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Developmental Biology

मधुमेह Keratopathy के लिए adenoviral जीन थेरेपी: घाव भरने पर प्रभाव और मानव अंग-सुसंस्कृत कॉर्निया और Limbal उपकला कोशिकाओं में स्टेम सेल मार्कर अभिव्यक्ति

Published: April 7, 2016 doi: 10.3791/54058
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Eye Program, Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Departments of Biomedical Sciences and Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Abstract

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मानव मधुमेह कॉर्निया में आणविक परिवर्तन का वर्णन है और प्रदर्शन कैसे वे अंग-सुसंस्कृत कॉर्निया में adenoviral जीन थेरेपी से क्रमशः समाप्त किया जा सकता है। मधुमेह रोग कार्निया कार्निया नसों और उपकला घाव भरने की लगातार असामान्यताओं के साथ मधुमेह के एक उलझन है। हम यह भी मानव मधुमेह कॉर्निया में कई ख्यात उपकला स्टेम सेल मार्कर की काफी बदल अभिव्यक्ति दस्तावेज है। इन परिवर्तनों को कम करने के लिए, adenoviral जीन थेरेपी सफलतापूर्वक सी मुलाकात आद्य ओंकोजीन अभिव्यक्ति की upregulation और / या proteinases मैट्रिक्स metalloproteinase-10 (एमएमपी 10) और cathepsin एफ इस थेरेपी डाउनरेगुलेशन का उपयोग कर लागू किया गया था मधुमेह कॉर्निया में घाव भरने त्वरित यहां तक ​​कि जब केवल limbal स्टेम सेल डिब्बे transduced किया गया था। सबसे अच्छा परिणाम संयुक्त उपचार के साथ प्राप्त किया गया। सामान्यीकृत स्टेम कोशिकाओं के संभावित मरीज प्रत्यारोपण के लिए, एक उदाहरण भी optimizati का प्रस्तुत किया हैpolycationic enhancers का उपयोग कर स्टेम सेल समृद्ध संस्कृतियों में जीन पारगमन की पर। यह दृष्टिकोण चयनित जीन के लिए बल्कि कार्निया उपकला घाव भरने के अन्य मध्यस्थों के लिए न केवल उपयोगी हो सकता है और सेल समारोह स्टेम सकता है।

Introduction

मधुमेह कार्निया रोग मुख्य रूप से अपक्षयी उपकला (keratopathy) और तंत्रिका (न्यूरोपैथी) परिवर्तन में परिणाम है। यह अक्सर उपकला घाव भरने और कार्निया तंत्रिका कमी 1-4 की असामान्यताओं से प्रकट होता है। एक अनुमान के अनुसार 60-70% मधुमेह रोगियों के विभिन्न कार्निया समस्याओं 1,3 है। हमारे अध्ययन सी मुलाकात आद्य ओंकोजीन (hepatocyte वृद्धि कारक रिसेप्टर) की डाउनरेगुलेशन सहित मानव मधुमेह कॉर्निया में बदल अभिव्यक्ति और मैट्रिक्स metalloproteinase-10 (एमएमपी 10) और cathepsin एफ 5, 6 की upregulation के साथ कई मार्कर प्रोटीन की पहचान की है। हम यह भी काफी दस्तावेज है मानव मधुमेह कॉर्निया में कई ख्यात उपकला स्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति की कमी हुई।

पिछले अध्ययनों में हम मानव मधुमेह कार्निया अंग संस्कृति प्रणाली है, जो धीमी गति से घाव भरने से पता चलता का उपयोग कर मधुमेह-बदल मार्कर के स्तर को सामान्य करने के लिए एक adenoviral आधारित जीन थेरेपी विकसित किया है, मधुमेहमार्कर परिवर्तन, और स्टेम सेल मार्कर अभिव्यक्ति कमी पूर्व vivo कॉर्निया 7.8 के समान है। परिवर्तन के इस हठ epigenetic चयापचय स्मृति 9 के अस्तित्व के कारण प्रतीत होता है। इस संस्कृति प्रणाली आगे जीन थेरेपी के लिए किया जाता था। इस थेरेपी के लिए लक्ष्य मधुमेह कॉर्निया (सी-मुलाकात आद्य ओंकोजीन), या वृद्धि की अभिव्यक्ति (एमएमपी 10 और cathepsin एफ) में या तो कम अभिव्यक्ति के साथ मार्कर से चुने गए हैं।

adenoviral (ए वी) चिकित्सा पूरे अंग-सुसंस्कृत कॉर्निया या corneoscleral परिधीय limbal ही डिब्बे में इस्तेमाल किया गया था। इस डिब्बे उपकला स्टेम कोशिकाओं कि कार्निया उपकला नवीनीकृत और सक्रिय रूप से घाव भरने 4,10-15 में भाग लेने के बंदरगाहों। इधर, प्रोटोकॉल सामान्य और मधुमेह मानव कॉर्निया अंग संस्कृति, उपकला घाव भरने, अलगाव और स्टेम सेल समृद्ध limbal सेल संस्कृतियों के लक्षण, और adenoviral सेल और कार्निया पारगमन के लिए प्रदान की जाती हैं। हमारीपरिणाम संभव भविष्य प्रत्यारोपण के लिए मधुमेह कॉर्निया में मार्कर अभिव्यक्ति और घाव भरने को सामान्य बनाने के लिए इस थेरेपी की व्यवहार्यता दिखा। उन्होंने यह भी सुझाव है कि संयोजन चिकित्सा मधुमेह कॉर्निया 16-18 में सामान्य मार्कर पैटर्न और उपकला चिकित्सा बहाल करने के लिए सबसे प्रभावी तरीका है।

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Protocol

राष्ट्रीय रोग अनुसंधान इंटरचेंज (एनडीआरआई, फिलाडेल्फिया, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) सहमति दे दी पोस्टमार्टम स्वस्थ और मधुमेह मानव आंखों के कॉर्निया और आपूर्ति की। एनडीआरआई के मानव ऊतक संग्रह प्रोटोकॉल प्रबंधकीय समिति और स्वास्थ्य निरीक्षण के राष्ट्रीय संस्थानों के अधीन द्वारा मंजूरी दे दी है। इस शोध को मंजूरी दे दी देवदारों सिनाई मेडिकल सेंटर संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) छूट दी गई प्रोटोकॉल पूर्व-1055 के तहत आयोजित किया गया है। कार्निया सर्जन सहयोग, डीआरएस। ई Maguen और वाई Rabinowitz, स्टेम सेल समृद्ध कार्निया उपकला संस्कृतियों के अलगाव के लिए त्यागने corneoscleral रिम्स की आपूर्ति की। इस शोध को मंजूरी दे दी आईआरबी प्रोटोकॉल Pro00019393 के तहत आयोजित किया गया है।

1. मानव कॉर्नियल अंग संस्कृति

नोट: सामान्य और मधुमेह कॉर्निया या पूरे आँखों ठंडा कार्निया भंडारण माध्यम में प्राप्त कर रहे हैं (जैसे, Optisol जी एस) के राष्ट्रीय आपूर्तिकर्ता एनडीआरआई से मौत के बाद 48 घंटे के भीतर।

  1. संदंश के साथ भंडारण कंटेनर से कॉर्निया निकालें और उन्हें मैं दो बार धोनेn एंटीबायोटिक कवकनाशी (ABAM) मिश्रण। पूरे आँखों के मामले में, घुमावदार कैंची के साथ ग्लोब से कॉर्निया में कटौती। कम से कम एक 5 मिमी conjunctival रिम छोड़ दो और भी ABAM में कॉर्निया धो लें।
  2. मिश्रण कार्निया नतोदरता में रखा जाना करने के लिए तैयार करें। यह सीरम मुक्त न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) युक्त ABAM, 1 मिलीग्राम / एमएल बछड़े की खाल (0.1 एन एसिटिक एसिड में 10 मिलीग्राम / एमएल के एक शेयर समाधान से बना) कोलेजन, 1% अगर, और इंसुलिन transferrin-Selenite के होते हैं पूरक 7।
  3. माइक्रोवेव नसबंदी और अगर विघटन के लिए उबलते के लिए इस मिश्रण। सब कुछ भंग करने के लिए यह 1 मिनट तक का समय लग सकता है। ट्यूब टोपी आंशिक रूप से खुला है, क्योंकि मिश्रण आसानी से overflows जब यह फोड़े छोड़ दें। इस कारण से, कई उबलते चक्र की जरूरत हो सकती है, प्रत्येक 10-15 सेकंड के लिए। 37-39 डिग्री सेल्सियस के लिए मिश्रण शांत हो जाओ।
  4. कॉर्निया नीचे उपकला पक्ष बाँझ 60 मिमी बर्तन में रखें। मिश्रण 1.2 में वर्णित के लगभग 0.5 मिलीलीटर के साथ कार्निया नतोदरता भरें।मिश्रण 2 मिनट के भीतर कॉर्निया पर solidifies।
  5. कॉर्निया बाँझ 60 मिमी बर्तन में नीचे रखें अगर पक्ष और पूर्ण मध्यम ABAM साथ सदस्य युक्त जोड़ने के लिए, और इंसुलिन transferrin-Selenite पूरक 7 (37 डिग्री सेल्सियस) हवा तरल इंटरफेस संस्कृति के लिए किनारी पर लगभग अपने स्तर पर रखने के लिए। मध्यम मात्रा पकवान प्रति 7-8 मिलीलीटर है।
  6. कॉर्निया के साथ बर्तन एक पानी पैन के साथ humidified एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखें 35 डिग्री सेल्सियस (सामान्य कार्निया तापमान) में (इस तरह, आर्द्रता स्तर पर या 95% से ऊपर रखा जाता है)। कॉर्निया गीला करना उपकला पर 100 μl मध्यम (दो बूँदें) दैनिक जोड़ें।
  7. कार्निया आकृति विज्ञान और उपकला सेल व्यवहार्यता microscopically प्रेषित प्रकाश के तहत एक 4X उद्देश्य के साथ एक मानक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मॉनिटर। एक दिन में एक बार तो करो।
  8. मध्यम बदलें हर तीन दिन। कॉर्निया में कम से कम तीन सप्ताह के लिए संवर्धित किया जा सकता है। जीन थेरेपी प्रयोगों के लिए, संस्कृति 3-5 दिनों के लिए कॉर्निया, तो transducब्याज (4.1-4.4) के जीन के साथ ई, transgene और घाव भरने प्रोटोकॉल (2.1-2.4) के अधीन के आधार पर एक और 3-5 दिनों के लिए छोड़ दें।

2. उपकला घाव भरने

नोट: मधुमेह कॉर्निया में, यांत्रिक scraping द्वारा उपकला क्षतशोधन क्योंकि नाजुक उपकला तहखाने झिल्ली प्रक्रिया है, जो सामान्य कॉर्निया में नहीं होता है में अलग है संभव नहीं है। इस प्रकार, घाव भरने की ऐसी ही परिस्थितियों में सामान्य और मधुमेह कॉर्निया रखने के लिए, एन heptanol साथ उपकला के रासायनिक हटाने 19 प्रयोग किया जाता है। यह प्रक्रिया उपकला निकालता है, लेकिन दोनों सामान्य और मधुमेह कॉर्निया में एक अक्षुण्ण तहखाने झिल्ली पीछे छोड़ देता है।

  1. केंद्रीय उपकला क्षतशोधन 20 को करने के लिए एक 5 मिमी फिल्टर पेपर डिस्क 75 सेकंड के लिए केंद्रीय कार्निया पूर्वकाल सतह पर एन-heptanol में भिगो दें।
  2. फिल्टर निकालें और पूर्ण माध्यम में कॉर्निया धो लें। 0.5 मिलीलीटर आगर-कोलेजन के साथ नतोदरता भरेंमिश्रण और 1.4 में के रूप में संस्कृति। क्षतशोधन के बाद, उपकला कोशिकाओं को आमतौर पर मर जाते हैं और microscopically बरकरार तहखाने झिल्ली 7 पीछे छोड़ने दूर स्लाव।
  3. केवल limbal जीन थेरेपी के साथ प्रयोगों में बड़ा उपकला घाव बनाने के लिए 8.5 मिमी डिस्क का प्रयोग करें। यह घाव भरने की प्रक्रिया में limbal स्टेम कोशिकाओं की भागीदारी सुनिश्चित करेगा।
  4. कार्निया चिकित्सा microscopically मॉनिटर। 4X और 10X पर तस्वीरों हर दिन बनाने के लिए जब तक उपकला दोष पूरी तरह से ठीक है। घाव भरने की प्रक्रिया राज्य (सामान्य या मधुमेह) और घाव आकार पर निर्भर करता है 2 से 15 दिनों से ले जा सकते हैं।
    नोट: चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान, काला मकड़ी जैसी कोशिकाओं शीर्ष फोकल हवाई जहाज़ पर मनाया जाता है। इन कोशिकाओं को apoptotic stromal keratocytes कि उपकला हटाने 4 के बाद निधन हो रहे हैं। चिकित्सा जब इन मृत कोशिकाओं चिकित्सा उपकला से ऊंचा हो गया हैं और लंबे समय तक नहीं दिखाई (चित्रा 2, इनसेट) कर रहे हैं पूरा होने के लिए निर्धारित किया जाता है।
  5. चिकित्सा के बादपूरा होने, आधे में कटौती कॉर्निया cryostat वर्गों पर अप्रत्यक्ष immunofluorescence के लिए या पश्चिमी blots 16,21 के लिए अक्टूबर यौगिक और इस प्रक्रिया में उन्हें एम्बेड।

3. Limbal प्रकोष्ठों और स्टेम सेल समृद्ध संस्कृतियों का रख-रखाव का अलगाव

नोट: corneoscleral रिम्स से प्राथमिक limbal उपकला स्टेम सेल (LESC) -enriched संस्कृतियों तैयार करें। रिम्स स्वस्थ दाताओं से आ रही है और त्याग के बाद कार्निया प्रत्यारोपण मानक कार्निया भंडारण माध्यम (जैसे, Optisol) में सहयोग सर्जन से प्राप्त कर रहे हैं। अन्यथा, LESC समृद्ध संस्कृतियों रिम्स सामान्य और मधुमेह पूरे कॉर्निया से excised से प्राप्त किया जा सकता है या कार्निया भंडारण माध्यम में एनडीआरआई से प्राप्त ग्लोब्स।

  1. पूरे कॉर्निया या ग्लोब इस्तेमाल कर रहे हैं, तो पहले limbal क्षेत्रों को अलग। ऐसा करने के लिए, ऊपर उपकला पक्ष के साथ एक बाँझ प्लास्टिक पकवान पर कॉर्निया जगह और एक 9 एमएम trephine (परिपत्र कार्निया चाकू) के साथ केंद्रीय क्षेत्र को हटा दें।इस मध्य भाग त्यागें। फिर एक 13 मिमी trephine का उपयोग कर limbal क्षेत्र आबकारी एवं बाहरी conjunctival हिस्सा त्यागें। अलग करने के लिए कोशिकाओं bagel-तरह limbal रिम का उपयोग करें। सेल अलगाव से पहले, एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ सतह उपकला के विपरीत कॉर्निया के भीतर की ओर से endothelial कोशिकाओं और आइरिस का पालन अवशेष को हटा दें।
  2. Dispase उपचार का उपयोग कर limbal सेल शीट अलग। 1.5 मिलीलीटर keratinocyte सीरम मुक्त मध्यम (KSFM) 2 घंटा 22 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक में 2.4 यू / एमएल Dispase द्वितीय के साथ प्रत्येक corneoscleral रिम सेते हैं।
  3. धीरे limbal उपकला कोशिका रिम बंद एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक संदंश के साथ चादर को कम करने और 0.25% trypsin के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को अलग कर देना - कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 0.02% EDTA समाधान।
  4. मध्यम (जैसे, Epilife) के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को धो लें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक टेबल टॉप अपकेंद्रित्र में 300 XG पर उन्हें गोली।
  5. resuspend वेंसंस्कृति के माध्यम से ई कोशिकाओं: एन 2, B27 और मानव keratinocyte विकास की आपूर्ति करता है, और 10 एनजी / एमएल epidermal वृद्धि कारक (EGF) के साथ मध्यम।
  6. , 3,000-5,000 कोशिकाओं / एमएल बोतल में या 60 मिमी बर्तन फ़ाइब्रोनेक्टिन, प्रकार चतुर्थ कोलेजन, और laminin (एफसीएल) सहित मानव तहखाने झिल्ली प्रोटीन का एक मिश्रण के साथ लेपित पर कोशिकाओं बीज 0.5-1 माइक्रोग्राम / 2 सेमी, KSFM में मध्यम।
  7. संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified (95% या अधिक आर्द्रता) सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं जब तक वे पूरी तरह से मिला हुआ monolayers के रूप में। यह 1-2 सप्ताह लग सकते हैं।
    नोट: नियमित रूप से Pax6, केरातिन (कश्मीर) 14, K15, K17, और ΔNp63α सहित ख्यात LESC मार्करों के लिए सकारात्मक immunocytochemical धुंधला द्वारा सेल पहचान की पुष्टि। प्राथमिक एंटीबॉडी सहित धुंधला विवरण 8,16-18,22 प्रकाशित किया गया है।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए: (0.25% समाधान के 5 कमजोर पड़ने 1) पारित होने मिला हुआ कोशिकाओं के लिए, उन्हें 1 मिलीलीटर 0.05% trypsin समाधान के साथ व्यवहार करते हैं। 5 मिलीलीटर सोयाबीन टीआर जोड़े3.5 में के रूप में 4 मध्यम में, और सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं: ypsin अवरोध समाधान (10 मिलीग्राम / मिलीग्राम) 1 पतला।
  9. पतला सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला समाधान के 3 मिलीलीटर में सेल गोली धो लें। 2 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल में एफसीएल-लेपित पर कोशिकाओं (3.7 देखें) बर्तन या कांच कक्ष स्लाइड प्लेट।

4. अंग-सुसंस्कृत कॉर्निया की adenoviral पारगमन

नोट: पुनः संयोजक एडिनोवायरस (ए वी) ए वी-वेक्टर (कोई जीन डाला), ए वी-cmet (सी-मुलाकात जीन खुला पढ़ने फ्रेम के साथ), (एमएमपी 10 shRNA के साथ) ए वी-shM10, और ए वी-shCF शामिल हैं ( shRNA के साथ एफ cathepsin के लिए)। वे E1 / E3 हटाए प्रकार 5 प्रमुख तत्काल जल्दी cytomegalovirus प्रमोटर के नियंत्रण के तहत जीन व्यक्त ए वी कर रहे हैं। ए वी-cmet वायरस ए वी वेक्टर पैड / सीएमवी / वी 5-गंतव्य 16 का उपयोग उत्पन्न कर रहे हैं। ए वी-shRNA वायरस कस्टम एक प्रतिकृति अक्षम (-E1 / -E3) हुमा में hH1 प्रमोटर और iLenti-EGFP वेक्टर से GFP टैग अनुक्रम के साथ shRNA दृश्यों के subcloning द्वारा उत्पन्न कर रहे हैंn ए वी प्रकार 5 जीनोम एडिनो 4 अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करते हुए 17।

  1. ए वी-वेक्टर और एक अन्य कॉर्निया के साथ प्रत्येक जोड़ी में से एक अंग-सुसंस्कृत कॉर्निया transduce, एक जीन अभिव्यक्ति का नियमन ए वी के साथ। ए वी-cmet कॉर्निया प्रति 0.8 1.25 x 10 8 पट्टिका के गठन इकाइयों (pfu) में 24 अच्छी तरह से पकवान के एक कुएं में प्रत्येक मध्यम सतह के नीचे कॉर्निया रखते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए संस्कृति के माध्यम में प्रयोग करें। कॉर्निया प्रति 1-2 एक्स 10 8 pfu पर ए वी-shRNA वायरस का प्रयोग करें।
  2. 75 माइक्रोग्राम / एमएल सिल्डेनाफिल साइट्रेट के साथ पूरक पूर्ण माध्यम में पारगमन के लिए वायरस का प्रयोग करें। यह अभिकर्मक उपकला कोशिकाओं 21 से वायरल तेज की सुविधा caveolin परिवहन को सक्रिय करता है। जलीय समाधान में सिल्डेनाफिल की कम आधा जीवन के कारण, एक ही राशि मध्यम 4-5 घंटा के बाद में फिर से जोड़ें। मानक उपचार 48 घंटे के लिए है।
  3. ए वी किनारी पर मध्यम स्तर रखने के बिना एक गोल अंत बाँझ रंग और मध्यम में संस्कृति के साथ नए व्यंजन को कॉर्निया स्थानांतरण। जोड़ने के बादitional तरल हवा इंटरफेस में 4-8 दिन, प्रक्रिया विभिन्न विश्लेषण या उपकला घाव भरने के लिए परीक्षण के लिए ए वी इलाज कॉर्निया (ऊपर देखें)। नियमित रूप से कॉर्निया की चोटी पर 100 μl मध्यम (दो बूँदें) जोड़कर संस्कृति के दौरान कॉर्निया गीला।
  4. केवल limbal कोशिकाओं के पारगमन के लिए, किनारी पर मध्यम स्तर के साथ हवा तरल इंटरफेस में कॉर्निया के साथ वायरस सेते हैं, केंद्रीय उपकला के पारगमन से बचने के लिए।

5. संवर्धित Limbal प्रकोष्ठों के adenoviral पारगमन

  1. LESC समृद्ध (3.5 देखें) 10 एनजी / एमएल EGF के साथ मध्यम में संस्कृतियों 0.5 माइक्रोग्राम / 2 सेमी में एफसीएल मिश्रण के साथ लेपित प्लास्टिक के बर्तन पर बनाए रखें।
  2. संवर्धित कोशिकाओं है कि हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन (ए वी GFP) या ए वी-तले संक्रमण की बहुलता की एक श्रेणी में shRNA-GFP (: ​​1-300 pfu / सेल MOI) को शरण देने ए वी के साथ 70-80% confluency तक पहुँच चुके transduce 2 एनजी / एमएल EGF के साथ मध्यम में। transductio प्रदर्शन करनाn एक न्यूनतम मात्रा (0.2 एमएल) के 0.5 मिलीलीटर माध्यम में 20 घंटा के द्वारा पीछा में 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए। caveolin परिवहन उत्प्रेरक सिल्डेनाफिल सेल संस्कृति पारगमन के लिए आवश्यक नहीं है।
  3. या तो polycations (1 माइक्रोग्राम / एमएल पाली एल लाइसिन या 5 माइक्रोग्राम / एमएल polybrene), या 6 μl / एमएल पारगमन अभिकर्मक (: निम्नलिखित अभिकर्मकों कि ए वी कोशिका की सतह के लिए बाध्य की सुविधा ए वी पारगमन दक्षता को बढ़ाने के लिए एक का उपयोग करें जैसे, ViraDuctin), या 20 μl / एमएल पारगमन बढ़ाने (जैसे, ibiBoost)।
  4. ए वी के बिना एक के लिए मध्यम जगह के बाद, humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर में, 4 दिनों के लिए संवर्धित कोशिकाओं सेते हैं और एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग GFP अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन।
  5. ए वी-transduced संस्कृतियों में सेल प्रवास का मूल्यांकन करने के लिए खरोंच, घाव भरने परख का प्रयोग करें। multiwell चैम्बर स्लाइड्स में कोशिकाओं को विकसित। एक 200 μl पीआई के साथ एक सीधे रेखीय गति में कोशिकाओं scratching द्वारा एक monolayer में घाव बनाओPette टिप। घायल करने के बाद, अलग कोशिकाओं को हटाने के लिए एक ताजा एक के लिए मध्यम बदल जाते हैं।
  6. एक डिजिटल 4X बढ़ाई एक औंधा माइक्रोस्कोप से जुड़ी कैमरा के साथ हर दिन घाव तस्वीर। समय का रिकार्ड जब चिकित्सा पूरा हो गया है (घाव किनारों पूरे घाव के साथ संपर्क में आते हैं)।

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Representative Results

हम पहले से पता चला है कि कार्निया अंग संस्कृतियों में, मधुमेह मार्कर (जैसे, तहखाने झिल्ली प्रोटीन और इंटीग्रिन α3β1) और सामान्य और मधुमेह के बीच कॉर्निया घाव भरने की अभिव्यक्ति में मतभेद संरक्षित कर रहे हैं। इस संस्कृति प्रणाली जीन मधुमेह-बदल मार्कर, सी-मेट, एमएमपी 10 के स्तर को सामान्य बनाने के उद्देश्य से चिकित्सा, और cathepsin एफ के अधीन था

जब पूरे कार्निया उपकला ए वी-cmet, या एमएमपी 10 या cathepsin एफ (अलग से या संयोजन में) करने के लिए ए वी-shRNA साथ transduced किया गया था, उपकला घाव भरने में काफी तेजी से पूरा किया गया (पी <0.03 बनती छात्र टी परीक्षण द्वारा की तुलना ए वी-वेक्टर) ए वी-वेक्टर transduced ही दानदाताओं 16,17 से साथी कॉर्निया की तुलना में। ए वी-cmet आधा है, जो काफी सामान्य कॉर्निया के उपचार से अलग नहीं किया था द्वारा चिकित्सा समय (figu कम होफिर से 1)। ए वी-shM10 और ए वी-shCF छोटे प्रभाव नहीं पड़ा। हालांकि, ए वी-shM10 और ए वी-shCF (कॉम्बो) के साथ ए वी-cmet का एक संयोजन पूरी तरह से उपकला चिकित्सा बार (चित्रा 1) सामान्य मजबूत प्रभाव का उत्पादन किया। समय के उपचार में यह कमी मधुमेह (तहखाने झिल्ली और इंटीग्रिन) की सामान्यीकृत पैटर्न के साथ गया था और मधुमेह कॉर्निया 8,16,17 में सेल मार्कर स्टेम।

उपकला स्टेम कोशिकाओं प्रमुख घाव भरने के प्रतिभागियों 4 हैं। इसलिए, हम जांच की है कि क्या limbal जीन थेरेपी स्टेम सेल डिब्बे को निशाना मधुमेह कॉर्निया के लिए फायदेमंद होगा। यह अंत करने के लिए, केवल मधुमेह कॉर्निया की limbal भागों ए वी-cmet या कॉम्बो और बड़े से transduced थे, 8.5 मिमी घाव बनाया गया था। ए वी-cmet transduced कॉर्निया काफी तेजी से चंगा (पी <0.001 बनती छात्र टी परीक्षण द्वारा) से ए वी-वेक्टर साथी कॉर्निया transduced (छविUre 2)। कॉम्बो उपचार एक ही परिणाम 18 में हुई। जीन थेरेपी ऐसे इंटीग्रिन α3β1 और तहखाने झिल्ली घटक nidogen -1 (चित्रा 3, बाएँ कॉलम, कॉम्बो) के रूप में मधुमेह से दबा मार्कर, अभिव्यक्ति की वृद्धि हुई है। महत्वपूर्ण बात है, पूरे कार्निया पारगमन 8,17 के रूप में, या तो ए वी-cmet या कॉम्बो के साथ limbal जीन थेरेपी K15 और ΔNp63α सहित ख्यात LESC मार्कर का एक उल्लेखनीय वृद्धि हुई अभिव्यक्ति के लिए ए वी-वेक्टर transduced कॉर्निया की तुलना में नेतृत्व, (चित्रा 3 , सही कॉलम, दोनों सी मुलाकात की और कॉम्बो)। इन आंकड़ों से मधुमेह कॉर्निया की जीन थेरेपी पर त्वरित घाव भरने में स्टेम सेल सामान्य बनाने की भूमिका का समर्थन किया और मधुमेह कार्निया रोग के उपचार के लिए हमारे दृष्टिकोण की व्यवहार्यता दिखा।

हम अगले सुसंस्कृत LESC समृद्ध limbal उपकला कोशिकाओं पर जीन थेरेपी प्रभाव की जांच करने के लिए शुरू कर दिया। संस्कृतियोंसामान्य और मधुमेह limbal उपकला कोशिकाओं की स्थापना की है और ख्यात LESC मार्करों के लिए दाग रहे थे। कई कोशिकाओं दाग सकारात्मक (चित्रा 4)। मधुमेह संस्कृतियों में धुंधला तीव्रता जो मधुमेह बनाम सामान्य पूर्व vivo कॉर्निया 8 में स्थिति के लिए बहुत इसी तरह की थी सामान्य संस्कृतियों (K15 चित्रा 4 में एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है), की तुलना में लगातार कमजोर हो गया था। इन प्रयोगों जीन थेरेपी के लिए उपयुक्त के रूप में प्राप्त सेल संस्कृतियों मान्य।

एक टेलोमिरेज-अमर कार्निया उपकला कोशिका लाइन के साथ प्रारंभिक प्रयोगों (23 देखें) (डेटा यहाँ नहीं दिखाया गया है) से पता चला है कि कोशिकाओं को आसानी से उपलब्ध ए वी निर्माणों द्वारा transduced थे। हालांकि, प्राथमिक limbal संस्कृतियों और अधिक वायरल लोड और / या पारगमन अभिकर्मक के प्रति संवेदनशील साबित हुई, पारगमन प्रोटोकॉल के अनुकूलन की जरूरत महसूस। द्वारा सुसंस्कृत limbal सेल पारगमनउच्च MOI (> 80% कोशिकाओं में GFP अभिव्यक्ति) पर पारगमन का एक काफी उच्च स्तर में जिसके परिणामस्वरूप, ए वी-GFP (चित्रा 5) संक्रमण की बहुलता (रेंज 30-300 pfu / सेल MOI) पर निर्भर करता था। हालांकि, उच्च MOI भी विषाक्त थे, पारगमन के 3-4 दिन (चित्रा 6) के बाद खरोंच घावों में कोशिका मृत्यु या गंभीर रूप से प्रभावित सेल प्रवास के कारण। कम MOI (10-30 pfu / सेल), ए वी पारगमन कम उत्पादित या कोई साइटोटोक्सिक प्रभाव है, लेकिन GFP व्यक्त कोशिकाओं (5-15%) की एक कम संख्या में हुई पर।

हम अगले पारगमन बढ़ाने अभिकर्मकों कि आम तौर पर ए वी कोशिका की सतह के लिए बाध्य की सुविधा का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता समझौता किए बिना पारगमन दक्षता को बढ़ावा देने का प्रयास किया। वे MOI 10-30 में ए वी द्वारा limbal उपकला सेल पारगमन में विभिन्न क्षमता में सुधार दिखाया। दोनों polycations, पाली एल लाइसिन, और polybrene, गैर विषैले थे और सबसे प्रभावीGFP पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या में 3-4 गुना वृद्धि हो जाती है (चित्रा 7, शीर्ष पंक्ति)। ibiBoost भी प्रभावी लेकिन थोड़ा विषाक्त हो गया था, और ViraDuctin अप्रभावी और नहीं बल्कि विषाक्त (चित्रा 7, नीचे पंक्ति) था। इसलिए, polycations सुरक्षित और कारगर तरीका ए वी पारगमन पर ब्याज अभिव्यक्ति की जीन को बढ़ावा देने की पेशकश करते हैं और जीन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए और चिकित्सा प्रयोगों घाव।

आकृति 1
चित्रा 1: सी-मेट जीन पारगमन काफी कार्निया उपकला घाव भरने के समय (मतलब ± SEM) में कमी आई हो जाती है। इसके अलावा, संयुक्त जीन थेरेपी (कॉम्बो) ए वी शरण सी मुलाकात जीन और shRNAs एमएमपी -10 और एफ cathepsin जीन के साथ पूरी तरह से उपकला घाव भरने के समय normalizes। महत्व (पी मान) respectiv के साथ तुलना में बनती टी परीक्षण छात्र द्वारा स्थापित किया गया था ई वेक्टर उपचार। सलाखों के मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: मधुमेह कॉर्निया की एक जोड़ी में 8.5 मिमी उपकला घावों के उपचार। शीर्ष पंक्ति, वेक्टर transduced कॉर्निया; चिकित्सा 8 दिन में पूरा हो गया है। नीचे पंक्ति, ए वी-cmet साथी कॉर्निया transduced; चिकित्सा 5 दिनों में पूरा हो गया है। तीर घाव (डब्ल्यू) में बढ़त दिखा। *, गैर-चंगा हिस्सा (इनसेट भी रूप में उच्च वृद्धि पर दिखाया गया है), मकड़ी के आकार का apoptosed stromal keratocytes के साथ। जब तक उपकला परत उनमें से शीर्ष पर बढ़ता वे दिखाई दे रहे हैं। बार = 50 माइक्रोन। चरण विपरीत। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ove_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्र तीन
चित्रा 3: limbal जीन थेरेपी के बाद विभिन्न मार्करों के लिए मधुमेह कार्निया वर्गों के immunostaining। दोनों ए वी-cmet और कॉम्बो उपचार मधुमेह मार्कर (इंटीग्रिन α3β1 और nidogen -1) और ख्यात स्टेम सेल मार्कर (K15 और ΔNp63α) के लिए उल्लेखनीय वृद्धि हुई limbal धुंधला में परिणाम। nidogen -1 पैनल पर तीर कार्निया उपकला तहखाने झिल्ली निशान। बार = 30 माइक्रोन। ई, उपकला; एस, स्ट्रोमा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: एक ख्यात LESC मार्कर K15 के लिए प्राथमिक limbal उपकला संस्कृतियों के Immunocytochemical धुंधला हो जाना। शीर्ष पंक्ति, सामान्य संस्कृति; सबसे कोशिकाओं थानेदारK15 के लिए W मजबूत धुंधला। नीचे पंक्ति, मधुमेह संस्कृति; सबसे कोशिकाओं केवल कमजोर धुंधला दिखाई देते हैं। सही पैनल DAPI परमाणु counterstaining के साथ प्रस्तुत कर रहे हैं। सामान्य और मधुमेह कोशिकाओं को एक ही जोखिम समय के साथ फोटो खींच रहे थे। बार = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: transduced limbal उपकला कोशिकाओं में GFP अभिव्यक्ति के स्तर पर ए वी-GFP के MOI पर निर्भर करता है: (क) 30 pfu / सेल; (ख) 120 pfu / सेल; (ग) पारगमन के 3 दिन में 300 pfu / सेल। जीवित कोशिकाओं के फोटोग्राफ दिखाए जाते हैं। बार = 300 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 6: सेल प्रवास पर प्रतिकूल बढ़ती ए वी की एकाग्रता के रूप में खरोंच घाव परीक्षण से पता चला है से प्रभावित है: (क) नियंत्रण; (ख) 20 pfu / सेल; (ग) 80 pfu / सेल; (घ) 120 pfu / सेल। जीवित कोशिकाओं के फोटोग्राफ दिखाए जाते हैं। बार = 500 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: Limbal उपकला 30 pfu / सेल में ए वी-GFP के साथ transduced कोशिकाओं। (क) नियंत्रण; (ख) पाली एल लाइसिन; (ग, घ) पारगमन अभिकर्मक; पारगमन के 5 दिनों के लिए। पारगमन अभिकर्मक गसेल गोलाई और मौत (घ, चरण विपरीत) के लिए अग्रणी एक महत्वपूर्ण साइटोटोक्सिक प्रभाव aused। जीवित कोशिकाओं के फोटोग्राफ दिखाए जाते हैं। बार = 400 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कॉर्निया इसकी सतह स्थान जहां जीन वितरण, साथ ही प्रभावकारिता और साइड इफेक्ट के मूल्यांकन, आसान कर रहे हैं के कारण जीन थेरेपी के लिए एक आदर्श ऊतक प्रतीत होता है। हालांकि, इस शक्तिशाली दृष्टिकोण का एक नैदानिक ​​अनुवाद अभी भी कार्निया रोगों के आनुवंशिक कारणों और जीन थेरेपी के ठिकानों पर 24 दुर्लभ जानकारी की वजह से धीमी है। कार्निया परिवर्तन सहित मधुमेह जटिलताओं प्रकृति है, जो चयापचय स्मृति 9 में तब्दील करने में काफी हद तक epigenetic हो सकता है। इस कारण से, मधुमेह ऊतकों और कोशिकाओं को अपनी असामान्यताएं पूर्व vivo के संरक्षण और अंग और टिशू कल्चर में अध्ययन किया जा सकता है। इसके अलावा, मधुमेह जीन अभिव्यक्ति के स्तर और पैटर्न है कि जीन थेरेपी से ठीक किया जा सकता है में विशिष्ट परिवर्तन का कारण बनता है। हम स्टेम सेल डिब्बे 5,6,8 सहित मधुमेह कार्निया उपकला में बदल कई मार्कर की पहचान की है, और उपयोग मानव कॉर्निया अंग संस्कृतियों 7.8 से सामान्य करने के लिएजीन थेरेपी मार्कर अभिव्यक्ति और उपकला घाव भरने मधुमेह कॉर्निया में समझौता।

हम अपनी मजबूत transgene अभिव्यक्ति, अपने गैर समेकित करने प्रकृति, और उपकला कोशिकाओं है, जो एडिनो से जुड़े वायरस (एएवी) 25 में से उन लोगों के लिए बेहतर गुण हैं के लिए अपने चयनात्मकता की वजह से जीन डिलीवरी वाहन के रूप में ए वी चुना है। कार्निया अंग संस्कृतियों के ए वी पारगमन कई महत्वपूर्ण कदम है। कॉर्निया उपकला है कि भंडारण के दौरान होता है के नुकसान को कम करने के लिए 48 घंटे के भीतर पोस्टमार्टम प्रयोगशाला के लिए दिया जाना चाहिए। वायरल तेज बढ़ाने के लिए, यह पारगमन 21 के दौरान इस तरह के रूप में सिल्डेनाफिल caveolae परिवहन बूस्टर, जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है। जब प्रोटीन अभिव्यक्ति पर पारगमन प्रभाव मान्य, कई मार्कर के उपयोग की सिफारिश की है (चित्रा 3) के रूप में विशिष्ट स्टेम सेल मार्कर निश्चित पहचान नहीं कर रहे हैं। जब उपकला घाव बना रही है, वहाँ चे का उपयोग करने की आवश्यकता हैmical मधुमेह उपकला तहखाने झिल्ली मैनुअल scraping के दौरान अपनी टुकड़ी में जिसके परिणामस्वरूप की कमजोरी के कारण क्षतशोधन। घाव भरने की प्रक्रिया के एक सावधान दैनिक निगरानी में इस तरह के दृश्य से मृत subepithelial keratocytes के लापता होने के रूप में चिकित्सा के उद्देश्य मानदंडों के साथ की जरूरत है जब उन पर उपकला (चित्रा 2) regrows है। अंत में, कारण कुछ ए वी और / या प्राथमिक limbal कोशिकाओं को GFP विषाक्तता के लिए, यह वायरल खुराक कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, एक ही समय में इस तरह के polycations के रूप में गैर विषैले पारगमन बूस्टर, का उपयोग करने पर है, कुशल और सुरक्षित पारगमन सुनिश्चित करने के लिए (आंकड़े 5 - 7)।

जीन थेरेपी प्रणाली पशु अंग-सुसंस्कृत कॉर्निया का उपयोग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। वे बहुत मानव की तुलना में सस्ता कर रहे हैं, एक नियमित आधार पर मात्रा में प्राप्त किया जा सकता है, और स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त हो सकता है, उदाहरण के लिए, घाव भरने का नियमन दवाओं की। बहरहाल, मानव कॉर्निया के लिए संभावित व्यापक संभावनाओं की पेशकशअभिकर्मकों, विशेष रूप से एंटीबॉडी की बहुतायत के कारण अध्ययन। गैर मधुमेह पशु कॉर्निया में दवा स्क्रीनिंग के मामले में, क्षतशोधन यंत्रवत् किया जा सकता है। एक निश्चित मार्कर के लिए एक एंटीबॉडी कुछ मानव कॉर्निया में अच्छी तरह से काम नहीं करता है, यह व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता और / या रोग अवधि या गंभीरता के कारण हो सकता है। इस मामले में, अन्य मार्करों की जांच की सिफारिश की जा सकती है। एन heptanol की क्षमता कोशिकाओं को हटाने के लिए काफी भंडारण के दौरान संभवतः ऑक्सीकरण के कारण समय के साथ कम हो सकती है। यदि ऐसा होता है, एक नया, पहले से बंद, शीशी में इस्तेमाल किया जा करने के लिए आवश्यकता हो सकती है। महंगा मानव कॉर्निया के साथ काम करते हैं, तो क्षतशोधन के दूसरे दौर का प्रयास किया जा सकता है। सिल्डेनाफिल जलीय समाधान में एक कम आधा जीवन है; इसलिए, यह हौसले से हर बार एक कार्निया पारगमन किया जाता है तैयार रहना चाहिए। limbal कोशिकाओं दाता की उम्र पर निर्भर हो सकता संवर्धन की सफलता; छोटे दानदाताओं से कोशिकाओं को आम तौर पर बेहतर हो जाना। एक एकल जीन थेरेपी एजेंट एक signif प्रकाश में लाना नहीं कर सकतेicant प्रभाव; इस मामले में, इस तरह के एजेंटों की एक संयोजन इष्टतम 17 हो सकती है। प्राथमिक कार्निया कोशिकाओं विषाक्तता के लक्षण दिखाने हैं, तो यह वायरल और polycation (जैसे, पाली एल लाइसिन) कम करने के लिए महत्वपूर्ण है जहरीले प्रभाव को कम करने के लिए, जबकि कुशल पारगमन संरक्षण खुराक।

हालांकि मधुमेह अंग संस्कृतियों रोग और बदल जीन अभिव्यक्ति के कई संकेत पुन: पेश, वे denervated हैं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की आपूर्ति, जो घाव भरने को प्रभावित और स्टेम सेल सकता है की कमी है। इस संबंध में, पशु मॉडल, कुछ लाभ प्रदान करते हैं, हालांकि जानवरों मानव रोग के संकेत का पूरा स्पेक्ट्रम पुन: पेश नहीं कर सकते हैं। अन्य जीन थेरेपी लक्ष्यों मौजूद है कि कुशलता से मधुमेह कॉर्निया मानक के अनुसार। इस तरह के लक्ष्यों का एक उदाहरण microRNA, विशेष रूप से, मीर-146a या मीर-424 23 हो सकती है। विशिष्ट microRNA के निषेध के साथ इस्तेमाल किया लक्ष्य जीन संशोधनों के संयोजन संभवतः एक अधिक शक्तिशाली लाभकारी प्रभाव उत्पादन हो सकता है। anothएर सीमा ताकि अधिक से अधिक वायरल तेज सुनिश्चित करने के लिए topically दिलाई ए वी (जैसे, आई ड्रॉप के रूप में) के साथ कॉर्निया की अपेक्षाकृत लंबी ऊष्मायन की आवश्यकता भी शामिल है। इस क्लिनिक में एक समस्या खड़ी हो सकती है, हालांकि पलकें टेप ऊष्मायन के समय को बढ़ाने में सहायता कर सकता है। वायरल समाधान में सिल्डेनाफिल की कम एकाग्रता का उपयोग ए वी तेज तेजी लाने सकता है। ए वी पारगमन प्रभाव है जो ए वी आधारित जीन थेरेपी की रोगनाशक क्षमता को सीमित कर सकता है क्षणिक है। हालांकि यह काफी लंबे समय से मधुमेह घाव भरने मंदी को दूर करने के लिए रहता है, जैसे एएवी आधारित जीन थेरेपी 24 द्वारा प्रदान की, उपकला स्टेम कोशिकाओं को सामान्य बनाने निरंतर एक लंबे समय तक टिकाऊ प्रभाव पड़ सकता है। यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि प्रतिरक्षाजनकता जल्दी ए वी वैक्टर के एक गंभीर खामी थी। हालांकि, नई पीढ़ी "gutless" वायरस सहित पुनः संयोजक ए वी इस पक्ष प्रभाव का काफी हद तक स्वतंत्र हैं, शक्तिशाली translati होने का उनकी संभावनाओं में वृद्धिonal जीन थेरेपी वाहन 26।

विभिन्न मार्ग है कि घाव भरने 16,17,21 के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है के छोटे अणु modulators, 27-30 प्रयोगात्मक मॉडल और क्लिनिक में किया जाता है। हालांकि, वे एक विशेष सेल प्रकार के लिए लक्षित नहीं कर रहे हैं, विभिन्न कक्षों में अलग अलग प्रभाव हो सकता है, और केवल मधुमेह कार्निया रोग 31,32 के कुछ पहलुओं पर कार्य कर सकते हैं। जीन थेरेपी विशिष्ट कोशिकाओं में एक वांछित दिशा है, जो हम इस काम में निपुण दोनों जीन overexpression (सी-एमईटी) और मुंह बंद (एमएमपी -10 और एफ cathepsin) का उपयोग उपकला कोशिकाओं transducing में जीन की अभिव्यक्ति को बदलने के लिए एक संभावना प्रदान करता है। यह दृष्टिकोण भी विशेष बीमारी मार्कर जीनों की अभिव्यक्ति, एक के बाद एक या संयोजन 5,6 में नियमन करने की अनुमति देता है। हमारे प्रयोगों से पता चला है कि यहां तक ​​कि विभिन्न जीन अभिव्यक्ति modulators शरण तीन AVs के संयोजन के मामले में, सभी तीन जीन प्रभावित हो रहे हैं जैसा कि उम्मीद थी, औरउपचार जब प्रत्येक ए वी अकेले 17 इस्तेमाल किया गया था की तुलना में अधिक कुशल था।

लगातार उपकला दोष या vitrectomy या लेजर फोटोकोगुलेशन पर अधूरा उपकला उपचार के साथ गंभीर मधुमेह keratopathy में, बेकार limbal स्टेम कोशिकाओं के एक प्रतिस्थापन जीन थेरेपी के लिए एक विकल्प हो सकता है। इन मामलों में, सुसंस्कृत और विस्तारित इन विट्रो में जीन थेरेपी पर limbal उपकला कोशिकाओं रोगग्रस्त कॉर्निया पर प्रत्यारोपित किया जा सकता है। हमारे डेटा है कि मधुमेह के कॉर्निया से सुसंस्कृत limbal कोशिकाओं उन्हें जीन थेरेपी के लिए अच्छा लक्ष्य बना रही पूर्व vivo कॉर्निया के रूप में स्टेम सेल मार्कर अभिव्यक्ति में इसी प्रकार के मतभेदों को दिखाते हैं। हालांकि, इस उपचार अनुकूलित किया जाना, इस्तेमाल किया वायरल लोड और अभिकर्मक अभिकर्मक के लिए ऐसी कोशिकाओं की उच्च संवेदनशीलता के कारण की जरूरत है। हम दिखाने के लिए कि cationic अभिकर्मक अभिकर्मकों सुसंस्कृत मधुमेह कार्निया उपकला में ब्याज की एक जीन की उच्च अभिव्यक्ति के साथ कुशल और सुरक्षित प्रसव सुनिश्चित किया सक्षम थे। टीhese परिणामों में इन विट्रो के सफल जीन थेरेपी गंभीर मधुमेह keratopathy के मामलों में भविष्य के प्रत्यारोपण के प्रयोजनों के लिए विस्तार किया LESC के लिए मार्ग प्रशस्त हो सकता है। क्योंकि वंशानुगत और अधिग्रहीत LESC कमी भी मधुमेह 33,34 के समान कार्निया नसों की कमी के साथ जुड़ा हुआ है, रोगग्रस्त कॉर्निया पर स्वस्थ LESC समृद्ध संस्कृतियों के प्रत्यारोपण संभवतः के रूप में अच्छी तरह से मधुमेह कार्निया न्यूरोपैथी को कम कर सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
minimum essential medium Thermo Fisher Scientific 11095-080
Optisol-GS  Bausch & Lomb 50006-OPT
ABAM antibiotic-antimycotic mixture Thermo Fisher Scientific 15240062
calf skin collagen  Sigma-Aldrich  C9791
agar, tissue culture grade Sigma-Aldrich  A1296
n-heptanol Sigma-Aldrich  72954-5ML-F
O.C.T. compound  VWR International 25608-930
Dispase II  Roche Applied Science 4942078001
keratinocyte serum-free medium (KSFM)  Thermo Fisher Scientific 17005042
EpiLife medium with calcium Thermo Fisher Scientific MEPI500CA
N2 medium supplement, 100x Thermo Fisher Scientific 17502-048
B27 medium supplement, 50x Thermo Fisher Scientific 17504-044
human keratinocyte growth supplement, 100x Thermo Fisher Scientific S-001-5
trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
trypsin 0.25% with phenol red Thermo Fisher Scientific 15050065
soybean trypsin inhibitor  Sigma-Aldrich  T6414
fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 26140079
insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) Sigma-Aldrich  I3146-5ML
antibody to keratin 14 Santa Cruz Biotechnology sc-53253
antibody to keratin 15 Santa Cruz Biotechnology sc-47697
antibody to keratin 17 Santa Cruz Biotechnology SC-58726
antibody to ΔNp63α Santa Cruz Biotechnology sc-8609
antibody to PAX6 BioLegend PRB-278P-100
antibody to nidogen-1 R&D Systems MAB2570
antibody to integrin α3β1 EMD Millipore MAB1992
human fibronectin BD Biosciences 354008
human laminin Sigma-Aldrich  L4445
human type IV collagen Sigma-Aldrich  C6745-1ML
adenovirus expressing MMP-10 shRNA Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing cathepsin F shRNA Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP Capital BioSciences custom made
adenovirus expressing c-met OriGene (plasmid) SC323278
adenovirus expressing GFP KeraFAST FVQ002
sildenafil citrate, 25 mg Pfizer from pharmacy
epidermal growth factor  Thermo Fisher Scientific PHG0311
poly-L-lysine Sigma-Aldrich  P4707
polybrene Sigma-Aldrich  107689-10G
ViraDuctin Cell Biolabs AD-200
ibiBoost ibidi, Germany 50301
phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049
Corning round end spatula  Dow Corning 3005
60 mm Petri dishes Thermo Fisher Scientific 174888
Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides  Sigma-Aldrich C6807
200 μl pipet tips Bioexpress P-1233-200 other suppliers available
inverted microscope  Nikon Diaphot other suppliers/models available
humidified CO2 incubator  Thermo Fisher Scientific 370 (Steri-Cycle) other suppliers/models available
fluorescent microscope Olympus, Japan BX-40 other suppliers/models available
dissecting stereo microscope Leica, Germany S4 E other suppliers/models available

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 110 मधुमेह कॉर्निया जीन थेरेपी adenovirus एमएमपी 10 cathepsin एफ सी-मेट limbal स्टेम सेल अंग संस्कृति polycations shRNA घाव भरने सेल संस्कृति
मधुमेह Keratopathy के लिए adenoviral जीन थेरेपी: घाव भरने पर प्रभाव और मानव अंग-सुसंस्कृत कॉर्निया और Limbal उपकला कोशिकाओं में स्टेम सेल मार्कर अभिव्यक्ति
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