Abstract
このプロトコルの目的は、ヒトの糖尿病角膜内の分子変化を説明し、それらが器官培養角膜にアデノウイルス遺伝子治療によって軽減することができる方法を示すことです。糖尿病性角膜疾患は、角膜神経と上皮創傷治癒の頻繁な異常を伴う糖尿病の合併症です。我々はまた、ヒトの糖尿病角膜内のいくつかの推定上皮幹細胞マーカーの有意な発現変化を報告しています。これらの変化を緩和するために、アデノウイルス遺伝子治療は、正常のc-Met癌原遺伝子発現のアップレギュレーションおよび/またはプロテイナーゼマトリックスメタロプロテイナーゼ10（MMP-10）およびカテプシンF.この治療のダウンレギュレーションを用いて実施されたが、糖尿病性角膜において創傷治癒を加速します唯一の輪部幹細胞区画を形質導入した場合であっても。最良の結果は、併用治療で得られました。正規化された幹細胞の可能性のある患者の移植のために、例もoptimizatiで提示されていますポリカチオン性増強剤を使用して幹細胞に富む培養物における遺伝子導入の上。このアプローチでは、選択された遺伝子についても、角膜上皮の創傷治癒の他のメディエーターのためだけでなく、有用であると細胞機能幹よいです。
Introduction
糖尿病性角膜疾患は、主に退行性上皮（角膜症）と神経（神経障害）の変化をもたらします。それは多くの場合、上皮創傷治癒および角膜神経削減1-4の異常によって明らかにされています。推定60から70パーセントの糖尿病患者は1,3、様々な角膜の問題を抱えています。我々の研究は、変化したのc-Metプロトオンコジーン（肝細胞増殖因子受容体）のダウンレギュレーションを含む、ヒトの糖尿病角膜における発現およびマトリックスメタロプロテイナーゼ10（MMP-10）およびカテプシンF 5,6の上方制御で複数のマーカータンパク質を同定しました。我々はまた、大幅に文書化されたヒトの糖尿病角膜にいくつかの推定上皮幹細胞マーカーの発現が低下しています。
以前の研究では、糖尿病、遅い創傷治癒を示し、ヒト糖尿病性角膜器官培養系を用いた糖尿病改変マーカーのレベルを正常化するために、アデノウイルスに基づく遺伝子治療を開発しましたマーカーの変更、およびex vivo角膜7,8と同様の細胞マーカー発現の減少を食い止めます。この変更の持続性は、エピジェネティックな代謝メモリ9の存在によるものと思われます。この培養系は、さらに、遺伝子治療のために使用しました。この治療のためのターゲットは、糖尿病性角膜における発現低下（ のc-Met癌原遺伝子）、または増加した発現（MMP-10およびカテプシンF）のいずれかでマーカーから選択されました。
アデノウイルス（AV）療法は、全器官培養角膜または唯一の強角膜周辺輪部の区画に使用しました。この区画は、角膜上皮を更新し、積極的に4,10-15創傷治癒に関与する上皮幹細胞を保有します。ここでは、プロトコルが正常及び糖尿病のヒト角膜臓器培養、上皮創傷治癒、幹細胞に富む輪部細胞培養物の単離および特徴付け、ならびにアデノウイルス、細胞および角膜形質導入するために提供されます。私たちの結果は、将来の移植のための糖尿病性角膜にマーカー発現および創傷治癒を正規化するため、この治療法の実現可能性を示しています。彼らはまた、併用療法は、糖尿病性角膜16-18通常マーカパターンと上皮の治癒を回復するための最も効果的な方法であることを示唆しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
国立疾病研究インターチェンジ（NDRI、フィラデルフィア、PA）は承諾し、死後の健康と糖尿病の人の目と角膜を供給する。 NDRIのヒト組織収集プロトコルは、経営委員会と健康の監督の国立研究所の対象によって承認されています。本研究では、承認されたシーダーズ・サイナイ医療センター施設内倫理委員会（IRB）免除プロトコルEX-1055の下で行われています。 、博士を角膜外科医のコラボレーション。 E. MaguenとY.ラビノビッツは、幹細胞に富む角膜上皮の文化を単離するための廃棄強角膜縁を供給する。本研究では、承認されたIRBプロトコルPro00019393の下で行われています。
1.ヒト角膜器官培養
注：正常および糖尿病性角膜または全体の目はチルド角膜の記憶媒体に受信されている（ 例えば 、のOptisol GS）国家サプライヤーNDRIから死後48時間以内。
- 鉗子で貯蔵容器からの角膜を削除し、私はそれを二度洗いnは抗生物質 - 抗真菌（ABAM）の混合物。全体の目の場合には、湾曲したハサミで地球儀から角膜を切り出しました。少なくとも5ミリメートル結膜縁を残し、またABAMで角膜を洗います。
- 角膜の凹部に配置する混合物を準備します。これはABAM、1ミリグラム/（0.1N酢酸中10mg / mlのストック溶液から作られた）mlのウシ皮膚コラーゲン、1％寒天、およびインスリン - トランスフェリン - 亜セレンを含有する無血清の最小必須培地（MEM）からなりますサプリメント7。
- マイクロ波殺菌および寒天溶解のために沸騰するまでこの混合物。すべてが溶解することは1分ほどかかる場合があります。それが沸騰したときに、混合物を簡単に溢れているため、部分的にオープンチューブキャップを残します。この理由のため、いくつかの沸騰サイクルは、10〜15秒毎に必要とされ得ます。 37-39℃に混合物を冷却。
- 滅菌60ミリメートル皿に角膜上皮側を下に置きます。 1.2に記載された混合物の約0.5ミリリットルと角膜の凹部を埋めます。ザ混合物を2分以内に角膜上で固化します。
- 気液界面培養のための輪部で約そのレベルを維持するために、滅菌60-mmディッシュにダウン角膜寒天側を置き、ABAMでMEMを含む完全培地を追加し、インスリン-トランスフェリン-セレンサプリメント7（37°C）。培地容積は、皿当たり7〜8ミリリットルです。
- 水パンと加湿5％CO 2インキュベーターに角膜と皿を置き、35℃（通常の角膜温度）で（この方法では、湿度レベルはで、または95％以上に維持されています）。角膜を湿らせるために上皮で毎日100μlの培地（2滴）を追加します。
- 4Xの目的とした標準的な顕微鏡を用いて、角膜の形態学および透過光下での顕微鏡で上皮細胞の生存率を監視します。一日一回行ってください。
- 3日ごとに培地を変更します。角膜は、少なくとも3週間培養することができます。 3-5日のための遺伝子治療実験のために、文化角膜、その後transduc金利（4.1から4.4）の遺伝子とeは、創傷治癒のプロトコル（2.1〜2.4）に導入遺伝子および対象に応じて別の3-5日に向けて出発します。
2.上皮創傷治癒
注意：脆弱な上皮基底膜は、通常の角膜では発生しないプロセスにデタッチされているため、糖尿病性角膜では、機械的スクレーピングによって上皮デブリードマンは現実的ではありません。従って、創傷治癒の同様の条件下で、正常および糖尿病角膜を維持するために、n型ヘプタノールで上皮の化学的除去は、19を使用します。この手順は、上皮を除去するが、両方の正常及び糖尿病性角膜中の無傷の基底膜が残ります。
- 中央上皮創面切除20を実行するために、75秒間の中央角膜前面のNヘプタノールに浸漬し、5mmの濾紙ディスクを置きます。
- フィルターを取り外して、完全培地中で角膜を洗います。寒天、コラーゲン0.5ミリリットルで凹部を埋めます1.4のような混合物と文化。デブリードマン後、上皮細胞は通常、死ぬ、顕微鏡無傷の基底膜7を残す剥がれ落ちます。
- 唯一の輪部遺伝子療法を用いた実験で、より大きな上皮の傷を作成するために、8.5ミリメートルのディスクを使用してください。これは、治癒過程における輪部幹細胞の関与を確保します。
- 微視的に角膜の治癒を監視します。上皮欠損が完全に治癒するまで毎日4X及び10Xで写真を作ります。治癒過程は、（正常または糖尿病）状態および創傷サイズに応じて2〜15日から取ることができます。
注：治癒過程の間、黒クモ状細胞は上部焦点面で観察されます。これらの細胞は、上皮除去4後に死亡したアポトーシス間質角膜実質です。治癒がこれらの死んだ細胞が治癒上皮によって生い茂っていないと見えなくなる（ 図2、挿入図）である場合に完了したと判断されました。 - 治癒した後、完了、半分に角膜を切るには、クリオスタット切片上またはウェスタンブロット16,21のための間接的免疫蛍光のために10月の化合物およびプロセスでそれらを埋め込 みます。
幹細胞に富む文化の輪部細胞およびメンテナンスの3分離
注：強角膜縁から、プライマリ輪部上皮幹細胞（LESC）に富んだ文化を準備します。リムは、健康なドナーから来ると角膜移植は、標準的な角膜記憶媒体（ 例えば 、のOptisol）におけるコラボレーション外科医から受信された後に廃棄されました。そうでなければ、LESC富化培養物は正常および糖尿病全体の角膜の切除縁から得ることができ、または角膜の記憶媒体にNDRIから受信地球儀。
- 全体の角膜や地球儀が使用されている場合は、最初の輪部領域を分離。これを行うには、上皮側を上にして滅菌プラスチックシャーレ上で角膜を配置し、9 mmのトレフィン（円形角膜ナイフ）で中央領域を削除します。この中央部分を破棄します。その後、13ミリメートルのトレパンを使用して、輪部ゾーンを切除し、外側結膜部分を破棄します。細胞を単離するには、ベーグルのような輪部のリムを使用しています。細胞の単離の前に、内皮細胞を除去し、滅菌綿棒で表面上皮に角膜反対の内側から虹彩の残党を接着します。
- ディスパーゼ処理を用いて輪部細胞シートを分離します。 II 1.5 mlの2.4 U / mlのディスパーゼで2時間22 37℃で10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したケラチノサイト無血清培地（KSFM）を各強角膜縁をインキュベートします。
- 穏やかに鉗子で解剖立体顕微鏡下リムオフ縁上皮細胞シートを容易にし、0.25％トリプシン1mlの細胞を解離する - 室温で30分間、0.02％EDTA溶液。
- 培地（ 例えば 、Epilife）10mlに細胞を洗浄し、室温で5分間、卓上遠心機で300×gで、それらをペレット化。
- 再懸濁番目培養培地中のE細胞：N2、B27及びヒトケラチノサイト成長補助剤を含む培地、および10ng / mLの上皮成長因子（EGF）。
- KSFM中、0.5μgの/ cm 2で、フィブロネクチン、IV型コラーゲン、及びラミニン（FCL）を含むヒト基底膜タンパク質の混合物でコーティングされたフラスコ中で3,000〜5,000細胞/ mlまたは60 mmディッシュで細胞を播種ミディアム。
- 培養は、37℃で加湿（95％以上の湿度）CO 2インキュベーター中の細胞は、彼らは完全にコンフルエントな単層を形成するまで。これは、1〜2週間かかる場合があります。
注：定期的にPAX6、ケラチン（K）14、K15、K17、およびΔNp63αを含む推定上LESCのマーカーに陽性免疫細胞化学染色によって細胞の同一性を確認します。一次抗体を含む染色詳細は8,16-18,22が公開されています。 - 37℃で10分間（0.25％溶液の5希釈1）通路にコンフルエント細胞を、1mlの0.05％トリプシン溶液でそれらを扱います。 5ミリリットルの大豆TRを追加します。培地4、及び3.5のように細胞を遠心分離：ypsinインヒビター溶液（10mg / ml）を1に希釈しました。
- 希釈された大豆トリプシンインヒビター溶液3mlで細胞ペレットを洗浄します。 FCLコート上プレートの細胞は、2×10 4細胞/ mlで皿またはガラスチャンバースライド（3.7を参照します）。
器官培養角膜の4アデノウイルス形質導入
注：組換えアデノウイルス（AV）は、AV-ベクター（何の遺伝子が挿入されていない）から（c-met遺伝子のオープンリーディングフレームを含む）、AV-のcMet、（MMP-10へのshRNAを含む）AV-shM10、およびAV-shCFを含みます（ shRNAを）Fカテプシンします。彼らは主要前初期サイトメガロウイルスプロモーターの制御下の遺伝子を発現するE1 / E3欠タイプ5 AVです。 AV-のcMetウイルスはAVベクターパッド/ CMV / V5-DEST 16を使用して生成されます 。 AV-shRNAのウイルスは、カスタム複製不能（-E1 / -E3）フーマーにiLenti-EGFPベクターからHH1プロモーターとGFPタグ配列と一緒にshRNA配列のサブクローニングによって生成されますアデノ4発現系17を用いて、n個のAV 5型ゲノム。
- 遺伝子発現調節AVで、AV-ベクトルと別の角膜との各ペアの1つの器官培養角膜を伝達します。 24ウェル皿のウェル中で各媒体表面の下に角膜を保ち、37℃で48時間培養液中に角膜あたり0.8×10 8〜1.25プラーク形成単位（pfu）でAV-のcMetを使用してください。角膜あたり1〜2×10 8 PFUでAV-shRNAのウイルスを使用してください。
- 75 / mlのクエン酸シルデナフィルを補充した完全培地中で形質導入のためのウイルスを使用してください。この試薬 は、上皮細胞21によるウイルスの取り込みを促進するカベオリン輸送を活性化させます。水溶液中でのシルデナフィルの短い半減期に、それ以降の媒体4-5時間に同じ量を再度追加します。標準治療は、48時間です。
- 角膜輪部で中レベルを維持するAVを含まない培地中でラウンド終了無菌スパチュラと文化と新しい皿に角膜を転送します。追加した後液体 - 空気界面におけるitional 4~8日、工程上皮創傷治癒のための様々な分析または試験するためのAV処置角膜（上記参照）。日常的に、角膜の上に100μlの培地（2滴）を添加して、培養中に角膜を湿ら。
- 唯一の輪部細胞の形質導入のために、中央の上皮の形質導入を回避するために、角膜輪部で中レベルでの気液界面での角膜でウイルスを培養します。
培養輪部細胞の5アデノウイルス形質導入
- / cm 2と0.5μgのでFCLの混合物でコーティングされたプラスチック皿に（3.5を参照）を10ng / mlのEGFを含む培地中でLESCに富んだ文化を維持します。
- AVは、感染の多重度の範囲で緑色蛍光タンパク質遺伝子（AV-GFP）またはAV-スクランブルのshRNA-GFPを保有して70から80パーセントの集密度に達した培養細胞（：1から300 PFU /細胞MOI）を伝達、2 ngの/ mlのEGFを含む培地インチtransductioを実行しますnは0.5ミリリットル培地中で20時間、続いて最小量（0.2ミリリットル）で37℃で4時間。カベオリン輸送活性剤シルデナフィルは、細胞培養の形質導入のために必要とされません。
- （ポリカチオン（1 / mlのポリ-L-リジンまたは5μg/ mlのポリブレン）、または6μL/ mlの形質導入試薬のいずれか：AV導入効率を高めるために、細胞表面に結合するAVを容易に以下の試薬のいずれかを使用し例えば 、ViraDuctin）、または20μL/ mlの形質導入増強剤（ 例えば 、ibiBoost）。
- AVずにいずれかの培地を交換した後、加湿CO 2インキュベーター中で、4日間培養した細胞をインキュベートし、倒立蛍光顕微鏡を用いてGFPの発現レベルを評価します。
- AV-形質導入培養物中の細胞の移動を評価するためにスクラッチ創傷治癒アッセイを使用してください。マルチウェルチャンバースライドに細胞を増殖させます。 200μlのPIでまっすぐな直線運動で細胞を掻くことにより、単層で傷を作りますpetteチップ。負傷した後、剥離した細胞を除去するために、新鮮な1のための媒体を変更します。
- 4Xの倍率で倒立顕微鏡に取り付けたデジタルカメラで毎日傷を撮影。治癒が完了したときに時間を記録する（創傷の縁は、全体の傷に沿って接触します）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
私たちは、角膜器官培養では、糖尿病のマーカーの発現の差（ 例えば 、基底膜タンパク質とインテグリンα3β1）および正常および糖尿病角膜の間の創傷治癒が保存されていることが以前に示されています。この培養系は、C-MET、MMP-10、およびカテプシンF.、糖尿病、改変されたマーカーのレベルを正常化することを目的とした遺伝子治療を行いました
全体角膜上皮がMMP-10またはカテプシンF（別々に、または組み合わせて）にAV-のcMet、またはAV-shRNAを形質導入した場合には、上皮創傷治癒がかなり短い時間で完了した（P <対応スチューデントt検定により0.03に比べて同じドナー16,17からAV-ベクター形質導入仲間角膜よりもAV-ベクトル）。 AV-のcMetが大幅に正常な角膜（Figuの治癒異ならなかった半分、によって治癒時間を減少しました）1再。 AV-shM10とAV-shCFが小さく効果がありました。しかし、AV-shM10とAV-shCF（コンボ）とAV-のcMetの組み合わせは、完全に上皮治癒時間（ 図1）を正規化する最強の効果を生じました。治癒時間の減少は、糖尿病（基底膜およびインテグリン）の正規化されたパターンを伴う糖尿病性角膜8,16,17における幹細胞マーカーました。
上皮幹細胞は、参加者4治癒主要な創傷です。したがって、我々は幹細胞区画を標的輪部の遺伝子治療は、糖尿病性角膜のために有益であろうかどうかを検討しました。この目的のために、糖尿病性角膜の唯一の縁の部分はAV-のcMetまたはコンボや大きなによって形質導入された、8.5ミリメートルの傷が作成されました。 （対応スチューデントt検定によりP <0.001）かなり速く治癒したAV-のcMet形質導入された角膜AV-ベクター形質導入された仲間の角膜よりも（ 図URE 2）。コンボ処理は同じ結果18が得られました。遺伝子治療は、このようなインテグリンα3β1と基底膜成分ニドジェン-1（ 図3、左列、コンボ）などの糖尿病抑制マーカーの発現を増加させました。重要なことは、全体の角膜伝達8,17のように、AV-のcMetまたはコンボのいずれかで輪部の遺伝子治療は、AV-ベクター形質導入された角膜（ 図3と比較すると、K15およびΔNp63αを含む推定上LESCマーカーの著しく増加した発現につながりました、右の列、両方のc-Metとコンボ）。これらのデータは、糖尿病性角膜の遺伝子治療時の創傷治癒の加速中の幹細胞の正常化の役割を支持し、糖尿病性角膜疾患の治療へのアプローチの実現可能性を示しています。
私たちは、次の培養LESCに富む輪部上皮細胞に遺伝子治療効果を検討し始めました。文化正常及び糖尿病の輪部上皮細胞を樹立したと推定されるLESCマーカーについて染色しました。多くの細胞染色陽性（ 図4）。糖尿病の培養物中の染色強度は、ex vivo正常な対糖尿病角膜8の状況と非常に類似していた通常の培養（ 図4の例として示したK15）、よりも一貫して弱かったです。これらの実験は、遺伝子治療に適したようにして得られた細胞培養物を確認しました。
テロメラーゼ不死化された角膜上皮細胞株を用いた予備実験では、（23を参照）（データはここに示していない）細胞を容易に入手可能なAV構築物によって形質導入されたことを示しました。しかし、主要な縁培養物を形質導入プロトコルの最適化を必要とする、はるかに敏感ウイルス負荷及び/又は形質導入試薬であることが判明しました。によって培養輪部細胞形質導入高MOI（> 80％の細胞におけるGFP発現）での形質導入のかなり高いレベルの結果、AV-GFP（ 図5）は 、感染の多重度（範囲30から300 PFU /細胞MOI）に依存しました。しかし、より高いMOIは、形質導入の3〜4日（ 図6）の後、スクラッチ傷に細胞死または重度障害の細胞遊走を引き起こし、また毒性でした。低いMOI（10-30 PFU /細胞）、より少ない生成AV伝達または細胞毒性作用ではなく、GFP発現細胞（5〜15％）数の減少をもたらしました。
我々は、次に、一般的に、細胞表面に結合するAVを容易に形質導入増強試薬を用いて細胞生存率を損なうことなく導入効率を向上しようとしました。彼らは、MOI 10月30日にAVによって輪部上皮細胞伝達において異なる効率の改善を示しました。両方のポリカチオン、ポリ-L-リジン、およびポリブレン、非毒性であり、最も効果的なGFP陽性細胞の数の3-4倍の増加を生じた （ 図7、上の列）。 ibiBoostも有効であるが、わずかに毒性であった、とViraDuctinは（ 図7、一番下の行）、無効とかなり毒性でした。従って、ポリカチオンは、AV伝達時に関心の発現遺伝子を高めるために安全かつ効率的な方法を提供し、遺伝子発現のために使用されるべきであり、治癒実験創傷。
図1： のc-Metの遺伝子導入が大幅に時間を（平均±SEM）治癒角膜上皮の創傷の減少につながります。また、MMP-10およびカテプシンF遺伝子へのc-met遺伝子とのshRNAを保有するAVと組み合わせた遺伝子治療（コンボ）が完全に治癒時間上皮創傷を正規化します。有意性（p値）をrespectivと比較して、対のスチューデントのt検定によって確立されました Eベクタートリートメント。バーは平均の標準誤差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：糖尿病性角膜のペアで8.5ミリメートルの上皮の創傷の治癒。一番上の行、ベクトル形質導入角膜;治癒は8日間で完了です。一番下の行は、AV-のcMetは仲間の角膜を形質導入しました。治癒は5日間で完了です。矢印は、傷（W）のエッジを示しています。 （また、挿入図のような高倍率で示す）*、非治癒した部分、クモ状のapoptosed間質性角膜実質を持ちます。上皮層は、それらの上に成長するまで、彼らは見ることができます。バー=50μmです。位相コントラスト。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：輪部遺伝子治療後の種々のマーカーのための糖尿病性角膜切片の免疫染色。 AV-のcMetとコンボの治療の両方が糖尿病マーカー（インテグリンα3β1とニドジェン-1）と推定される幹細胞マーカー（K15とΔNp63α）のため著しく増加輪部の染色をもたらします。ニドジェン-1の矢印パネルは、角膜上皮基底膜をマーク。バー=30μmです。電子、上皮;秒、間質。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：推定上LESCマーカーK15のための主要な輪部上皮培養物の免疫細胞化学染色。一番上の行、通常の培養;ほとんどの細胞の笙K15のためのワット強い染色。一番下の行、糖尿病の文化。ほとんどの細胞は弱い染色を示します。右側のパネルはDAPI核対比染色されています。正常及び糖尿病の細胞が同一の露光時間で撮影しました。バー=20μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：形質導入された輪部上皮細胞におけるGFP発現のレベルは、AV-GFPのMOIに依存する：（a）は、30 PFU /細胞; （B）120 PFU /細胞。 （c）の伝達の3日間で300 PFU /細胞。生細胞の写真が示されています。バー=300μmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：細胞遊走に悪影響引っかき傷試験によって明らかになったようにAVの濃度を増加させることによって影響される：（A）コントロール。 （B）20 PFU /細胞。 （C）80 PFU /細胞。 （D）120 PFU /細胞。生細胞の写真が示されています。バー=500μmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7：30 PFU /細胞でAV-GFPで形質導入輪部上皮細胞。 （a）の制御; （b）は、ポリ-L-リジン。 （C、D）導入試薬。形質導入の5日間。形質導入試薬C細胞丸めと死の（d、位相コントラスト）につながる重要な細胞毒性効果をaused。生細胞の写真が示されています。バー=400μmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
角膜が原因遺伝子送達、ならびに有効性および副作用の評価は、簡単で、その表面の場所に遺伝子治療のための理想的な組織であると思われます。しかし、この強力なアプローチの臨床翻訳はまだによる角膜疾患や遺伝子治療のターゲット24の遺伝的原因に乏しい情報に遅いです。角膜の変化を含む糖尿病の合併症は、代謝メモリ9に変換され、自然の中で主にエピジェネティックな場合があります。この理由のため、糖尿病患者の組織および細胞は、ex vivoでその異常を維持し、器官及び組織培養で研究することができます。また、糖尿病は、遺伝子治療によって補正することができる遺伝子の発現レベルおよびパターンの特定の変化を引き起こします。我々はによって正規化するヒト角膜器官培養7,8を幹細胞区画の5,6,8を含む糖尿病性角膜上皮に変更されたいくつかのマーカーを同定し、使用しています遺伝子治療マーカー発現および糖尿病角膜に妥協上皮創傷治癒。
私たちは、その強力な導入遺伝子発現、その非統合の性質、およびアデノ随伴ウイルス（AAV）25よりも優れた資質である上皮細胞、に対する選択性の遺伝子送達媒体としてのAVを選択しました。角膜器官培養のAV伝達には、いくつかの重要なステップがあります。角膜は、貯蔵中に発生する上皮の損失を最小限にするために、48時間の死後内実験室に送達されるべきです。ウイルスの取り込みを増加させるために、そのような形質導入21中シルデナフィルなどカベオラ輸送ブースターを追加することが重要です。タンパク質発現に対する導入効果を検証する際、特定の幹細胞マーカーが明確に識別されないように、いくつかのマーカーの使用は、（ 図3）をお勧めします。上皮の創傷を作るとき、CHEを使用する必要がありますマニュアルスクレイピングの間にその剥離が生じ、糖尿病上皮基底膜の脆弱性に起因するmicalデブリードマン。上皮がその上に再成長する際、治癒プロセスを慎重に毎日監視が（ 図2）このような観点から、死んだ上皮下角膜実質細胞の消失などの治癒の客観的な基準で必要とされています。プライマリ縁細胞へのいくつかのAVおよび/ またはGFP毒性のために、そのようなポリカチオンのような非毒性の伝達ブースターを使用して同時に、ウイルス量を低下させることが重要であるため、最終的に、効率的かつ安全な伝達を確実にする（ 図5 - 7）。
遺伝子治療システムは、動物の器官培養角膜を使用するように変更されてもよいです。それらは、通常の塩基の量で得ることができる、人間よりもはるかに安価であり、かつ創傷治癒調節薬の、 例えば 、スクリーニングのために適切であり得ます。しかし、人間の角膜はのための潜在的により広い可能性を提供します試薬、特に抗体の存在量による研究。非糖尿病の動物の角膜における薬物スクリーニングの場合には、創面切除は、機械的に行われてもよいです。特定のマーカーに対する抗体は、いくつかのヒトの角膜にうまく動作しない場合には、個体差および/または疾患の持続期間または重症度に起因し得ます。この場合には、他のマーカーを検査することは推奨されてもよいです。細胞を除去するためのn-ヘプタノールの能力が大幅におそらく保管中の酸化のために、時間の経過とともに低下することがあります。この問題が発生した場合は、新しい、以前は未開封、バイアルを使用する必要があるかもしれません。高価な人間の角膜を扱う場合は、デブリードマンの第二ラウンドが行われる場合があります。シルデナフィルは、水溶液中で短い半減期を有します。したがって、新たに角膜の伝達が行われるたびに調製しなければなりません。輪部細胞を培養の成功には、ドナーの年齢に依存し得ます。若いドナー由来の細胞は、通常、より良い成長します。単一の遺伝子治療剤は、signifを誘発しないことがありますicant効果;この場合には、このような薬剤の組み合わせは、最適17であってもよいです。一次角膜細胞毒性の兆候を示している場合、ウイルスおよびポリカチオン（ 例えば 、ポリ-L-リジン）を低くすることが重要である効率的な形質導入を維持しながら毒性効果を最小限にするために用量。
糖尿病の器官培養は、疾患の多くの徴候および遺伝子発現の変化を再現するが、それらは、創傷治癒に影響を及ぼし、幹細胞を得る、除神経され、免疫細胞の供給が不足しています。動物は、ヒト疾患の徴候の完全なスペクトルを再現していないが、この点において、動物モデルは、いくつかの利点を提供することができます。他の遺伝子治療の標的は、効率的に、糖尿病性角膜を正規化することが存在します。このような標的の例は、マイクロRNA、具体的には、のmiR-146A又はmiR-424 23とすることができます。特定のマイクロRNAの阻害に使用される標的遺伝子の修飾の組み合わせは、潜在的に、より強力な有益な効果をもたらすことができます。 Anothえー制限が最大のウイルスの取り込みを確実にするために、（点眼薬の形で、）局所的に投与AVと角膜の比較的長いインキュベーションの必要性を含んでいます。まぶたをテーピングするインキュベーションを延長するのに役立つ可能性が、これは、診療所での問題を引き起こす可能性があります。ウイルス液中のシルデナフィルの低濃度の使用は、AVの取り込みを加速することができます。 AV伝達効果がAVに基づく遺伝子治療の治癒の可能性を制限する可能性がある、一過性です。それは糖尿病性創傷治癒の減速を修正するのに十分長く続くものの、AAVに基づく遺伝子治療24によって提供されるような、より長く持続する効果が必要な場合があります上皮幹細胞の正常化を持続。免疫原性が早期AVベクターの重大な欠点であったことを言及すべきです。しかし、「ガットレス」ウイルスを含む新世代組換えAVは、この副作用の大部分は自由である強力translatiであることの彼らの見通しを増やしますonal遺伝子治療車26。
16,17,21創傷治癒のために重要であり得る種々の経路の小分子モジュレーターは、27〜30は、実験モデルおよび臨床において使用されています。しかしながら、それらは特定の細胞型に標的化されていない、異なるセルにおいて異なる効果を有することができ、唯一の糖尿病性角膜疾患31,32のいくつかの側面に作用することができます。遺伝子治療は、我々は、遺伝子の過剰発現（ のc-Met）とサイレンシング（MMP-10 およびカテプシンF）の両方を使用して上皮細胞を形質導入するこの作業で達成特定の細胞内で所望の方向に遺伝子発現を変更する可能性を提供しています。このアプローチは、一つずつ又は組み合わせ5,6における特定の疾患のマーカー遺伝子の発現を調節することができます。我々の実験は、予想通りであっても、異なる遺伝子発現調節を保有3のAVの組み合わせの場合には、すべての3つの遺伝子が影響を受けたことを示し、そして治療は、各AVは17単独で用いた場合よりも効率的でした。
持続性の上皮欠損、または硝子体切除またはレーザー光凝固の際に不完全な上皮の治癒を伴う重度の糖尿病性角膜症では、機能不全の輪部幹細胞の置換は、遺伝子治療の代替とすることができます。これらのケースでは、 インビトロでの遺伝子治療の際に培養および拡張縁上皮細胞は、病気の角膜に移植されてもよいです。我々のデータは、糖尿病性角膜から培養輪部細胞は、遺伝子治療のためにそれらを良好な標的を作製エキソビボ角膜などの幹細胞マーカーの発現の同様の違いを示すことを示しています。しかし、この処理は、使用されるウイルス量およびトランスフェクション試薬のような細胞の高い感受性のために、最適化する必要があります。私たちは、カチオン性トランスフェクション試薬を培養糖尿病角膜上皮における目的の遺伝子の高発現して効率的で安全な配送を確保することを示すことができました。 THESE結果は、in vitroでの成功、遺伝子治療に道を開くことが重度の糖尿病性角膜症の例で将来の移植目的のためにLESCを拡大しました。遺伝性および後天LESC欠乏症はまた、糖尿病33,34に類似の角膜神経の減少と関連しているので、病気の角膜への健康LESCに富んだ文化の移植は、潜在的にだけでなく、糖尿病性角膜神経障害を軽減することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
| antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
| adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
| epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
| 60 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μl pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
| inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
| humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
| fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
| dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |
References
- Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
- Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
- Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R. Corneal changes in diabetes mellitus. DOS Times. 20 (5), 55-58 (2015).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Prog Retin Eye Res. 49, 17-45 (2015).
- Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
- Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
- Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
- Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
- Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
- Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
- Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Exp Biol Med. 226 (7), 653-664 (2001).
- Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
- Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
- Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
- Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
- Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
- Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
- Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
- Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
- Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
- Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
- Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425 (2013).
- Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
- Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
- Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
- Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
- Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
- Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
- Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
- Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
- Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
- Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).
