Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

العلاج الجيني الفيروسة الغدانية لمرضى السكري اعتلال القرنية: التأثيرات على شفاء الجروح ووقف علامة الخلية التعبير في الإنسان القرنيات الجهاز مثقف والخلايا الظهارية الحوفي

Published: April 7, 2016 doi: 10.3791/54058
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Eye Program, Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Departments of Biomedical Sciences and Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Abstract

والهدف من هذا البروتوكول هو لوصف التعديلات الجزيئية في القرنيات لمرضى السكري الإنسان وإظهار كيف يمكن تخفيفها عن طريق العلاج الجيني الفيروسة الغدانية في قرنية العين-الجهاز مثقف. مرض القرنية السكري هو من مضاعفات مرض السكري مع تشوهات المتكررة للأعصاب القرنية والتئام الجروح الظهارية. لقد وثقت أيضا التعبير تغيير كبير العديد من علامات الخلايا الجذعية الظهارية المفترضة في القرنيات لمرضى السكري الإنسان. للتخفيف من حدة هذه التغييرات، تم تنفيذ العلاج الجيني الفيروسة الغدانية بنجاح باستخدام upregulation للتعبير عن بروتو الجين الورمي-التقى ج و / أو downregulation من proteinases مصفوفة الفلزي 10 (MMP-10) وكاثبسين واو هذا العلاج تسارع التئام الجروح في القرنيات لمرضى السكري حتى عندما كان transduced مقصورة الخلايا الجذعية الحوفي فقط. تم الحصول على أفضل النتائج مع العلاج جنبا إلى جنب. لاحتمال زرع المريض من الخلايا الجذعية طبيعية، ويقدم مثالا أيضا من optimizatiعلى تنبيغ الجينات في الثقافات التخصيب الخلايا الجذعية باستخدام القدرة polycationic. قد يكون هذا النهج مفيدا ليس فقط للجينات منتقاة ولكن أيضا لغيرها من الوسطاء من القرنية التئام الجروح الظهارية وتنبع وظيفة الخلية.

Introduction

مرض القرنية السكري النتائج بشكل رئيسي في الظهارية التنكسية (القرنية) وعصب التغييرات (الاعتلال العصبي). وغالبا ما يتجلى ذلك من تشوهات التئام الجروح الظهارية والحد من العصبية القرنية 1-4. ما يقدر ب 60-70٪ مرضى السكري لديهم مختلف مشاكل القرنية 1،3. وقد حددت الدراسات لدينا العديد من البروتينات علامة مع التعبير تغير في القرنيات لمرضى السكري الإنسان بما في ذلك downregulation من-التقى ج بروتو الجين الورمي (نمو خلايا الكبد مستقبلات عامل) وupregulation من مصفوفة الفلزي 10 (MMP-10) وكاثبسين F 5، 6. لقد وثقت بشكل ملحوظ انخفض تعبير عن العديد من علامات الخلايا الجذعية الظهارية المفترضة في القرنيات لمرضى السكري الإنسان.

في الدراسات السابقة قمنا بتطوير العلاج الجيني المعتمد الفيروسة الغدانية لتطبيع مستويات من علامات المعدلة والسكري باستخدام السكري نظام الجهاز ثقافة القرنية البشرية، مما يدل على بطء التئام الجروح، السكريالتغييرات علامة، والخلايا الجذعية علامة تخفيض تعبير مشابه إلى خارج الجسم الحي القرنيات 7،8. ويبدو أن هذا استمرار التغييرات أن ذلك يعود إلى وجود ذاكرة الأيض جينية 9. وكان هذا النظام الثقافة اكثر ما يستخدم للعلاج بالجينات. وقد تم اختيار الأهداف لهذا العلاج من علامات مع أي انخفاض التعبير في القرنيات السكري (ج التقى بروتو الجين الورمي)، أو زيادة التعبير (MMP-10 و F كاثبسين).

تم استخدام الفيروسة الغدانية (AV) العلاج في قرنية العين-الجهاز مثقف كلها أو مقصورة الحوفي الطرفية القرنية والصلبة فقط. هذه المقصورة تؤوي الخلايا الجذعية الظهارية أن تجديد ظهارة القرنية والمشاركة بنشاط في التئام الجروح 4،10-15. هنا، يتم توفير بروتوكولات للثقافة الطبيعية لمرضى السكري البشرية القرنية الجهاز، التئام الجروح الظهارية، والعزلة وتوصيف الجذعية مزارع الخلايا الحوفي التخصيب خلية، والخلية الفيروسة الغدانية والتنبيغ القرنية. لناوأظهرت النتائج جدوى هذا العلاج لتطبيع التعبير علامة والتئام الجروح في القرنيات لمرضى السكري لزرع محتمل في المستقبل. كما أنها تشير إلى أن الجمع بين العلاج هو الوسيلة الأكثر فاعلية لاستعادة نمط علامة الطبيعي والشفاء الظهارية في القرنية لمرضى السكري 16-18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

مرض الوطنية تبادل البحوث (ندري، فيلادلفيا، PA) المرفق وافق بعد الوفاة صحية لمرضى السكري والعين البشرية والقرنيات. الموافقة بروتوكول جمع الأنسجة البشرية ندري من قبل لجنة إدارية وتخضع لالمعاهد الوطنية للرقابة الصحية. وقد أجريت هذه الدراسة في إطار المركز الطبي مجلس المراجعة المعتمدة سيناي المؤسسية (IRB) بروتوكول إعفاء EX-1055. التعاون الجراحين القرنية، د. E. Maguen وY. رابينوفيتش، زودت الحافات القرنية والصلبة عن تجاهل لعزل الجذعية الثقافات الظهارية القرنية التخصيب الخلية. وقد أجريت هذه الدراسة في إطار البروتوكول العائد المحلي وافق Pro00019393.

1. الإنسان القرنية ثقافة الجهاز

ملاحظة: يتم استلام القرنيات الطبيعية لمرضى السكري أو العينين كلها في وسائط تخزين القرنية المبردة (على سبيل المثال، Optisol ع) في غضون 48 ساعة بعد الموت من المورد الوطني ندري.

  1. إزالة القرنيات من حاوية تخزين مع ملقط وغسلها مرتين طن (ابام) خليط من المضادات الحيوية مضاد فطري. في حالة من العيون كلها، وقطع القرنيات الخروج من الكرات مع مقص منحني. ترك ما لا يقل عن حافة الملتحمة 5 ملم وأيضا غسل القرنيات في ابام.
  2. إعداد هذا المزيج على وضعها في تقعر القرنية. وهو يتألف من المصل خالية الأساسية الدنيا والمتوسطة (MEM) التي تحتوي على ابام، 1 ملغ / مل العجل الجلد الكولاجين (مصنوعة من محلول المخزون من 10 ملغ / مل في حمض 0.1 N الخليك)، 1٪ أجار، والانسولين ترانسفيرين-سيلينات تكملة 7.
  3. الميكروويف هذا الخليط ليغلي لمدة التعقيم وحل أجار. قد يستغرق ما يصل إلى 1 دقيقة في كل شيء إلى حل. ترك غطاء أنبوب مفتوحة جزئيا لأن خليط تجاوزات بسهولة عندما يغلي. لهذا السبب، قد تكون هناك حاجة إلى عدة دورات المغلي، كل لمدة 10-15 ثانية. يبرد الخليط إلى 37-39 درجة مئوية.
  4. وضع القرنيات الجانب الظهارية عليها في العقيمة 60 ملم الأطباق. ملء تقعر القرنية مع ما يقرب من 0.5 مل من الخليط وصفها في 1.2. الخليط يتصلب على القرنيات داخل 2 دقيقة.
  5. وضع القرنيات الجانب آغار أسفل في أطباق العقيمة 60 ملم وإضافة المتوسطة كامل يحتوي على MEM مع ابام، والانسولين ترانسفيرين-سيلينات ملحق 7 (37 ° C) للحفاظ على مستواه تقريبا في حوف للثقافة واجهة الهواء السائل. حجم المتوسط ​​هو 7-8 مل لكل طبق.
  6. ضع الأطباق مع القرنيات إلى 5٪ CO 2 حاضنة مرطب مع وعاء الماء (بهذه الطريقة، يتم الاحتفاظ مستوى الرطوبة عند أو فوق 95٪) عند 35 درجة مئوية (درجة الحرارة العادية القرنية). إضافة 100 ميكرولتر المتوسطة (نقطتين) يوميا على البشرة لترطيب القرنية.
  7. مراقبة التشكل القرنية وبقاء الخلية الظهارية مجهريا تحت الضوء المرسل باستخدام المجهر معيار مع الهدف 4X. القيام بذلك مرة واحدة في اليوم.
  8. تغيير المتوسط ​​كل ثلاثة أيام. يمكن القرنيات يكون مثقف لمدة ثلاثة أسابيع على الأقل. للتجارب العلاج الجيني، والثقافة القرنيات لمدة 3-5 أيام، ثم transducه مع جينات الفائدة (4،1-4،4)، يترك لمدة 3-5 أيام آخر اعتمادا على التحوير وتخضع لبروتوكول التئام الجروح (2،1-2،4).

2. شفاء الجروح طلائي

ملاحظة: في القرنيات لمرضى السكري، والتنضير الظهارية عن طريق كشط لالميكانيكي ليس ممكنا لأن فصل الغشاء القاعدي الظهارية الهش في هذه العملية، وهو ما لا يحدث في القرنيات الطبيعية. وبالتالي، للحفاظ على القرنيات الطبيعية لمرضى السكري في ظل ظروف مماثلة من التئام الجروح، ويستخدم لإزالة الكيميائي للظهارة مع ن heptanol 19. هذا الإجراء يزيل الظهارة ولكن يترك خلف الغشاء القاعدي سليمة في كل من القرنيات الطبيعية لمرضى السكري.

  1. لأداء المركزي الظهارية التنضير 20، وضع 5 مم القرص ورق الترشيح غارقة في ن heptanol على السطح الأمامي القرنية المركزي لمدة 75 ثانية.
  2. إزالة عامل التصفية وغسل القرنيات في المتوسط ​​الكامل. ملء التقعر مع 0.5 مل أجار الكولاجينخليط والثقافة كما في 1.4. بعد التنضير، والخلايا الظهارية عادة ما تموت وتنصل من مخلفين وراءهم الغشاء القاعدي سليمة مجهريا 7.
  3. استخدام 8.5 مم أقراص لخلق الجروح الظهارية أكبر في التجارب مع العلاج الجيني الحوفي الوحيد. وهذا يضمن إشراك الخلايا الجذعية الحوفي في عملية الشفاء.
  4. مراقبة شفاء القرنية مجهريا. جعل الصور في 4X و10X كل يوم حتى تشفى الخلل الظهارية تماما. عملية الشفاء يمكن أن يستغرق 2-15 يوما حسب الدولة (عادي أو السكري) وحجم الجرح.
    ملاحظة: أثناء عملية الشفاء، ويلاحظ السوداء خلايا تشبه العنكبوت في طائرة التنسيق العليا. هذه الخلايا هي keratocytes انسجة أفكارك الذي مات بعد إزالة الظهارية 4. يتم تحديد الشفاء لتكون كاملة عندما تكون هذه الخلايا الميتة هي متضخمة من ظهارة الشفاء ولم تعد مرئية (الشكل 2، الشكل).
  5. بعد الشفاءالانتهاء، وقطع القرنيات في النصف تضمينها في أكتوبر مركب وعملية المناعي غير المباشر على أقسام ناظم البرد أو البقع الغربية 16،21.

3. عزل الخلايا الحوفي وصيانة الجذعية الثقافات التخصيب خلية

ملاحظة: إعداد الحوفي الخلية الأولية الظهارية الجذعية (LESC) الثقافات -enriched من الحافات القرنية والصلبة. الحافات القادمة من المتبرعين الأصحاء والتخلص منها بعد تلقي عمليات زرع القرنية من الجراحين التعاون في وسائط تخزين القرنية القياسية (على سبيل المثال، Optisol). خلاف ذلك، يمكن الحصول على الثقافات التخصيب LESC من الحافات رفعه من القرنيات كلها الطبيعية لمرضى السكري أو الكرات التي وردت من ندري في وسائط تخزين القرنية.

  1. إذا تم استخدام القرنيات كلها أو الكرات، أولا عزل المناطق الحوفي. للقيام بذلك، ضع القرنية على طبق من البلاستيك العقيمة مع الجانب الظهارية صعودا وإزالة المنطقة الوسطى مع منقب 9 ملم (التعميم سكين القرنية).تجاهل هذا الجزء المركزي. ثم استئصال منطقة الحوفي باستخدام منقب 13 مم وتجاهل الجزء الملتحمة الخارجي. لعزل الخلايا تستخدم حافة الحوفي مثل الخبز. قبل عزل الخلايا، وإزالة الخلايا البطانية والالتزام بقايا القزحية من الجانب الداخلي للقرنية مقابل ظهارة السطح مع مسحة القطن المعقم.
  2. عزل أوراق خلية الحوفي باستخدام العلاج dispase. احتضان كل حافة القرنية والصلبة مع 2.4 U / dispase مل الثاني في 1.5 مل القرنية المصل خالية المتوسطة (KSFM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة 22.
  3. تخفيف بلطف ورقة الحوفي الخلايا الظهارية قبالة حافة تشريح تحت المجهر ستيريو مع ملقط وفصل الخلايا في 1 مل من 0.25٪ التربسين - 0.02٪ محلول EDTA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. غسل الخلايا في 10 مل من المتوسط ​​(على سبيل المثال، Epilife) وبيليه لهم في 300 x ج في أعلى الجدول أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. عشر و resuspendخلايا الإلكترونية في مستنبت: متوسطة مع N2، B27 والمكملات نمو الخلايا الكيراتينية الإنسان، و 10 عاملا نانوغرام / مل نمو البشرة (EGF).
  6. البذور الخلايا في 3،000-5،000 خلية / مل في قوارير أو 60 ملم أطباق المغلفة مع خليط من البروتينات الغشاء القاعدي البشري بما في ذلك فبرونيكتين، النوع الرابع الكولاجين، و laminin (FCL)، في 0.5-1 ميكروغرام / سم 2، في KSFM متوسط.
  7. ثقافة الخلايا في ترطيب (95٪ أو أعلى نسبة الرطوبة) CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية حتى أنها تشكل الطبقات الوحيدة متموجة بشكل كامل. وهذا قد يستغرق 1-2 أسابيع.
    ملاحظة: تأكيد بانتظام هوية الخلية تلطيخ immunocytochemical إيجابي لعلامات LESC المفترضة بما في ذلك PAX6، الكيراتين (K) 14، K15، K17، وΔNp63α. وقد نشرت تفاصيل تلطيخ بما في ذلك الأجسام المضادة الأولية 8،16-18،22.
  8. لمرور الخلايا متموجة، تعاملهم مع حل 1 مل 0.05٪ التربسين (1: 5 التخفيف من الحل 0.25٪) لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة 5 مل فول الصويا آرحل ypsin المانع (10 ملغ / مل) المخفف 1: 4 في المتوسط، وأجهزة الطرد المركزي الخلايا كما في 3.5.
  9. يغسل بيليه خلية في 3 مل من فول الصويا المخفف حل مثبط التربسين. لوحة الخلايا على FCL المغلفة (انظر 3.7) أطباق أو الشرائح غرفة زجاجية في 2 × 10 4 خلية / مل.

4. تنبيغ الفيروسة الغدانية من القرنيات-الجهاز مثقف

ملاحظة: الغدية المؤتلف (AV) وتشمل AV-ناقلات (أي الجينات إدخال)، AV-cmet (مع جين فتح إطار القراءة التقى ج)، AV-shM10 (مع shRNA إلى MMP-10)، و AV-shCF ( مع shRNA إلى كاثبسين F). هم حذف E3-E1 / 5 نوع AV التعبير عن الجينات تحت سيطرة المروج الفيروس المضخم للخلايا في وقت مبكر كبير على الفور. يتم إنشاء فيروسات-AV cmet باستخدام ناقل AV الوسادة / CMV / V5-DEST 16. يتم إنشاء الفيروسات AV-shRNA مخصصة عن طريق استنساخ فرعي من تسلسل shRNA جنبا إلى جنب مع HH1 المروج وGFP العلامة تسلسل من ناقلات iLenti-EGFP إلى هوما النسخ المتماثل غير كفء (-E1 / -E3)ن نوع AV 5 الجينوم باستخدام الغدة-4 نظام التعبير 17.

  1. تنبيغ واحد القرنية-عضو مثقف من كل زوج مع AV-النواقل والقرنية آخر، مع AV الجين التعبير عن تحوير. استخدام AV-cmet في ،8-1،25 × 10 8 وحدات تشكيل لوحة (PFU) في القرنية في مستنبت لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية حفظ القرنيات تحت سطح المتوسط ​​في كل بئر من صحن 24 أيضا. استخدام الفيروسات AV-shRNA في 1-2 × 10 8 PFU في القرنية.
  2. استخدام الفيروسات لالتنبيغ في المتوسط ​​الكامل تستكمل مع 75 ميكروغرام / مل سترات السيلدينافيل. هذا كاشف ينشط النقل caveolin تسهيل امتصاص الفيروسي من الخلايا الظهارية 21. نظرا لنصف عمر قصير من فياغرا في المحاليل المائية، وإعادة إضافة نفس المبلغ إلى متوسطة 5/4 ساعة في وقت لاحق. العلاج القياسي هو لمدة 48 ساعة.
  3. نقل القرنيات لأطباق جديدة مع نهاية ملعقة العقيمة المستديرة والثقافة في وسيط وبدون AV الحفاظ على مستوى متوسط ​​في حوف. بعد الوظيفةitional 4-8 أيام في واجهة السائل الهواء، عملية القرنيات المعالجة AV لتحليلات مختلفة أو اختبار لالتئام الجروح الظهارية (انظر أعلاه). بشكل روتيني ترطيب القرنية خلال ثقافة بإضافة 100 ميكرولتر المتوسطة (نقطتين) على الجزء العلوي من القرنية.
  4. لتنبيغ من الخلايا الحوفي فقط، واحتضان الفيروسات مع القرنيات في واجهة الهواء السائل مع مستوى متوسط ​​في حوف، لتجنب تنبيغ ظهارة المركزية.

5. تنبيغ الفيروسة الغدانية من الخلايا مثقف الحوفي

  1. الحفاظ على الثقافات المخصب LESC في المتوسط ​​مع 10 نانوغرام / مل EGF (انظر 3.5) على الأطباق البلاستيكية المغلفة مع الخليط FCL عند 0.5 ميكروغرام / سم 2.
  2. تنبيغ الخلايا المستزرعة التي وصلت إلى 70-80٪ confluency مع AV إيواء الأخضر الفلورسنت جين البروتين (AV-GFP) أو shRNA-GFP في مجموعة من تعدد العدوى سارعت AV (وزارة الداخلية: 1-300 PFU / خلية) في المتوسط ​​مع 2 نانوغرام / مل EGF. أداء transductioن لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية في حجم الحد الأدنى (0.2 مل)، يليه 20 ساعة في 0.5 مل المتوسطة. ليست هناك حاجة للcaveolin فياغرا المنشط النقل لتنبيغ ثقافة الخلية.
  3. استخدام واحدة من الكواشف التالية التي تسهل AV ملزمة لسطح الخلية لتعزيز كفاءة AV التنبيغ: إما polycations (1 ميكروغرام / مل بولي-L-يسين أو 5 ميكروغرام / polybrene مل)، أو 6 ميكرولتر / مل التنبيغ الكاشف ( على سبيل المثال، ViraDuctin)، أو 20 ميكرولتر / مل محسن التنبيغ (على سبيل المثال، ibiBoost).
  4. بعد استبدال المتوسطة لواحد من دون مركبات، واحتضان الخلايا المزروعة لمدة 4 أيام، في ترطيب CO 2 الحاضنة وتقييم مستوى التعبير GFP باستخدام المجهر الفلورسنت المقلوب.
  5. استخدام الصفر التئام الجروح فحص لتقييم هجرة الخلايا في الثقافات transduced AV. تنمو الخلايا في الشرائح غرفة multiwell. جعل الجروح في أحادي الطبقة التي كتبها خدش الخلايا في الحركة الخطية على التوالي مع بي 200 ميكرولترpette طرف. بعد اصابة، تغيير المتوسطة للحصول على واحدة جديدة لإزالة خلايا منفصلة.
  6. تصوير الجروح كل يوم مع كاميرا رقمية تعلق على مجهر مقلوب في التكبير 4X. تسجيل الوقت الذي يكون فيه الشفاء الكامل (حواف الجرح تتلامس على طول الجرح بأكمله).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لقد أظهرنا سابقا أن في الثقافات الجهاز القرنية، والحفاظ على الاختلافات في التعبير عن علامات السكري (على سبيل المثال، بروتينات الغشاء القاعدي وα3β1 إنتغرين) والتئام الجروح بين القرنيات الطبيعية لمرضى السكري. تعرض هذا النظام الثقافة إلى العلاج الجيني التي تهدف إلى تطبيع مستويات من علامات المعدلة ومرض السكري، ج-MET، MMP-10، وكاثبسين F.

عندما تم transduced ظهارة القرنية بأكملها مع AV-cmet، أو AV-shRNA إلى MMP-10 أو كاتيبسين F (منفردة أو مجتمعة)، تم الانتهاء من التئام الجروح الظهارية بشكل أسرع (P <0.03 عن طريق إقران الطلاب ر اختبار مقارنة AV-ناقلات) مما كانت عليه في transduced AV-ناقلات زميل القرنيات من نفس الجهات المانحة 16،17. خفضت-cmet AV الوقت الشفاء بمقدار النصف، والتي لم تختلف كثيرا عن الشفاء من القرنيات الطبيعية (فيقوإعادة 1). كان AV-shM10 وAV-shCF تأثير أصغر. ومع ذلك، وهو مزيج من AV-cmet مع AV-shM10 وAV-shCF (كومبو) تنتج التأثير الأقوى تطبيع تماما الأوقات الشفاء الظهارية (الشكل 1). ورافق هذا الانخفاض في وقت الشفاء من أنماط طبيعية من السكري (الغشاء القاعدي وإنتغرين) ووقف علامات خلية في القرنيات لمرضى السكري 8،16،17.

الخلايا الجذعية الظهارية هي الجرح كبير الشفاء المشاركين (4). ولذلك، درسنا ما إذا كان العلاج الجيني الحوفي استهداف مقصورة الخلايا الجذعية سيكون مفيدا للقرنيات لمرضى السكري. ولهذه الغاية، تم transduced فقط الأجزاء الحوفي من القرنيات لمرضى السكري من قبل AV-cmet أو كومبو وكبيرة، تم إنشاؤها 8.5 الجروح ملم. وAV-cmet القرنيات transduced تلتئم أسرع بكثير (P <0.001 كتبها يقترن الطلاب ر اختبار) من AV-ناقلات transduced زميل القرنيات (الشكللدى عودتهم 2). أسفرت علاج كومبو بنفس النتيجة (18). ارتفع العلاج الجيني في التعبير عن علامات قمعها مرض السكري، مثل α3β1 إنتغرين والطابق السفلي مكون غشاء nidogen-1 (الشكل 3، أعمدة اليسار، كومبو). الأهم من ذلك، كما هو الحال في تنبيغ القرنية كله 8،17، أدى العلاج الجيني الحوفي سواء مع AV-cmet أو كومبو إلى زيادة ملحوظة التعبير عن علامات LESC المفترضة بما في ذلك K15 وΔNp63α، مقارنة القرنيات AV-ناقلات transduced (الشكل 3 والأعمدة الصحيحة، على حد سواء، التقى ج وكومبو). دعمت هذه البيانات دور تطبيع الخلايا الجذعية في التئام الجروح تسارع على العلاج الجيني من القرنيات لمرضى السكري وتظهر جدوى نهجنا لعلاج أمراض القرنية السكري.

بدأنا المقبل لدراسة آثار العلاج الجيني في الخلايا الظهارية الحوفي التخصيب LESC مثقف. الثقافاتمن الخلايا الظهارية الحوفي الطبيعية لمرضى السكري أنشئت والملون لعلامات LESC المفترضة. العديد من الخلايا الملون الإيجابي (الشكل 4). كانت كثافة تلطيخ في الثقافات السكري أضعف باستمرار مما كانت عليه في الثقافات العادية (K15 كما هو موضح في المثال في الشكل 4)، والتي كانت مشابهة جدا للوضع في السكري مقابل العادي خارج الحي القرنيات 8. هذه التجارب التأكد من صلاحيتها للزراعة الخلايا التي تم الحصول عليها باعتبارها مناسبة للعلاج الجيني.

وأظهرت التجارب الأولية مع خط الخلايا الظهارية القرنية-خلد التيلوميراز (انظر 23) أن الخلايا كانت transduced بسهولة من قبل بنيات AV المتاحة (لا تظهر البيانات هنا). ومع ذلك، أثبتت الثقافات الحوفي الأولية أن تكون أكثر حساسية لالحمل الفيروسي و / أو كاشف التنبيغ، مما يستلزم تعظيم الاستفادة من بروتوكول ترنسدوكأيشن. المثقف التنبيغ خلية الحوفي بواسطةوAV-GFP (الشكل 5) يتوقف على تعدد العدوى (وزارة الداخلية، مجموعة 30-300 PFU / خلية) مما أدى إلى مستوى عال نسبيا من التنبيغ في ارتفاع وزارة الداخلية (التعبير GFP في الخلايا> 80٪). ومع ذلك، كانت أعلى زارة الداخلية أيضا السامة، مما تسبب في موت الخلايا أو ضعف شديد الهجرة الخلية في جروح الصفر بعد 3-4 أيام من تنبيغ (الشكل 6). في أقل زارة الداخلية (10-30 PFU / خلية)، تنبيغ AV ينتج أقل أو أي تأثير السامة للخلايا، ولكن أدى إلى انخفاض عدد الخلايا معربا عن GFP (5-15٪).

حاولنا المقبل لتعزيز كفاءة تنبيغ دون المساس بقاء الخلية باستخدام الكواشف تعزيز التنبيغ التي تسهل عموما AV ملزمة لسطح الخلية. أظهروا تحسين كفاءة مختلفة في الحوفي تنبيغ الخلايا الظهارية التي AV في وزارة الداخلية 10-30. كلا polycations، بولي-L-ليسين، وpolybrene، كانت غير سامة والأكثر فعاليةمما أدى إلى 3-4 أضعاف في عدد الخلايا GFP إيجابية (الشكل 7، الصف العلوي). كان ibiBoost أيضا فعالة لكنها شديدة السمية قليلا، وكان ViraDuctin غير فعالة وبدلا سامة (الشكل 7، الصف السفلي). لذلك، polycations تقدم طريقة آمنة وفعالة لتعزيز الجين التعبير الفائدة على تنبيغ AV وينبغي أن تستخدم للتعبير عن الجينات وجرح التجارب الشفاء.

الشكل 1
الشكل 1: ج-الأرصاد تنبيغ الجينات يؤدي إلى انخفاض ملحوظ الجرح الظهارية القرنية الشفاء الوقت (يعني ± SEM). وعلاوة على ذلك، والعلاج الجيني مجتمعة (كومبو) مع الجينات التقى ج-AV إيواء وshRNAs إلى الجينات MMP-10 و F كاثبسين طبيعتها تماما الظهارية التئام الجروح الوقت. تأسست أهمية (قيم ص) من خلال إرفاقها الطلاب ر اختبار بالمقارنة مع respectiv العلاج الموجه ه. الحانات تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: شفاء من 8.5 ملم الجراح الظهارية في زوج من القرنيات لمرضى السكري. الصف العلوي،-transduced متجه القرنية. الشفاء الكامل في 8 أيام. الصف السفلي، AV-cmet transduced زميل القرنية. الشفاء الكامل في 5 أيام. وتشير السهام جرح (W) الحافة. *، غير تلتئم جزء (كما هو موضح أيضا في تضخم عالية كما أقحم)، مع keratocytes انسجة apoptosed على شكل العنكبوت. تكون مرئية حتى تنمو طبقة الطلائية على رأسها. بار = 50 ميكرون. المرحلة التباين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ove_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل (3)
الشكل (3): المناعية من أقسام القرنية لمرضى السكري لعلامات مختلفة بعد العلاج الجيني الحوفي. كلا AV-cmet والعلاجات كومبو يؤدي إلى زيادة ملحوظة تلطيخ الحوفي للعلامات السكري (إنتغرين α3β1 وnidogen-1) وعلامات الخلايا الجذعية المفترضة (K15 وΔNp63α). الأسهم على nidogen-1 لوحات علامة القرنية الغشاء القاعدي الظهارية. بار = 30 ميكرون. ه، ظهارة. الصورة، سدى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: تلطيخ Immunocytochemical الثقافات الظهارية الحوفي الأولية لالمفترض LESC علامة K15. الصف العلوي والثقافة العادية. معظم شو خلايا تلطيخ قوي ث عن K15. الصف السفلي والثقافة السكري. معظم الخلايا تظهر فقط تلطيخ ضعيفة. تم عرض لوحات اليمين مع counterstaining النووي دابي. تم تصويرها الخلايا الطبيعية لمرضى السكري مع الوقت التعرض نفسه. بار = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
ويعتمد مستوى GFP في التعبير في الخلايا الظهارية الحوفي transduced على وزارة الداخلية من AV-GFP: الرقم 5 (أ) 30 PFU / الخلية؛ (ب) 120 PFU / الخلية؛ (ج) 300 PFU / خلية في 3 أيام من تنبيغ. وتظهر الصور من الخلايا الحية. بار = 300 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل (6)
الشكل 6: يتأثر الهجرة خلية سلبا عن طريق زيادة تركيز مركبات كما يتضح من اختبار الصفر الجرح: (أ) السيطرة؛ (ب) 20 PFU / الخلية؛ (ج) 80 PFU / الخلية؛ (د) 120 PFU / الخلية. وتظهر الصور من الخلايا الحية. بار = 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7: الخلايا الظهارية الحوفي transduced مع AV-GFP في 30 PFU / الخلية. (أ) السيطرة؛ (ب) بولي-L-ليسين. (ج، د) ترنسدوكأيشن كاشف. 5 أيام من تنبيغ. تنبيغ الكاشف جaused تأثير السامة للخلايا كبير مما يؤدي إلى التقريب الخلية وفاة (د، النقيض من المرحلة). وتظهر الصور من الخلايا الحية. بار = 400 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تظهر القرنية لتكون الأنسجة مثالية للعلاج الجيني نظرا لموقعها سطحه حيث توصيل الجينات، وكذلك تقييم فعالية والآثار الجانبية، من السهل. ومع ذلك، فإن الترجمة السريرية لهذا النهج قوية لا تزال بطيئة بسبب المعلومات الشحيحة على الأسباب الوراثية لأمراض القرنية وأهداف العلاج الجيني 24. مضاعفات السكري بما في ذلك التعديلات القرنية قد تكون جينية إلى حد كبير في الطبيعة، وهو ما يترجم إلى ذاكرة التمثيل الغذائي 9. لهذا السبب، فإن الأنسجة السكري والخلايا الحفاظ على تشوهات من خارج الحي، ويمكن أن تدرس في الثقافة الجهاز والأنسجة. أيضا، مرض السكري يسبب تغيرات محددة في مستويات التعبير الجيني والأنماط التي يمكن تصحيحها عن طريق العلاج الجيني. لقد حددنا العديد من علامات تغيير في ظهارة القرنية السكري بما في ذلك مقصورة 5،6،8 الخلايا الجذعية، واستخدام الثقافات الجهاز القرنية البشرية 7،8 لتطبيع من قبلالعلاج الجيني التعبير علامة والظهارية التئام الجروح خطر في القرنية لمرضى السكري.

لقد اخترنا AV باعتبارها وسيلة توصيل الجينات بسبب التعبير القوي التحوير، والطبيعة غير دمج والخمسين، والانتقائية في الخلايا الظهارية، والتي هي الصفات متفوقة على تلك فيروس الغدة المرتبطة (AAV) 25. تنبيغ AV الثقافات الجهاز القرنية لديها العديد من الخطوات الحاسمة. وينبغي تسليم القرنيات إلى المختبر خلال 48 ساعة بعد الوفاة، لتقليل الخسائر من ظهارة التي تحدث أثناء التخزين. لزيادة امتصاص الفيروسي، فمن المهم أن نضيف التعزيز النقل caveolae، مثل فياغرا، خلال تنبيغ 21. عند التحقق من صحة تأثير التنبيغ على التعبير البروتين، فمن المستحسن استخدام العديد من علامات (الشكل 3)، كما لم يتم تحديد علامات الخلايا الجذعية محددة بشكل نهائي. عندما جعل الجروح الظهارية، هناك ضرورة لاستخدام تشيmical التنضير يرجع إلى هشاشة غشاء طلائي الطابق السفلي السكري مما أدى إلى انفصال لها خلال كشط اليدوي. وهناك حاجة إلى الرصد اليومي الدقيق للعملية الشفاء لمعايير موضوعية للشفاء، مثل اختفاء keratocytes تحت الظهارة القتلى من الرأي عندما ينمي ظهارة عليها (الشكل 2). أخيرا، بسبب بعض AV و / أو سمية GFP إلى الخلايا الحوفي الأولية، فمن المهم لخفض جرعة الفيروسية، في الوقت نفسه باستخدام التعزيز التنبيغ غير سامة، مثل polycations، لضمان التنبيغ فعالة وآمنة (الشكلان 5 - 7).

قد يتم تعديل نظام العلاج الجيني لاستخدام الحيوان القرنيات-عضو مثقف. فهي أرخص بكثير من الإنسان، ويمكن الحصول على كميات على أساس منتظم، ويمكن أن تكون مناسبة للفحص، على سبيل المثال، من المخدرات تحوير التئام الجروح. ومع ذلك، فإن القرنيات البشرية تتيح إمكانات محتملة أوسع للالدراسة بسبب وفرة من المواد الكيميائية، وخصوصا الأجسام المضادة. في حالة فحص المخدرات في القرنيات الحيوان غير مصاب بالسكري، ويمكن أن يتم في التنضير ميكانيكيا. إذا لم يعمل الجسم المضاد لعلامة معينة بشكل جيد في بعض القرنيات الإنسان، قد يكون راجعا إلى تقلب الفردية و / أو مدة المرض أو الشدة. في هذه الحالة، ودراسة علامات أخرى قد يكون الموصى بها. قدرة ن heptanol لإزالة الخلايا قد يقلل بشكل كبير مع مرور الوقت، وربما يعود ذلك إلى أكسدة أثناء التخزين. إذا حدث هذا، قد تحتاج إلى استخدام جديدة، مفتوحة سابقا، قارورة. إذا كان يعمل مع القرنيات البشرية باهظة الثمن، قد يكون حاول جولة ثانية من التنضير. فياغرا لديه نصف عمر قصير في المحاليل المائية. وبالتالي، فإنه يجب أن يكون مستعدا حديثا في كل مرة يتم تنفيذ التنبيغ القرنية. نجاح زراعة الخلايا الحوفي قد تعتمد على سن المتبرع. الخلايا من المانحين الأصغر سنا عادة ما تنمو على نحو أفضل. وقال وكيل علاج جين واحد قد لا يستخلص signifتأثير icant. في هذه الحالة، وهو مزيج من هذه العوامل قد يكون الأمثل 17. إذا أظهرت الخلايا القرنية الابتدائية علامات السمية، فمن المهم أن خفض الفيروسي وpolycation (على سبيل المثال، بولي-L-ليسين) الجرعات لتقليل التأثير السام مع الحفاظ على التنبيغ كفاءة.

على الرغم من الثقافات الجهاز السكري تتكاثر علامات كثيرة من هذا المرض والتعبير جين متغير، فهي المزالة التعصيب وتفتقر إلى إمدادات من الخلايا المناعية، والتي قد تؤثر على التئام الجروح والخلايا الجذعية. في هذا الصدد، أن تعرض على نماذج حيوانية بعض المزايا، على الرغم من أن الحيوانات لا تتكاثر الطيف الكامل من علامات المرض الإنسان. وجود أهداف العلاج الجيني الأخرى التي تطبيع بكفاءة القرنيات لمرضى السكري. مثال على مثل هذه الأهداف قد يكون الرنا الميكروي، وتحديدا، مير-146A أو مير-424 23. تركيبات من استخدام التعديلات الجين المستهدف مع تثبيط الرنا الميكروي محدد يحتمل أن ينتج تأثير مفيد أكثر قوة. عنوتإيه يتضمن الحد ضرورة حضانة طويلة نسبيا من القرنية مع مركبات تدار موضعيا (على سبيل المثال، في شكل قطرات العين) من أجل ضمان أقصى قدر من امتصاص الفيروسي. هذا قد يشكل مشكلة في العيادة، على الرغم من تسجيل الجفون يمكن أن تساعد في إطالة أمد الحضانة. استخدام تركيز منخفض من فياغرا في حل الفيروسي يمكن ان تسرع امتصاص مركبات. تأثير مركبات التنبيغ هو عابر، والتي قد تحد من إمكانات العلاجية في العلاج الجيني القائم على AV. على الرغم من أنها تستمر لفترة كافية لتصحيح السكري التئام الجروح التباطؤ، مستمرة تطبيع الخلايا الجذعية الظهارية قد تتطلب تأثير أطول أمدا، مثل التي تقدمها العلاج الجيني القائم على AAV 24. وتجدر الإشارة إلى أن المناعية كان يشكل عائقا خطيرا ناقلات AV مبكرة. ومع ذلك، من الجيل الجديد للمركبات المؤتلف بما في ذلك الفيروسات "جبان" أحرار إلى حد كبير من هذه الآثار الجانبية، وزيادة فرصهم في كونها translati قويةاونال المركبات العلاج الجيني 26.

جهري جزيء صغير من مختلف المسارات التي قد تكون مهمة لالتئام الجروح 16،17،21، وتستخدم 27-30 في النماذج التجريبية والعيادة. ومع ذلك، فإنها ليست موجهة إلى نوع خلية معينة، قد يكون لها تأثيرات مختلفة في خلايا مختلفة، ويمكن أن تعمل فقط على بعض جوانب هذا المرض القرنية السكري 31،32. ويقدم العلاج الجيني إمكانية لتغيير التعبير الجيني في الاتجاه المرغوب في خلايا معينة، وهو ما يتحقق في هذا العمل transducing الخلايا الظهارية باستخدام كل من overexpression الجين (ج-MET) وإسكات (MMP-10 و F كاثبسين). كما يسمح هذا النهج تحوير التعبير عن جينات محددة علامة المرض، واحدا تلو الآخر أو في مجموعات 5،6. وأظهرت تجاربنا أنه حتى في حالة الجمع بين ثلاثة الأسهم السعودية بإيواء مختلفة جهري التعبير الجيني، كل الجينات الثلاثة تأثرت كما هو متوقع، ووكان العلاج أكثر فعالية مما كانت عليه عندما تم استخدام كل AV وحدها 17.

في القرنية السكري الشديد مع العيوب الظهارية المستمرة أو الشفاء الظهارية غير مكتمل على استئصال الزجاجية أو الضوئي ليزر، بديلا للخلايا الجذعية الحوفي مختلة قد يكون بديلا للعلاج الجيني. في هذه الحالات، قد يتم زرع الخلايا الظهارية الحوفي مثقف وأفاض العلاج الجيني في المختبر على القرنيات المريضة. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن الخلايا الحوفي مثقف من القرنيات لمرضى السكري تظهر اختلافات مماثلة في الخلايا الجذعية التعبير علامة كما المجراة سابقا القرنيات مما يجعلها أهدافا جيدة للعلاج الجيني. ومع ذلك، يحتاج هذا العلاج إلى أن يكون الأمثل، نظرا لحساسية عالية من هذه الخلايا إلى الفيروسي الحمل وكاشف ترنسفكأيشن المستخدمة. كنا قادرين على إظهار أن الكواشف ترنسفكأيشن الموجبة ضمنت تسليم فعالة وآمنة مع التعبير عالية من الجين من الفائدة في ظهارة القرنية السكري مثقف. تالنتائج ذات المناظر قد يمهد الطريق أمام العلاج الجيني بنجاح في المختبر توسيع LESC لأغراض زرع في المستقبل في حالات اعتلال القرنية السكري الحاد. لأنه يرتبط نقص LESC وراثي وحصلت أيضا مع الحد من الأعصاب القرنية مشابهة لمرض السكري 33،34، وزرع صحية الثقافات المخصب LESC-على القرنيات المريضة يحتمل أن تخفف من الاعتلال العصبي السكري القرنية كذلك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
minimum essential medium Thermo Fisher Scientific 11095-080
Optisol-GS  Bausch & Lomb 50006-OPT
ABAM antibiotic-antimycotic mixture Thermo Fisher Scientific 15240062
calf skin collagen  Sigma-Aldrich  C9791
agar, tissue culture grade Sigma-Aldrich  A1296
n-heptanol Sigma-Aldrich  72954-5ML-F
O.C.T. compound  VWR International 25608-930
Dispase II  Roche Applied Science 4942078001
keratinocyte serum-free medium (KSFM)  Thermo Fisher Scientific 17005042
EpiLife medium with calcium Thermo Fisher Scientific MEPI500CA
N2 medium supplement, 100x Thermo Fisher Scientific 17502-048
B27 medium supplement, 50x Thermo Fisher Scientific 17504-044
human keratinocyte growth supplement, 100x Thermo Fisher Scientific S-001-5
trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
trypsin 0.25% with phenol red Thermo Fisher Scientific 15050065
soybean trypsin inhibitor  Sigma-Aldrich  T6414
fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140079
insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) Sigma-Aldrich  I3146-5ML
antibody to keratin 14 Santa Cruz Biotechnology sc-53253
antibody to keratin 15 Santa Cruz Biotechnology sc-47697
antibody to keratin 17 Santa Cruz Biotechnology SC-58726
antibody to ΔNp63α Santa Cruz Biotechnology sc-8609
antibody to PAX6 BioLegend PRB-278P-100
antibody to nidogen-1 R&D Systems MAB2570
antibody to integrin α3β1 EMD Millipore MAB1992
human fibronectin BD Biosciences 354008
human laminin Sigma-Aldrich  L4445
human type IV collagen Sigma-Aldrich  C6745-1ML
adenovirus expressing MMP-10 shRNA Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing cathepsin F shRNA Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing c-met OriGene (plasmid) SC323278
adenovirus expressing GFP KeraFAST FVQ002
sildenafil citrate, 25 mg Pfizer from pharmacy
epidermal growth factor  Thermo Fisher Scientific PHG0311
poly-L-lysine Sigma-Aldrich  P4707
polybrene Sigma-Aldrich  107689-10G
ViraDuctin Cell Biolabs AD-200
ibiBoost ibidi, Germany 50301
phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049
Corning round end spatula  Dow Corning 3005
60 mm Petri dishes Thermo Fisher Scientific 174888
Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides  Sigma-Aldrich C6807
200 μl pipet tips Bioexpress P-1233-200 other suppliers available
inverted microscope  Nikon Diaphot other suppliers/models available
humidified CO2 incubator  Thermo Fisher Scientific 370 (Steri-Cycle) other suppliers/models available
fluorescent microscope Olympus, Japan BX-40 other suppliers/models available
dissecting stereo microscope Leica, Germany S4 E other suppliers/models available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
  2. Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
  3. Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R. Corneal changes in diabetes mellitus. DOS Times. 20 (5), 55-58 (2015).
  4. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Prog Retin Eye Res. 49, 17-45 (2015).
  5. Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
  6. Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
  7. Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
  8. Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
  9. Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
  10. Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
  11. Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Exp Biol Med. 226 (7), 653-664 (2001).
  12. Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
  13. Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
  14. Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
  15. Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
  16. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  17. Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
  18. Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
  19. Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
  20. Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
  21. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  22. Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
  23. Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425 (2013).
  24. Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
  25. Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
  28. Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
  29. Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
  30. Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  31. Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
  32. Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
  33. Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
  34. Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 110، القرنية لمرضى السكري، والعلاج الجيني، اتش، MMP-10، F كاثبسين، ج-MET، خلية الحوفي الجذعية، الثقافة الجهاز، polycations، shRNA، التئام الجروح، وزراعة الخلايا
العلاج الجيني الفيروسة الغدانية لمرضى السكري اعتلال القرنية: التأثيرات على شفاء الجروح ووقف علامة الخلية التعبير في الإنسان القرنيات الجهاز مثقف والخلايا الظهارية الحوفي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kramerov, A. A., Saghizadeh, M.,… More

Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (110), e54058, doi:10.3791/54058 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter