Introduction
Skapande av syntetiska cellstorlek, jätte unilamellära vesiklar (GUVs) är att öka intresset för återuppbyggnaden av olika cellulära processer in vitro för att bygga ett ramverk för generering av en artificiell cell-liknande system 1,2. Medan GUVs består av lipidmembran är utmärkta härmar av naturliga, biologiska membran, de är instabila mot miljöförändringar och har en relativt kort hållbarhetstid. På grund av dessa begränsningar har amfifila segmentsampolymerer använts som lipid härmar för att bilda polymer vesiklar, eller polymersomes. I detta sammanhang polymersomes är fördelaktiga i utvecklingen av biomimetiska cellsystem på grund av deras ökade stabilitet 3, kemisk mångsidighet 4,5 och modifierbara fysiska drag 6 - 8.
Nuvarande metoder för att bilda jättestort polymersomes inkluderar electroformation 9 och mallade rehydrering 10, båda av which är tidskrävande, arbetsintensiva, kräver specialiserad utrustning och producerar låga utbyten av intakta jätte polymersomes. En enkel gel-assisterad rehydrering metod har nyligen utvecklats för produktion av blodfett GUVs 11. Här beskriver vi en anpassning av gelén assisterade rehydrering teknik för att skapa jätte polymersomes med varierande polymerkompositioner, reglerad storlek och i olika buffertkompositioner.
I korthet, är 1% vikt / volym standard DNA gelelektrofores agaros filmer uttorkad på ett täckglas. Polymerlösningar som framställts i kloroform sedan spridda över uttorkad agaros film och fick avdunsta. Efter fullständig avlägsnande av lösningsmedel, är polymerfilmer rehydreras i bufferten av val med måttlig upphettning (40-70 ° C) och jätte (> 4 | j, m) stora polymersomes bildas inom 30 min. Denna metod ger snabbt hundratals helt intakta, välformade polymersomes med vanlig laboratorieutrustning och reagents vid minimala kostnader.
Figur 1. Schematisk som visar gel-assisterad rehydrering metoden. Giant polymersomes sammansatta av en disegmentsampolymer bildas efter ~ 30 min av rehydrering. Den hydrofila blocket betecknas i magenta och hydrofoba blocket betecknas i grönt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
1. Polymer och Agarose Förberedelse
Obs: handskar och en laboratorierock skall bäras under hela den tid detta protokoll. Skyddsglasögon är också krävs vid arbete med något organiskt lösningsmedel eller något steg med möjliga stänk.
- Bered en 5 mg / ml lösning av polymer i kloroform. Tillsätt 1 ml kloroform till 5 mg fast poly (etylenoxid) - b- poly (butadien) (PEO-PBD, EO 22 -bd 37) disegmentsampolymer i en injektionsflaska av glas och snurra att fullständigt upplösas. Utför alla steg med användning av kloroform i en kemisk draghuv.
- Blanda i en fluorescensmärkt lipid (köpt redan löst i kloroform) vid en 0,5 mol-% slutkoncentration i 99,5 mol-% omärkt polymer.
- Exempelvis pipett ~ 12 | il av en 1 mg / ml fluorescensmärkt lipid i kloroform till 997,58 | il PEO-PBD, EO 22 -bd 37 polymer i kloroform (med en molekylvikt av 2.950 Dalton) för en slutkoncentration av 0.5 mol% märkt lipid blandas och 99,5 mol% polymer.
- Butikslösning i en lufttät injektionsflaska med en kloroform-säkra lock vid -20 ° C. Wrap rörmokare tejp på flaskan kant där locket skruvas fast på flaskan och säkra locket på flaskan. Linda en annan bit av rörmokare tejp på utsidan av locket och slutligen linda Parafilm på utsidan av bandet för att säkerställa minimal avdunstning.
- Gör en 1% vikt / volym agaros-lösning genom att blanda 0,5 mg standard agaros i 50 ml vatten (eller 50 ml 100 mM sackaros) i en 250 ml Erlenmeyer-kolv. Koka agaroslösningen i en vanlig mikrovågsugn för ~ 1 minut (eller tills helt upplöst som noterats av clearing av lösningen).
Anmärkning: agaros lösning kan användas efter några minuter av kylning eller får stelna, lagras och åter smälts med användning av samma förfarande.
2. Agarose Film Framställning
- Skär i slutet av en 1000 mikroliter pipettspets för att förhindra igensättning. Med hjälp av cut spets, pipett 300 | il av smält agaros lösning på en 25 mm i fyrkant täckglas direkt från tillverkaren.
- Tillåt agarosen svalna till ~ 65-75 ° C före deponering. Om agarosen är för kall, kommer den att börja att klumpa på ytan under spridningsprocess. Omvänt, om agarosen är för varmt kommer det att krävas flera spridnings att vidhäfta agarosen till ytan.
- Håll bara kanten av täck med handskar och använda den långa kanten av en annan 1000 mikroliter pipettspets för att sprida agarosen jämnt över ytan av täckglas. Flytta fram och tillbaka över täck pipettspetsen tills agarosen helt vidhäftar och täcker täck.
- Placera agaros belagda täckglas på en bit Parafilm med agarosen vänd uppåt. När önskat antal täck beläggs, placera Parafilm med täck i en 37 ° C inkubator för att torka agarosen på ytan i minst en timme.
Obs: Uttorkningbestäms av försvinnandet av det synliga skikt av agaros; täck ska se platt och tydlig. När filmerna är helt uttorkad, täck butik med agarosen ytan uppåt i en disponibel plast petriskål.
3. Polymer Film Formation
- Pipettera 30 pl beredda polymerlösningen på agarosen filmen.
- Håll bara kanten av täck med handskar och använda långsidan av en 18 G nål för att sprida lösningen över agarosen filmer med hjälp av en cirkulär spridningsrörelse. Fortsätta sprida tills lösningen indunstas.
Obs: Var försiktig med den vassa änden av nålen. - Placera polymerfilm i en plastpetriskål polymer uppåt och sätta petriskål i ett vanligt hus vakuumexsickator täckt av aluminiumfolie (för att förhindra fotoblekning av den märkta lipid) under minst en timme för att helt ta bort alla rester av lösningsmedel.
4. Bildning av Polymersomes
- Vidhäfta en coverwell, antingen en hemgjorda polydimetylsiloxan (PDMS) brunn (en ~ 0,5 cm tjockt block av härdade PDMS med ~ 1 cm diameter på mitten stansas ut) eller en kommersiellt tillgänglig väl på täckglas belagda med polymerfilmen. Tryck på coverwell försiktigt på den polymerbelagda täckglas med polymeren uppåt tills en tät försegling bildas mellan coverwell och täckglas. Var noga med att inte trycka för hårt och bryta täck.
- Lägg 200-500 l vätskeersättning (vatten är bra, men en rad buffertar eller medier fungerar också) till kammaren (vätskeersättning volym beror på storleken på coverwell följs).
- Skapa en fuktkammare för att minska avdunstningen av vätskeersättning. Placera en rullad, våt Kimwipe längs kanterna av ett glas petriskål. Placera polymerfilmen med den vidhäftade coverwell in i fuktkammaren och täck med ett lock. Täck petriskål med aluminiumfolie för att minimera fotoblekning. Platspetriskål på en varm platta inställd på 40 ° C under minst 30 min.
- Justera temperaturen hos den varma plattan under rehydratisering 24-70 ° C för att ställa in storleken på vesiklarna bildade (Figur 5). 70 ° C är nära Tm av agarosen så försiktighet bör användas när fortsätter bortom denna temperatur.
5. Karakterisering av Polymersomes av fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP)
- Flytta täckglas med den vidhäftade coverwell direkt till ett inverterat mikroskop för avbildning.
- Välja lämplig filteruppsättningen baserad på den fluorescerande lipid ingår i polymerlösningen. För Rhodamine-märkta lipider dopade i polymerlösningar, använd en 560/25 nm excitationsfilter och 607/36 nm emissionsfilter, eller jämförbara filteruppsättningar.
- Använda en 100X oljeobjektiv för att fokusera på den övre ytan av täckglas där polymersomes kommer att följas. Om polymersomes är särskiltstor (> 20 um) eller om polymerfilmen är för tjock, bör en lägre effekt mål (t.ex. 40X) användas för att bättre visualisera polymersomes.
- Identifiera de polymersomes använder fluorescensmikroskopi. Identifiera polymersomes av den karakteristiska ihåliga, sfäriska vesikler med en diameter> 5 pm.
- Karakterisera membran fluiditet använder fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) på ett fluorescensmikroskop som innehåller en justerbar kondensator. På grund av den vidhäftande natur och tät packning av polymersomes på substraten, är naturlig rörelse av de polymersomes begränsat, vilket ökar FRAP avbildningskvalitet.
- Fokusera mikroskop på polymersome av intresse. Stänga kondensorn till en liten region och se till att kanten av en polymersome ligger inom avbildnings regionen av intresse.
- Öka kamerans exponering och garanterar alla neutrala täthetsfilter avlägsnas för att effektivt photobleach regionen av intresse. Tillåta membranet fl uorescence intensitet till photobleach för 30-60 sek eller till dess fluorescensintensiteten är betydligt minskat.
- Stänga av lampan och fullt öppna kondensorn. Minska exponeringen tillbaka till utgångsinställningarna och börjar omedelbart ta bilder var 30 sekund under 3 minuter.
- Beräkna membran diffusionskoefficienter användning av standardmetoder 12. Om blekta regionen återfår fluorescensintensiteten inom 3-5 minuter, indikerar detta att membranet är flytande.
6. Karakterisering av Polymersome Storlek
Figur 6. Process för storleksanalys av polymersomes använder bildbehandlingsprogram den. Steg-för-steg-instruktioner om hur man mäter diametern av blåsor bildas. Användaren måste känna kalibreringsenheter i pixlar / um av mikroskopet används.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Öppna förvärvade bilder av polymersomes inom bildanalys programvara 13.
- Ställ in skalan för bilden genom att klicka på analysera rullgardinsmenyn och klicka på "set skala".
- Kalibrera skalan för mikroskop med hjälp av standardmetoder (dvs en mikrometer).
- Fyll i kalibreringsheter och klicka på "OK".
- Klicka på linjen verktygslådan och dra en linje som sträcker sig över diametern av en vesikel.
- Samla mätningar längd genom att klicka på rutan analysera falla ner och klicka på "åtgärd".
- Fortsätt att mäta enskilda vesiklar efter ovanstående procedur och varje ny mätning läggs till mätningar datafönster.
- Tryck på "Ctrl + D" efter dragning varje rad och mäta längden ska fällas in linje dragen påbild gör det lättare att spåra vilka vesiklar har analyserats.
Representative Results
Polymersomes bildades med användning av förfarandet som beskrivits ovan (Figur 1) och den gemensamma laboratorieutrustning som visas i figur 2. Polymersomes rehydrerades med avjoniserat vatten (fig 3) och avbildas på ett inverterat mikroskop i epifluorescens med användning av en 100X oljeobjektiv. Observera att om polymersomes inte syns, de kanske inte har uppstått i storlekar för stora för att fånga med en 100X olja mål; en lägre effekt mål kan behöva användas i stället. En av fördelarna med att använda gel-assisterad rehydrering är mångsidigheten i formnings polymersomes i en mängd olika rehydreringslösningar. Polymersomes styrde bildad i avjoniserat vatten, en fullständig däggdjurscellodlingsmedium, sackaroslösningar och två fysiologiskt relevanta buffertlösningar (fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller Tris-buffrad saltlösning (TBS)), såsom visas i figur 4. Under standardförhållanden (rehydreringmed vatten vid 40 ° C under 1 timme), är större än ~ 70 polymersomes normalt återfinns per 40 x 40 ^ m 2 synfält. Medan ytan produktion av polymersomes är inte homogen, det finns dussintals synfält med denna representativa avkastningen. Vidare polymersomes var stabila i lösning under minst 24 h.
Polymersomes storlek var lätt trimmad genom rehydratisering polymerfilmer vid varierande temperaturer. Polymersomes bildade i avjoniserat vatten vid RT hade en medeldiameter av 2,9 ± 0,7 | j, m. När temperaturen ökar under rehydratisering, ökar den genomsnittliga storleken på de polymersomes också (tabell 1). Vid höga temperaturer (> 60 ° C), polymersomes bildade med storlekar och med större än 100 | j, m (Figur 5).
Alla bildbehandling fördes med hjälp av öppen källkod bildbehandlingsprogram (Figur 6).Bilder som samlats öppnades i programmet. Den kalibrerade pixelstorlek ingicks inställd skala låda. Använda linjeverktyget har linjer dragna över diametrarna. Efter varje enskild linje drogs var kalibrerad längd mäts och adderas till rutan resultat. Data kan sedan ritas i matematisk programvara val (t.ex. Excel, Prism, ursprung, etc.)
. Figur 2. Bild av de gemensamma och billiga lab material som krävs för bildandet av polymersomes Föremålen som krävs är: Parafilm, en 18,5 G nål, polymer i kloroform eller annat lämpligt lösningsmedel, en 1000 mikroliter pipettspets, en Erlenmeyerkolv, pincett, agaros, 25 mm kvadratiska täck, PDMS avbildnings brunnar och ett glas petriskål. klicka här för atten större version av denna siffra.
Figur 3. Bilder på gel-assisterad rehydrering metod. Upplöst agaros sprids på en 25 mm fyrkant täck tills en jämn film rockar hela täck. Täckglas läggs sedan i en 37 ° C inkubator och filmen är uttorkad. En polymerlösning avsätts på uttorkad agaros film och sprids med hjälp av en nål i en cirkelrörelse. Täck sedan placera i en torkapparat O / N till fullo avdunsta eventuella lösningsmedelsrester. Slutligen, och avbildning kammare är fäst vid substratet och polymerer rehydreras med lösningen av val och placeras i en petriskål vid 40 ° C under minst 25 minuter för att möjliggöra bildandet av polymersomes. Klicka här för att se en större version av denna figur. >
Figur 4. Polymersomes kan bildas i en mängd olika buffertar. PEO-PBD polymerfilmer rehydrerades med den angivna bufferten vid 40 ° C under 1 timme. Skala bar = 10 mikrometer. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Ökning av temperaturen under rehydratisering ökar storleken på de polymersomes. Representativa epifluorescence bilder av polymersomes bildade i vatten vid de angivna rehydrering temperaturer. Ökande temperatur resulterar i större polymersomes. Skalstreck = 10 | im._blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Temperatur (° C) | Medelstorlek (| im) |
| 24 | 2,93 ± 0,7 |
| 40 | 5,76 ± 2,5 |
| 50 | 6,65 ± 2,4 |
| 60 | 11,46 ± 5,8 |
| 70 | 14,04 ± 7,0 |
Tabell 1. En ökning av temperaturen under rehydrering resulterar i ökad polymersome storlek. Medeldiametrar större än 100 polymersomes i vatten per olika temperaturtillstånd beräknades och visas här. Fel är standardavvikelsen.
Discussion
Polymersomes är blir allmänt utforskas biologiska membran härmar. De robusta och mångsidiga egenskaper hos polymerer gör dem allmänt tilltalande för studier som kräver membran funktionalisering, livslängd och trimmad respons. Traditionella metoder för att bilda jättestort polymersomes 9,10 (> 4 um) är arbetskrävande och kräver dyr och specialiserad utrustning. Här presenterar vi för första gången, en snabb, mångsidig och robust metod för att bilda jättestora polymersomes användning av standard billiga laboratoriereagens och utrustning.
Med användning av gel-assisterad rehydratisering, kan unilamellära polymersomes formas snabbt (<30 min), i en mängd olika rehydrering lösningar (inklusive cellodlingsmedier) och med en mängd olika polymerer (data ej visade). Bildandet av multilamellära eller asymmetriska vesiklar observerades inte med användning av denna teknik. Under hela detta arbete har vi använt poly (etylenoxid) - b- poly (butadien) (PEO-PBD, EO 22 -bd 37) neutral disegmentsampolymer. Många olika polymerkompositioner (inklusive laddade disegmentsampolymerer) fungerar bra med den här metoden (ej visad). Men vissa kommersiellt tillgängliga trisegmentsampolymerer och högre molekylvikt disegmentsampolymerer (~> 5000 Dalton) inte bilda distinkta polymersomes. För alla experimenten i detta manuskript, hade en låg koncentration av märkt lipid dopad i polymerlösningar för visualiseringssyfte. Andra metoder för visualisering, inklusive polymerer direkt funktionaliserade med en fluorescerande färg kan också användas. Polymersomes kan likaledes avbildas med ljusfältsmikroskopi, fast fluorescensmikroskopi ger större upplösning.
De flesta mindre ändringar av protokollet normalt inte ändra resultatet. Till exempel behöver små skillnader i koncentrationen av polymerlösningen spreds på täckglasen inte ändra bildandet av polymer film bildades. Medan hela koncentrationsområdet inte bestämdes, kommer polymersome bildning framgångsrikt ske med ett stort utbud av polymerfilm koncentrationer (t.ex. 1-10 mg / ml). Det finns dock några protokoll förändringar som påverkar polymersome bildning negativt. Det mest anmärkningsvärda är att runda täckglas (i stället för kvadratiska) resulterar i mycket dålig bildning av polymersomes. Vi tillskriver detta till extremt jämnt lager av agaros på glaset som faktiskt hindrar bildandet av polymersomes.
En av de mest anmärkningsvärda utmaningarna i denna teknik är förmågan att återvinna de polymersomes från ytan med ett högt utbyte. Det finns vissa fall där avlägsnande av polymersomes från den ursprungliga ytan kan vara fördelaktig. Grund av den höga bakgrundsfluorescensen från det dehydratiserade polymerfilmen, avlägsnande individuella polymersomes och vidhäfta dem att rengöra täckglas kommer att öka bildkvalitet och karakterisering (partiskilt under FRAP analys). För att göra detta, försiktig pipettering med en pipettspets i vilken änden har skurits av kommer desorbera polymersomes från ytan (om antalet vesiklar återvunna är betydligt lägre än de som ursprungligen bildats). Polymersomes kan sedan placeras på modifierade täckytor, vilket gör att polymersome att interagera med det nya täck. Typiskt för neutrala PEO-PBD polymersomes, täckglas behandlades med ozon under 15 min tillåta polymersomes att falla ner till ytan för avbildning. Annan ytmodifiering krävs för olika polymersome kompositioner (t.ex. negativt eller positivt laddade polymerer).
De flesta material som används i detta protokoll framgångsrikt lagras och används i flera dagar till veckor. Den stelnade agarosen kan återkokas och återanvändas tills agarosen börjar få aggregat även efter kokning, eller den stelnade agarosen börjar torka. Täckglas med torkade agaros filmer kan lagras och användningd på obestämd tid (t.ex. månader). Polymeren löstes i kloroform kan lagras vid -20 ° C under flera månader. När polymerfilmen torkas på agarosen filmerna emellertid filmerna behöver lagras under husvakuum och användes inom två veckor (längre lagring sikt var inte direkt bestämmas, men det finns märkbara skillnader i polymersomes bildade av polymerfilmer som är äldre än två veckor).
Använda gel assisterade vätskeersättning Protokollet presenteras här, hundratals enhetligt formade polymersomes bildas snabbt med bara några timmars arbete med hjälp av standardutrustning och billiga laboratoriereagens. Vidare kan polymersomes formas i en mängd olika fysiologiska buffertlösningar och från olika polymerkompositioner (ej visade). Smärre ändringar av den metod som inte negativt förändra bildningen av polymersomes, rendering gel-assisted rehydrering en mångsidig och tillgänglig teknik för att forskare med varierande tekniska expertise.
Möjligheten att enkelt skapa jätte polymersomes på storlekstabellen av celler är viktig för att bygga konstgjorda cell liknande system. Den användarvänlighet och mångsidigheten hos gel-assisterad rehydrering att göra dessa polymersomes erbjuder ett stort framsteg inom biomimetisk fält för att skapa robusta cellmembranet härmar. Exempelvis med användning av denna teknik, strategier för inkapsling av olika intracellulära komponenter, funktionalisering av polymeren med cellmembranproteiner och inkorporeringen av membrantransportproteiner, bara för att nämna några, kan utformas för att bygga polymersome baserade artificiella celler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 ml Erlenmeyer flask | VWR | 89000-360 | |
| 18 guage needle | VWR | BD-305196 | |
| 25 mm square coverslips | VWR | 48366-089 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | A standard agarose for DNA gel electrophoresis |
| Chloroform | Sigma | 288306-2L | |
| Commerical coverwell | Electron Microscopy Sciences | 70336 | Press-to-Seal Silicone Isolators |
| Fiji Image Analysis Software | ImageJ | Free Download: http://fiji.sc/Fiji | |
| Glass vial with Teflon Lid | VWR | 66009-556 | 1.9 ml capacity, case of 144 |
| Liss-rhodamine B PE Lipid | Avanti Polar Lipids | 810150C | 1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | 10.2 cm x 38.1 m |
| poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940) | Polymer Source | P2904-BdEO | http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf |
| Pastic Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
| Teflon tape | VWR | 300001-057 | 1/2" width |
References
- Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
- Paxton, W., Bouxsein, N. F., Henderson, I., Gomez, A., Bachand, G. Dynamic Assembly of Polymer Nanotube Networks via Kinesin Powered Microtubule Filaments. Nanoscale. , (2015).
- Bermudez, H., Brannan, A. K., Hammer, D. a, Bates, F. S., Discher, D. E. Molecular weight dependence of polymersome membrane structure, elasticity, and stability. Macromolecules. 35 (21), 8203-8208 (2002).
- Amos, R. C., Nazemi, A., Bonduelle, C. V., Gillies, E. R. Tuning polymersome surfaces: functionalization with dendritic groups. Soft Matter. 8 (21), 5947-5958 (2012).
- Egli, S., et al. Biocompatible functionalization of polymersome surfaces: A new approach to surface immobilization and cell targeting using polymersomes. J. Am. Chem. Soc. 133 (12), 4476-4483 (2011).
- Kim, K. T., Cornelissen, J. J. L. M., Nolte, R. J. M., Van Hest, J. C. M. A polymersome nanoreactor with controllable permeability induced by stimuli-responsive block copolymers. Adv. Mater. 21 (27), 2787-2791 (2009).
- Paxton, W. F., Price, D., Richardson, N. J. Hydroxide ion flux and pH-gradient driven ester hydrolysis in polymer vesicle reactors. Soft Matter. 9, 11295-11302 (2013).
- Henderson, I. M., Paxton, W. F. Salt, shake, fuse - Giant hybrid polymer/lipid vesicles through mechanically activated fusion. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (13), 3372-3376 (2014).
- Discher, B. M. Polymersomes: Tough Vesicles Made from Diblock Copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
- Howse, J. R., et al. Templated formation of giant polymer vesicles with controlled size distributions. Nat Mat. 8 (6), 507-511 (2009).
- Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J. Am. Chem. Soc. , 1-24 (2009).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat meth. 9 (7), 676-682 (2012).
