersome 형성에 영향을 미치지 않는 일부 프로토콜의 변경이 있습니다. 가장 주목할만한 polymersomes의 매우 가난한 형성 결과 (대신 정사각형의) 그 라운드 커버 글라스입니다. 우리는 실제로 polymersomes의 형성을 방해 유리에 아가로 오스의 매우에도 코팅이 때문이다.
이 기술의 가장 주목할만한 문제점 중 하나는 높은 수율로 표면으로부터 polymersomes를 복구 할 수있는 능력이다. 원래의 표면에서 polymersomes을 제거하는 것이 바람직 할 수있는 특정 경우가 있습니다. 탈수 인해 고분자 필름의 높은 배경 형광 개별 polymersomes을 제거하고 화상 품질 및 특성을 증가 커버 슬립을 청소하도록 부착 (이상적 상대 행) FRAP 분석 중에 cularly. (복구 된 소포의 수는 원래 형성된 것보다 상당히 낮다하더라도) 단부가 표면으로부터 탈착된다 polymersomes 차단되어있는 피펫 팁이 부드러운 피펫 팅을 수행한다. Polymersomes 다음 polymersome 새 커버 슬립과 상호 작용할 수 있도록 변형 된 커버 슬립의 표면 상에 배치 될 수있다. 15 분은 polymersomes 이미징의 표면 아래로 떨어지지을 위해 일반적으로 중성 PEO-PBD의 polymersomes를 들어, 오존 처리 된 커버. 다른 표면 개질 서로 다른 polymersome 조성 (예를 들어, 부정적 또는 긍정적는 폴리머 충전)이 필요합니다.
이 프로토콜에서 사용되는 대부분의 재료가 성공적으로 저장되어 주 일에 사용됩니다. 아가로 오스는 고형화 재비 및 아가도 비등 후 응집체를 시작하거나 응고 아가 건조 시작할 때까지 재사용 될 수있다. 건조 아가로 오스 필름으로 된 커버를 저장하고 사용 할 수 있습니다(예를 들어, 개월) 무기한 거라고. 클로로포름에 용해 된 중합체는 몇 달 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 중합체 필름은 아가 필름상에서 건조한 후에, 그러나, 필름 2 주 (장기 저장이 직접 결정되지 내에 하우스 진공하에 저장되고 사용될 필요가 있지만, 중합체 필름보다 오래된 두 형성된 polymersomes의 두드러진 차이가있다 주).
여기에 제시된 겔 보조 재수 프로토콜을 사용하여, 균일 한 형상 polymersomes 수백 표준 장비하고 저렴한 실험 시약을 사용하여 노동 몇 시간에 따라 빠르게 형성된다. 또한 polymersomes 생리 완충 용액의 다양한 상이한 중합체 조성물 (도시되지 않음)로부터 형성 될 수있다. 상기 방법에 사소한 변경을 부정 과학자에 겔 - 보조 재수에게 다용도 액세스 기술을 렌더링 polymersomes의 형성을 변경하지 기술 전자를 변화xpertise.
쉽게 세포의 크기 규모의 거대한 polymersomes을 만들 수있는 능력은 인공 세포와 같은 시스템을 구축하기위한 필수적이다. 이러한 polymersomes를 만들기 위해 젤 보조 재수의 사용과 다양성의 용이성 강력한 세포 막 모방의 창조를위한 생체 모방 분야에서 큰 발전을 제공합니다. 예를 들어,이 기술을 이용하여 다른 세포 내 성분, 세포막 단백질, 막 수송 단백질의 혼입과 중합체 기능화, 캡슐화 전략은 몇 가지 예를 들자면, polymersome 계 인공 세포를 만들도록 설계 될 수있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 ml Erlenmeyer flask | VWR | 89000-360 | |
| 18 guage needle | VWR | BD-305196 | |
| 25 mm square coverslips | VWR | 48366-089 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | A standard agarose for DNA gel electrophoresis |
| Chloroform | Sigma | 288306-2L | |
| Commerical coverwell | Electron Microscopy Sciences | 70336 | Press-to-Seal Silicone Isolators |
| Fiji Image Analysis Software | ImageJ | Free Download: http://fiji.sc/Fiji | |
| Glass vial with Teflon Lid | VWR | 66009-556 | 1.9 ml capacity, case of 144 |
| Liss-rhodamine B PE Lipid | Avanti Polar Lipids | 810150C | 1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | 10.2 cm x 38.1 m |
| poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940) | Polymer Source | P2904-BdEO | http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf |
| Pastic Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
| Teflon tape | VWR | 300001-057 | 1/2" width |
References
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