Abstract
Målet med denne protokollen er å beskrive molekylære endringer i menneskelige diabetiske hornhinner og vise hvordan de kan lindres ved adenovirus genterapi i organ kultivert hornhinner. Den diabetiker hornhinnen sykdom er en komplikasjon av diabetes med hyppige abnormiteter i hornhinnen nerver og epitel sårtilheling. Vi har også dokumentert betydelig endret uttrykk for flere mulige epiteliale stamcellemarkører i menneskelige diabetiske hornhinner. For å avhjelpe disse endringene ble adenovirus genterapi implementert ved hjelp av oppregulering av c-met proto-onkogen ekspresjon og / eller nedregulering av proteinaser matriksmetalloproteinase-10 (MMP-10) og cathepsin F. Denne terapien akselerert sårheling hos diabetiske hornhinner selv når bare den limbale stamcellelinjen ble transdusert. De beste resultater ble oppnådd med kombinert behandling. For mulig pasienten transplantasjon av normaliserte stamceller, er et eksempel presenteres også av optimizatipå av genet transduksjon i stamcelle-anrikede kulturer ved hjelp av polykationiske enhancere. Denne tilnærmingen kan være nyttig ikke bare for de utvalgte gener, men også for de andre mediatorer av hornhinneepitel sårtilheling og stamcellefunksjon.
Introduction
Den diabetiske hornhinnen sykdom resulterer hovedsakelig i degenerative epitel (keratopathy) og nerve (nevropati) endringer. Det er ofte manifestert av de unormalt av epitel sårtilheling og hornhinnen nerve reduksjon 1-4. Anslagsvis 60-70% diabetikere har ulike hornhinneproblemer 1,3. Våre studier har identifisert flere markørproteiner med endret ekspresjon i humane diabetiske hornhinner herunder nedregulering av c-met proto-onkogen (hepatocytt-vekstfaktor-reseptor) og oppregulering av matriksmetalloproteinase-10 (MMP-10) og cathepsin F 5, 6. Vi har også dokumentert betydelig redusert uttrykk for flere mulige epiteliale stamcellemarkører i den menneskelige diabetiske hornhinner.
I de tidligere studiene har vi utviklet en adenoviral basert genterapi for å normalisere nivået av diabetes forandret markører under anvendelse av human diabetiker korneal organkultursystem, som viser langsom sårtilheling, diabetiskmarkør endringer, og stamcelle markør uttrykk reduksjon lik ex vivo hornhinner 7,8. Dette utholdenhet av endringer synes å være på grunn av eksistensen av epigenetisk metabolsk minne 9. Dette kultursystemet ble videre brukt for genterapi. Målene for denne behandlingen ble valgt fra markører med enten redusert uttrykk hos diabeteshornhinner (c-met proto-onkogen), eller økt uttrykk (MMP-10 og cathepsin F).
Den adenovirale (AV) terapi ble brukt i hele organ dyrket hornhinner eller corneoscleral omkrets limbale seksjonen kun. Dette rommet havner epiteliale stamceller som fornyer hornhinnen epitel og delta aktivt i sårheling 4,10-15. Her blir protokoller gitt for normal og diabetisk human korneal organkultur, epitelial sårheling, isolering og karakterisering av stamcelleanriket limbale cellekulturer, og adenoviral celle og hornhinnen transduksjon. VårResultatene viser gjennomførbarheten av denne behandlingen for å normalisere markør uttrykk og sårheling hos diabeteshornhinner for mulig fremtidig transplantasjon. De foreslår også at kombinasjonsterapi er den mest effektive måten å gjenopprette normal markør mønster og epitel helbredelse i diabetiker hornhinnen 16-18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
National Disease Forskning Interchange (NDRI, Philadelphia, Pennsylvania) levert samtykket obduksjons sunne og diabetiske menneskelige øyne og hornhinner. NDRI menneskelige vev samling protokollen er godkjent av ledelseskomiteen og underlagt National Institutes of Health forglemmelse. Denne forskningen har blitt gjennomført under godkjente Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board (IRB) unntatt protokollen EX-1055. Samarbeide hornhinnen kirurger, Drs. E. Magu og Y. Rabinowitz, som leveres forkast corneoscleral felger for isolering av stamcelle-beriket hornhinneepitelet kulturer. Denne forskningen har blitt gjennomført under godkjente IRB-protokollen Pro00019393.
1. Menneskelig Hornhinnen Organ Culture
Merk: Normal og diabetiske hornhinner eller hele øyne er mottatt i kjølt hornhinnen lagringsmedium (f.eks Optisol GS) innen 48 timer etter døden fra nasjonal leverandør NDRI.
- Fjern hornhinner fra oppbevaringsboksen med pinsett og vaske dem to ganger in antibiotika-antimycotic (ABAM) blanding. Ved hele øynene, kutt hornhinner ut fra globuser med buede saks. La det være minst 5 mm konjunktival rim og også vaske hornhinner i ABAM.
- Fremstille blandingen som skal plasseres i hornhinnen konkavitet. Den består av serumfritt minimum essensielt medium (MEM) inneholdende ABAM, 1 mg / ml kalveskinnkollagen (laget fra en stamløsning av 10 mg / ml i 0,1 N eddiksyre), 1% agar, og insulin-transferrin-selenitt supplere 7.
- Mikrobølgeovn denne blandingen til kokepunktet for sterilisering og agar oppløsning. Det kan ta opptil 1 min for alt å oppløse. La røret cap delvis åpen fordi blandingen flyter lett når det koker. Av denne grunn, kan flere sykluser med koke være nødvendig, for hver 10-15 sek. Avkjøl blandingen til 37-39 ° C.
- Plasser hornhinner epitel siden ned i sterile 60 mm retter. Fylle det corneale konkavitet med omtrent 0,5 ml av blandingen som er beskrevet i 1.2. Deblandingen stivner på hornhinner innen 2 min.
- Plasser hornhinner agar side ned i sterile 60-mm skåler og legge til den fullstendige medium inneholdende MEM med ABAM, og insulin-transferrin-selenitt supplement 7 (37 ° C) for å holde dens nivå omtrent ved limbus for luft-væske-grenseflate kultur. Mediet volum er 7-8 ml per parabolen.
- Plasser retter med hornhinner i en 5% CO 2 inkubator fuktet med vann pan (på denne måten, er fuktighetsnivået holdes på eller over 95%) ved 35 ° C (normal hornhinnen temperatur). Tilsett 100 mL medium (to dråper) daglig på epitelet å fukte hornhinner.
- Overvåk hornhinnen morfologi og epiteliale celleviabilitet mikroskopisk henhold overført lys ved hjelp av en standard mikroskop med en 4X mål. Gjør det en gang om dagen.
- Endre medium hver tredje dag. Hornhinner kan bli dyrket i minst tre uker. For genterapi eksperimenter, kultur hornhinner i 3-5 dager, deretter sensorer,e med gener av interesse (04.01 til 04.04), la stå i ytterligere 3-5 dager avhengig av transgenet og lagt sårtilheling protokollen (2,1-2,4).
2. Epitelial Wound Healing
Merk: I de diabetiske hornhinner, er ikke gjennomførbart epithelial debridement av mekanisk skraping fordi den skjøre epiteliale basalmembran er frittliggende i prosessen, noe som ikke skjer i normal hornhinner. Således, for å holde de normale og diabetiske hornhinner under lignende betingelser for sårheling, er kjemisk fjerning av epitel med n-heptanol som brukes 19. Denne fremgangsmåten fjerner epitelet, men etterlater en intakt basalmembran i både normale og diabetiske hornhinner.
- For å utføre sentrale epithelial debridement 20, plassere et filter papir plate 5 mm dynket i n-heptanol på den sentrale hornhinne fremre overflate for 75 sek.
- Fjern filter og vaske hornhinner i fullstendig medium. Fyll hulrommet med 0,5 ml agar-kollagenblandingen og kultur som i 1.4. Etter debridement, epitelcellene vanligvis dør og Slough off later mikroskopisk intakt basalmembran 7.
- Bruk 8,5 mm disker for å skape større epiteliale sår i forsøkene med bare limbale genterapi. Dette vil sikre involvering av limbale stamceller i helbredelsesprosessen.
- Overvåk hornhinnen healing mikroskopisk. Gjør fotografiene på 4X og 10X hver dag frem til epiteldefekt er helt leget. Helbredelsesprosessen kan ta fra to til 15 dager, avhengig av tilstand (normal eller diabetiker) og såret størrelse.
Merk: Under helbredelsesprosessen, er svart edderkopp-lignende celler observert på toppen fokusplanet. Disse cellene er apoptotiske stromal keratocytter som døde etter epitel fjerning fire. Helbredelsen er fast bestemt på å være komplett når disse døde cellene er overgrodd av healing epitel og er ikke lenger synlig (figur 2, innfelt). - etter healingferdigstillelse, kutte hornhinner i to, legge dem i oktober sammensatte og prosess for indirekte immunfluorescens på kryostatsnitt eller for vestlige blotter 16,21.
3. Isolering av limbale celler og vedlikehold av stamcelle-beriket kulturer
Merk: Klargjør primære limbale epithelial stamcelle (LESC) anrikede kulturer fra corneoscleral felger. Felgene kommer fra friske donorer og kasserte etter hornhinnetransplantasjoner er mottatt fra de samarbeidende kirurger i standard hornhinnen lagringsmedium (f.eks Optisol). Ellers kan de LESC-beriket kulturer fås fra felgene skåret ut fra normale og diabetiske hele hornhinner eller globuser mottatt fra NDRI i hornhinnen lagringsmedium.
- Hvis hele hornhinner eller globuser brukes, først isolere limbale områder. For å gjøre dette, plasserer hornhinnen på en steril plast tallerken med epitelial side opp og fjerne det sentrale området med en 9-mm trephine (sirkulær hornhinnen kniv).Kast denne sentrale delen. Deretter eksisere limbale sonen ved hjelp av en 13 mm trephine og kast den ytre konjunktival del. Å isolere cellene bruke bagel-lignende limbale rim. Før celleisolasjon, fjerne endotelceller og fester seg rester av iris fra innersiden av hornhinnen motsatt til den flate epitel med en steril bomullspinne.
- Isoler limbale celle ark ved hjelp dispase behandling. Inkuber hver corneoscleral krans med 2,4 U / ml dispase II i 1,5 ml keratinocytt serumfritt medium (KSFM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i 2 timer 22.
- Forsiktig lette limbale epiteliale cellefolien av felgen under et disseksjonsmikroskop stereomikroskop med en tang og dissosiere cellene i 1 ml av 0,25% trypsin - 0,02% EDTA-løsning i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask cellene i 10 ml medium (f.eks Epilife) og pelletere dem ved 300 xg i en bordsentrifuge i 5 minutter ved romtemperatur.
- resuspender the celler i kulturmedium: medium med N2, B27 og humane keratinocytt veksttilskudd, og 10 ng / ml epidermal vekstfaktor (EGF).
- Seed cellene ved 3,000-5,000 celler / ml i kolber eller 60 mm skåler belagt med en blanding av human basalmembranproteiner, inkludert fibronektin, kollagen type IV, og laminin (FCL), på 0,5-1 ug / cm2, i KSFM medium.
- Kultur ble cellene i en fuktet (95% eller høyere luftfuktighet) CO 2 inkubator ved 37 ° C inntil de danner fullt sammenflytende monolag. Dette kan ta 1-2 uker.
Merk: Regelmessig bekrefte cellen identitet ved positiv immunocytokjemisk farging for mulige LESC markører inkludert Pax6, keratin (K) 14, K15, K17, og ΔNp63α. De farge detaljer, inkludert de primære antistoffer har blitt publisert 8,16-18,22. - Til passasje av konfluente celler, behandle dem med 1 ml 0,05% trypsin-løsning (1: 5 fortynning av 0,25% løsning) i 10 minutter ved 37 ° C. Tilsett 5 ml soya trypsin inhibitor oppløsning (10 mg / ml) fortynnet 1: 4 i medium, og sentrifuger cellene som i 3.5.
- Vask cellepelleten i 3 ml fortynnet soyabønnetrypsininhibitor løsning. Plate cellene bort på FCL-belagt (se 3.7) retter eller glass kammer lysbilder på 2 x 10 4 celler / ml.
4. Adenoviral Transduksjon av organ kultivert hornhinner
Merk: rekombinante adenovirus (AV) og består av AV-vektor (ingen gen), AV-cmet (med c-met-genet åpne leserammen), AV-shM10 (med shRNA til MMP-10), og AV-shCF ( med shRNA til cathepsin F). De er E1 / E3-slettet type 5 AV ekspresjon av gener under kontroll av den større umiddelbare tidlige cytomegalovirus-promotor. AV-cmet virus blir generert ved hjelp av AV-vektor PAD / CMV / V5-dest 16. AV-shRNA virus er tilpasset generert av subkloning av shRNA sekvenser sammen med HH1 promoter og GFP tag sekvens fra iLenti-EGFP vektor inn i en replikering-inkompetent (-E1 / -E3) Human AV type 5 genom hjelp Adeno-fire uttrykk system 17.
- Transduce en organ kultivert hornhinnen av hvert par med AV-vektoren og en annen hornhinnen, med en genekspresjon-moduler AV. Bruke AV-cmet på 0,8 til 1,25 x 10 8 plaque-dannende enheter (pfu) pr hornhinnen i kulturmedium i 48 timer ved 37 ° C å holde hornhinner under medieoverflaten hver i en brønn av en 24-brønners skål. Bruk AV-shRNA virus på 1-2 x 10 8 pfu per hornhinnen.
- Bruk virus for transduksjon i fullstendig medium supplementert med 75 ug / ml sildenafil citrat. Denne reagensen aktiverer caveolin transport tilrettelegging viral opptak av epitelcellene 21. På grunn av kort halveringstid av sildenafil i vandige løsninger, re-legge til samme beløp til medium 4-5 timer senere. Standard behandling er i 48 timer.
- Overfør hornhinner til nye retter med en runde enden steril spatel og kultur i medium uten AV holde middels nivå ved limbus. Etter tilleggetitional 4-8 dager på væskeluftgrensesnitt, behandler AV-behandlet hornhinner for ulike analyser eller test for epitel sårtilheling (se ovenfor). Rutinemessig fukte hornhinner i løpet av kulturen ved å tilsette 100 mL medium (to dråper) på toppen av hornhinnen.
- For transduksjon av bare de limbale celler, inkuberes de virus med hornhinner på luft-væske-grensesnittet med middels nivå ved limbus, for å unngå transduksjon av den sentrale epitel.
5. Adenoviral Transduksjon av Cultured limbale Cells
- Opprettholde LESC-anrikede kulturer i medium med 10 ng / ml EGF (se 3.5) på plastskåler belagt med det FCL blandingen ved 0,5 ug / cm2.
- Transduce dyrkede celler som har nådd 70-80% konfluens med AV skjuler det grønne fluorescente protein gen (AV-GFP) eller AV-egge shRNA-GFP i en rekke infeksjonsmultiplisitet (MOI: 1 til 300 pfu / celle) i mellom med 2 ng / ml EGF. Utfør transduction i 4 timer ved 37 ° C i et minimalt volum (0,2 ml) etterfulgt av 20 timer i 0,5 ml medium. Den caveolin transport aktivator sildenafil er ikke nødvendig for cellekulturoverføring.
- Bruke en av de følgende reagenser som letter AV binding til celleoverflaten for å forbedre AV transduksjon effektivitet: enten polykationer (1 pg / ml poly-L-lysin eller 5 pg / ml polybren), eller 6 pl / ml transduksjon reagens ( f.eks ViraDuctin) eller 20 ul / ml transduksjon enhancer (f.eks ibiBoost).
- Etter utskifting av medium for en uten AV, inkuber dyrkede celler for 4 dager, i fuktet CO 2 inkubator og vurdere GFP uttrykk nivå ved hjelp av en invertert fluorescerende mikroskop.
- Bruk scratch sårtilheling analyse for å vurdere cellemigrasjon i AV-transduced kulturer. Grow cellene i multibrønn kammer lysbilder. Gjør sårene i et monolag ved å skrape celler i en rett lineær bevegelse med en 200 mL pipette tips. Etter såret, endre medium for en ny en for å fjerne frittliggende celler.
- Fotografere sårene hver dag med et digitalt kamera festet til en invertert mikroskop ved 4X forstørrelse. Notere tiden når helbredelse er fullført (sårkantene komme i kontakt langs hele såret).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere vist at i hornhinnen organkulturer, blir forskjeller i ekspresjonen av diabetiske markører (f.eks, basalmembranproteiner og integrin α3β1) og sårheling mellom de normale og diabetiske hornhinner bevart. Dette kultursystem ble utsatt for genterapi som tar sikte på å normalisere nivået av diabetes endret markører, c-Met, MMP-10, og cathepsin F.
Når hele corneale epitel ble transdusert med AV-cmet, eller AV-shRNA til MMP-10 eller cathepsin F (hver for seg eller i kombinasjon), ble det epiteliale sårheling utført betydelig raskere (P <0,03 ved paret Student t-test sammenlignet aV-vektor) enn i aV-vektor-transduserte andre hornhinner fra de samme donorer 16,17. AV-cmet redusert healing tid til det halve, som ikke signifikant forskjellig fra helbredelse av de normale hornhinner (Figure 1). AV-shM10 og AV-shCF hatt mindre effekt. Men en kombinasjon av AV-cmet med AV-shM10 og AV-shCF (Combo) produserte den sterkeste effekten fullstendig normalisering av epiteliale helbredende ganger (figur 1). Denne reduksjonen i healing tid ble ledsaget av de normaliserte mønstre av diabetiker (basalmembran og inte) og stamcellemarkører i diabeteshornhinner 8,16,17.
Epithelial stamceller er den viktigste sårtilheling deltakere 4. Derfor undersøkte vi om limbale genterapi rettet mot stamcelle ville være gunstig for diabetikere hornhinner. For dette formål, ble bare de limbale deler av diabetiske hornhinner transdusert av AV-cmet eller Combo og store, ble mm sår 8,5 opprettet. AV-cmet omsatte hornhinner helbredet betydelig raskere (P <0,001 av paret Student t-test) enn AV-vektor omformet andre hornhinner (Figure 2). Combo behandling resulterte i det samme utfallet 18. Genterapi øket ekspresjon av diabetestrykkes markører, slik som integrin α3β1 og basalmembrankomponent nidogen-1 (figur 3, venstre kolonne, Combo). Viktigere, som i hele hornhinnen transduksjon 8,17, den limbale genterapi med enten AV-cmet eller Combo førte til en betydelig økt ekspresjon av antatte LESC markører inkludert K15 og ΔNp63α, sammenlignet med AV-vektoren transduserte hornhinner (figur 3 , høyre kolonne, både c-møtte og Combo). Disse dataene støtter rollen til stamcelle normalisering i den akselererte sårheling ved genterapi av diabetiske hornhinner og viser muligheten for vår tilnærming til behandling av diabetisk corneal sykdom.
Vi neste begynte å undersøke genterapi effekter på dyrkede LESC-beriket limbale epitelceller. kultureneav normale og diabetiske limbale epitelceller ble etablert og farget for mulige LESC markører. Mange celler farget positive (figur 4). Den fargeintensitet i diabetes kulturer var gjennomgående svakere enn i de vanlige kulturer (K15 vist som et eksempel i figur 4), som var svært lik situasjonen i diabetes vs. normal ex vivo hornhinner 8. Disse forsøk bekreftet de oppnådde cellekulturer som er egnet for genterapi.
Preliminære eksperimenter med et telomerase-udødelig corneal epitelisk cellelinje (se 23) viste at cellene ble lett transdusert av de tilgjengelige AV konstruksjoner (data ikke vist her). Men de primære limbale kulturene viste seg å være mye mer følsomme for den virusmengde og / eller den transduksjon reagens, hvilket nødvendig optimalisering av transduksjon protokollen. Den dyrkede limbale celle transduksjon avAV-GFP (figur 5) avhang av den infeksjonsmultiplisitet (MOI; område 30-300 pfu / celle) som resulterer i et relativt høyt nivå av transduksjon ved høy MOI (GFP-ekspresjon i> 80% celler). Imidlertid, jo høyere MOI ble også giftige og forårsaker celledød eller sterkt nedsatt cellemigrering inn i skrape sårene etter 3-4 dager med transduksjon (figur 6). Ved den nedre MOI (10-30 pfu / celle), det AV transduksjon produserte mindre eller ingen cytotoksisk effekt, men resulterte i et redusert antall GFP-uttrykkende celler (5-15%).
Vi har ved siden forsøkt å øke transduksjon effektivitet uten å ødelegge cellelevedyktigheten ved hjelp av overførings-forsterke reagenser som vanligvis letter AV binding til celleoverflaten. De viste forskjellige effektivisering limbale epitelcelledifferensiering transduksjon av AV på MOI 10-30. Begge polykationer, poly-L-lysin, og polybren, var ikke-toksisk og den mest effektiveresulterte i 3-4 gangers økning i antall av GFP-positive celler (figur 7, øverste rad). ibiBoost var også effektive, men litt giftig, og ViraDuctin var ineffektive og heller giftig (Figur 7, nederste rad). Derfor polykationer tilbyr sikker og effektiv måte å øke genet av interesse ekspresjon på AV-transduksjon og bør brukes for genekspresjon og sårheling eksperimenter.
Figur 1: c-Met-genet transduksjon fører til signifikant redusert hornhinneepitel sårheling tid (gjennomsnitt ± SEM). Videre kombinert genterapi (Combo) med AV husing c-met-genet og shRNAs til MMP-10 og cathepsin F gener helt normaliserer epitel sårheling tid. Signifikans (p-verdier) ble etablert av paret Student t-test sammenlignet med respectiv e vektor behandlinger. Barer representerer standard feil av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Healing på 8,5 mm epiteliale sår i et par av diabetiske hornhinner. Øverste raden, vektor-transduced hornhinnen; helbredelse er fullført i 8 dager. Nederste rad, AV-cmet omformet fyr hornhinnen; helbredelse er fullført i 5 dager. Pilene viser sår (W) kant. *, Ikke-helbredet del (også vist ved høy forstørrelse som innfelt), med Spider-formet apoptosed stromal keratocytter. De er synlige inntil epitellaget vokser på toppen av dem. Bar = 50 mikrometer. Fase kontrast. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: farging av diabetiske hornhinnen seksjoner for ulike markører etter limbale genterapi. Både AV-cmet og Combo behandlinger føre til betydelig økt limbale farging for diabetesmarkører (inte α3β1 og nidogen-1) og antatte stamcellemarkører (K15 og ΔNp63α). Piler på nidogen-1 paneler markere hornhinneepitel basalmembran. Bar = 30 mikrometer. e, epitel; s, stroma. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: immunocytokjemisk farging av primær limbale epiteliale kulturer for en antatt LESC markør K15. Øverste raden, normal kultur; de fleste celler show sterk farging for K15. Nederste rad, diabetiker kultur; de fleste cellene viser bare svak farging. De riktige paneler presenteres med DAPI atomkontra. Normale og diabetiske celler ble fotografert med samme eksponeringstid. Bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Nivået av GFP-ekspresjon i transduserte limbale epitelceller avhenger MOI på AV-GFP: (a) 30 pfu / celle; (B) 120 pfu / celle; (C) 300 pfu / celle i 3 dager for transduksjon. Fotografier av levende celler er vist. Bar = 300 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Cell migrasjon er negativt påvirket av økende konsentrasjon av AV som avslørt av scratch såret test: (a) kontroll; (B) 20 pfu / celle; (C) 80 pfu / celle; (D) 120 pfu / celle. Fotografier av levende celler er vist. Bar = 500 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: limbale epitel-celler transdusert med AV-GFP ved 30 pfu / celle. (A) kontroll; (B) poly-L-lysin; (C, d) transduksjon reagens; 5 dager etter transduksjon. Transduksjon reagens caused en signifikant cytotoksisk effekt som fører til celle avrunding og død (d, fasekontrast). Fotografier av levende celler er vist. Bar = 400 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hornhinnen ser ut til å være et ideelt vev for genterapi på grunn av sin overflate sted hvor den genavlevering, så vel som vurdering av effekt og bivirkninger, er lett. Imidlertid er en klinisk oversettelse av denne kraftige metoden fortsatt langsom på grunn av knappe informasjon om genetiske årsaker hornhinnen sykdommer og de genterapeutiske målene 24. Diabetiske komplikasjoner inkludert hornhinne endringene kan være i stor grad epigenetisk i naturen, som oversettes til metabolsk minne 9. Av denne grunn, diabetiske vev og celler bevare deres avvik ex vivo og kan studeres i organet og vevskultur. Dessuten forårsaker diabetes spesifikke endringer i genuttrykk nivåer og mønstre som kan løses av genterapi. Vi har identifisert flere markører endret i diabetiker cornealepitelets herunder stamcelle 5,6,8, og brukte den menneskelige hornhinnen organkulturer 7,8 til normal avgenterapi markør uttrykk og epitel sårtilheling kompromittert i diabetiker hornhinnen.
Vi har valgt AV som genavlevering kjøretøyet på grunn av sin sterke transgene ekspresjon, dets ikke-integrere natur, og dens selektivitet for epitelceller, som er egenskaper bedre enn de til de adeno-assosiert virus (AAV) 25. AV-transduksjon av hornhinnen organkulturer har flere kritiske trinn. Hornhinner skal leveres til laboratoriet innen 48 timer post mortem, for å minimalisere tapet av epitel som inntreffer under lagring. For å øke virusopptak, er det viktig å legge caveolae transport boostere, for eksempel sildenafil, i løpet av 21 transduksjon. I valideringen transduksjon effekt på protein uttrykk, anbefales bruk av flere markører (figur 3), som spesifikke stamcellemarkører ikke er definitivt identifisert. Ved å gjøre de epiteliale sår, er det en nødvendighet å bruke chemical debridement grunn av sårbarheten i diabetiker epitel basalmembran som resulterer i sin avløsning ved manuell skraping. En forsiktig daglig overvåking av helbredelsesprosessen er nødvendig med objektive kriterier for healing, for eksempel forsvinningen av døde subepiteliale keratocytter fra visningen når epitelet gror over dem (figur 2). Til slutt, på grunn av noen AV og / eller GFP toksisitet for de primære limbale celler, er det viktig å redusere det virale dose, på samme tid ved hjelp av ikke-toksiske transduksjon boostere, slik som polykationer, for å sikre effektiv og sikker transduksjon (figurene 5 - 7).
Den genterapi Systemet kan modifiseres til å benytte organ dyrket hornhinner dyr. De er mye billigere enn menneskelig, kan fås i mengder på en jevnlig basis, og kan være egnet for screening, for eksempel, for sårheling modulerende legemidler. Men den menneskelige hornhinner har potensielt bredere muligheterstudien på grunn av overflod av reagenser, spesielt antistoffer. I tilfelle av narkotika screening i ikke-diabetiske dyr hornhinner, kan debridement gjøres mekanisk. Dersom et antistoff for en bestemt markør ikke virker godt i noen menneskelige hornhinner, kan det være på grunn av individuell variabilitet og / eller sykdomsvarighet eller alvorlighetsgrad. I dette tilfelle undersøker andre markører kan anbefales. Evnen av n-heptanol for å fjerne cellene kan i betydelig grad reduseres over tid, muligens på grunn av oksydasjon under lagring. Hvis dette skjer, kan en ny, tidligere uåpnet flaske må brukes. Hvis du arbeider med de dyre menneskelige hornhinner, kan en andre runde med debridement forsøkes. Sildenafil har en kort halveringstid i vandige oppløsninger; Derfor må det tilberedes hver gang en hornhinnen transduksjon utføres. Suksessen til dyrkning av celler limbale kan avhenge av giverens alder; cellene fra yngre givere vanligvis vokser bedre. En enkelt genterapi Agenten kan ikke lokke fram en betydicant effekt; i dette tilfelle kan en kombinasjon av slike midler være optimal 17. Dersom de primære corneale celler som viser tegn på toksisitet, er det viktig å redusere det virale og polykationet (for eksempel, poly-L-lysin) doser for å minimalisere toksiske virkning og samtidig bevare effektiv transduksjon.
Selv om diabetiske organkulturer gjengi mange tegn på sykdommen og endret genuttrykk, de er denerveres og mangler tilførsel av immunceller, noe som kan påvirke sårtilheling og stamceller. I denne forbindelse kan de dyremodellene har noen fordeler, selv om dyrene ikke gjengi hele spektret av humane sykdoms tegn. De andre genterapi mål eksisterer som effektivt normal diabetiker hornhinner. Et eksempel på slike mål kan være mikroRNA, spesielt, mir-146a eller mir-424 23. Kombinasjoner av de benyttede målet genmodifikasjoner med hemning av spesifikk mikroRNA potensielt kan produsere en mer potent effekt. another begrensningen omfatter nødvendigheten av forholdsvis lang inkubasjon av hornhinnen med den topisk administrerte AV (f.eks, i form av øyedråper), for å sikre maksimal virusopptak. Dette kan utgjøre et problem i klinikken, selv om taping øyelokkene kan hjelpe i å forlenge inkubasjon. Bruken av lave konsentrasjon av sildenafil i den virale løsning kan akselerere AV uptake. AV-transduksjon effekt er forbigående, noe som kan begrense den kurative potensialet i AV-baserte genterapi. Selv om det varer lenge nok til å korrigere diabetiker sårtilheling nedgang, vedvarende normalisering av epiteliale stamceller kan kreve en lengre varig effekt, for eksempel levert av AAV-basert genterapi 24. Det bør nevnes at immunogenitet var en alvorlig ulempe ved tidligere AV vektorer. Men den nye generasjonen rekombinant AV inkludert "gutless" virus er stort sett fri for denne bivirkningen, øke deres muligheter til å være potent til oversettelseronal genterapi biler 26.
Små molekyl modulatorer av ulike veier som kan være viktige for sårheling 16,17,21, er 27-30 brukt i eksperimentelle modeller og klinikken. Men de er ikke rettet mot en spesiell celletype, kan ha forskjellige effekter i forskjellige celler, og kan virke bare på noen aspekter av den diabetiske hornhinnen sykdom 31,32. Den genterapi tilbyr en mulighet for å endre genekspresjon i en ønsket retning i spesifikke celler, som vi oppnådd i dette arbeidet transducing epitelceller ved anvendelse av både genet overekspresjon (c-met) og lyddemping (MMP-10 og cathepsin F). Denne tilnærmingen gjør også modulere uttrykk for spesifikke markører sykdom gener, enkeltvis eller i kombinasjoner 5,6. Våre eksperimenter viste at selv i tilfelle av kombinasjonen av tre AVS huser forskjellige genuttrykk modulatorer, alle tre gener ble påvirket som forventet, ogbehandling var mer effektiv enn når hver AV ble anvendt alene 17.
Ved alvorlig diabetisk keratopati med vedvarende epiteliale defekter eller ufullstendig epitelial helbredelse ved vitrektomi eller laser fotokoagulasjon, kan en erstatning av dysfunksjonelle limbale stamceller være et alternativ til genterapi. I slike tilfeller kan dyrkede og ekspanderte limbale epitelceller ved genterapi in vitro bli transplantert på syke hornhinner. Våre data viser at kultur limbale celler fra diabeteshornhinner viser lignende forskjeller i stamcelle markør uttrykk som ex vivo hornhinner gjør dem gode mål for genterapi. Imidlertid må denne behandling for å være optimalisert, på grunn av den høye følsomheten av slike celler til den virusmengde og transfeksjon reagens. Vi var i stand til å vise at de kationiske transfeksjon reagenser sikres effektiv og sikker levering med høyt uttrykk av et gen av interesse i den kultiverte diabetiker cornealepitelets. These resultater kan bane vei for vellykket genterapi av in vitro utvidet LESC for fremtidige transplantasjonsformål i tilfeller av alvorlig diabetiker keratopati. Fordi arvelig og ervervet LESC mangel er også assosiert med reduksjon av hornhinnen nerver som ligner på diabetes 33,34, kunne transplantasjon av sunne LESC-anrikede kulturer på den syke hornhinner potensielt eliminere diabetisk nevropati hornhinnen i tillegg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
| antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
| adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
| epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
| 60 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μl pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
| inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
| humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
| fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
| dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |
References
- Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S.
- Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2014).
- Tripathy, K., Chawla, R., Sharma, Y. R., Venkatesh, P., Vohra, R.
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M.
- Saghizadeh, M., et al. Overexpression of matrix metalloproteinase-10 and matrix metalloproteinase-3 in human diabetic corneas: a possible mechanism of basement membrane and integrin alterations. Am J Pathol. 158 (2), 723-734 (2001).
- Saghizadeh, M., et al. Proteinase and growth factor alterations revealed by gene microarray analysis of human diabetic corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (10), 3604-3615 (2005).
- Kabosova, A., Kramerov, A. A., Aoki, A. M., Murphy, G., Zieske, J. D., Ljubimov, A. V. Human diabetic corneas preserve wound healing, basement membrane, integrin and MMP-10 differences from normal corneas in organ culture. Exp Eye Res. 77 (2), 211-217 (2003).
- Saghizadeh, M., et al. Alterations of epithelial stem cell marker patterns in human diabetic corneas and effects of c-met gene therapy. Mol Vis. 17, 2177-2190 (2011).
- Kowluru, R. A., Kowluru, A., Mishra, M., Kumar, B. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 40-61 (2015).
- Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. J Cell Sci. 111 (Pt 19), 2867-2875 (1998).
- Lu, L., Reinach, P., Kao, W. W.
- Rama, P., et al. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. N Engl J Med. 363 (2), 147-155 (2010).
- Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 48 (1), 203-225 (2014).
- Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Di Girolamo, N. Moving epithelia: Tracking the fate of mammalian limbal epithelial stem cells. Prog Retin Eye Res. 48 (Sep), 203-225 (2015).
- Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-met gene. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (4), 1970-1980 (2010).
- Saghizadeh, M., et al. Enhanced wound healing, kinase and stem cell marker expression in diabetic organ-cultured human corneas upon MMP-10 and cathepsin F gene silencing. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8172-8180 (2013).
- Saghizadeh, M., Dib, C. M., Brunken, W. J., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and stem cell marker patterns in organ-cultured human diabetic corneas by gene therapy of limbal cells. Exp Eye Res. 129 (Dec), 66-73 (2014).
- Hatchell, D. L., et al. Damage to the epithelial basement membrane in the corneas of diabetic rabbits. Arch Ophthalmol. 101 (3), 469-471 (1983).
- Chung, J. H., Kim, W. K., Lee, J. S., Pae, Y. S., Kim, H. J. Effect of topical Na-hyaluronan on hemidesmosome formation in n-heptanol-induced corneal injury. Ophthalmic Res. 30 (2), 96-100 (1998).
- Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Res Bull. 81 (2-3), 262-272 (2010).
- Sareen, D., et al. Differentiation of human limbal-derived induced pluripotent stem cells into limbal-like epithelium. Stem Cells Transl Med. 3 (9), 1002-1012 (2014).
- Funari, V. A., et al. Differentially expressed wound healing-related microRNAs in the human diabetic cornea. PLoS One. 8 (12), e84425 (2013).
- Mohan, R. R., Rodier, J. T., Sharma, A. Corneal gene therapy: basic science and translational perspective. Ocul Surf. 11 (3), 150-164 (2013).
- Liu, J., et al. Different tropism of adenoviruses and adeno-associated viruses to corneal cells: implications for corneal gene therapy. Mol Vis. 14, 2087-2096 (2008).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
- Sharma, G. D., He, J., Bazan, H. E. P38 and ERK1/2 coordinate cellular migration and proliferation in epithelial wound healing: evidence of cross-talk activation between MAP kinase cascades. J Biol Chem. 278 (24), 21989-21997 (2003).
- Saika, S., et al. Role of p38 MAP kinase in regulation of cell migration and proliferation in healing corneal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (1), 100-109 (2004).
- Xu, K. P., Li, Y., Ljubimov, A. V., Yu, F. S. High glucose suppresses epidermal growth factor receptor/phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and attenuates corneal epithelial wound healing. Diabetes. 58 (5), 1077-1085 (2009).
- Xu, K., Yu, F. S. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3301-3308 (2011).
- Takamura, Y., et al. Aldose reductase inhibitor counteracts the enhanced expression of matrix metalloproteinase-10 and improves corneal wound healing in galactose-fed rats. Mol Vis. 19, 2477-2486 (2013).
- Byun, Y. S., Kang, B., Yoo, Y. S., Joo, C. K. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves corneal epithelial innervation and wound healing in diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1948-1955 (2015).
- Deng, S. X., et al. Characterization of limbal stem cell deficiency by in vivo laser scanning confocal microscopy: a microstructural approach. Arch Ophthalmol. 130 (4), 440-445 (2012).
- Lagali, N., et al. In vivo morphology of the limbal palisades of Vogt correlates with progressive stem cell deficiency in aniridia-related keratopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5333-5342 (2013).
