Abstract
L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere le alterazioni molecolari in cornee diabetici umani e dimostrare come possono essere alleviati con la terapia genica adenovirale in cornee organo-colta. La malattia corneale diabetica è una complicanza del diabete con frequenti anomalie dei nervi corneali e epiteliali guarigione delle ferite. Abbiamo anche documentato l'espressione significativamente alterato di diversi marcatori di cellule staminali epiteliali putativi in cornee diabetici umani. Per alleviare questi cambiamenti, la terapia genica adenovirale è stato implementato con successo utilizzando la up-regolazione dell'espressione proto-oncogene c-met e / o la sottoregolazione di matrice proteinasi metalloproteinasi-10 (MMP-10) e catepsina F. Questa terapia accelerato la guarigione delle ferite nei diabetici cornee anche se solo il vano di cellule staminali limbari è stato trasdotto. I migliori risultati sono stati ottenuti con il trattamento combinato. Per possibile il trapianto del paziente di cellule staminali normalizzati, un esempio è presentato anche del optimizatisu di gene trasduzione in colture di cellule staminali arricchita utilizzando esaltatori policationici. Questo approccio può essere utile non solo per i geni selezionati, ma anche per gli altri mediatori di cicatrizzazione corneale epiteliale e gambo funzione delle cellule.
Introduction
La malattia della cornea diabetica si traduce principalmente in epiteliale degenerativa (cheratopatia) e nervose modifiche (neuropatia). E 'spesso manifesta con le anomalie di epiteliale guarigione delle ferite e la riduzione dei nervi della cornea 1-4. Si stima che circa il 60-70% i diabetici hanno vari problemi corneali 1,3. I nostri studi hanno individuato una serie di proteine marker con alterata espressione in cornee diabetici umani, compresa la down-regulation di c-met proto-oncogene (recettore del fattore di crescita degli epatociti) e l'up-regolazione di metalloproteinasi della matrice-10 (MMP-10) e catepsina F 5, 6. abbiamo anche documentato significativamente diminuita espressione di diversi marcatori di cellule staminali epiteliali putativi nelle cornee diabetici umani.
Negli studi precedenti, abbiamo sviluppato una terapia a base di adenovirale gene per normalizzare i livelli di marcatori diabete alterato con sistema di coltura di organi umani diabetica corneale, che mostra lenta guarigione delle ferite, diabeticomodifiche marcatori, e arginare la riduzione dell'espressione marker delle cellule simili alle ex vivo cornee 7,8. Questa persistenza di cambiamenti sembra essere dovuto alla presenza di epigenetica memoria metabolica 9. Questo sistema di coltura è stata ulteriormente utilizzati per la terapia genica. Gli obiettivi di questa terapia sono stati scelti da marcatori o con ridotta espressione in cornee diabetici (c-met proto-oncogene), o aumento dell'espressione (MMP-10 e catepsina F).
L'adenovirus (AV) la terapia è stata usata in tutto il cornee organo-colta o solo il corneosclerale vano limbare periferico. Questo comparto nutre le cellule staminali epiteliali che rinnovano l'epitelio corneale e partecipano attivamente alla guarigione delle ferite 4,10-15. Qui, i protocolli sono forniti per la cultura normale e diabetico umano corneale organo, epiteliale la guarigione delle ferite, l'isolamento e la caratterizzazione di cellule arricchita di colture di cellule staminali limbare, e la cella adenovirale e trasduzione corneale. Nostrorisultati dimostrano la fattibilità di questa terapia per normalizzare l'espressione marcatore e la guarigione delle ferite nei diabetici cornee per il trapianto possibile futuro. Essi inoltre suggeriscono che la terapia di combinazione è il modo più efficace per ripristinare il normale modello marcatore e la guarigione epiteliale nella cornea diabetica 16-18.
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Protocol
La malattia Nazionale delle Ricerche Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) ha fornito titolari di autorizzazione post mortem sani e diabetici occhi umani e cornee. protocollo di raccolta dei tessuti umani di NDRI è stato approvato dal comitato direttivo e soggetti a National Institutes of supervisione Salute. Questa ricerca è stata condotta sotto la omologato Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board (IRB) protocollo esenti EX-1055. Collaborare chirurghi corneali, Drs. E. Maguen e Y. Rabinowitz, forniti cerchi corneosclerale di scarto per l'isolamento di colture di cellule epiteliali corneali arricchito staminali. Questa ricerca è stata condotta nell'ambito del protocollo IRB approvato Pro00019393.
1. umana corneale Cultura Organo
Nota: cornee normali e diabetici o gli occhi interi vengono ricevuti nel supporto di memorizzazione della cornea raffreddato (ad esempio, Optisol GS) entro 48 ore dopo la morte dal fornitore nazionale NDRI.
- Rimuovere le cornee da contenitore di stoccaggio con una pinza e lavarli due volte in il (ABAM) miscela antibiotico-antimicotico. In caso di occhi interi, tagliare le cornee fuori dai globi con forbici curve. Lasciare almeno 5 mm Cerchio congiuntivale e anche lavare le cornee in ABAM.
- Preparare la miscela da collocare nella concavità corneale. Consiste in mezzo privo di siero minimo essenziale (MEM) contenente ABAM, 1 mg / ml di vitello collagene della pelle (fatto da una soluzione stock di 10 mg / ml di acido 0,1 N acetico), 1% agar, e insulina-transferrina selenite integrare 7.
- Microwave questa miscela all'ebollizione per la sterilizzazione e dissoluzione agar. Si può richiedere fino a 1 minuto per ogni cosa a sciogliere. Lasciare il tappo della provetta parzialmente aperta, perché la miscela trabocca facilmente quando bolle. Per questa ragione, possono essere necessari più cicli ebollizione, ciascuno per 10-15 sec. Raffreddare il composto di 37-39 ° C.
- Posizionare le cornee lato epiteliale nel sterili 60 mm piatti. Riempire la concavità corneale con circa 0,5 ml della miscela descritta in 1.2. Ilmiscela solidifica sulle cornee all'interno 2 min.
- Posizionare le cornee lato agar verso il basso in piatti sterili da 60 mm e aggiungere il supporto completo contenente MEM con ABAM, e insulino-transferrina-selenite supplemento 7 (37 ° C) per mantenere il suo livello approssimativamente al limbus per la cultura interfaccia aria-liquido. Il volume medio è di 7-8 ml per piatto.
- Porre le capsule con le cornee in un incubatore CO 2 5% umidificata con una vaschetta dell'acqua (in questo modo, il livello di umidità è mantenuta pari o superiore al 95%) a 35 ° C (temperatura normale corneale). Aggiungere 100 microlitri di media (due gocce) ogni giorno sul dell'epitelio per inumidire le cornee.
- Monitorare la morfologia corneale e la vitalità delle cellule epiteliali microscopio in luce trasmessa utilizzando un microscopio standard con un obiettivo di 4X. Farlo una volta al giorno.
- Cambiare la media ogni tre giorni. Le cornee possono essere coltivate per almeno tre settimane. Per gli esperimenti di terapia genica, la cultura le cornee per 3-5 giorni, poi transduce con i geni di interesse (4,1-4,4), lascia per altri 3-5 giorni a seconda del transgene e soggetti al protocollo guarigione delle ferite (2.1-2.4).
2. La guarigione delle ferite epiteliale
Nota: Nelle cornee diabetici, il debridement epiteliale raschiamento meccanico non è fattibile perché la fragile membrana basale dell'epitelio si stacca nel processo, che non avviene nelle cornee normali. Pertanto, per mantenere le cornee normali e diabetici in condizioni simili di guarigione delle ferite, rimozione chimica dell'epitelio con n-eptanolo viene utilizzato 19. Questa procedura rimuove l'epitelio ma lascia dietro una membrana basale intatta in entrambe le cornee normali e diabetici.
- Per eseguire centrale epiteliale sbrigliamento 20, inserire un disco di carta filtro di 5 millimetri imbevuta di n-eptanolo sulla superficie anteriore della cornea centrale per 75 sec.
- Rimuovere il filtro e lavare le cornee in piena media. Riempire la concavità con 0,5 ml di agar-collagenemiscela e della cultura come in 1.4. Dopo debridement, le cellule epiteliali di solito muoiono e slough off lasciando intatto microscopio membrana basale 7.
- Utilizzare 8,5 mm dischi per creare grandi ferite epiteliali negli esperimenti con solo terapia genica limbare. Ciò garantirà il coinvolgimento delle cellule staminali del limbus nel processo di guarigione.
- Monitorare la guarigione della cornea al microscopio. Fare fotografie a 4X e 10X ogni giorno fino a quando il difetto epiteliale è completamente guarita. Il processo di guarigione può richiedere da 2 a 15 giorni a seconda dello stato (normale o diabetica) e le dimensioni della ferita.
Nota: Durante il processo di guarigione, le cellule simili a ragni neri sono stati osservati sul piano focale superiore. Queste cellule sono apoptotici cheratociti stromali che sono morti dopo la rimozione dell'epitelio 4. La guarigione è determinato per essere completo quando queste cellule morte sono ricoperte da epitelio guarigione e non sono più visibili (Figura 2, nel riquadro). - dopo la guarigionecompletamento, tagliare le cornee a metà, li incorporare in OCT compound e di processo per immunofluorescenza indiretta su sezioni al criostato o per Western blot 16,21.
3. Isolamento di cellule del limbus e manutenzione di colture cellulari staminali arricchita
Nota: Preparare la cellula primaria limbare epiteliali stelo (LESC) culture -enriched dai cerchi corneosclerale. I cerchi provenienti da donatori sani e scartati dopo trapianti di cornea vengono ricevuti dai chirurghi che collaborano nel supporto di memorizzazione della cornea standard (ad esempio, Optisol). Altrimenti, le culture LESC arricchita possono essere ottenuti dai cerchi asportati dalle normali e diabetici cornee interi o globi ricevuti dal NDRI nel supporto di memorizzazione corneale.
- Se si utilizzano le intere cornee o globi, prima di isolare le zone limbari. Per fare ciò, posizionare la cornea su un piatto di plastica sterile con lato epiteliale e rimuovere la zona centrale con un trapano 9 mm (coltello corneale circolare).Eliminare questa parte centrale. Poi asportare la zona limbare utilizzando un trapano da 13 mm e scartare la parte esterna congiuntivale. Per isolare le cellule utilizzano il bordo limbare bagel-like. Prima di isolamento delle cellule, rimuovere le cellule endoteliali e aderenti resti dell'iride dal lato interno della cornea opposta all'epitelio superficie con un tampone di cotone sterile.
- Isolare fogli di cellule del limbus con trattamento dispasi. Incubare ciascun bordo corneosclerale con 2.4 U / ml dispasi II in 1,5 ml di cheratinociti mezzo privo di siero (KSFM) supplementato con siero fetale bovino 10% (FBS) a 37 ° C per 2 ore 22.
- Delicatamente facilitare strato di cellule epiteliali limbari dal cerchio sotto un microscopio da dissezione stereo con una pinza e dissociare le cellule in 1 ml di 0,25% tripsina - soluzione EDTA 0,02% per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule in 10 ml di terreno (ad esempio, Epilife) e pellet a 300 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min a temperatura ambiente.
- Risospendere °e le cellule in terreno di coltura: media con N2, B27 e integratori di crescita dei cheratinociti umani, e 10 fattore ng / ml di crescita epidermico (EGF).
- Seme le cellule a 3.000-5.000 cellule / ml in flaconi o 60 piatti mm rivestiti con una miscela di proteine di membrana basale umana compresa fibronectina, collagene di tipo IV e laminina (FCL), a 0,5-1 mg / cm 2, in KSFM medie.
- Cultura le cellule in un umidificata (95% o superiore umidità) CO 2 incubatore a 37 ° C fino a formare monostrati confluenti completamente. Questa operazione potrebbe richiedere 1-2 settimane.
Nota: Regolarmente confermare l'identità delle cellule con colorazione immunocitochimica positivo per i marcatori LESC putativi tra cui PAX6, la cheratina (K) 14, K15, K17, e ΔNp63α. I dettagli di colorazione tra cui gli anticorpi primari sono stati pubblicati 8,16-18,22. - Per passare le cellule confluenti, trattarli in un 1 ml 0,05% tripsina (1: 5 diluizione della soluzione di 0,25%) per 10 min a 37 ° C. Aggiungere 5 ml di soia trsoluzione inibitore ypsin (10 mg / ml) diluito 1: 4 in media, e centrifugare le cellule come in 3.5.
- Lavare il pellet cellulare in 3 ml di soia soluzione diluita inibitore della tripsina. Piastra le cellule su FCL-rivestito (vedi 3.7) piatti o le diapositive da camera in vetro a 2 x 10 4 cellule / ml.
4. trasduzione adenovirale delle cornee organo-colta
Nota: I adenovirus ricombinanti (AV) includono AV-vettore (nessun gene inserito), AV-CMET (con il gene aperta griglia di lettura c-met), AV-shM10 (con shRNA di MMP-10), e AV-shCF ( con shRNA di catepsina F). Sono E1 / E3-cancellato Tipo 5 AV esprimere geni sotto il controllo del grande promotore immediato precoce citomegalovirus. I virus AV-CMET sono generati utilizzando AV vettore pad / CMV / V5-DEST 16. I virus AV-shRNA sono personalizzati generati da subcloning di sequenze shRNA con HH1 promotore e GFP sequenza di tag da iLenti-EGFP vettore in una Huma replica-incompetente (E1 / -E3)n tipo AV 5 genoma utilizzando adeno-4 sistema di espressione 17.
- Trasdurre una cornea organo-colta di ogni coppia con AV-vettore e un altro cornea, con un AV espressione genica-modulante. Utilizzare l'AV-CMET a 0,8 a 1,25 x 10 8 unità formanti placca (PFU) per cornea in terreno di coltura per 48 ore a 37 ° C mantenendo le cornee sotto la superficie del terreno ciascuno in un pozzo di un piatto da 24 pozzetti. Utilizzare i virus AV-shRNA a 1-2 x 10 8 pfu per cornea.
- Utilizzare i virus per la trasduzione in piena media integrato con 75 mg / ml sildenafil citrato. Questo reagente attiva il trasporto caveolina facilitare l'assorbimento virale da parte delle cellule epiteliali 21. A causa della breve emivita del sildenafil in soluzioni acquose, aggiungere nuovamente la stessa quantità al mezzo 4-5 hr tardi. Il trattamento standard è per 48 ore.
- Trasferimento cornee a nuovi piatti con un finale rotondo spatola sterile e cultura nel mezzo senza AV mantenere il livello medio al limbus. Dopo l'addtransi- 4-8 giorni all'interfaccia liquido-aria, processo le cornee AV-trattati per varie analisi o di prova per epiteliale guarigione della ferita (vedi sopra). Ordinariamente inumidire le cornee in coltura aggiungendo 100 microlitri di media (due gocce) sulla parte superiore della cornea.
- Per la trasduzione delle sole cellule del limbus, incubare i virus con le cornee all'interfaccia aria-liquido con livello medio al limbus, per evitare trasduzione dell'epitelio centrale.
5. Trasduzione adenovirale di cellule in coltura limbare
- Mantenere le culture LESC-arricchito nel mezzo con 10 ng / ml EGF (vedi 3.5) su piatti di plastica rivestiti con la miscela FCL a 0,5 mg / cm 2.
- Trasdurre cellule in coltura che hanno raggiunto il 70-80% di confluenza con l'AV ospitare il gene della proteina fluorescente verde (AV-GFP) o AV-strapazzate shRNA-GFP in una serie di molteplicità di infezione (MOI: 1-300 pfu / cell) , nel mezzo con 2 ng / ml EGF. Eseguire la transduction per 4 ore a 37 ° C in un volume minimo (0,2 ml), seguita da 20 ore in 0,5 ml di mezzo. La caveolina sildenafil trasporto attivatore non è necessaria per la trasduzione coltura cellulare.
- Utilizzare uno dei seguenti reagenti che facilitano il legame alla superficie cellulare AV per migliorare l'efficienza AV trasduzione: o policationi (1 mg / ml di poli-L-lisina o 5 mg / polibrene ml), o 6 microlitri / ml trasduzione reattivo ( ad esempio, ViraDuctin), o 20 microlitri / ml enhancer trasduzione (ad esempio, ibiBoost).
- Dopo aver sostituito il mezzo per una senza l'AV, incubare cellule coltivate per 4 giorni, nella umidificata CO 2 incubatore e valutare il livello di espressione GFP usando un microscopio a fluorescenza invertito.
- Utilizzare il test la guarigione della ferita zero per valutare la migrazione delle cellule nelle colture AV-trasdotte. Far crescere le cellule nelle diapositive da camera pozzetti. Effettuare le ferite in un monostrato da graffi cellule in un movimento lineare dritto con un PI 200 plPette punta. Dopo ferendo, cambiare il mezzo per una fresca per rimuovere le cellule staccate.
- Fotografare le ferite ogni giorno con una fotocamera digitale collegata ad un microscopio invertito a 4X ingrandimento. Registra il tempo in cui la guarigione è completa (ai bordi della ferita vengono a contatto lungo tutta la ferita).
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Representative Results
Abbiamo precedentemente dimostrato che nelle culture organo corneali, le differenze nell'espressione di marcatori diabetici (per esempio, proteine della membrana basale e integrina α3β1) e la guarigione della ferita tra le cornee normali e diabetici sono conservati. Questo sistema di coltura è stato sottoposto alla terapia genica finalizzato a normalizzare i livelli dei marcatori diabete alterati, c-met, MMP-10 e catepsina F.
Quando l'intero epitelio corneale è stato trasdotto con l'AV-CMET, o AV-shRNA di MMP-10 o catepsina F (separatamente o in combinazione), il epiteliali guarigione delle ferite è stata completata significativamente più veloce (P <0.03 con il test t di Student accoppiato rispetto al AV-vector) rispetto ai compagni di cornee AV-vector-trasdotte dagli stessi donatori 16,17. L'AV-CMET ha ridotto il tempo di guarigione della metà, che non sono molto diverse da guarigione delle cornee normali (Figure 1). L'AV-shM10 e AV-shCF hanno avuto un effetto minore. Tuttavia, una combinazione di AV-CMET con AV-shM10 e AV-shCF (Combo) ha prodotto l'effetto più forte normalizzare completamente i tempi di guarigione epiteliali (Figura 1). Questa riduzione del tempo di guarigione è stato accompagnato dai modelli normalizzati di diabetici (membrana basale e integrina) e staminali marcatori di cellule nelle cornee diabetici 8,16,17.
Le cellule staminali epiteliali sono la principale guarigione delle ferite partecipanti 4. Pertanto, abbiamo esaminato se la terapia genica limbare mira il compartimento di cellule staminali sarebbe vantaggioso per le cornee diabetici. A tal fine, solo le parti del limbus delle cornee diabetici sono state trasdotte con l'AV-CMET o Combo e grandi dimensioni, sono stati creati 8,5 mm ferite. L'AV-CMET cornee trasdotte guarite significativamente più veloce (p <0,001 per appaiati test di t di Student) rispetto alla AV-vettore trasdotto compagni di cornee (Figure 2). Il trattamento combinato ha portato lo stesso risultato 18. La terapia genica ha aumentato l'espressione di marcatori diabete soppresso, come integrina α3β1 e componente della membrana basale nidogen-1 (figura 3, colonne a sinistra, Combo). È importante sottolineare che, come in tutto trasduzione corneale 8,17, la terapia genica limbare sia con l'AV-CMET o Combo portato ad un marcato aumento dell'espressione di marcatori LESC putativi compresi K15 e ΔNp63α, rispetto alle cornee AV-vector trasdotte (Figura 3 , colonne di destra, sia c-met e Combo). Questi dati sostenuto il ruolo della normalizzazione cellule staminali nella guarigione della ferita accelerato sulla terapia genica delle cornee diabetici e dimostrano la fattibilità del nostro approccio per il trattamento della malattia diabetica corneale.
Abbiamo poi iniziato a esaminare gli effetti di terapia genica sulle cellule epiteliali del limbus LESC arricchita di coltura. le culturedelle cellule epiteliali limbari normali e diabetici sono stati stabiliti e colorati per i marcatori LESC putativi. Molte cellule colorate positivo (Figura 4). L'intensità della colorazione nelle culture diabetici era costantemente più debole rispetto alle colture normali (K15 mostrato come esempio in figura 4), che era molto simile alla situazione in diabetici vs normale ex vivo cornee 8. Questi esperimenti convalidati colture cellulari ottenute come idonei per la terapia genica.
Esperimenti preliminari con una linea di cellule epiteliali corneali telomerasi-immortalata (vedi 23) hanno dimostrato che le cellule sono state facilmente trasdotte dai costrutti AV disponibili (dati non mostrati qui). Tuttavia, le colture primarie limbari dimostrato di essere molto più sensibile al carico virale e / o il reagente trasduzione, che richiede l'ottimizzazione del protocollo trasduzione. Il colta trasduzione delle cellule limbari daAV-GFP (Figura 5) dipendeva dalla molteplicità di infezione (MOI, range 30-300 pfu / cell) risultando in un livello piuttosto elevato di trasduzione ad alto MOI (espressione GFP nelle cellule> 80%). Tuttavia, il più alto MOI erano anche tossici, provocando la morte delle cellule o la migrazione delle cellule gravemente compromessa nelle ferite zero dopo 3-4 giorni di trasduzione (Figura 6). Alla minore MOI (10-30 pfu / cell), la trasduzione AV prodotti meno o nessun effetto citotossico, ma ha determinato una riduzione del numero di cellule GFP-esprimono (5-15%).
Abbiamo poi tentato di aumentare l'efficienza di trasduzione senza compromettere la vitalità cellulare utilizzando reagenti di trasduzione di miglioramento che generalmente facilitano il legame alla superficie cellulare AV. Hanno mostrato diversi miglioramenti di efficienza in limbare trasduzione cellule epiteliali dal AV a MOI 10-30. Entrambi i policationi, poli-L-lisina, e polibrene, sono non tossici e più efficacicon conseguente aumento di 3-4 volte il numero di cellule GFP-positive (Figura 7, riga superiore). ibiBoost era anche efficace ma leggermente tossico, e ViraDuctin era inefficace e piuttosto tossici (Figura 7, fila inferiore). Pertanto, policationi offrono modo sicuro ed efficace per aumentare gene di espressione di interesse sulla trasduzione AV e dovrebbero essere utilizzati per l'espressione genica e ferita esperimenti di guarigione.
Figura 1: c-Met gene trasduzione porta alla diminuita significativamente corneale ferita epiteliale tempo (media ± SEM) di guarigione. Inoltre, la terapia genica combinata (Combo) con il gene AV l'ospitare c-met e shRNAs ai geni MMP-10 e catepsina F normalizza completamente la guarigione delle ferite tempo epiteliale. Significatività (valori di p) è stato istituito con appaiati test t di Student in confronto con respectiv trattamenti vettore e. Barre rappresentano l'errore standard della media. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Healing di 8.5 mm ferite epiteliali in un paio di cornee diabetici. Top fila, vettore-trasdotte cornea; guarigione è completa in 8 giorni. fila inferiore, AV-CMET trasdotto compagno di cornea; guarigione è completa in 5 giorni. Le frecce indicano ferita (W) bordo. *, Parte non guarito (mostrato anche ad alto ingrandimento come inserto), con i cheratinociti apoptosed stromali a crociera. Sono visibili finché lo strato epiteliale cresce su di essi. Bar = 50 micron. Contrasto di fase. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: immunocolorazione delle sezioni corneali diabetici di vari marcatori dopo la terapia genica limbare. Entrambi AV-CMET e trattamenti Combo risultato in marcato aumento colorazione limbare di marcatori diabetici (integrina α3β1 e nidogen-1) e marcatori di cellule staminali putativi (K15 e ΔNp63α). Frecce su-1 nidogen pannelli segnano corneale membrana basale dell'epitelio. Bar = 30 micron. e, l'epitelio; s, stroma. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: colorazione immunocitochimica delle colture epiteliali limbari primari per un putativo LESC marcatore K15. Top fila, cultura normale; maggior parte delle cellule show forte colorazione per K15. riga in basso, la cultura diabetica; maggior parte delle cellule mostrano solo una debole colorazione. I pannelli a destra vengono presentati con DAPI di contrasto nucleare. Le cellule normali e diabetici sono stati fotografati con lo stesso tempo di esposizione. Bar = 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Il livello di GFP-espressione nelle cellule epiteliali limbari trasdotte dipende MOI di AV-GFP: (a) 30 pfu / cellula; (B) 120 pfu / cellula; (C) 300 pfu / cellulare a 3 giorni di trasduzione. sono mostrati fotografie di cellule vive. Bar = 300 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: la migrazione delle cellule è influenzata negativamente dalla crescente concentrazione di AV come rivelato da scratch test ferita: (a) il controllo; (B) 20 pfu / cellula; (C) 80 pfu / cellula; (D) 120 pfu / cell. sono mostrati fotografie di cellule vive. Bar = 500 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: cellule epiteliali limbari trasdotte con AV-GFP a 30 pfu / cell. (A) controllo; (B) poli-L-lisina; (C, d) reagenti trasduzione; 5 giorni di trasduzione. La trasduzione del reagente CAUSED un significativo effetto citotossico che porta a arrotondamenti cellulare e la morte (d, contrasto di fase). sono mostrati fotografie di cellule vive. Bar = 400 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La cornea sembra essere un tessuto ideale per la terapia genica per la sua posizione superficie in cui il gene delivery, nonché la valutazione della efficacia e gli effetti collaterali, sono facili. Tuttavia, una traduzione clinica di questo approccio potente è ancora lento a causa della scarsa informazione sulle cause genetiche delle malattie corneali e gli obiettivi di terapia genica 24. Complicanze del diabete, tra cui alterazioni corneali possono essere in gran parte epigenetica in natura, che si traduce in memoria metabolica 9. Per questo motivo, i tessuti e le cellule diabetici conservano le anomalie ex vivo e possono essere studiati nella cultura organi e tessuti. Inoltre, il diabete provoca cambiamenti specifici nei livelli di espressione genica e modelli che possono essere corretti dalla terapia genica. Abbiamo identificato diversi marcatori alterati nell'epitelio corneale diabetico compreso il vano 5,6,8 cellule staminali, e utilizzato i umane colture d'organo corneali 7,8 per normalizzare daterapia genica l'espressione marcatore e epiteliali guarigione delle ferite compromessa nella cornea diabetico.
Abbiamo scelto l'AV come veicolo di consegna gene causa della sua forte espressione del transgene, la sua natura non-integrazione, e la sua selettività per le cellule epiteliali, che sono qualità superiori a quelli del virus adeno-associato (AAV) 25. La trasduzione AV delle colture d'organo corneali ha diversi passaggi critici. Le cornee devono essere consegnati al laboratorio entro 48 ore post-mortem, per minimizzare la perdita dell'epitelio che si verifica durante la conservazione. Per aumentare l'assorbimento virale, è importante aggiungere booster trasporto caveolae, come il sildenafil, durante trasduzione 21. Durante la convalida l'effetto trasduzione sull'espressione della proteina, l'uso di diversi marcatori è raccomandato (figura 3), come marcatori di cellule staminali specifici non sono definitivamente identificati. Nella realizzazione delle ferite epiteliali, vi è una necessità di utilizzare il CheMICAL debridement a causa della fragilità della diabetica membrana basale epiteliale con conseguente suo distacco durante raschiatura manuale. Un monitoraggio quotidiano accurato del processo di guarigione è necessaria con criteri oggettivi di guarigione, come la scomparsa dei cheratinociti subepiteliali morte dalla vista quando l'epitelio ricresce su di loro (figura 2). Infine, a causa di qualche AV e / o tossicità GFP alle cellule del limbus primarie, è importante abbassare la dose virale, allo stesso tempo utilizzando booster trasduzione non tossici, come policationi, per assicurare trasduzione efficiente e sicuro (figure 5 - 7).
Il sistema di terapia genica può essere modificato per utilizzare gli animali cornee organo-coltura. Essi sono molto più economici che umani, possono essere ottenuti in quantità su base regolare, e possono essere adatti per lo screening, ad esempio, di farmaci guarigione-modulante ferita. Tuttavia, le cornee umane offrono possibilità potenzialmente più ampie perlo studio per l'abbondanza di reagenti, in particolare gli anticorpi. Nel caso dello screening farmaco nel cornee animali non diabetici, il debridement può essere fatta meccanicamente. Se un anticorpo per un determinato marcatore non funziona bene in alcune cornee umane, può essere dovuto alla variabilità individuale e / o durata di malattia o gravità. In questo caso, esaminando altri marcatori può essere raccomandato. La capacità di n-eptanolo per rimuovere le cellule può significativamente diminuire nel tempo, probabilmente a causa della ossidazione durante lo stoccaggio. In questo caso, un nuovo, precedentemente aperto, fiala può essere necessario utilizzare. Se si lavora con i costosi cornee umane, una seconda fase di sbrigliamento può essere tentata. Sildenafil ha una breve emivita in soluzioni acquose; pertanto, deve essere preparata ogni volta che viene eseguita una trasduzione corneale. Il successo della coltura di cellule del limbus può dipendere l'età del donatore; le cellule da donatori più giovani di solito crescono meglio. Un unico agente terapia genica può non suscitare una signifeffetto icant; in questo caso, una combinazione di tali agenti può essere ottimale 17. Se le cellule corneali primarie mostrano segni di tossicità, è importante abbassare la virale e policatione (ad esempio, poli-L-lisina) dosi per minimizzare effetto tossico preservando trasduzione efficiente.
Anche se diabetici colture d'organo riproducono molti segni della malattia e l'espressione genica alterata, sono denervato e non hanno la fornitura di cellule del sistema immunitario, che possono influenzare la guarigione della ferita e cellule staminali. A questo proposito, i modelli animali possono offrire alcuni vantaggi, anche se gli animali non riproducono l'intero spettro di segni malattie umane. Gli altri obiettivi di terapia genica esistono che in modo efficiente normalizzare cornee diabetici. Un esempio di tali obiettivi può essere microRNA, in particolare, mir-146a o mir-424 23. Le combinazioni delle modifiche gene bersaglio utilizzati con l'inibizione di specifici microRNA possono potenzialmente produrre un più potente effetto benefico. Another limitazione comprende la necessità di relativamente lunga incubazione della cornea con AV topica somministrata (ad esempio, sotto forma di gocce oculari), al fine di garantire l'assimilazione massima virale. Ciò può costituire un problema in clinica, anche se nastratura le palpebre potrebbe aiutare a prolungare l'incubazione. L'uso di bassa concentrazione di sildenafil nella soluzione virale potrebbe accelerare l'assorbimento AV. L'effetto AV trasduzione è transitoria, che può limitare il potenziale curativo della terapia genica AV-based. Anche se dura abbastanza lungo per correggere il diabetico cicatrizzazione rallentamento, sostenuta normalizzazione delle cellule staminali epiteliali potrebbe richiedere un effetto più duraturo, come fornito dalla terapia genica AAV-base 24. Va ricordato che l'immunogenicità è stato un grave inconveniente di vettori primi AV. Tuttavia, l'AV ricombinante di nuova generazione, tra cui virus "senza palle" sono in gran parte privo di questo effetto collaterale, aumentando le loro prospettive di essere potente translativeicoli di terapia genica onal 26.
Piccole modulatori molecola di vari percorsi che possono essere importanti per la guarigione delle ferite 16,17,21, 27-30 sono utilizzati nei modelli sperimentali e la clinica. Tuttavia, essi non sono destinati ad uno specifico tipo cellulare, possono avere effetti diversi in celle diverse, e possono agire solo su alcuni aspetti della malattia diabetica corneale 31,32. La terapia genica offre la possibilità di modificare l'espressione genica in una direzione desiderata in cellule specifiche, che abbiamo realizzato in questo lavoro trasduzione delle cellule epiteliali utilizzando sia sovraespressione del gene (c-met) e silenziamento (MMP-10 e catepsina F). Questo approccio consente anche modulare l'espressione di specifici geni marcatori malattia, singolarmente o in combinazioni 5,6. I nostri esperimenti hanno mostrato che, anche in caso di combinazione di tre AVs ospitano differenti modulatori di espressione genica, tutti tre geni erano affetti come previsto, e latrattamento era più efficace rispetto a quando ciascuna AV è stato usato da solo 17.
In grave cheratopatia diabetico con difetti epiteliali persistenti o incompleta guarigione epiteliale su vitrectomia o fotocoagulazione laser, una sostituzione di cellule staminali limbari disfunzionali può essere un'alternativa alla terapia genica. In questi casi, le cellule epiteliali limbari coltivate e sviluppato terapia genica in vitro possono essere trapiantate sulle cornee malate. I nostri dati mostrano che le cellule del limbus coltivate dalle cornee diabetici mostrano differenze simili nell'espressione marker delle cellule staminali come ex vivo cornee che li rende buoni obiettivi per la terapia genica. Tuttavia, questo trattamento deve essere ottimizzato, a causa della elevata sensibilità di tali cellule al carico e trasfezione reagente virale utilizzato. Siamo stati in grado di dimostrare che i reagenti di trasfezione cationici assicurata la consegna efficiente e sicuro con elevata espressione di un gene di interesse nel colta epitelio corneale diabetica. Trisultati ueste possono aprire la strada per la terapia genica con successo in vitro ampliato LESC per i futuri scopo di trapianto in caso di grave cheratopatia diabetica. Poiché deficienza ereditaria e acquisita LESC è anche associato con la riduzione dei nervi corneali simili al diabete 33,34, il trapianto di sani culture LESC arricchiti sulle cornee malate potrebbe potenzialmente alleviare la neuropatia diabetica corneale pure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| minimum essential medium | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM antibiotic-antimycotic mixture | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| calf skin collagen | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| agar, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. compound | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| keratinocyte serum-free medium (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife medium with calcium | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| N2 medium supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 medium supplement, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| human keratinocyte growth supplement, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| trypsin 0.25% - EDTA 0.02% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| trypsin 0.25% with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15050065 | |
| soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulin-transferrin-selenite supplement (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| antibody to keratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| antibody to keratin 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| antibody to keratin 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| antibody to ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| antibody to PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| antibody to nidogen-1 | R&D Systems | MAB2570 | |
| antibody to integrin α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| human fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| human laminin | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| human type IV collagen | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| adenovirus expressing MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing cathepsin F shRNA | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing scrambled shRNA and GFP | Capital BioSciences | custom made | |
| adenovirus expressing c-met | OriGene (plasmid) | SC323278 | |
| adenovirus expressing GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| sildenafil citrate, 25 mg | Pfizer | from pharmacy | |
| epidermal growth factor | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Germany | 50301 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning round end spatula | Dow Corning | 3005 | |
| 60 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II multiwell chamber slides | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μl pipet tips | Bioexpress | P-1233-200 | other suppliers available |
| inverted microscope | Nikon | Diaphot | other suppliers/models available |
| humidified CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | other suppliers/models available |
| fluorescent microscope | Olympus, Japan | BX-40 | other suppliers/models available |
| dissecting stereo microscope | Leica, Germany | S4 E | other suppliers/models available |
References
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